JPS63123397A

JPS63123397A - 新規ポリペプチド

Info

Publication number: JPS63123397A
Application number: JP61271605A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Matsumoto; 正松本; Naoko Harada; 原田　菜穂子; Kazuo Yamaguchi; 和夫山口; Yuki Komatsu; 小松　由紀; Seiga Itou; 伊藤　菁莪
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-11-14
Filing date: 1986-11-14
Publication date: 1988-05-27
Also published as: EP0267629A2; EP0267629A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規なインターロイキン−１活性を示すポリペ
プチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、該Ｄ
ＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミ
ドを含む微生物および該微生物を用いるインターロイキ
ン−１活性を示すポリペプチドの製造法に関する。

産業上の利用分野インターロイキン−１（以下ＩＬ−１と略記する）は、
活性化されたマクロファージにより産生されるモノカイ
ンの１種である。ＩＬ−１はＴ細胞などに働き免疫増強
作用を示し、制ガン剤あるいは抗感染症剤としての臨床
応用が期待されている。本発明のＩＬ−１活性を示すポ
リペプチドも、ＩＬ−１と同様医薬としての利用が期待
される。

従来の技術近年急速に発展している組換えＤＮＡ技術は高等生物の
細胞では生産量が少なく分離が困難な物質を微生物で大
量に生産することを可能にした。

ＩＬ−１に関しては、アーロンらがヒト末梢血マクロフ
ァージ由来のｃＤＮＡを大腸菌にクローン化し、その塩
基配列を決定したことが報告されている〔フィリップ・
イー・アーロン（Ｐｈｉｌｉｐ、巳、Ａｕｒｏｎ）　　
ら、プロシイ−ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、）　、８１　７９０７（１９８４）　）
。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、ＩＬ−１活性を有しかつ哺乳動物に対
して実質的に発熱性を有しないポリペプチドを安価に大
量に製造する手段を提供すことにある。

問題点を解決するための手段本発明者はヒト末梢血マクロファージ由来のＩＬ−１ｃ
ＤＮＡを大腸菌にクローン化し、全塩基配列を決定した
。その塩基配列は第１表に示したが、コードするアミノ
酸配列はアーロンらが報告したものと一致した。

次いで本発明者は、第１表に示されたＩＬ−１のｃＤＮ
ＡよりＩＬ−１発現プラスミドを作成し、クローン化し
た大腸菌を培養し、ＩＬ−１を生産し、このＩＬＬＩを
高度に精製した後、酵素で分解したときに、ＩＬ−１活
性を示すポリペプチドが製造できることを見出し、本発
明を完成するに至った。

第　　　１　　　表ＧｌｕＬｅｕＬｙｓＡｌａＬｅｕｔ（ｉｓＬｅｕＧＩｎ
Ｇ１ｙＧＩｎＡｓｐＭｅｔＧｌｕＧｌｎＧ１ｎＶａＩＶ
ａ］ＰｈｅＳｅｒ１４ｅｔＡｓｐＰｈｅＴｈｒＭｅｔＧ
］ｎＰｈｅＶａｌＳｅｒＳｅｒ本本本＾ＡＴＧＴ　ＧＧ
ＡＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＧ　ＧＧＣＴＧ　ＧＣＡＧＡ
ＡＡＧＧＧ　ＡＡＣＡＧＡＡＡ　ＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧ
ＴＡＣＧＧＣＴ発明の詳細な説明本発明によれば、新規なＩＬ−１活性を示すポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片および該Ｄ
ＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミ
ドを含む微生物および該微生物を用いる新規な■Ｌ−１
活性を示すポリペプチドの製造法が提供される。

本発明のＩＬ−１活性を示すポリペプチドは、ヒトイン
ターロイキン−１を酵素、たとえばアクロモバクター・
プロテアーゼＩまたはスタフィロコッカス・アウレウス
■８プロテアーゼで処理して得られ、インターロイキン
−１活性を有し、かつ哺乳動物に対して発熱作用を実質
的に有しないポリペプチドである。本発明のポリペプチ
ドの具体例は下記式で示されるアミノ酸配列を有する。

（ａ）　　　Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ　　　（式Ａ−４）Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ　
　　（武人−３）（ｄ）　　　Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
Ｉ　１ｅ−Ｇ　１ｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
　　（式Ａ−１０）（ｅ）　　Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｌ　ｙ　
ｓ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ＝−Ｍｅｔ−ＧＪｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
−１１ａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−３ｅｒ
−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
３ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ｒｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−しｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ　　（式Ｖ８−１１）（式中記号に対応するアミノ
酸は次のとおりである。

Ａｈａ：アラニン、Ａｒｇ：アルギニン、Ａｓｎ：アス
パラギン、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｃｙｓニジスティ
ン、Ｇｌｎ：グルタミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｇａ
ｙニゲリシン、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｉｌｅ：イソロイ
シン、Ｌｅｕ：ｃｌイシン、Ｌｙｓ　：リジン、Ｍｅｔ
：メチオニン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｐｒｏ：フ
ロリン、Ｓｅｒ　：セリン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｔｙ
ｒ　：チロシン、ｖａｌ：バリン）　（以下これらの式
で表されるポリペプチドをそれぞれＡ−４，Ｖ８−７．
Ａ−３，Δ−１０，Ｖ８−１１と称する）ヒトインター
ロイキン−１は、ヒト末梢血マクロファージ由来のＩＬ
−１ｃＤＮΔを大腸菌にクローン化し、該大腸菌を培地
に培養し、培養物中にＩＬ−１を蓄積させ、培養物から
該ＩＬ−１を採取することによって得ることができる。

ＩＬ−１ｃＤＮＡとしては、ｐｃＤＩＬ−１またはｐＣ
Ｄ−４１５を用いることができる。ｐｃＤＩＬ−１の製
造は参考例に示すとおりに行う。ｐｃＤ−４１５の製造
はプロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイｘ　ンｘ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）８１　。

７９０７、　　（１９８４）に記載されている方法によ
って行う。

ヒ）ＩＬ−１をコードするＤＮＡを組み込むプラスミド
としては、大腸菌で該ＤＮＡが発現できるものならいか
なるプラスミドでも使うことができる。好ましくは、適
当なプロモーター、例えば、ｔｒｐ系、ｌａｃ系のプロ
モーターの下流に開始コドン（ＡＴＧ）を有し、制限酵
素で切断したときに３′末端側に開始コドンを残し、外
来ＤＮＡを挿入することができ、しかもシャイン−ダル
カリ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と開始コドンの間
を適当な距離、例えば６〜１８塩基対に調製したプラス
ミド（ＡＴＧベクター）が用いられる。具体的に好適な
例としてはｐＴｒｓ２０　（参考例２）などがあげられ
る。

ヒトＩＬ　　１ｃＤＮＡとしてｐｃＤＩＬ−１を、該ｃ
ＤＮＡに開始コドンを与えるプラスミドとしてｐＴｒｓ
２０をそれぞれ用いてヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡ
を組み込んだ組換え体プラスミドｐＬＩｃ１２を造成す
る例を以下に述べる。

第１図に示したようにして、ｐｃＤＩＬ−１を１３ａｍ
ＨＩとＤｐｎ　Ｉで切断し低融点アガロースゲル電気泳
動法（ＬＣ，Ｔ法）〔エル・ライスラング（Ｌ、Ｗｉｅ
ｓｌａｎｄｅｒ）　：アナリティカ／Ｌ／　ｌ　ハイオ
ケミストリイ（＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）因、３０５　（１９７９）：ｌにて約１，
０００塩基対（以下ｂｐと略記する）のＤＮＡ断片を精
製する。またｐＴｒｓ２０をＳａｃ　■で切断し、Ｔ４
ポリメラーゼで処理した後にＰｓｔＩで切断しｌ、ｌＫ
ｌ］のＤＮＡ切断を得、さらにｐＧＥＬｌをＰｓｔＩと
ＢａｍＨｌで切断し１．７にｂのＤＮＡ断片を得る。こ
のようにして（尋られたＤＮＡ＠）ｑをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより結合し、ｐ　Ｌ　Ｉ　Ｃ１２を得る。

上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０Ｊ
１ｇのＤＮＡを２〜２ＧＱｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ６，０〜９．
５好ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭ
のＮａｃｊ！、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ
）のＭｇＣβ２を含む反応液中で、１尾のＤＮＡに対し
て制限酵素０．１〜１００単位（好ましくは１〜３単位
）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素に
より異なる）において、１５分間〜２４時間行う。

反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱
することによるが、フェノールまたはジエチルピロカー
ボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も
用いることができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、前記
ＬＧＴ法などを用いる。

ＤＮＡ断片の結合方法は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４ＱｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐ　Ｈ７，０〜８．０）、２〜２０
ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣＬ　、０．１
〜１０ｍＭ　（好ましくは０．５〜２．０ｍＭ）のＡＴ
Ｐ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のジチオ
スレイトールを含む反応液中で、Ｔ、４ＤＮＡリガーゼ
０，３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３〜
２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０時
間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔ニス・エヌ・コー
エン（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）ら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｖａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　）。

６９　２１１０　（１９７２）　）によって、大腸菌に
導入する。

組換えプラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの単
離は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボ
イム（ｔｌ、　Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　　ら：ヌクレ
イック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ。

Ａｃ１ｄ、Ｒｅ＋Ｊ　７．１５１３　（１９７９））な
どを用いて行う。

プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で切断後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基
配列を決定する必要があるときは前述のメッシング（Ｍ
ｅｓｓ　ｉｎｇ）の方法〔ジー７　（Ｇｅｎ６）旦、　
２６９　（１９８２）　）によって決定する。

以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。

本発明のＩＬ−１活性を示すポリペプチドは以下のとお
りに製造できる。すなわち、プラスミド（例えばｐＬＩ
ｃ１２）を用いて［ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉ　
ＫＭ４３０　（工業技術院微生物工業技術研究所に昭和
６１年２月１日付でＦ　Ｅ　ＲＭ　　ＢＰ−９８１とし
て寄託しである。）を形質転換させ、アンピシリン耐性
（Ａｐ’以下同じ）のコロニーの中からｐＬＩｃ１２を
有する大腸菌を選びだす。

ｐＬＩｃ１２を有する大腸菌を培地に培養することによ
り培養物中に該ポリペプチドの前駆体ポリペプチドを生
成させることができる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに上記前
駆体ポリペプチドの生産に好適なものならば合成培地、
天然培地のいずれも使用できる。

炭素原としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、クリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ，Ｃβ、（ＮＨｌ＞２ｓｏ４、
ガザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バ
クトドリブトン、コーン・ステイープ・リカーなどが、
その他の栄養源としテハ、ＫｔＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ，
、ＮａＣｊ！、Ｍｇ５Ｏａ、ビタミ／　Ｂ　ＩＳＭ　ｇ
　Ｃ１２などが使用できる。

培養はｐ　Ｈ５，５〜８．５、温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間で培養菌体
中にＩＬ−１が蓄積するので、培養物から菌体を集菌し
、菌体を超音波処理により破砕し、遠心してから上清を
６５％硫酸沈殿により、ＩＬ−１を分離・精製できる。

更にＩＬ−１を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ
）にかけて高度に精製することができる。蛋白量の測定
はエム・エム・ブラッドフォードの方法〔エム・エム・
ブラッドフォード（Ｍ、　Ｍ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ）　
　：アナリティカル・バイオケミストリイ（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）ユ、２４Ｂ　
（１９７６））により行うことができる。また試料中の
ＴＬ−１の含量は、レムリの方法〔ニー・ケー・レムリ
（Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ）　：　　ネイチ＋　−
（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７　。

６８０　（１９７０））により５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った後、クロマトスキャナーで測
定することができる。さらに、ここで得られたＩＬ−１
は、酵素〔アクロモバクター・プロテアーゼＩ　（Ａｃ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉ　：以
下ＡＰＩと略記する）または、スタフィロコッカス・ア
ウレウス・■８プロテアーゼ（Ｓｔａｐｈｙ−１ｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　　ｖ８菌株Ｐｒｏｔｅａｓｅ
　：以下■８プロテアーゼと略記する）〕と適当な条件
で反応させ、本発明のＩＬ−１活性を示すポリペプチド
を得ることができる。

ＩＬ−１の酵素分解処理および分解したポリペプチドの
採取は以下のとおり行う。

ＡＰＩ分解では、ＩＬ−１１００■と酵素２Ｉｔｇと０
．０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ　　４Ｍ　　尿素（ｐＨ９，１）
に溶解し、３７℃で５時間反応させる。

■８プロテアーゼ分解では、ＩＬ−１１００μｇと酵素
２．５■とを０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，８）に溶
解し、３７℃、２２時間反応させる。

反応後、逆相系カラムの山村化学社製ＹＭＣＡＭ３１２
　０ＤＳで、フラグメントを分画した。

本発明のポリペプチドは、ペプチド自動合成機械を用い
て合成することができる。ペプチド自動合成機械、試薬
、溶媒類を使用し、使用機種の標準的な運転プログラム
に従ってポリペプチドを合成できる。本発明ポリペプチ
ドの１つであるＶ−４の合成例を実施例７に示す。他の
ポリペプチドについても同様の方法で合成することがで
きる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１組換え体プラスミドｐＬＩｃ１２の造成：参考例１の方
法によって得たｐｃＤＩＬ−１（４７５０ｂｐ）　　１
０ｎを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ７，５）、７
　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ！　２．１００ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１および６ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む溶
液（以下“Ｙ−１ｏ。

緩衝液”と略記する）全量５０ｇに溶かし、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ　（宝酒造社製、以下制限酵素については特記
しない限りすべて宝酒造社製）２０単位を加えて、３７
℃で２時間切断反応を行った。次いで、このＤＮＡをフ
ェノールークロロホルムで抽出し、エタノール沈殿を行
った後、ＤＮＡを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐ
Ｈ７，５）、７ｍＭ　　ＭｇＣｊ！□、１５０ｍＭＮ　
ａ　Ｃｊ！および５ｍＭ　　２−メルカプトエタノール
を含む溶液（以下“Ｙ−１５０緩衝液”と略記する）全
量５０ｍに溶かし、制限酵素Ｄｐｎ■を１０単位加え、
３７℃で３０分間切断反応を行った（この反応は、部分
消化反応である）。

反応液からＬＧＴ法によってヒ）ＩＬ−ＩＤＮＡを含む
約１，０００ｂｐのＤＮＡ断片（Ｄｐｎｌ−ＢａｍＨＩ
断片）を約０．５Ｊｉｇ得　た。

別にｐＴｒＳ２０（参考例２）１０ｇを１０ｍＭＴｒ　
ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、７　ｍＭ　）Ｊｇ
Ｃｊ１！　２および５ｍＭ　　２−メルカプトエタノー
ルを含む溶液（以下“Ｙ−０緩衡液”と略記する）全ｍ
５０ρに溶かし、制限酵素５ａｃＩを２０里位加えて、
３７℃で２時間切断反応を行った。

次いでこのＤＮＡをフェノール・クロロホルムで抽出し
、エタノール沈殿を行った後、５７ｍＭＴｒ　ｉ　５−
ＨＣｊ！　（ｐＨ８，８＞、６．７ｍＭＭｇＣｊ！２．
１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、１６．７ｍＭ
　　（ＮＨ４）２ＳＯ４，６，７ｍ！ＪＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ　　ｄＡＴＰ、１ｍＭ　　ｄＧＴＰ。

１ｍＭ　　ｄｃＴＰおよび１ｍＭＴＴＰを含む溶液５（
ｌｄに溶かし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ４Ｉ１位を加え
て３７℃、１時間反応を行った。

さらにこのＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出を行
った後、エタノール沈殿を行い、ＤＮＡを１０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、７　ｍ　Ｍ　　Ｍ　
ｇ　Ｃｊ！　２．５０ｍＭ　　ＮａＣｊ！および５ｍＭ
　　２−メルカプトエタノールを含む溶液（以下“Ｙ−
５０緩衝液”と略記する。）全量５０■に溶かし、制限
酵素ＰｓｔＩ２Ｏｊｉ位を加えて、３７℃で２時間切断
反応を行った。反応液からＬＧＴ法によってトリプトフ
ァンプロモーターを含む約１，１００ｂｐのＤＮＡ断片
ＣＰｓ　ｔ　ｌ−３ａｃ　Ｉ　（Ｔ４ｐｏｌ）断片）　
２１１ｇを得た。

また別にｐＧＥＬＩ　Ｃ関根らニブロン−ディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　８２　　
。

４３０６　、　　（１９８５）　：１１０■を全量５０
ρのＹ−５０緩衝液に溶かし、制限酵素ＰｓｔＩ２０単
位を加えて、３７℃で２時間切断反応を行った。次いで
、ＮａＣｆ１を１００ｍＭになるように加え、制限酵素
ＢａｍＨＩを２０単位加えて、３７℃で２時間切断反応
を行った。反応液からＬＧＴ法によって、複製開始点を
含む１．７００ｂｐのＤＮＡ断片（Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｂａ
ｍＨＩ断片）２ｇを得た。

次に上記で得たｐｃＤＩＬ−１由来のＤｐｎ　Ｉ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（約１．０００ｂｌ））　０．２ｇ、ｐＴｒ
ｓ２Ｑ由来のＰｓｔｌ−３ａｃＩ　（Ｔ４ｐ０１）断片
（約１．１００ｂｐ）　　ｏ、　２μｇとｐＧＥＬ１由
来のＰｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約１，７００ｂｐ
）０゜Ｂａｇを２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ
７，６）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ２２．１０ｍＭ　　ジ
チオスレイトールおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液
（以下にこの緩衝液を“Ｔ　４１Ｊガーゼ緩衝液”と略
記する）全１２０ＪＬ１に溶かし、この混合溶液をさら
に２単位のＴ４ＤＮΔリガーゼ（宝酒造社製：以下同じ
）を加えて４℃、１８時間反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　Ｍ
　４３０株をコーエンらの方法〔ニス・エヌ・コーエン
（Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）ら：プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＞　６９．
２１１０　（１９７２）、以下大腸菌の形質転換にはこ
の方法を用いる）〕により形質転換し、Ａｐｒのコロニ
ーを得た。

この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法〔エ
イチ・シー・バーンボイム（Ｈ，ＣｌＢｉｒｎｂｏｉｍ
）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｎｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、＞　７．１５１３　（１９７
９）　］　（以下プラスミドＤＮＡの分離精製にはこの
方法を用いる）に従って分離精製し、該プラスミドＤＮ
ＡをＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｅｃｏ
ＲＩ等の制限酵素で切断することによりプラスミドの構
造解析を行った。その結果、目的プラスミドが得られた
ことを確認した。この組換え体プラスミドをｐＬＩｃ１
２と命名した。

実施例２ＩＬ−１の精製：ｐＬＩｃ１２で形質転換した大腸菌をＭ９・カザミノ酸
培地で３０℃、１５時間培養し、その７５　Ｑｍｌを遠
心分離（５，０００ｘｇ、　１０分間）して菌体を集め
、２０　Ｑｍｌのリン酸含有生理食塩水〔組成：０．８
％ＮａＣｊ！、０．０２　％Ｋ（１，０，１１５％Ｎａ
２ＨＰＯ＜　、０．２％ＫＨ，ＰＯ，）（以下ＰＢＳと
略記する）で懸濁し、超音波を用いて細胞を破壊した。

次に遠心分離（５，０００ｘｇ、　１０分間）により上
清２０　Ｑｍｌを集め、硫酸アンモニウムを５５．４　
ｇ加え、４５％飽和溶液にして遠心分離（５，０００％
ｇ、１０分間）し、上滑２０　Ｑ＋ｎｌを得た。さらに
、この上清に１９．８　ｇの硫酸アンモニウムを加え遠
心分離（５，０００Ｘｇ、　１０分間）し、沈殿物を２
０１Ｔ１１のＰＢＳで溶解し、さらにＰＢＳに透析して
、粗精！！ＩＬ−１溶液４５ｍ１を得た。

次に、このＩＬ−１溶液３ｍｌをセントリコン１０（ア
ミコン社）を用いて４倍に濃縮し、そのうち５０ｇを高
速液体クロマトグラフィ〔東洋曹達　ティ・ニス・ケイ
・ゲル・ジ−３０００ニス・ダブル（ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ
　３０００　ＳＷ）　：１を用いて精製し、高純度ＩＬ
−１２ｍｇを得た。

実施例３ＩＬ−１活性を示すポリペプチドΔ−４，Δ−３，Ｖ８
−７．Ａ−１０，Ｖ８−１１　：純度９７％以上に精製
したＩＬ−１１００μｇを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−４Ｍ
尿素（ｐＨ９，１）の溶液に全量が１００４になるよう
に溶かしＡＰＩ（和光純薬工業社製）を２■加え、３７
℃で５時間分解反応を行った。反応相を逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（山村化学社製）ＭＭＣＡＭ３１２Ｏ
ＤＳカラムにかけてＡ液（０，１％トリフロロ酢酸）１
００％からＡ液２０％とＢ液（０，１％トリフロロ酢酸
−９０％アセトニトリル）８０％との混液までのグラジ
ェントで溶出し、流出する分画のＩＬ−１活性を測定し
て、早く溶出する方から順に式Ａ−４、式Ａ−３および
式Δ−１０で示されるポリペプチド（それぞれ、Ａ−４
、Ａ−３およびＡ−１０と称する）それぞれ２Ｊｔｇを
得た。

同様にして、精製ＩＬ−１１００■を１００ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ７，８）に溶かし
、■８プロテアーゼ（マイルス・ラボラトリーズ社製）
２．５μｇを加え３７℃で、２２時間切断反応を行った
。反応液を上記と同様に逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにかけて溶出し、流出する分画のＩＬ−１活性を測定
し、早く溶出する方から順に式■８−７およびＶ８−１
１で示されるポリペプチド（それぞれ■８−７およびＶ
８−１１と称する）をそれぞれ２μｇ得た。

ＩＬ−１、Ａ−４、Δ−３、■８−７、Ａ−１０、Ｖ８
−１１はすべて、ＩＬ−１活性を示した。

実施例４ＩＬ−１活性の測定等厚らの方法（臨床検査２８　（３）、　３２８１９８
４）に準じて、活性の評価を行った。すなわち、４〜６
週令退会３Ｈ／Ｈｅマウスの胸腺細胞を１０％仔牛脂児
血清（ＦＣ３）（ギプコ社製）およびコンカナバリンＡ
（ＣｏｎＡ）０．５〜１．０ｇ／ｍｌを加えたＲＰＭＩ
−１６４０培地（白水製薬社製）に１０１〜２Ｘ１０’
細胞／ｍｌの濃度で懸濁させた。この胸腺細胞懸濁液Ｑ
、１ｍｌおよび適当濃度に稀釈した本発明試料各Ｑ、１
ｍｌを９６穴マイクロプレートの各ウェルに入れ、これ
を５９６炭酸ガス含有空気中、３７℃で４８時間培養し
た。０．２５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルにパル
スラベルして、３日目に細胞を回収した。３Ｈ−チミジ
ンの導入は続く液体シンチレーション計数により測定し
た。活性は最大胸腺細胞３Ｈ−チミジン導入の５０％を
発生させる能力を１単位とする。第３表に実施例２．３
で得たＩＬ−１、Ａ−４、Ａ−３、■８−７、Ａ−１０
およびＶ８−１１のインターロイキン−１活性値を示す
。

第　　　３　　　表実、施例５実施例２で得られたペプチドの発熱性を調べる目的でウ
サギ（１群３匹）に第４表に示した濃度で各ペプチドを
３回／匹投与して１時間後の体温上昇を調べた。その結
果（ａ）のみ発熱性陽性で他は陰性であった。（ａ）の
ＩＬ−１と（Ｃ）および（ｅ）〜（社）のペプチドは分
子数にして同数値なので、これらはＩＬ−１活性は示す
が発熱性を示さない、又発熱性の低下したペプチドであ
ることが判明したく第４表）。

第　　　４　　　表実施例６好中球の貧食作用促進活性ストッセルらの方法〔ティー・ピー・ストッセル＜　Ｔ
、Ｐ、５ｔｏｓｓｅｌ）ら、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、
）１３７　．６９０　＜１９７３））によって好中球の
貧食作用促進活性を次の通り評価した。

２Ｘ１０’細胞の好中球をリン酸含有タレブス・リンゲ
ル液（ＫＲＰ）に懸濁し、適当に稀釈した試料と３０分
間インキュベートした。これに、オプソニン化させた色
素ｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ（半回化学薬品社製）を加え、好
中球に取り込ませた。取り込まれたｏｉｌ　ｒｅｄ　Ｏ
は細胞を破壊し、破壊細胞をクロロホルムで抽出し抽出
液の５２５ｎｍでの吸収を測定した。結果を第５表に示
す。

第　　　５　　　表実施例７　Ａ−４ペプチドの化学合成ペプチドの合成はアプライド・バイオシステムズ社（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）の
ペプチド自動合成機４３０Ａ型を用いて、同社市販の試
薬、溶媒類を使用し、同機の標準的な運転プログラムに
従って行った。α−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ε−
クロルベンジルオキンカルボニルリジン（０，５ミリモ
ル）が結合したポリスチレン固相担体０．８８　ｇを自
動合成機の反応機に入れ、５０％トリフルオロ酢酸−塩
化メチレンでｔ〜ブチルオキシカルボニル基を除去し、
固相担体上のリジンのα−アミン基を遊離させた。これ
に２当量のα−ｔ−プチルオキシ力ルホニルアスパラギ
ン酸と１当量のジシクロへキシルカルボイミドと１当量
のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールから生成したアス
パラギン酸の活性エステルを含む反応液を加え縮合反応
を行った。これらの工程はプログラムに従って自動的に
行われ、固相担体上にアスパルチルリジン（Ａｓｐ−Ｌ
ｙｓ）が合成された。以下、トリフルオロ酢酸によるｔ
−ブチルオキシカルボニルの脱離と、ジシクロへ手ジル
カルボイミドを活性化剤とするアミノ酸の縮合を自動的
にくり返し、固相担体上にＡｒｇ−Ｖａβ−Ａｓｎ−Ｌ
ｙｓを合成した。

合成反応終了後に得られた固相担体は１．２０　ｇであ
った。この担体５００ｍｇをアニソール０．５ｍｌに懸
濁し、−夜室温で放置した後、フッ化水素５ｍｌを加え
、水冷下１時間攪拌した。次いでフッ化水素を減圧下に
留去し、残渣を１Ｍ酢酸水溶液３　Ｑｍｌで抽出して、
すべての保護基が除去され、固相担体から遊離したペプ
チドの粗生成物を得た。このペプチドを含む溶液をエー
テル３０ｍ１で２回洗浄後、イオン交換樹脂（ダイアイ
オン、Ｄｉａｉｏｎ　　ＳＡ−１１）６ｍｌをつめたカ
ラムを通過させ、カラムを２０ｍ１の１Ｍ酢酸水溶液で
洗い、溶出液を合わせて凍結乾燥した。

残渣を０．５Ｍ酢酸水溶液３ｍｌに溶かし、セファデッ
クスＧ−２５（φ２．４Ｘ８４（Ｊ）のカラムにのせた
。カラムは０．５Ｍ酢酸水溶液で溶出し、溶出液を７ｍ
ｌに分画し、フラクション３３−４０を合わせて濃縮し
てほぼ純粋なペプチド２１１　ｍｇを得た。この一部分
を逆相カラム（山村科学、ＹＭＣ−ＯＤＳ　　φ４．６
Ｘ２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）で精製した。ペプチドのＨＰＬＣでの溶出は
０．１％のトリフルオロ酢酸を含む１５％から６０％の
アセトニ）ＩＪル水溶液の直線濃度勾配法で行い、ペプ
チドの純品を得た。ペプチドの構造は質量分析（日立Ｍ
２Ｏ３機〉で８１０（Ｍ＋１）のピークを検出し、６８
１，５６７．４２０゜３２１に各々、カルボキシ末端か
ら−アミノ酸が脱離したピークが検出されたことにより
確３忍した。

参考例１ヒトＩＬ−１ｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐｃＤＩＬ−１
の単離：（１〕　　ヒトマクロファージよりポリ（Ａ）ＲＮＡの
調製：ヒト正常人マクロファージをアーロンの方法〔フィリッ
プ・イー・アーロン（Ｐｈｉｌｉｐ。

ε、　Ａｕｒｏｎ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　８１　、
７９０７（１９８４）　］に従って分離し、大腸菌リポ
ポリサッカライドでマクロファージを活性化した。５Ｘ
１０８のマクロファージに大腸菌リポポリサッカライド
（ディフコ社製）を３００％ｇ／ｍｌの濃度で加え４時
間培養し、培養上清を取り除き、５Ｍチオシアン酸グア
ニジン、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７）および８％
（Ｖ／Ｖ）　２−メルカプトエタノールからなる溶液５
　Ｑｍｌで可溶化した。この可溶化物を遠心分離管に移
し、４Ｍ　　Ｌ＋Ｃｊｌ’溶液３５　Ｑｍｌを加えて攪
拌した後、４℃２０時間静置した。旧ｔａｃｈｉ　ＲＰ
ＲＩＯローターにて６．００　Ｏｒｐｍ　、　６０分間
遠心分離後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈
殿を４Ｍ尿素および２ＭＬｉＣβからなる溶液２００ｍ
１に懸濁し、旧ｔａｃｈｉ　ＲＰＲＩＯローターにて６
．０００ｒｐｍ　、　６０分間遠心分離後、再びＲＮＡ
沈殿を回収した。ＲＮＡの沈殿を０．１％ラウリル硫酸
ナトリウム、１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ　　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（＋）Ｈ７゜５）からなる溶液１
５ｍｌに溶解し、フェノール・クロロホルムで抽出後、
エタノール沈殿により回収した。得られたＲＮＡ約２．
０　ｍｇを１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ８
，０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液１ｍｌに溶か
した。６５℃、５分間位インキュベートし、Ｑ、１ｍｌ
の５ＭＮａＣｊ！を加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラム〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ　−
Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）社製〕りＣ１？トゲラ
フイー（カラム体積０．５ｍ１）にかけた。

吸着したポＩＪ（Ａ＞を有するｍＲＮＡを１０ｍＭ　　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０＞および１ｍＭ
　　ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ！Ｊ　（Ａ）を
有するｍＲＮＡ約５０μｇを得た。

（２）　ｃＤＮＡ合成：オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法
〔モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Ｍ
ｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、）、　２　．１６１　（１
９８２））に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込んだ
組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概略を
第２図に示す。

ｐｃＤＶＩ　Ｃオカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ
ｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）　　：モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏ
ｌ、　）。

３　．２８０　（１９８３））　４００ｘｒをｌＱｍＭ
Ｔｒ　ｉ　ｓ’−ＨＣｌ２　　（ｐＨ７，５）、６ｍＭ
Ｍ　ｇ　ＣＲ２および１０ｍＭ　　ＮａＣｊｌ！からな
る溶液３００ｍに加え、さらに５００単位のＫｐｎ　Ｉ
を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫ
ｐｎ　１部位で切断した。フェノール−クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。Ｋｐｎ
　Ｉ切断した該ＤＮＡ約２００■を４ＱｍＭカコジル酸
ナトリウム、３０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐ　Ｈ
６，８）、１　ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃｊ！　２および０．
１ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）か
らなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴ
Ｐを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００ｍに加え
、さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジル
トランフエラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）（Ｐ　−Ｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃
、１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶｌのＫｐｎ　
Ｉ切断部位の３′末端にポ’Ｊ　（ｄＴ）鎖が約６７個
付加された。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出
、エタノール沈殿により、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐ
ＣＤＶＩＤＮＡ約１００■を回収した。該ＤＮＡを１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊＭｐＨ７，５）、６ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２．１００ｍＭＮａＣｊ！からなる緩衝液１５
０ｇに加え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩを加え、３
７℃、２時間反応させた。該反応物をＬＧＴ法で処理後
、約３．１にｂのＤＮＡ断片を回収し、約６０■のポリ
（ｄＴ）鎖付加ｐｃＤＶ１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　
　ＥＤＴＡからなる溶液５００ＪＩＪｔに溶解し、６５
℃、５分間インキニベート後、氷冷して５０．ｄの５Ｍ
ＮａＣｊ２を加えた。混合物をオリゴ（ｄＡ）セルロー
スカラム（コラボラティブリサーチ社ｍ＞クロマトグラ
フィーにかけた。ポＩＪ（ｄＴ）鎖長が充分なものはカ
ラムに吸着し、これをｌＱｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８，０＞および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、
ポＩＪ（ｄＴ）鎖の付加したｐｃＤＶｌ　（以下ベクタ
ープライマーと略記する）２７■を得た。

次にリンカ−ＤＮＡの調製を行った。

ｐＬｌ（オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ＆
　Ｂｅｒｇ）　　：モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジイ（Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、）、　３
　．２８０（１９８３）　）約１４河を１０ｍＭ　　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７゜５）、６ｍＭ　　ＭｇＣ
ｊＣおよび５０ｍＭ　　Ｎａ（ｌからなる緩衝液２００
屑に加え、さらに５０単位のＰｓｔｌを加え、３７℃４
時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰｓｔ１部位で切断さ
せた。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿を行い、Ｐｓｔｌで切断したｐＬ　Ｉ　Ｄ
ＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ約１３ｇをＴｄＴ
緩衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０
μｇに加え、さらにＴｄＴ（Ｐ　−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製）５４単位を加えて３７℃、１３分間
インキュベートし、ｐＬｌのＰｓｔＩ切断部位３′末端
に（ｄＧ）鯛を約１４個付加した。フェノール−クロロ
ホルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該
ＤＮＡを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，
５）、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２２、および６０ｍＭ　　Ｎ
ａＣｊ！からなる緩衝液１００ｍに加え、さらに８０単
位のＨｉｎｄ■を加えて３７℃、３時間インキュベート
し、ｐＬＩＤＮＡのＨｉｎｄ［部位で切断シタ。

該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．
５ＫｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツェン
（叶ｅｔｚｅｎ）　　ら：　アナリテイ力）Ｌｔ・バイ
オケミストリ４　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）
１１２．２９５　（１９８１）　：ｌにて回収し、オリ
ゴ（ｄＧ）鎖付きのリンカ−ＤＮＡ　（以下単にリンカ
−ＤＮＡと略記する）を１等だ。

上記で調製したポＩＪ　（Ａ）ＲＮΔＮａ■、ベクター
プライマー約ｔ、４μｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
　（ｐ）（８，３）、８ｍＭ　　！ｖ！ｇＣＬ、３０ｍ
Ｍ　　ＫＣＩ！、Ｑ、３ｍＭ　　ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴ
Ｐ　（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰＳｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）
および１０単位のりボヌクレアーセインヒビター（Ｐ　
−Ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液
２２．３ｍに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工
業社製）を加え、４１ｔ、９０分間インキュベートし、
ｍＲＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、
ＲＮＡ−Ｄ　Ｎ　Ａ二重鎖の付加したベクタープライマ
ーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６ｐＭ　　ｄｃＴＰ
および０．２Ｉ１ｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液２０
Ａｉ！に溶かし、１４単位のＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ　−Ｌ　
　Ｂｉｃｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３７℃、２
分間インキュベートし、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　３’末端に２
０個の（ｄＣ）鎮を付加した。該反応物をフェノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により（ｄＣ）鎖
の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを回収
した。該ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩｌ　　（ｐ
Ｈ７，５）、６ｍＭ　　ＭｇＣｊ！ｓ、および６０ｍＭ
　　ＮａＣｊ！からなる液４００誠に溶かし、２０単位
のＨｉｎｄＩｎを加え、３７℃、２時間インキュベート
し、Ｈｉｎｄ■部位で切断した。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して０．５ピコモ
ルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮ
Ａを得た。該Ｄ　Ｎ　Ａ　０．２ピコモル右よび前記の
リンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ　０．４ピコモルを１０ｍＭ　　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐ）１７．５）、Ｑ、１Ｍ　
　ＮａＣｊ！および１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液１
００ρに溶かし、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０
分、２５分、３０分間インキュベートした。２０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ　（ｐＨ７，３）、４ｍＭ　　Ｍ
ｇ（１，，１０ｍＭ　　（ＮＨ，＞２３Ｏ４，０，１Ｍ
　　ＫＣＩおよび０．１ｍＭ　　β−ＮＡＤの組成で、
全量１］Ｃｌ０ｍとなるよう反応液を調製した。該反応
液に２５単位の大腸菌ＤＮＡ’ＩＩガーゼ（二ニーイン
グランド・バイオラブズ社製）を加え、１１℃、１８時
間インキュベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮＴ
Ｐ。

０．１５ｍＭ　　βＮＡＤとなるよう成分を追加調製し
、１０単位の大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ、２０単位
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ＋ｃａｌｓ社製）および１０単位の大腸菌リボヌクレ
アーゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂｊｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を
加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキュベート
した。

上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され
、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミドが生成した
。

（３）　　ヒトＩＬ−１ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの
選択：（２）で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６０
０ＳＦ８株〔カメｏ　７　（Ｃａｍｅｒｏｎ）ニブロン
−ディング・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミイ・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ７２．３４１６　（１９
７５）　　〕を５ＣＯｔｔらの方法〔重定勝哉；細胞工
学　２　　、６１６（１９８３）　〕に従い形質転換し
た。得られた約３，０００個のコロニーをニトロセルロ
ース・フィルター上に固定した。

アーロンらが単離したヒトＩＬ−ＩＣＤＮＡ〔フィリッ
プ・イー・アーロン（Ｐｈｉｌｉｐ、　　巳。

Ａｕｒｏｎ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　８１．７９０７　（１９
８４）　〕のＮ末端側の一部の塩基配列と一致する１７
塩基の合成りＮＡ５’−ＣＧＡＧＣＴＴＡＧＧＴ　Ａ　
ＣＴ　Ｔ　ＣＴ　−３’を３２ｐで才票識したプローブ
に４２℃で強く会合した１Ｍ株を選んだ〔グルンステイ
ン・ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−）１ｏｇｎｅｓｓ
）の方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　７２．３９６１　（１９７５）
　　）。

この菌株が持つプラスミドｐｃＤＩ、Ｌ−１のｃＤＮＡ
の全塩基配列を、Ｍ１３ファージを用いた、ディデオキ
シ・ンークエンス法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔａｌ：
Ｇｅｎｅ　１９．２６９　（１９８５）〕により決定し
た。その結果ｐｃＤＩＬ−１のｃＤＮＡは第２表に示し
たヒ）ＩＬ−１をコードしていることが判明した。

参考例２ＡＴＧベクターｐＴｒＳ２０の造成：第３図に示した手順に従い、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コド
ンの間の距離が１４塩基で、かつΔＴＧコドンの直後に
Ｓａｃ　Ｉサイトを有するＡＴＧベクターｐＴｒｓ２Ｑ
を造成した。

まず、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰｌｏ　　３■をＹ−１００緩衝液３０ｍ
に溶かし、制限酵素ＢａｎＩ［ｌと制限酵素ＮｒｕＩ　
にューイングランド・バイオラブズ社製）をそれぞれ６
単位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行った。この
反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約３．８Ｋｂ
のＤＮＡ断片（Ｂａｎ［−Ｎｒｕ　ｌ断片）約０．５■
を得た。

一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するた
めに下記のＤＮＡ’ＩＩンカーをトリエステル法により
合成した。

１９−ｍｅｒと１７−ｍａｒの合成りＮＡ　（各々１０
ピコモルずつ）を５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐ
Ｈ７，５）、１０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　２．５
ｍＭジチオスレイト−７ｕ％　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡお
よび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量２０４の溶液に溶かし
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３単位（宝酒造社製）
を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＫＹＰ　１０由来のＢａｎｍ−Ｎｒｕ
Ｊ断片（約３．８Ｋｂ）　　０．　ｌｘと上記のＤＮＡ
リンカ−約０．５ピコモルをＴ４リガーゼ緩衝液２０４
に溶かし、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４
℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ）らニジ−７（
Ｇｅｎｅ）　２　．７５　（１９７７）　〕を形質転換
し、Ａｐｒのコロニーを得た。このコロニーの培養菌体
からプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミド
の構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａｎ１ｌ［、Ｈｉｎｄ
■、Ｓａｃ■、Ｎｒｕ■で切断後、アガロースゲル電気
泳動により確認した。このプラスミドをｐＴｒｓ２０と
名付けた（第３図）。ｐＴｒＳ２０の１３ａｎ■、Ｈｉ
ｎｄＩＩ［サイト付近の塩基配列は下記のとおりである
ことをＭ１３ファージを用いたディデオキン・シーフェ
ンス法を用い確認した。

本発明によれば、発熱性を示さないＴＬ−１活性ペプチ
ドが供給され、抗感染症剤などの医薬としての用途が期
待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＬＩｃ１２造成のフローシート
を示す。第２図〔１）および（２）は、岡山・パーク法によるｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａ合成と該ＤＮＡを含む組換えプラスミドの
造成過程の概略を示す。第３図は、ＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０の造成工程を示
すフローシートである。特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図第２図（１）第２図（２）ベクター７′フイマーＤＮＡＴＴＴＴ　　　ｍＲＮＡ−−一− ＡＡＡＡ−−ｍ− ＴＴＴＴゆ、７ユエ、。ＩＣｃｃＣＣＣＡＡＡＡＤＮＡり人γ−ご第３図ｃｏＲＩ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトインターロイキン−１を酵素で処理して得ら
れ、インターロイキン−１活性を有し、かつ哺乳動物に
対して発熱作用を実質的に有しないポリペプチド。
（２）該酵素がアクロモバクター・プロテアーゼ I ま
たはスタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼ
である特許請求の範囲第１項のポリペプチド。
（３）下記アミノ酸配列を有するポリペプチドから選ば
れる特許請求の範囲第１項のポリペプチド。（ａ）【アミノ酸配列があります】（式Ａ−４）（ｂ）
【アミノ酸配列があります】（式Ｖ８−７）（ｃ）【ア
ミノ酸配列があります】（式Ａ−３）（ｄ）【アミノ酸
配列があります】（式Ａ−１０）（ｅ）【アミノ酸配列
があります】（式Ｖ８−１１）（式中記号に対応するア
ミノ酸は次のとおりである。Ａｌａ：アラニン、Ａｒｇ：アルギニン、Ａｓｎ：アス
パラギン、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｃｙｓ：システイ
ン、Ｇｌｎ：グルタミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｇｌ
ｙ：グリシン、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｉｌｅ：イソロイ
シン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｌｙｓ：リジン、Ｍｅｔ：メ
チオニン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｐｒｏ：プロリ
ン、Ｓｅｒ：セリン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｔｙｒ：チ
ロシン、Ｖａｌ：バリン）
（４）式Ａ−４、式Ｖ８−７、式Ａ−３、式Ａ−１０ま
たは式Ｖ８−１１で示されるポリペプチドをコードする
ＤＮＡ。