JPS61291598A - 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法
に関する。

〔従来の技術〕

カルシトニンは、Ｃ末端がアミド化された３２個のアミ
ノ酸からなるペプチドであり、高カルシウム血症、Ｐａ
ｇｅｔ　（ベージェット）病について治療効果が認めら
れている。このポリペプチドには、骨吸収抑制作用、骨
新生促進作用も確認されており老人性の骨粗鬆症に対し
ても有望視されている。

現在すでにカルシトニンは、ブタ、ウシ、ヒト、ラット
、ニワトリ、サケ、ウナギから分離され、それぞれ構造
が明らかにされている。

由来する生物種間におけるカルシトニンの血中での生理
活性を比較すると魚類の鯰後腺から得られるものは、哺
乳類の甲状腺由来のものに比較して約３０倍の比活性を
示し、効力の持続時間も長い。この理由として、例えば
サケカルシトニンにおいては、他のカルシトニンと較べ
て血中で不活性化されにくいことが、例えば、ｎ、ｃｏ
ｐｐ等、カルシトニン、プロシーディンゲス・オブ・セ
カンド・インターナショナル・シンポジウム（Ｃａｌｃ
ｉｔｏ−ｎｔｎ、　Ｐｒｏｃ、　２ｎｄ、　Ｉｎｔ、　
Ｓｙｍｐｏ、）ロンドン、ハイネマン２８１　（１９８
１）により報告されている。また、ウナギカルシトニン
は特に、活性が高いのみならずイン−ビトロにおける血
清中又は肝、腎等の臓器の抽出液中での安定性が極めて
高い。このため、魚類カルシトニンが特に医薬として使
用するのに有利である。現在治療用のカルシトニンとし
て市販されているものは、ブタ、サケ、ウナギのカルシ
トニンであるが、これらは生体から抽出したりまたは化
学的に合成することによって得られている。しかしその
生産量はわずかでありまた高価である。従って魚類カル
シトニンを経済的、且つ大量に製造することができる新
規な方法の開発が強く望まれている。更にカルシトニン
の生理活性を有し、より容易に製造し得るその誘導体の
開発もまた要望されている。

このような目的を達成するためには遺伝子操作技術を用
いる方法が最も好ましい。特開昭５８−２０３９５３に
はヒトカルシトニンの化学合成遺伝子と大腸菌における
その発現が記載されている。特表昭５８−５０１１２１
にはヒトカルシトニンの前駆体遺伝子が記載されている
。特表昭５９−５０１０９５にはヒトカルシトニンの化
学合成遺伝子とその発現について記載されている。また
、特表昭５９−５０１２４３には天然由来ヒトカルシト
ニン遺伝子及びその発現について記載されている。

しかしながら、魚類カルシトニン遺伝子又はその誘導体
の遺伝子の合成及び大腸菌における発現についてはまだ
記載されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この発明は、前記のごとく最も有望視されている魚類カ
ルシトニンの製造のための前駆体として使用することが
でき、且つそれ自体としてもカルシトニンの生理活性を
用する魚類カルシトニン誘導体、及びその製造方法を提
供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、次のアミノ酸配列： Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃ
ｙｓ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
ＧｉｎＴｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ、　Ｘ
　　Ｙ　　Ｇｌｙ　Ｚ　　ＧｌｙＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｙ （配列中、ＸはＡｓｎ又は＾ｓｐを表わし、ＹはＴｈｒ
又はＶａｌを表わし、そしてＺはＳｅｒ又はＡｌａを表
わす、）で表わされる魚類カルシトニン誘導体；及び前
記魚類カルシトニン誘導体をコードする遺伝子と他の蛋
白質をコードする遺伝子を含有しこれらの遺伝子を大腸
菌中で発現することができるプラスミドにより形質転換
された大腸菌を培養して該魚類カルシトニン誘導体と該
他の蛋白質とを含んで成る融合蛋白質を生成せしめ、こ
の融合蛋白質を回収し、回収された融合蛋白質を切断し
て前記魚類カルシトニンを遊離せしめ、そしてこれを採
取することを特徴とする前記誘導体の製造方法を提供す
ることにより解決される。

〔具体的な説明〕

Ａ０缶　カルシトニン誘 この発明の魚類カルシトニン誘導体はアミノ酸３２個か
ら成る魚類カルシトニンのＣ末端にさらに１個のグリシ
ン（Ｇｌｙ）が付加されたものであり、例えばサケカル
シトニン誘導体は次のアミノ酸配列（ＩＩ）： を有し、天然サケカルシトニン■の３２個のアミノ酸の
Ｃ末端に追加のアミノ酸であるグリシンを有する。

また、ウナギカルシトニン誘導体は次のアミノ酸配列（
■）： を有し、天然ウナギカルシトニンの３２個のアミノ酸の
Ｃ末端に追加のアミノ酸であるグリシンを有する。

しかしながら、この発明の魚類カルシトニン誘導体は前
記のアミノ酸配列（ｎ）で表わされるサケカルシトニン
誘導体、及び前記アミノ酸配列（Ｉ［［）で表わされる
ウナギカルシトニン誘導体に限定されるのではなく、一
般式（１）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基Ｘ、Ｙ
、及びＺの具体的な任意の組み合わせから成るすべての
カルシトニン誘導体がこの発明の範囲に属する。

Ｂ、魚類カルシトニン誘導体の製造 一般にカルシトニンのごとき比較的分子量の小さいペプ
チドを遺伝子工学的手法により大腸菌を用いて製造する
には、まず目的ペプチドと他の蛋白質との融合蛋白質を
コードする遺伝子を用いて融合蛋白質を生成せしめ、次
にこれを切断して目的とするペプチドを得るのが得策で
あるといわれている。

このため本発明においては、まず、魚類カルシトニン誘
導体をコードする遺伝子と他の蛋白質、例えばメタビロ
力テカーゼ又はその部分をコードする遺伝子とを連結し
、この遺伝子を含有する大腸菌用発現プラスミドを作製
し、このプラスミドにより形質転換された大腸菌を培養
することによって融合蛋白質を生成せしめる。この融合
蛋白質は主として大腸菌の菌体内に蓄積されるため、培
養物からまず培養菌体を分離し、次にこの培養菌体から
前記融合蛋白質を回収し、最後にこの融合蛋白質を切断
して目的とする魚類カルシトニン誘導体を遊離せしめて
そしてこれを採取精製する。

１、　サケカルシトニ・ン誘導体の遺伝子系の作製（１
）　サケカルシトニン誘導体構造遺伝子の合成サケカル
シトニン誘導体をコードする構造遺伝壬申には５個の反
復するロイシン（Ｌｅｕ）を含む領域が存在し、このよ
うな強いホモロジーを有する二重鎖ポリヌクレオチドは
合成が困難であると言われていた（例えば、Ｊ、ウイン
ダス等、ニュクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−ｅａｒｃｈ）、　１０．
６６３９　（１９８２）参照〕。

このアミノ酸配列には、遺伝暗号の縮重の故に、この蛋
白質の暗号を構成するヌクレオチド配列が多数存在する
。この様な場合には大腸菌の中でよく使用されている、
あるいは高発現をしている蛋白質において好んで用いら
れているトリヌクレオチドコドンを使用することが一般
にすすめられている。しかしサケカルシトニン誘導体の
ように、同一アミノ酸が反復して存在する領域を持つ構
造遺伝子の場合には、特定のヌクレオチド配列の選択で
は目的とする遺伝子を合成することはできない。このた
め本発明においては、第一に構造遺伝子の合成に係るオ
リゴヌクレオチド相互のハイブリダイゼーションの強さ
を理論的に求め、第二に好ましくないハイブリダイゼー
ションの自由エネルギーを上回るような値を、オリゴヌ
クレオチドの正しい相補的な接続部位に与えるようにア
ミノ酸のコドンを選択することによって好ましいヌクレ
オチド配列を例えば次のように決定する。

正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ−負鎖：
　ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ−ＴＧＣＧＴ
ＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ−ＡＣＧＣＡＡＧＡ
ＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ−ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡ
ＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ−ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴ
ＣＧＡＣＧＴＴ−ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＡ
ＣＡＣＴ−ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＧ
Ａ−ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧ
ＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡこの遺伝子のヌクレオチド
配列の最初にメチオニンのコドンを、末端に終止コドン
を付加することが好ましく、特に終止コドンは複数使用
することが好ましい。また配列の両端及び内部にいくつ
かの制限酵素認識部位及び切断部位を組み入れることが
好ましい。上流側末端の制限酵素切断部位のヌクレオチ
ド配列を選択することにより、構造遺伝子を効果的にｍ
ＲＮＡへ転写させることができる。

制限酵素切断部位を付加した好ましい具体例を第１図に
示す。

上記のような遺伝子の合成に当っては、（１）該遺伝子
の塩基配列の部分を構成する複数のオリゴヌクレオチド
フラグメントを合成し、（２）該フラグメントを連結す
ることによって複数のサブブロックを作製し、（３）該
サブブロックを連結するのが好ましい。

以下に構造遺伝子の人工合成における配列の確立及び製
造法についてさらに詳細に述べる。

大腸菌内で、高発現される蛋、白質において好んで用い
られるトリプレットコドン（例えば、Ｒ９Ｇｒａｎｔｈ
ａｍ等ニュークレイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　　９４３
　（１９８１）参照）をサケカルシトニン誘導体のアミ
ノ酸配列にあてはめて好ましい二本鎖ヌクレオチド配列
を選び、さらにそのＮ末端に遺伝子の転写と翻訳の開始
をコードする部分、必要に応じて挿入された融合さるべ
きポリペプチドをコードする部分、及びメチオニンのコ
ドンを、Ｃ末端に翻訳停止コドンを、更にまたプラスミ
ドベクターに挿入するためのヌクレオチド配列を両端に
付加する。この二本鎖ヌクレオチド配列を適当な長さの
オリゴヌクレオチドに分割する。

本発明者らは、オリゴヌクレオチドの接着と結合にかか
わる反応、アニーリング反応とライゲーシッン反応、を
常に好結果に導く構造遺伝子のヌクレオチド配列を見い
出した。また、結合を行うために集合された複数のオリ
ゴヌクレオチド相互において、設定された接着部位のハ
イブリダイゼーションの自由エネルギーが他のすべての
好ましくないクロスハイフ゛リダイゼーションを与える
自由エネルギーより充分に負の値であれば反応において
常に好結果が得られることを本発明者らは見い出した。

ハイブリダイゼーションの自由エネルギーの値は、ＲＮ
Ａのヌクレオチド配列におけるアテエニュエーター構造
のハイブリダイゼーションの強さを推定する計算方法〔
例えば、１．　Ｔｉｎｏｃｏ、　Ｊｒ等ネイチュアー・
二ニー・バイオロジー（ＮａｔｕｒｅＮｅｗ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）　２４６４０　（１９７３）参照）を用いて求
められる数値で代替することが行われているようである
。本発明者らは、コンピューターを用いて第一に上記に
設定した７塩基からなるオリゴヌクレオチドの接着部位
についてハイブリダイゼーションの数値を求め、次に前
記のようにして選んだ二本鎖ヌクレオチド配列を構成す
るオリゴヌクレオチド相互のクロスハイブリダイゼーシ
ョンについて数値を求めた。両者の数値の比較により、
クロスハイブリダイゼーションが正しい接着に優先する
と判定された部分について、アミノ酸のトリプレットコ
ドンを縮重する他のコドンに置き換え、二本鎖ヌクレオ
チド配列を修正した。このような修正操作を繰り返すこ
とにより好ましいヌクレオチド配列を前記のように設定
した。

この構造遺伝子は、クロスハイブリダイゼーションを少
なくするために例えば第２図に示すようなサブブロック
を作製して段階的に集合、連結することか好ましい。サ
ブブロック相互の接着部位としては、自由エネルギーの
負の値の大きい部位を選ぶことが好ましい。

設計されたオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル法
により小ユニットから作り上げる方法、及び酵素を用い
てオリゴヌクレオチドを連結していく方法は公知である
〔例えば、■、　Ｈｓｉｖｎｇ等、ニュークレイツク・
アシズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ）　６　１３７１　（１９７９）　、および
Ｋ。

Ａｇａｒｗａｌ等、ネイチェアー（Ｎａｔｕｒｅ）　　
２２７　２７（１９７０）参照〕。オリゴヌクレオチド
を合成するためには固相ホスホトリエステル法を用いる
ことが好ましい。

１例として、オリゴヌクレオチドし−３１を合成する方
法を示せば、まず樹脂担体上に３′位の水酸基を用いて
固定されたベンゾイルデオキシシチジン（以下デオキシ
シチジンを単にシチジンと記載する。デオキシグアノシ
ン、デオキシアデノシンもまた同じ）の５′位の水酸基
と、核酸塩基、インターヌクレオチドリン酸基と５′位
の水酸基が保護されたダイマーユニットシチジン−グア
ノシン（ＣＧ）のグアノシンの３′位の水酸基とを、リ
ン酸基の活性化剤を用いて縮合させる。

次に新しく付加したシチジンの５′位の水酸基の保護基
を除去してダイマーユニットアデノシン−アデノシン（
ＡＡ）と縮合させる。このようにして以下、ＡＣ，ＣＣ
，ＣＣ，ＴＴ、、ＡＣのダイマーユニットを順次縮合さ
せることによって保護基を含むオリゴヌクレオチドし−
３１が合成される。

オリゴヌクレオチドし−３１は、担体樹脂につながるベ
ンゾイルシチジンの３′位の、核酸塩基、インターヌク
レオチドリン酸基とオリゴヌクレオチド鎖の先端のアデ
ノシンの５′位に存在する保護基をすべて除去すること
によって得られる。

オリゴヌクレオチドを連結して構造遺伝子を合成するた
めには、酸素反応を用いることが好ましい。酵素ポリヌ
クレオチドキナーゼとアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）
・を用いてオリゴヌクレオチドにリン酸基を付加する。

このオリゴヌクレオチドの複数を一旦加熱しさらに再冷
却することによって物理的に凝集させ、酵素、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドリガーゼを作用させて、オリゴヌクレオチ
ド相互の５′末端のリン酸基と３′末端の水酸基とを縮
合させることにより遺伝子の一部を構成するサブブロッ
クを合成することができる。構造遺伝子はサブブロック
相互を同様に縮合させることにより製造できる（第３図
）。

なお、この発明において、サケカルシトニン誘導体の遺
伝子をＣ７０と称する。

プラスミドｐＨ７２中にサケカルシトニン誘導体構造遺
伝子ＣＴ２を含有するプラスミドをｐＳＣＴ　２と称す
る。

このようにして得たプラスミドｐＳＣＴ　２をＥ、コリ
菌株ＲＲＩに形質転換することによって、それぞれ形質
転換株を得る。プラスミドｐＳＣＴ　２を含有する形質
転換株をＲＲＩ／ｐＳＣＴ２と称する（第４図）。

この菌株ＲＲＩ／　ｐＳＣＴ　２は微工研菌寄第７７７
５号（ＦＥＲＭＰ−７７７５）として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。

（２）　　融Ａ　白　をコードするＤＮＡ一般にカルシ
トニンのような低分子量ペプチドを大腸菌で生産するに
は、まず他の蛋白質と融合した安定な高分子量蛋白質と
して採取し、これをイン−ビトロで切断して所望の低分
子量ペプチドを得ることが得策であると言われている。

このような融合蛋白質を構成する蛋白質として、本発明
のサケカルシトニン誘導体の生産においては精製の便利
等の観点からメタピロカテカーゼ又はその部分を用いる
のが好ましい。また、融合蛋白質を採取した後にこれを
切断して目的とするカルシトニン誘導体を得るために切
断部位、すなわちカルシトニン誘導体の第１アミノ酸と
メタピロカテカーゼ蛋白質のＣ末端アミノ酸の間にメチ
オニンを介在せしめるのが好ましい。

従って、本発明においては、この部分のＤＮＡ断片とし
て、例えばサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子
及びメチオニンのコドンＡＴＧを介してその上流に位置
するメタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分からなるＤ
ＮＡ断片を用いることができる。このメタピロカテカー
ゼ遺伝子又はその部分は、高い翻訳効率を得るため、メ
タピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列と、メタピロカテカ
ーゼ構造遺伝子又はその部分とから成ることが好ましい
。

メタピロカテカーゼ構造遺伝子部分の大きさは広範囲に
変えることができ、例えばメタピロカテカーゼの約３５
〜２００個のアミノ酸をコードする構造遺伝子を使用す
ることができる。この発明にお　　　゛いて、メタピロ
カテカーゼの３７個、９８個、１４２個、及び１９７個
のアミノ酸をコードする構造遺伝子を用いた場合、いず
れも本発明のサケカルシトニン誘導体のペプチドを含む
融合蛍白質が発現されることが確認された。

（３）　　又里ブ立玉ｌヱ 本発明の発現プラスミドは、大腸菌又はファージのプロ
モーター系、前記融合蛋白質遺伝子、及びターミネータ
−系をこの順序で含む大腸菌プラスミドである。プロモ
ーター系として、例えばｌａｃＵＶ５系、ＰＬ系、ｔａ
ｃ系等を使用することができ、又ターミネータ−として
例えばλＬ　Ｌ１％　ｔｒｐ　ａ等を使用することがで
きる。

具体的には、このような発現プラスミド系として、例え
ば次の表に示すものを挙げることができｐＬＭＣ２ｌａ
ｃＵＶ５　　λｔＬ、　　　　２３１ｐＰＭＣ２Ｐ　ｔ
　　　　λｊ＋、＋　　　　２３１ｐＴＭＣ２ｔａｃ　
　　　ｔｒｐ　ａ　　　　１７６ｐＴＭＣ２２ｔａｃ　
　　　ｔｒｐ　ａ　　　　　７１上記のごとき発現プラ
スミドにより融合蛋白質を発現せしめるために使用する
宿主大腸菌として、例えばＲ８７９１株、８８１０１株
、ＪＭ１０３株、０６００株、ＲＲＩ株、ＳＭ３２株、
Ｗ３１１０株等を使用することができる。

（５）　　　　ブースミドの　　　び　　の　量本発明
において前記のプラスミドを作製する場合、カルシトニ
ン誘導体構造遺伝子を含有する前記プラスミドｐｓｃｔ
　２から適当な制限酵素によって該構造遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を切り出し、これを適当な発現用プラスミドに
組み込む。

本発明の発現プラスミドの作製の系統図を第５図及び第
６図に示す、これらの図中、（ｐＳＣＴ　２　）はカル
シトニン誘導体構造遺伝子を含む出発プラスミドであり
、箱で囲んだプラスミドは本発明の発現プラスミドであ
る。

プラスミドｐｓＬＭＫ１はプロモーター１ａｃＬＩＶ５
及びメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有する
プラスミドであり、このプラスミドを有する大腸菌株エ
シェリシャ・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　１（ＢＩＯＩ　／ｐｓＬＭＫＩＪ（ＦＥＲＭ　Ｐ
−７６１６トして、Ｗ３１１０／　ｐｓＬＭＫＩがＦＥ
ＲＭ　Ｐ−７６１７として、ＲＲＩ／ｐｓＬＭＫ１がＦ
ＥＲＭ　Ｐ−７６１８として、そしてＲＢ７９１／ｐｓ
ＬＭＫ１がＦｆ！ＲＭ　Ｐ−７６１９としてそれぞれ工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

プラスミドｐＨ７３はプロモーターＰＬおよびメタピロ
カテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有するプラスミドで
あり、これを有する大腸菌エシェリシ中・コリ　　（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　　　ＨＢ　　１
０１／ｐＨＴ３が　ＦＥＲＭ　　Ｐ−７７７６として、
Ｃ６００／　ｐＨＴ３がＦＥＲＭ　Ｐ−７７７７として
、そして−３１１０／ｐＨＴ３がＦＥＲＭ　Ｐ−７７７
８としてそれぞれ前記寄託機関に寄託されている。

プラスミドｐｓＴ２１はトリプトファン・プロモーター
／オペレーター系（ｔｒｐ　Ｐｌｏ）及びリーダー領域
を含有するプラスミドである。

プラスミドｐＴｃｃＭ１はｔａｃプロモーター及びメタ
ピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有するプラスミ
ドであり、これを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＲＢ７９１／ｐ
ＴｃｃＭ１がＦＥＲＭＰ−７７８０として、そしてＪＭ
１０３／　ｐＴｃｃＭｌがＦＥＲＭ　Ｐ−７７８１とし
て、前記の寄託機関に寄託されている。

プラスミドｐＵＣ９は公知のプラスミドである（Ｊ、ビ
エイラ及びＪ、メッシング、ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｖｏｆ
ｆｉ　１９，２５９−２５８頁、（１９８２）　）。

プラスミドＬＭＣ２ 実施例１　〔第５図、第７図（Ａ）〕に詳細に記載する
方法により、プラスミドｐｓＬＭＫ１と、ｐＳＣＴ　２
とから発現プラスミドｐＬＭＣ２を作製する。なお、プ
ラスミドｐＳＣＴ　２は実施例１２に記載する方法によ
り作製する。このプラスミドｐＬＭＣ２にはｌａｃＵＶ
５プロモーター及びそれに続くメタピロカテカーゼ遺伝
子（Ｃ２３０）の部分の下流にフレームが整合するよう
にサケカルシトニン誘導体の遺伝子が組み込まれており
、さらにその下流にλｔＬＩターミネーターが存在する
。メタピロカテカーゼの構造遺伝子とサケカルシトニン
誘導体の構造遺伝子との連結部位は第７図（Ｂ）に示す
塩基配列を有する。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタピロカテカーゼ
の１９７個のアミノ酸、メチオニン、及びサケカルシト
ニン誘導体の３３個のアミノ酸（合計２３１個のアミノ
酸）から成る融合蛋白質をヨードする。

このプラスミドを含む大腸菌エシェリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ＪＭ１０３　／ｐＬＭ
Ｃ２は、工業技術院微生物工業技術研究所に徽工研菌寄
第８２２０号（ＦＥＲＭ　Ｐ〜１１１２２０）として寄
託されている。

このプラスミドにより大腸菌ＲＲＩを形質転換し、ＬＢ
培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃ
ｔｏｐｙｒａ−ｎｏｓｉｄｅ　；以下ＩＰＴＧと略す）
存在下及び非存在下で培養し、菌体を集め、これらの菌
体から蛋白質を抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけたところ、Ｉ　ＰＴＧ存在下で約２５．
０００ダルトンの蛋白質が誘導されているこＸが確認さ
れた。また、この蛋白質はサケカルシトニン■に対する
抗体と反応することがウェスタンプロット法により確認
され、前記約２５．０００ダルトンの発現生成物がメタ
ピロカテカーゼの部分とサケカルシトニン誘導体との融
合蛋白質であることが確認された。

プラスミドＰＭＣ２ 実施例２（第５図、第８図）に詳細に記載する方法によ
りプラスミドｐＬＭＣ２とｐＨＴ３１　とから発現プラ
スミドｐＰＭＣ２を作製する。なお、プラスミドｐＨ７
３１はプラスミドｐＨＴ３から参考例２に記載する方法
により作製する。このプラスミドはＰＬプロモーター及
びそれに続くメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）の
部分下流にフレームが整合するようにサケカルシトニン
誘導体遺伝子が組み込まれており、さらにその下流にλ
ｔＬターミネーターを有する。このプラスミドの構造遺
伝子部分はメタピロカテカーゼの１９７個のアミノ酸、
メチオニン、及びサケカルシトニン誘導体の３３個のア
ミノ酸（合計２３１個のアミノ酸）からなる融合蛋白質
をコードする。

このプラスミドを含む大腸菌エシェリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＲＲＩ／ｐＰＭＣ２
は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８
２２２号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８２２２）として寄託されて
いる。

このプラスミドｐＰＭＣ２により形質転換された大腸菌
は分子量約２５．０００ダルトンのメタピロカテカーゼ
の部分とサケカルシトニン誘導体とから成る融合蛋白質
を生産することが前記のようにして確認された。

プラスミドＴＭＣ２ 実施例７（第６図、第１１図）に詳細に記載する方法に
よりプラスミドｐＴＣＣＭＡＸとｐＵｃＴ２２とから発
現プラスミドｐＴＭＣ２を作製する。なお、プラスミド
ｐＴＣＣＭＡＸは実施例６（第６図、第１１図Ａ）に記
載する方法により、プラスミドＩ）ＴＣＣＭＩから作製
する。またプラスミドｐＵｃＴ２２は実施例３〜５、及
び参考例３（第６図、第９図、第１０図、第１５図）６
２記載する方法によりプラスミドｐＳＣＴ　２、ｐＵＣ
９１，ｐｓＴ２１、及びｐＢＲ３２２より作成する。プ
ラスミドｐＴＭＣ２にはｔａｃプロモーター及びそれに
続くメタピロカテカーゼ遺伝子の部分の下流にフレーム
が整合するようにサケカルシトニン誘導体の構造遺伝子
が組み込まれており、さらにその下流にｔｒｐ　ａター
ミネータ−が存在する。メタピロカテカーゼの部分をコ
ードする領域とサケカルシトニン誘導体をコードする領
域との連結部分の塩基配列を第１１図Ｂに示す。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタピロカテカーゼ
の１４２個のアミノ酸、メチオヨン、及びサケカルシト
ニンの３３個のアミノ酸（合計１７６個のアミノ酸）か
ら成る融合蛋白質をコードする。

このプラスミドを含む大腸菌エシェリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３／ｐＴＭ
Ｃ２は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
８２２３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８２２３）として寄託され
ている。

プラスミドＴＭＣ２２ 実施例８及び９（第６図、第１２図）に詳細に記載する
方法により、プラスミドｐＴＭｃ１２とプラスミドｐＴ
ＣＣＭＡＸとから発現プラスミドｐＴＭＣ２２を作製す
る。このプラスミドｐＴＭＣ２２にはｔａｃプロモータ
ー及びそれに続くメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０
）の部分の下流にフレームが整合するようにサケカルシ
トニン誘導体の遺伝子が組み込まれており、さらにその
下流にｔｒｐ　ａターミネータ−が存在する。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタピロカテカーゼ
の３７個のアミノ酸、メチオニン、及びサケカルシトニ
ン誘導体の３３個のアミノ酸（合計７１個のアミノ酸）
から成る融合蛋白質をコードする。

発現プラスミドｐＴＭＣ３２ 実施例１０（第６図、第１．３図）に詳細に記載する方
法により、プラスミドｐＴＭｃ１２とｐＴＭＣ２２とか
ら発現プラスミドｐＴＭＣ３２を作製する。このプラス
ミドｐＴＭＣ３２にはｔａｃプロモーター及びそれに続
くメタピロカテカーゼ遺伝子（ｃ２３０）の部分の下流
にフレームが整合するようにサケカルシトニン誘導体の
遺伝子が組み込まれており、さらにその下流にｔｒｐ　
ａターミネータ−が存在する。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタピロカテカーゼ
の９８個のアミノ酸、メチオニン、及びサケカルシトニ
ン誘導体の３３個のアミノ酸（合計１３２個のアミノ酸
）から成る融合蛋白質をコードする。

このプラスミドを含む大腸菌エシェリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＪＭ１０３／ｐＴＭ
Ｃ３２は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第８２２１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８２２１）として寄託
されている。

プラスミドｐＴＭＣ２、ｐＴＭＣ２２又は９７ＭＣ３２
のいずれかによって形質転換された大腸菌Ｒ８７９１株
のそれぞれを５０μｇ　／　ｍ　７！のアンピシリンを
含むＬＢ培地で一夜培養し、この培養液０．０５ｍｅを
５ｍｆの同培地に加え、３７℃にて振とう培養を行った
。

いずれの菌株についてもＩ　ＰＴＧにより誘導を行う場
合と行わない場合について試験した。誘導を行う場合に
は終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた。培養
は合計８時間行った。

培養後、培養液菌体を集め、その全蛋白質を抽出し、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。

その結果、ｐＴＭＣ２を有する株では分子量約１９、０
００．９７ＭＣ３２を有する株では分子量約１４，００
０（７）それぞれの蛋白質が、ＩＰＴＧの添加により顕
著に誘導されていることが見出された。

２、　ウナギカルシトニン誘導体遺伝子系の作製＋１１
　　ウナギカルシトニン誘導体構造遺伝子の作製 前記のごとく、ウナギカルシトニン誘導体においてはサ
ケカルシトニン誘導体中の２６位のアミノ酸であるアス
パラギンがアスパラギン酸に、２７位のアミノ酸である
スレオニンがバリンに、そして２９位のアミノ酸である
セリンがアラニンに置き換えられている。このように、
サケカルシトニン誘導体のアミノ酸配列と比べて３個の
アミノ酸が異なるに過ぎないウナギカルシトニン誘導体
の遺伝子の合成は、すでに合成されているサケカルシト
ニン誘導体遺伝子を、公知の変異誘発法、例えばオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いる特異的塩基置換変異（
Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）法により処理す
ることにより行うのが有利である。従って、本発明にお
いては、上記サケカルシトニン誘導体遺伝子に特異的塩
基置換変異をかけることにより、サケカルシトニン誘導
体の第２６位、第２７位及び第２９位のアミノ酸である
アスパラギン、スレオニン及びセリンのコドン、すなわ
ちＡＡＧ、ＡＣＴ及びＴＣＴをそれぞれアスパラギン酸
、バリン及びアラニンのコドン、例えばＧＡＣ，ＧＴＴ
。

ＯＣＴに変え、ウナギカルシトニン誘導体の遺伝子を得
る。これらのコドンは塩基配列中で相互に近接している
ため、１つのプライマーオリゴヌクレオチド、例えば次
の配列： ５’　ＴＧＧＴ（重ＴＧＧＴＴ並匹ＣＣＡＴＧＣＧＣ３
’Ａｌａ　　ＶａｒＡｓｐ を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて前記の変異を
行うことができる。

この変異処理は例えば次の様にして行われる。

すなわち、前記プラスミドｐＳＣＴ　２を制限酵素１匹
■及び５ａｌＩで切断して０．６　ｋｂｐの断片を得る
。

他方、ファージＭ１３ｎ＋ｐ９の２本鎖ＤＮＡを盈懸■
及び５ａｌＩで切断することにより２．７　ｋｂｐの断
片を得る。これらをＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し
、これを用いて大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、この形
質転換体を培養することにより１本鎖組換体ファージＤ
ＮＡを得る。こうして得られた、サケカルシトニン誘導
体遺伝子のアンチコーディング鎖（負鎖）を含有する１
本鎖ＤＮＡを得る。この組換体ファージをＣＴＭ３１と
称する。このファージ１本鎖ＤＮＡを鐘形として前記プ
ライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを形成した後これを精製
し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０３を形質転換する０次
に、ファージプラークを、例えばｓｔｐで標識された次
の合成オリゴヌクレオチドプローブ： ５’　ＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ　３’を用いて
スクリーニングし、変異体ファージを得る。この塩基配
列を決定し、目的とする変異が導入された遺伝子（ウナ
ギカルシトニン誘導体遺伝子）を含有するファージを選
択し、これをＣ７Ｍ４１と称する。

こうして得られた、ウナギカルシトニン誘導体をコード
する遺伝子は次の塩基配列： 圧填：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ−負鎖：
　ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ−ＴＧＣＧＴ
ＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ−ＡＣＧＣＡＡＧＡ
ＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ−ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡ
ＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ−ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴ
ＣＧＡＣＧＴＴ−ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＡ
ＣＧＴＴ−ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡ
Ａ−ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＧ
ＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡを有する。

なお、サケカルシトニン誘導体遺伝子（ファージＣＴＭ
３１の部分）、ウナギカルシトニン誘導体遺伝子（ファ
ージＣＴＭ４１の部分）、プライマーオリゴヌクレオチ
ド、及びプローブオリゴヌクレオチドのそれぞれの塩基
配列を、サケカルシトニン誘導体及びウナギカルシトニ
ン誘導体のアミノ酸配列と共に第１６図に示す。

（２）、融合　白　をコードするＤＮＡ断前記のごとく
、一般にカルシトニンのような低分子量ペプチドを大腸
菌で生産するには、まず他の蛋白質と融合した安定な高
分子量蛋白質として採取し、これをイン−ビトロで切断
して所望の低分子量ペプチドを得ることが得策であると
言われている。このような融合蛋白質を構成する蛋白質
として、本発明のウナギカルシトニン誘導体の生産にお
いては精製の便利等の観点からメタピロカテカーゼ又は
その部分を用いるのが好ましい。また、融合蛋白質を採
取した後にこれを切断して目的とするカルシトニン誘導
体を得るために切断部位、すなわちカルシトニン誘導体
の第１アミノ酸とメタピロカテカーゼ蛋白質のＣ末端ア
ミノ酸の間にメチオニンを介在せしめるのが好ましい。

従って、本発明においては、この部分のＤＮＡ断片とし
て、例えばウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝
子及びメチオニンのコドンＡＴＧを介してその上流に位
置するメタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分からなる
ＤＮＡ断片を用いることができる。このメタピロカテカ
ーゼ遺伝子又はその部分は、高い翻訳効率を得るため、
メタピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列と、メタピロカテ
カーゼ構造遺伝子又はその部分とから成ることが好まし
い。

メタピロカテカーゼ構造遺伝子部分の大きさは広範囲に
変えることができる。

（３）発現プラスミド 本発明の発現プラスミドは、大腸菌プロモーター系、及
び前記融合蛋白質遺伝子をこの順序で含む大腸菌プラス
ミドである。プロモーター系として、例えばｌａｃＵＶ
ｓ系、Ｐｔ系、ｔａｃ系等を使用することができる。

具体的な発現プラスミドの例として、例えば発現用プラ
スミドｐＴｃｃＭ１に前記ファージＣＴＭ４１のウナギ
カルシトニン誘導体遺伝子を挿入することにより得られ
る発現プラスミドｐＣＴＭ　４を挙げることができる。

プラスミドｐＴｃｃＭ１はｔａｃプロモーター及びその
下流にメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有す
るプラスミドであり、これを含有する大腸菌ニジエリシ
ャ’コリ（ＩＩ！５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｒ
Ｂ７９１／ｐＴｃｃＭ１がＦｌ！ＲＭ　Ｐ−７７８０と
して、そしてＪＭ１０３／ｐＴｃｃＭ１がＦＥＲＭＰ−
７７８１として、それぞれ工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。

プラスミドｐＣＴＭ　４の作製に当っては、第１７図（
Ａ）に示すように、ウナギカルシトニン誘ｉ体遺伝子（
図中ＣＴで示す）を含有するファージＣＴＭ４１の２本
鎖型をＥｃｏＲＩで消化することによりウナギカルシト
ニン遺伝子の０位のメチオニンコドンより上流であって
その近傍に位置するＥｃｏＲＩ部位を切断し、フィル−
インによって平滑化し、さらにウナギカルシトニン誘導
体遺伝子の下流に存在する５ａｌｌ部位を５ａｌｌによ
り切断する。次にウナギカルシトニン誘導体遺伝子を含
む５９０ｂ９の小断片を単離する。

他方、プラスミドｐＴｃｃＭ１を人■■で消化すること
により該プラスミド中のメタピロカテカーゼ遺伝子（図
中０２３０で示す）の中間に位置するＡｖａ１部位を切
断し、フィル−インにより平滑化する。

次に、メタピロカテカーゼ遺伝子の下流に位置する下刃
」部位を５ａｌｌにより切断し、メタピロカテカーゼ遺
伝子の下流部分が除去された２９４０ｂｐの大断片を単
離する。

次に、これらの両断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
し、これを用いて大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換し、ウ
ナギカルシトニン誘導体遺伝子が適切に挿入されたプラ
スミドを含有するクローンをコロニーハイブリダイゼー
ション、塩基配列の決定等により選択する。このような
プラスミドの１つをｐＣＴＭ　４と称する。このプラス
ミド中のウナギカルシトニン誘導体遺伝子（Ｃ７Ｍ４１
由来）の上流部とメタピロカテカーゼ遺伝子（ｐＴＣＣ
Ｍ　１由来）の下流部との連結領域の塩基配列を第１７
図（Ｂ）に示す。

このプラスミドｐＣＴＭ　４はｔａｃプロモーターの支
配下にメタピロカテカーゼのアミノ酸及びその下流のウ
ナギカルシトニン誘導体の３３アミノ酸からなる融合蛋
白質（合計１７４アミノ酸）をコードする遺伝子を含有
する。このプラスミドを含有する大腸菌エシェリシャ・
コリ　（Ｅｃｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｔ　ｉ）　ＪＭ
１０３／ｐＣＴＭ４は、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第８２３９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８２３９
）として寄託されている。

３８　　その他のカルシトニン誘導体の遺伝子系の作製 以上、サケカルシトニン誘導体の遺伝子系、及びサケカ
ルシトニン誘導体の構造遺伝子から出発するウナギカル
シトニン誘導体の遺伝子系の作製について記載したが、
同様にして一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中のＸ
　、　Ｙ、及びＺに、この一般式（Ｉ）において定義さ
れている具体的なアミノ酸を適用することにより規定さ
れる本発明の範囲に属する各種のカルシトニン誘導体の
遺伝子系を作製することができる。すなわち、本発明の
ウナギカルシトニン誘導体の構造遺伝子は、サケカルシ
トニン誘導体の構造遺伝子中の該当部分（第２６位、第
２７位及び第２９位のアミノ酸をコードする部分）に特
定のブライマーオリゴヌクレオチドを用いて特異的塩基
変換変異をかけることによって作製したが、適切な塩基
配列を有するプライマーオリゴヌクレオチドを用いるこ
とによって、該当部分の塩基配列を任意に変え、任意の
カルシトニン誘導体の構造遺伝子を作製することができ
る。

次に、このようにして作製された構造遺伝子を、例えば
前記のサケカルシトニン誘導体遺伝子又はウナギカルシ
トニン誘導体遺伝子と同様に操作して発現プラスミドを
作製することができ、そしてこのようにして作製された
プラスミドにより形質転換された大腸菌を用いて、後で
サケカルシトニン誘導体及びウナギカルシトニン誘導体
について詳細に記載する方法と同様にして、一般式（Ｉ
）により定義された任意のカルシトニン誘導体を製造す
ることができる。

前記の各種の発現プラスミドを大腸菌に導入することに
より融合蛋白質生産性の大腸菌株を得ることができる。

このための宿主として、例えばＲ８７９１株、ＪＭ１０
３株、Ｗ３１１０株、ＲＲＩ株、ＳＭ３２株等を使用す
ることができ、例えばプラスミドｐＬＭＣ２を用いる場
合の宿主としては一３１１０株及びＲ８７９１株が好ま
しい。

培養は常法に従って、例えばＬＢ培地中で好気的条件下
で行う。目的プラスミドを含有する宿主を維持するため
、培地中にはアンピシリンを例えば５０μｇ　／　ｍ　
１程度添加するのが好ましい。菌体濃度が所望濃度、例
えば５５０ｎｍにおける光学濃度０．３〜０．６に達し
たとき誘導剤として、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ　
−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰ
ＴＧと略す〕を、例えば最終濃度が１ｍＭとなるように
添加し、さらに数時間、例えば２〜８時間培養する。

培養終了後、遠心分離、濾過等の常法に従って菌体を分
離し、所望によりこの菌体を適当な緩衝液、例えば５０
ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７，
５により洗浄する。次にこの菌体を、リゾチーム処理、
超音波処理等の常法に従って破砕し、遠心分離により沈
澱画分を回収する。

所望によりこの沈澱を例えば５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液ｐＨ７，５に再懸濁し、再度遠心分離して沈澱を回
収することにより洗浄する。

このような処理により、大部分の目的融合蛋白質が沈澱
画分中に回収され、夾雑蛋白質が上清画分中に溶存し、
除去される。このような簡単な操作によって目的とする
融合蛋白質を夾雑蛋白質から分離することができること
が、魚類カルシトニン誘導体をメタピロカテカーゼとの
融合蛋白質として発現させるこの発明の大きな特徴の１
つである。

次に、こうして得られた不溶性画分をさらに精製するた
め、塩酸グアニジン水溶液に溶解し、この溶液を透析し
て塩酸グアニジンを除去することにより融合蛋白質を沈
澱せしめ、遠心分離等の方法により回収する。所望によ
り、この沈澱を塩酸グアニジン溶液に再熔解し、クロマ
トグラフィー、例えばセファデックス０７５カラムクロ
マトグラフイーによりさらに精製することができる。

次に、このようにして回収した融合蛋白質を、そのメチ
オニン部分において常法に従ってＣＮＢｒにより切断し
、目的とする魚類カルシトニン誘導体を遊離せしめる。

最後に、この魚類カルシトニン誘導体を、常法に従って
精製する。この精製においては１１例えばＣＩ８カラム
クロマトグラフィー、ＣＪＲＰカラムクロマトグラフィ
ー、ＴＳＫ　Ｇ２０００　Ｓ−カラムクロマトグラフィ
ー等が適当である。

Ｃ，３カルシトニンの　　・ アミノ酸分析の結果を次の表に示す。

以下余白 表中Ｇｕｙの理論値はＣ末端にＧｕｙを有するものとし
た場合の値である。本発明により得られたペプチドのア
ミノ酸組成は目的のサケカルシトニン誘導体の計算値と
よく一致した。

またアミノ酸シーケンサ−によりアミノ酸配列の決定を
行ったところ、すべてのアミノ酸配列が目的物のそれと
同一であることが確認された。

（２）　　　製されたウナギカルシトニン法律の扼 アミノ酸分析の結果を次の表に示す。

以下余白 表中Ｇｌｙの理論値はＣ末端にＧｌｙを有するものとし
た場合の値である。本発明により得られたペプチドのア
ミノ酸組成は文献記載のウナギカルシトニンに残基のグ
リシンが付加したもののそれとよく一致した。

またアミノ酸シーケンサ−によりアミノ酸配列の決定を
行ったところ、そのアミノ酸配列が予想されたウナギカ
ルシトニン誘導体のそれと同一であることが確認された
。

（３）魚類カルシトニン誘導体の生理活性本発明の魚類
カルシトニン誘導体はそれ自体としてカルシトニンとし
ての生理活性を有する。例えばサケカルシトニン誘導体
の活性の強さは哺乳動物に対してサケカルシトニンの１
／７程度でヒトカルシトニンと同等又はそれ以上である
。従って本発明の魚類カルシトニン誘導体は、医薬とし
て有用である。この生理活性は次の様にして証明された
。

Ｃｒｊ　：Ｗｉｓｔａｒラット（日本チャールス・リバ
ー株式会社）を３週齢で雄のみ１２０匹購入し、１週間
馴化飼育した後、健康な動物を４週齢で１１０匹使用し
た。

動物は温度２２±２℃、温度５５±１０％、換気１時間
１３回、照明１日１２時間（午前７時〜午後７時）に自
動調節した飼育室で飼育した。動物は金属製網ケージ（
２５０Ｘ　３５０　Ｘ　２００ｍｍ　：日本ケージ株式
会社）に５匹ずつ収容し、同型飼料（ＭＦ：オリエンタ
ル酵母工業株式会社）および水道水（御殿場重言水道）
を自由に摂取させた。

被験化合物として、本発明の方法により調製したサケカ
ルシトニン誘導体（白色凍結乾燥品）（ＳＧＥ−１と称
する）、及び市販のサケカルシトニン■（白色凍結乾燥
品）（ＣＴと称する）を使用した。

これらの被験物質を下記の溶媒に溶解し、１０、０００
　ｎ　ｇ　／　ｍの被験液を調製した。

クエン酸ナトリウム　　　１．３ｍＭ クエン酸　　　　　　　　２２ｍＭ 塩化ナトリウム　　　　　１２０ｍＭ ゼラチン　　　　　　　　０．１６％ ｐ　Ｈ６，０ ＳＧＥ−１は最高投与量を４００ｎｇ／ｋｇとし、以下
公比２で２８３，２００，１４１，１００．７１および
５０ｎｇ／ｋｇの７用量を、ＣＴは最高投与量を４０　
ｎ　ｇ／ｋｇとし、以下公比２で２０．１０および５ｎ
ｇ／蹟の４用量を設定した。被験液は投与液量が体重１
００ｇにつき１ｍｌになるように各用量について溶媒を
用いて希釈調製した。

動物は被験法投与前日の午後６時より絶食し、無作為に
１１０匹を１群１０匹として１１群にふり分け、体重を
測定した。この体重をもとに被験液を体重１００　ｇあ
たり１．０ｍｊ！の割合で尾静脈内投与した。投与後正
確に１時間経過した時から動物をエーテル麻酔下で腹大
動脈より採血した。血液は室温で約１時間放置してから
、３０００ｒｐｍ　１０分間遠心分離し、血清を採取し
た。得られた血清は０−Ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｉｅｉ
ｎ　Ｃｏｎｐｌ−ｅｘｏｎｅ法でのカルシウム濃度測定
に用いた。カルシウム濃度測定には臨床検査自動分析装
置ＪＣＡ−ＶＸ１００Ｏ（日本電子株式会社）を用い、
二重測定した平均値をカルシウム濃度測定値とした。

得られたデータは、まずＢａｒｔｌｅｔの方法で各群の
等分散性の検定を行い、等分散性は否定されなかったの
で２×３点の平行線検定によりＣＴに対する５ＧＩＥ−
１の比活性を求めた。結果を次の°表に示す。

以下余白 ＣＴ投与群では１０〜４０ｎｇ／ｋｇで直線的な用量相
関がみられ、５ＧＥ−１では５０〜２８３　ｎ　ｇ　／
　ｋｇで同じく直線的な用量相関がみられた。平行線検
定法では各用量とも同数のサンプルが必要であるので５
ＧＥ−１の５０　ｎ　ｇ　／　ｋｇ群は検定には使用で
きない。

そのため、ＣＴは１０　、２０および４０　ｎ　ｇ　／
　ｋｇ群、５ＧＥ−１はＣＴと公比を同じにするため、
７１　、１４１および２８３　ｎ　ｇ　／　ｋｇ群を用
いて２×３点の平行線検定を行った。その結果単位重量
あたりＣＴに対して５ＧＥ−１は約０．１４倍の活性に
相当し、９５％信軌限界は約０．１１〜０．１７倍であ
った。

サケカルシトニンは、ヒトに対して、ヒトカルシトニン
の約２０〜３０倍の活性を示すと言われているので、こ
の値は、この発明のサケカルシトニン誘導体が、ヒトに
対して、ヒトカルシトニンの約３〜４倍の活性を示すこ
とを強く示唆している。

（４）天然魚類カルシトニンの前駆体としての有用性 本発明の魚類カルシトニン誘導体はまた、その３３位の
グリシンを公知の方法、例えばカルボキシペプチ゛−ゼ
Ｙによりアミドに転換することにより、（Ｋ、ブレラダ
ン、Ｆ、ウィドマー及びＪ。

Ｔ、ヨハンセン、カールスベルグ・リサーチ・コミュニ
ケーション（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ＋Ｃｏ＋＋ｎ
ｕｎ、＋　４５＋２３７；４５．３６０１９８０）　）
　、３２位のプロリンがアミド化された天然魚類カルシ
トニンに転換することができる。すなわち、本発明の魚
類カルシトニン誘導体は活性の高い天然魚類カルシトニ
ンを製造するための中間体としても有用である。

ｍエ　プラスミドＬＭＣ２の　マｉ 第７図） ２０μｇのｐＳＣＴ、２を１５０μｌの旦ｇＩ緩衝液中
で３０ユニツトの１匹Ｉで３７℃、３時間消化した後、
エタノールで沈澱させた。０．０２０Ｄｚａｏユニツト
の５ａｌｌリンカ−ｄ　（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）を１０ｍ
ＭＡＴＰを含む１０μｌのキナーゼ緩衝液（５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ
　、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール）中で４ユニツ
トの　Ｔ４キナーゼと３７℃、１時間反応させた。

この反応液５μｌと旦１１で消化したＤＮＡとを２０μ
βのＴ４リガーゼ緩衝液（６６ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ１，６，６，６ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｚ　、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰ）中で３５０ユ
ニツトのＴ４リガーゼと共に２２℃、５時間反応させた
後エタノールで沈澱させた。沈澱を５０μｌの５囮」緩
衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣｊ！　、　ｐ　Ｈ７，
５，７ｍＭＭｇＣｊ！、、１７５ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　、　
０．２ｍＭＥＤＴＡ。

７ｍＭメルカプトエタノール）に溶解し４０ユニツトの
主計Ｉで３７℃、３時間消化した。反応溶液を６％アク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、６００ｂｐのＤＮＡ断
片（１１を泳動熔出により単離した。

１０℃ｇのｐｓＬＭＫｌを１００μｌの基１１緩衝液中
で４０ユニツトの５ａｌＩで３７℃、５時間消化した後
、エタノールで沈澱させた。これを２００μｌの５０　
ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐ　Ｈ８，０）に溶
解し、０．０４ユニツトのアルカリホスホターゼで６５
℃３０分間反応させた後フェノールで処理し、エタノー
ルで沈澱させた（２１　。

（１）のＤＮＡ断片（約０．５μｇ）と（２）のＤＮＡ
断片（約１μｇ）をＥｌｕｔｉｐ−ｄ　（商標）（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ）カラムで精製し
た後、エタノールで沈澱させた。これを２０μｌのＴ４
リガーゼ緩衝液に溶解し、３５０ユニツトのＴ４リガー
ゼを加え１６℃、５時間反応させた。この反応溶液５μ
ｌを用い大腸菌ＲＲＩ株を形質転換した。５０℃ｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で得られた株の中
から１％カテコール水溶液の噴霧により黄色を呈さない
ものを選択した。これらの株よりプラスミドを抽出し、
匡吐■、盈虹１．Ｒ拉■／八■■の消化パターンより目
的のプラスミドｐＬＭＣ２を選択した。

ス」Ｆ例」ユ　プラスミドＰＭＣ２の　１（第５ズ。

第８図） ２０℃ｇのｐＬＭＣ２を２００μｌの旦虹■緩衝液中で
４０ユニツトの下田」で３７℃で３時間消化した後、エ
タノールで沈澱させた。反応溶液を０．７％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、６００ｂｐのＤＮＡ断片（１）を
泳動溶出により単離した。

２０℃ｇのｐＨＴ３１を２００μｌのΣ旦■、緩衝液中
で４０ユニツトの）刀」で３７℃で３時間消化した後に
、エタノールで沈澱させた。これを２００　ｐ　１２の
５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８，０）緩
衝液に溶解し、０．０４ユニツトのアルカリホスホター
ゼで６５℃、３０分間反応させた後、フェノールで処理
し、エタノールで沈澱させた。この反応溶液を０．７％
アガロースゲル電気泳動し、５．２　Ｋ　ｂのＤＮＡ断
片（２）を泳動溶出により単離した。

（１）のＤＮＡ断片（約３μｇ）と（２）のＤＮＡ断片
（約５．５Ｋｂ）をＥｌｕｔｉｐ−ｄ（商標）Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ）カラムで精製した後
エタノールで沈澱させた。これを２０μｌのＴ４リガー
ゼ緩衝液に溶解し、３５０ユニツトのＴ４リガーゼを加
え１２℃で２４時間反応させた。

この反応溶液１０μβを用い大腸菌ＲＲＩ株を形質転換
し、３２℃で５０℃ｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒
天培地上で一晩培養した。これをさらに４２℃で１時間
培養後、１％カテコール水溶液の噴霧により黄色を呈さ
ないものを選択した。

５０℃ｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で
一晩培養し、同組成の培地に１％接種し、さらに培養し
た。ＯＤ　＆６６　”　０．３において３２℃から４２
℃に昇温しさらに３時間培養した。培養液１ｍｌを遠心
し、沈澱を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、２５．０００ダルトンの蛋白質が大きく
誘導される株を選択した。これらの株からプラスミドを
抽出し、５．２　Ｋ　ｂ前後のプラスミドを検索した。

次にΣａｌｌ消化パターンにより予想される大きさのＤ
ＮＡ断片を示すものを選択した。これらのプラスミドで
大腸菌５Ｋ３８３株を形質転換し、その株からプラスミ
ドを抽出し、Ｃ１ａＩの消化パターンにより目的のプラ
スミドを選択した。

実施例３．　プラスミドｐｓｃＴ１２の作製（第６図。

玉１回） 大腸菌５Ｋ３８３／　ｐＳＣＴ　２株から得られたプラ
スミドＤＮＡ５μｇを１００μｌの旦鳳！緩衝液（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、ｐ　Ｈ７，５，７ｍＭ　
ＭｇＣ１ｔ　、７ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタノール）
中２８ユニツトのＣ１ａＩと共に３７℃、９０分間反応
させた後、フェノール抽出を行い、エタノールにより沈
澱させた。次にこれを０．２　ｍ　ＭのｄＧＴＰ、ｄＡ
ＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰヲ含む２０ｔｔｌ！のニックト
ランスレーション緩衝液＜５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！　ＸｐＨ７，２，１０ｍＭＭｇ５Ｏａ　、１　ｍＭ
ジチオスレイトール）に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ・ラージフラグメント５ユニツトを加え、２２℃
、３０分間反応させた。フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱を行った後、活性化した５ａｌｌリンカ−０，０
２０Ｄとともにリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼ７００ユニツトを加え、１２℃、１２時
間反応を行った後、エタノール沈澱を行った。。

れを５刀ｊ緩衝液５０μｌに溶解し、２４ユニツト（７
）ＳａｌＩを加えて３７℃、１２０分間反応させた６５
℃、１０分間の熱処理を行い、さらにエタノール沈澱を
行った。これをリガーゼ緩衝液２００．ｕＩ！。

に溶解し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１７０ユニツトを加え
て　２２℃、５時間反応を行った。この反応液５０１１
βを用い、Ｈ８１０１株の形質転換を行った。

アンピシリン５０μｇ／ｍｌ！を含むり、Ｂ寒天培地上
で得られた形質転換株からホルメス及びクイグレイの方
法ＣＤ、Ｓ、ホルメス及びＭ、クイグレイ、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅ
ｎ＋、）Ｖｏｌ　１１４．１９３−１９７（１９８１）
　）によって抽出したプラスミドのうち、５ａｉｌ消化
、および５ａｌＩ　−１匣に重消化のパターンにより、
目的のプラスミドｐｓｃＴ１２を選択した。

（ｉ）１０＃ｇのｐＵｃ９をＨｉｎｄＩ［［緩衝液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ！、　１）　Ｈ７，５，７ｍＭ
　ＭｇＣｌ　ｔ、６０　ｍＭ　ＮａＣ１）１００μｌに
溶解し、３５ユニツトのＢｉｎｄｌ［［を加えて３７℃
、２時間反応させて消化した後、エタノール沈澱を行っ
た。

（ｉｉ　）この沈澱にニックトランスレーション緩衝液
２０ｐｌを加え、各２ｍＭのｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ＴＰＰを含む溶液２μｉ、および大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼｒ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２．５
ユニツトを加え、２２℃、３０分間の反応を行い、反応
終了後フェノール抽出およびエタノール沈澱を行った。

（ｉｉｉ　）これにリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ。

６．６ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、０．４ｍＭ　ＡＴＰＳｐ
Ｈ７，６）２０μ！および活性化したＸｈｏｌリンカ−
ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）０．０２０　Ｄを加えて混合し
、さらにＴａＤＮＡリガーゼ３５０ユニツトを加え、１
２℃で１２時間反応を行った。

（ｉｖ　）この反応物をエタノール沈澱させた後、１０
０μｌの５ａｌＩ緩衝液に溶解した。この溶液に５ａｌ
ＩおよびＸｈｏｌをそれぞれ２５ユニット加え、３７℃
で４時間反応させた。

（ｖ）これに５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！緩衝液（
ｐＨ８，０）１００μｌおよび大腸菌アルカリホスファ
ターゼ０．０４ユニツトを加え、６５℃、３０分間の反
応を行った。続いて２回のフェノール抽出およびエタノ
ール沈澱を行い、この沈澱を２００　＃　１のＴＥ緩衝
液（１０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０）に）容解した。

（ｖｉ）２Ｏ４ｇのｐｓｃＴ１２を１００　ｐ　１の１
匹Ｉ緩衝液に溶解し、１匹Ｉ３５ユニットを加え、３７
℃で４時間反応させて消化した後、エタノール沈澱を行
った。

（ｖｉ　）この消化物に対するＸｈｏＩリンカ−の付与
オヨヒｓａｌ　Ｉ　、Ｘ担すによる消化を、（ｉｉｉ　
）、（ｉｖ　）に示したものと同様の方法により行った
。さらにこの全量を、６％ポリアクリルアミド電気泳動
に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、約１２０
ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出により回収し
た。

（ｖｉｉ　）回収したフラグメント溶液に、（ｖ）で獲
られたＤＮＡ溶液５０μｌを加え、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカ
ラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌりによる
処理を行った後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。

（ｉｘ）この沈澱にリガーゼ緩衝液を２ｏμ１１及びＴ
４　ＤＮＡリガーゼを８０ユニット加え、１６℃で１０
時間反応させた。

（ｘ）この反応液５μｌを用い、大腸菌Ｈ８１０１株に
対して形質転換を行い、５０　ｐ　ｇ　／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢ寒天培地（１％バクトドリプトン、０
．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１％ｐ　Ｈ７，４，１，
５％寒天）上で生育するコロニーを得た。

（にｉ）得られた形質転換株から、ホルメス及びクイグ
レイ　（前掲）の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出し
、その大きさおよび制限酵素開裂パターンがｐＨｃＴ１
２と一致するプラスミドを選択した。

１０μｇのｐＵｃＴ１２を１００μｌのＥｃｏＲＩ緩衝
液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　ＳｐＨ７，５、？　
ｍＭ　ＭｇＣＪ　ｚ、１００ｍＭ　ＮａＣｊ！　、　７
　ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶解し、２２ユ
ニツトの旦ｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間反応させて
消化した後、エタノール沈澱を行った。この沈澱を１０
０μｌのＢａｍ旧緩衝液（１０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
Ｊ　、　ｐ　Ｈ８，０，７ｍＭＭｇ（１ｇ、１００ｍＭ
　ＮａＣ１、２ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶
解し、２４ユニツトの旦ａｍＨＩを加え、３７℃で２時
間反応させて消化した。この旦ｃｏＲＩ一旦憇旧二重消
化物について、実施例４（ｖ）と同様の方法により、５
′末端の脱リン酸を行い、エタノール沈澱を行った（１
）。

３００　ｇ（７）ｐＫＴＬｌを１００μｌ　（Ｄ　Ｅｃ
ｏＲＩｉｉ液ニ溶解し、ＥｃｏＲＩ９０ユニットを加え
、３７℃で４時間反応させて消化した後、エタノール沈
澱を行った。この沈澱を１００μｌのＢａｍＨＩ緩衝液
に溶解し、７２ユニツトのＢａａ旧を加え、３７℃で２
時間反応させて消化した後、エタノール沈澱を行った。

この消化物を１％アガロースゲル電気泳動（５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ、　１　ｍＭ　ＨＤＴＡ、　ｐ
　Ｈ８，３）に供し、エチジウムブロマイドで染色した
後、約６ｏｏｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出
により回収した。回収したフラグメントはＨｌｕｔｉｐ
−ｄカラムによる処理を行った後、エタノールで沈澱さ
せ、５０μｌのりガーゼ緩衝液に溶解した。

このフラグメント溶液２５μ２を前記のＤＮＡ消化物（
１）に加えて混合し、さらにＴａＤＮＡリガーゼを８０
ユニット加え、１５℃で６時間反応させた。

この反応物を５μｌ用い、大腸菌Ｈ８１０１株に対して
形質転換を行い、５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天培地上で生育するコロニーを得た。得ら
れた形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、その大
きさおよび制限酵素開裂パターンがｐＵｃＴ２２と一致
するプラスミドを選択した。

５μｇのｐＴｃｃＭｌを５０μｌのＡｕＩ緩衝液（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、　ｐ　Ｈ８，０，７ｍ　Ｍ
　ＭｇＣＩｔ　ｚ、６０　ｍＭ　ＮａＣｊ！、７ｍＭ２
−メルカプトエタノール）に溶解し、２０ユニツトの人
ｖａｌを加え、３７℃、２時間の反応により消化した後
、エタノール沈澱を行った。この沈澱を２０μｌのニッ
クトランスレーション緩衝液に溶解し、２ｍＭのｄＧＴ
ＰおよびｄＣＴＰを含む溶液２μｌ、および大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｖフラグメント２．５ユニツ
トを加え、２２℃、３０分間の反応を行い、さらにエタ
ノールによりＤＮＡを沈澱させた。沈澱を２００μＥの
８１緩衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６，５
０ｍＭ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＺｎＳＯ４，５０％グリセ
ロール）に溶解し、３ユニツトの８１ヌクレアーゼを加
えて、３７℃、１０分間の反応を行った。この反応物に
ついて、フェノール抽出およびエタノール沈澱を行った
。さらに実施例４　（ｉｉ　、　１ｉｉ）と同様の方法
によりＸｈｏＩリンカ−の付与を行った。この反応物を
用いて大腸菌ＪＭ１０３株に対する形質転換を行い、５
０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地
上で生育するコロニーを得た。

得られた形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、そ
の大きさおよび制限酵素開裂パターンがｐＴＣＣＭＡＸ
と一致するプラスミドを選択した。

実践開エ　プラスミドＴＭＣ２の　１（６゛。

第１１図） （ｉ）１０μｇのｐＯＣＴ２２を５０μβの又匝Ｉ緩衝
液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、　ｐ　Ｈ７，５
，７ｍＭＭｇＣＩｔ２．１００　ｍＭ　ＮａＣｊ！　、
　　７　ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶解し、
２５ユニツトのＸｈｏｌを加えて３７℃、２時間反応さ
せた後、エタノール沈澱を行った。

（１１）実施例４　（ｉｉ　）と同様の手法により、Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメントによる処理を行い、エタノール
沈澱を行った。

（ｉｉｉ　）この沈澱にリガーゼ緩衝液２０μ！、およ
び活性化した旦ｐａｌリンカ−０，０５０Ｄを加えて混
合し、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼ３５０ユニツトを加え
、１２．５℃で１０時間反応を行った。

（ｉｖ　）この反応物をエタノール沈澱させた後、５０
μｌの且ＬＩ緩衝液に溶解し、１８ユニツトの厘■およ
び２４ユニツトへＢａｎ１［Ｉを加え、３７℃で２時間
反応させた。

（Ｖ）この消化物全量を１％アガロースゲル電気泳動に
供し、エチジウムブロマイドで染色した後、約６９０ｂ
ｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出により回収した
。

（ｖｉ）５μｇのｐＴＣＣＭＡＸを５０μｌのＸｈｏＩ
緩衝液に溶解し、２５ユニツトのＸｈｏｌを加えて３７
℃、２時間反応させた後、エタノール沈澱を行った。

（ｖｉ　）実施例４（ｉｉ）と同様の手法により、Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメントによる処理を行った。

（偏）この線状ＤＮＡに対する指Ｉリンカ−の付与およ
びＢａｎＩ［［による消化を、（ｉｉｉ）。

（ｉｖ）と同様の方法により行った。

（ｉｘ　）この消化物の半量を１％アガロースゲル電気
泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、約３
．４　Ｋ　ｂのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出°に
より回収した。

（ｘ）得られたＤＮＡ溶液を、（ｖ）で得られたＤＮＡ
と混合し、これをＥｌｕｔｉｐ−ｄにより処理した後、
エタノール沈澱を行った。

（ｘｉ）この沈澱にリガーゼ緩衝液２０ｐｌおよびＴ、
ＤＮＡリガーゼ１７０ユニツトを加え、１６℃、８時間
の反応を行った。　　　。

（ｘ　ｉｉ　）反応物の半量を０．７％アガロースゲル
電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、
約４．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶
出により回収した。

（ｘ　ｉｉｉ　）回収したＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１
０３株に対して形質転換を行い、５０μｇ　／　ｍ　１
のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育するコロニ
ーを得た。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを
抽出し、その大きさが約４．ＩＫｂＯものを選択した。

［プラスミドｐＴＭｃ１２の作製（第６図）３μｇのｐ
ＴＭＣ２を１００μｌの止■緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！　、ｐＨ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣｊ！　
２．１００ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　２−メルカプト
エタノール）中、１０ユニツトのＸｈｏｌを用いて３７
℃で、１５時間消化した。エタノール沈澱の後、各々０
．２ｒｒｒＭのｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ＴＴＰ　５ｄ
ＣＴＰを含むニックトランスレーション緩衝液２０μｌ
に溶解し、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片２ユニッ
トを加え、２２℃で３０分間反応させた。フェノール抽
出およびエタノール沈澱の後、活性化したＨｐａＩリン
カ−ｄＧＴＴＡＡＣ１ｇｇとともに２０／Ｊｌのリガー
ゼ緩衝液に溶解し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを７００ユニッ
ト加えて、２２℃で８時間反応を行った。この反応液を
用いて大腸菌ＪＭ　１０３株を形質転換し、ｐＴＭｃ１
２を有する形質転換株を選択した。

実施例９．プラスミドｐＴＭＣ２２の作製（第６図。

第１２図） ２０　μｇ　（７）　ｐＴＣＣＭＡＸを１００　ｔｔ　
ｊ！のＨｉｎｄｌｌ［緩衝液中、６０ユニツトのＸαす
および５０ユニツトのＨｉｎｄｌｌ［により、３７℃で
３時間消化した。これをポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供した後、約６４０ｂｐのＤＮＡ断片を電気泳動溶
出により単離した。エタノール沈澱の後、このＤＮＡ断
片を１００μｊ！の５ａｕ３ＡＩで緩衝液（１０ｓＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　％ｐＨ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣ１
ｇ　、１００ｍＭ　　ＮａＣ１）中、１６ユニツトの５
ａｎ３ＡＩで２時間消化した。さらにエタノール沈澱を
行い、この沈澱を、０．２ｍＭのｄＧＴＰ。

ｄＡＴＰ、　ＴＴｒ’　５ｄＣＴＰを含むニックトラン
スレーション緩衝液２０μＥに溶解し、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩクレノウ断片２ユニットを加え、２２℃で３０分
間反応させた。フェノール抽出、エタノール沈澱の後、
活性化したｋｌリンカ−１ｇｇとともに２０μｌのリガ
ーゼ緩衝液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを７００ユニ
ット加えて、１２℃、１２時間の反応を行った。エタノ
ール沈澱の後、この反応物を５０１＋の旦μｌ緩衝液（
１０ｍＴｒｉｓ−１１（Ｊ　、ｐＨ７，５，７ｍＭ　　
ＭｇＣｊ！　ｚ　、１１００ｎ　ＭＣＩ、７ｍＭ　２−
メルカプトエタノール）に溶解し、１８ユニツトのＨｐ
ａＴにより、３７℃で２時間消化した。

さらにエタノール沈澱を行った後、これを５０μｌの旦
ｃｏＲＩ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、　ｐ
Ｈ７，５，７＊ＭＭｇＣｆ　ｚ　、１００　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶解し、
２０ユニツトのＥｃｏＲＩにより、３７℃で２時間消化
した。これをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片（断片Ａ）を電気泳動溶
出により単離した。

１０μｇのｐＴＭｃ１２をヱ旦Ｉ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　ｐＨ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣ
１ｚ　、１００ＳＭ　　ＮａＣｊ！　。

７ｍＭ２−メルカプトエタノール）１００　μｌ中、４
５ユニツトのＰｓｔｌを用い、３７℃で２時間消化した
。得られたｐＴＭｃ１２ののヱ１０消化物５μｇをエタ
ノール沈澱させ、１００μβの且匹ＲＩ緩衝液中、３０
ユニツトのＥ　ｃｏＲＩにより、３７℃・で３時間消化
した。さらにエタノール沈澱を行った後、これを１００
μｌのＣＩａＩ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
、。

ｐＨ７，５，７ａ＋Ｍ　　ＭｇＣｊ！ｚ、７ｍＭ　２−
メルカプトエタノール）に溶解し、２０ユニツトの−Ｃ
１ａＩにより、３７℃で２時間消化した。これをアガロ
ースゲル電気泳動に供した後、約１５００ｂｐのＤＮＡ
断片（断片Ｂ）を電気泳動溶出により単離した。

ρＴＭＣＩ２のヱ王ロ消化物５μｇを１００μｌの旦匹
Ｉｌｌ衝液中、２４ユニツトの且…■を用い、３７℃で
３時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供し
た後、約１８００ｂｐのＤＮＡ＠ＪＡｉ’Ｃ断片Ｃ）を
電気泳動溶出により単離した。

上記ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ、Ｃを混合し、Ｈｌｕｔｉｐ−ｄ
（商標）カラムで処理し、エタノール沈澱を行った後、
２０μ！のりガーゼ緩衝液中、７００ユニツトのＴ、Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、１２℃、１２時間の反応を行った
。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ　１０３株を形質転換
し、９７ＭＣ２２を有する形質転換株を選択した。

ス】ｌ４段、プラスミドＴＭＣ３２の　Ｌ（ＩＬ第１３
図） ２０μｇのｐＴＭｃ１２を１００μｌの人旦■緩衝液（
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、ｐＨ７，５，７ｍＭ　
　ＭｇＣｌ！ｚ　、６０ｍＭＭＣｌ、　７ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール）中、３０ユニツトのＡａｔＩＩを
用い、３７℃で２．５時間消化した。これをポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、約４００ｂｐのＤＮＡ断
片を電気泳動溶出により単離した。このＤＮＡ断片を１
００μｌのＡｌｕＩ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
４、７ｍＭ　　ＭｇＣ７！、　、２０ｍＭＮａＣ１，７
ｍＭ　２−メルカプトエタノール）中、２４ユニツトの
Ａｌｕｌにより、３７℃、で３時間消化した。これをポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供し、２４５ｂｐのＤ
ＮＡ断片（断片Ａ）を電気泳動溶出により単離した。

１０μｇの９７ＭＣ２２を１００μｌの上１０緩衝液中
、４５ユニツトのＰｓｔＩを用いて、３７℃で１６時間
消化した。得られた９７ＭＣ２２のＰｓｔｌ消化物５μ
ｇをエタノール沈澱させ、１００μβのＰｖｕＩＩ緩衝
液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、　ｐＨ７，５，
７ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ、６０ｓ＋Ｍ　ＮａＣ１、７ａ
＋Ｍ　２−メルカプトエタノール）中、３０ユニツトの
ＰｖｕＩ［を用い、３７℃で２時間消化した。これをア
ガロースゲル電気泳動に供した後、約１８００ｂｐのＤ
ＮＡ断片（断片Ｂ）を電気泳動溶出により単離した。

９７ＭＣ２２の旦■■消化物５μｇを１００μｌの且し
■緩衝液中、２４ユニツトの１匹■を用い、３７℃で２
時間消化した。エタノール沈澱の後、これを１００μ１
（７）Ｎｄｅ　Ｉ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
２　、ｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、　１７５ｍ
Ｍ　ＮａＣ１、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に
溶解し、１８ユニツトのＮｄｅｌを加えて、３７℃で９
時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供した
後、約１８２０ｂｐのＤＮＡ断片（断片Ｃ）を電気泳動
溶出により単離した。

上記ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ、Ｃを混合し、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ
（商標）カラムで処理し、エタノール沈澱を行った後、
２０μｌのりガーゼ緩衝液中、３５０ユニツトのＴ、Ｄ
ＮＡリガーゼを加えて１２℃、１７時間の反応を行った
。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０３株の形質転換し
、９７ＭＣ３２を有する形質転換株を選択した。

１）１本鎖鋳型ＤＮＡの調製 サケカルシトニン誘導体の遺伝子を有するプラスミドｐ
ＳＣＴ　２からのサケカルシトニン誘導体の遺伝子を含
む且匹■−狂１０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片０．５μｍｏ
／と、Ｍ１３ファージｍｐ９の２本鎖ＤＮＡからの旦匣
Ｉ−Σ虹Ｉ　２．７ｋｂｐ　ＤＮＡ断片０．５ｐ　ｍａ
ｌｔを混合し、６６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４’　（ｐ
Ｈ７，５）、５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、５　ｍＭＤ　Ｔ
Ｔ及び１ｍＭＡＴＰ含有する溶液２０μβ中で１００ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃にて１６時
間連結反応を行った。反応後、反応液を用いてメッシン
グ等の方法〔メッシング等、メンズ・イン・エンチモロ
ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
　１０１＋　２０−７８゜１９８３）に従って大腸菌Ｊ
Ｍ１０３を形質転換し、０．０２％Ｘ−ｇａｌ及びＩ　
ｍＭ　ＩＰＴＧを含有する軟寒天と共にプレートし、３
７℃にて一晩培養した。組換体によって形成された白い
プラークより一本鎖鋳型ＤＮＡを調製した。すなわち、
白いプラークをつまようじの先端で釣り、大腸菌ＪＭ１
０３が生育している１、５ｍｊ２の２ＸＹＴ培養液（１
，６％バタトトリプトン、１％酵母エキストラクト及び
０．５％Ｎａ（Ｊ　）中に懸濁して３７℃にて５時間培
養し、そして培養液上清から、ポリエチレングリコール
沈澱、フェノール処理及びエタノール沈澱によって１本
鎖組換体ファージＤＮＡを回収した。

得られた１本鎖ＤＮＡを鋳型としてメッシングらの方法
（前掲）に従ってジデオキシ法により塩基配列を決定し
、クローニングされた１本鎖ＤＮＡの配列を確認した。

こうしてサケカルシトニン誘導体の遺伝子のアンチコー
ディング鎖を含む１本ｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａが得られた。こ
の組換体ファージをＣＴＭ３１　と命名した。

２）オリゴヌクレオチドをブライマーとする二本鎖ＤＮ
Ａの合成 上記のようにしてえれらたＣＴＭ３１の１本ｔｉ　Ｄ　
ＮＡを鋳型として用い、合成オリゴヌクレオチド：５’
　　ＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＧＣ
３’をプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎ
ｏｗ断片による修復反応を行った。すなわち、鋳型１本
鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５　ｐｍｏｌｅに５′末端を燐酸化
したプライ”　　２μｍｏｌｅを加え、そして７　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５）　、０．１　ｍＭ
　ＥＤＴＡ　、　２０　ｍＭ　ＮａＣｊ！及び７　ｍ　
Ｍ　ＭｇＣβ２を含有する溶液１０μβ中で６０℃にて
２０分間保持し、続いて２３℃にて２０分間保持した。

さらに、この反応混合物に、ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、　ＴＴＰ　、及びｄＣＴＰをそれぞれ０．５
ｍＭになるように加え、全体を２０μｌとしてＤＮＡポ
リメラーゼＫｌｅｎｏ％１断片２ユニットを加え、そし
て２３℃にて２０分間インキュベートした。続いて、ｌ
ＱｍＭＡＴＰをり、ｃｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニ
ットを加え、１２℃にて一晩インキユベートした。

３）アガロースゲル電気泳動による２本鎖ＤＮＡの分離 上記のようにして得られた２本鎖ＤＮＡからバックグラ
ウンドとなる未反応の１本１３　Ｄ　Ｎ　Ａを除去する
ために反応溶液全量を２μｇ　／　ｍ　ｌのエチジウム
ブロマイドを含む０．８％のアガロースゲル電気泳動に
より分離した。目的とする２本ｔｌＮＡを確認したのち
、その部分のゲル片を切り出して透析チューブに入れ、
８９ｍＭ）リスホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ緩衝液を満たし
シールした後、同緩衝液中で５０Ｖの定電圧で１２時間
電気泳動する事によりゲル中のＤＮＡを溶出させた。次
にＤＮＡを透析チューブより取り出し凍結乾燥し、乾固
物を１００μｌの蒸留水に溶解して、イオン交換ディス
ポーザブルカラムＥｌｕｔｉｐ−ｄ　（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌ　１＞を用いて精製した。

４）大腸菌ＪＭ１０３の形質転換 上記２本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　０．１　ｐｍｏｌｅを用いてメ
ソシングの方法に従い大腸菌ＪＭ１０３を形質転換した
。

５）変異体の検索 上記のようにして得られたファージプラークについて、
合成オリゴヌクレオチド： ５’　ＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡ　３’（３２Ｐ
で標識したもの）をプローブとして用いて、プラークハ
イブリダイゼーションによる変異体ファージのスクリー
ニングを行った。すなわち、ベントン・ディビス等の方
法（Ｗ、Ｄ、ベントン及びＲ１−、ディビス、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１９６．１８０゜１９７７）に
従って軟寒天培地からニトロセルロースフィルターにプ
ラークを移し、真空中８０℃にて２時間ベーキングした
。このニトロセルロースフィルターを６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　
Ｃ，１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液中で、３２ｐで標識し
たプライマーオリゴヌクレオチドをプローブとして２３
℃にて１晩ハイブリダイゼーシヨンを行った。次に、こ
のフィルターを６ＸＳＳＣ中で４６℃にて洗浄し、そし
てオートラリオグラフィーを行い陽性シグナルを示す変
異体ファージプラークを単離した。

６）変異体ＤＮＡの塩基配列の決定 変異体ファージＤＮＡを鋳型としてジデオキシ法により
塩基配列を決定し、塩基置換変異が生じ、ウナギカルシ
トニン誘導体の遺伝子を有するファージを得た事を確認
した。この変異体ファージプラーク株をＪＭ１０３／Ｃ
Ｔ台４１　と命名した。

尖丘炎婬、プラスミド　Ｃ７Ｍ４の　＋（１７図）ファ
ージＣＴＭ４１の２本鎖ＤＮＡ　１０ｐｍｏｌｅを、１
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　、０．
７　ｍＭのＭｇＣｌ　１５ｍＭのＭａｃｌ及び０．７ｍ
Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む１００μｌの緩衝
液中２０ユニツトのＥｃｏＲＩにより３７℃にて４時間
消化し、反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽
出し、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、沈澱を乾燥し
た。このＤＮＡを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（
ｐＨ８，０）、７５ｍＭのＮａＣＡ！　、　１０　ｍＭ
のＭｇＣｆｚ　、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、
並びに０．２５ｍＭずつのｄＡＴＰＳｄＧＴＰ、　ｄＣ
ＴＰ、　ＴＴＰ及びＡＴＰを含有する１００μｌの緩衝
液中２０ユニツトのＤＡＮポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断
片により３７℃にて２時間フィル−イン反応を行った。

この反応抽出物をフェノール及びクロロホルムで抽出し
、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして乾燥した。

このＤＮＡを、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７
，５）　、０．７　ｍＭのＭｇＣ１ｇ　、１５ｍＭのＮ
ａＣ１、０，７ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び０
．０２ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液１００μβ中８
ユニツトの５！口により３７℃にて２時間消化した。こ
の反応液を、エチジウムブロマイドを含有する１、２％
のアガロースゲル上で電気泳動分離し、ＤＮＡの小断片
を含有するゲル部分を切り取り、透析膜を用いる電気溶
出法で目的とするＤＮＡ断片を溶出した。溶出液からＤ
ＮＡ断片をエタノールにより沈澱せしめ、この沈澱を乾
燥し、４０μｌの水に溶解した。

プラスミドｐＴｃｃＭ１のＤＮＡ　Ｉ　Ｑｐｎ＋ｏｌｅ
を、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）　、１　
ｍＭのＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭのＭａｃｌ及び０．１ｍＭ
のＥＤＴＡを含有する緩衝液１００με中２０ユニツト
のＡｖａＩにより３７℃にて４時間消化した。この反応
混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈澱せしめ、沈澱を乾燥した。この
後ＣＴＭ４１ＤＮＡの処理と同様にしてフィル−イン反
応、）剰」による消化、及びＤＮＡ断片のゲル分離を行
い、目的とする断片を含む溶液４０ｐＨを得た。

前記のＤＮＡ断片を含有する溶液それぞれ５μβずつを
、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　（ｐＨ７，８
）、７・ｍＭのＭｇＣ１ｚ　、１２ｍＭのジチオスレイ
トール及び０．４　ｍ　ＭのＡＴＰを含有する緩衝液合
計１００μβ中で、３０ユニツトの７４　Ｄ　Ｎ　Ａ　
ＩＪガーゼにより１６℃にて２４時間連結処理した。

この反応混合物１０μβを用いて大腸菌ＪＭ１０３（凍
結保存してあったコンピテント細胞）を形質転換した。

こうして処理された大腸菌コロニーについて、カルシト
ニン誘導体構造遺伝子Ｕ３１フラグメント（ＧＧＧＡＡ
ＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧ）　（参考例１及び第１図を参照
のこと）を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行
ったところ約６０％の頻度で陽性コロニーが得られた。

これらの陽性株について、発現試験を行い、約１９１０
０ダルトンの蛋白質を発現する株を選択した。これらの
株からプラスミドＤＮＡを調製し、カルシトニン誘導体
構造遺伝子Ｌ−４１７ラグメント（ＧＴＡＡＴＴＣＣＴ
ＧＡＣＴＣＡ）　（参考例１を参照のこと）をプローブ
として用いてジデオキシシーケンシング法により塩基配
列を決定し、ウナギカルシトニン誘導体遺伝子が逃切に
挿入されていることを確認した。このプラスミドをｐＣ
ＴＭ４と称する。

このプラスミドは、ｔａｃプロモーターの支配下に、メ
タビロ力テカーゼとウナギカルシトニン誘導体との融合
蛋白質をコードする遺伝子を含む。

大旌拠ｕ、サケカルシトニン辣　　の製′告（１）　　
培養 プラスミドｐＴＭＣ２を含有する大腸菌Ｒ８７９１株を
５０　ｐ　ｇ　／ｍｉのアンピシリンを含むＬＢ培地ｌ
Ｑｍｆ中で３７℃にて、１晩振とう培養した。

次にこの培養液を１１の同じ培地に接種し、２時間培養
した後にＩ　ＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるように添
加し、さらに６時間培養した。

（２）　　融合蛋白質の単離 前記のようにして得た培養液を遠心分離し、５０６１Ｍ
リン酸カリウム暖衝液（ｐＨ７，５）で洗浄することに
より約９．５ｇの菌体を得た。

この菌体を５０ｍ１の１０ｍＭＥＤ↑＾を含む５０１リ
ン酸カリウム暖衝液に懸濁し、これに１０Ｏｎ＋ｇのリ
ゾチームを加えて水中に３０分間置き、さらに３０分間
超音波処理することにより破砕した。

これを１５００Ｏｒｐｍにて３０分間遠心し不溶性画分
を得た。この不溶性画分を５０’ｒｒｌの７Ｍ塩酸グア
ニジン水溶液に懸濁し、０℃で３０分間静置し融合蛋白
を可溶化した。この水溶液を２１の蒸留水に対し、１晩
透析すると融合蛋白は不溶性の白色沈澱となった。これ
を遠心し、沈澱物を融合蛋白画分として回収した０回収
した沈澱を４Ｍ塩酸グアニジン水溶液に溶解し、セファ
デックスＧ７５カラムクロマトグラフイーにかけた。こ
のカラムは内径２．５　ｃｓ、高さ４５備、ベッド体積
２２０　ｍ　ｌであった。溶出は４Ｍ塩酸グアニジン水
溶液で行った。第１８図にその溶出パターン（Ａ）、及
び各画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲ
ルパターン（Ｂ）を示す。約２０．０００ダルトンに相
当する両分に融合蛋白がほぼ単一バンドとして溶出され
た。

このカラムクロマトグラフィーにおける排除体積画分か
ら融合蛋白質画分まで（画分Ｎ１１１７〜２０）を回収
し、次の段階でさらに処理した。

（３）サケカルシトニン誘導体の単離 上記のようにして得られた融合蛋白質含有画分を蒸留水
２ｊ２に対して１晩透析した後１４，００Ｏｒｐｍにて
３０分間遠心分離した。得られた沈澱を次のようにして
ＣＮＢｒで処理することによりメタピロカテカーゼとサ
ケカルシトニン誘導体を切断した。

すなわち、この沈澱に２０ｍ１の７０％蟻酸及び５００
ｍｇのＣＮＢｒを加え、混合した後、室温暗所にて２４
時間反応させた。反応終了後１８０ｍＡの水を加え、凍
結乾燥することにより白色粉末を得た。

この粉末を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解
し、ＲＰ３０４カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いる
ＨＰＬＣにより分画を行った。溶出０．１％ＴＦＡを含
む２６％〜４４％のアセトニトリル水溶液の直線的濃度
勾配法により溶出した。その溶出の様子を第１９図Ａに
示す。こうして、市販サケカルシトニン■とほぼ一致す
るリテンションタイムをもつピーク画分を分取した。分
取した両分をさらに精製するために０．０５％ＴＦＡ水
溶液を用いてＴＳＫＧ２００Ｏ３−カラム（東洋曹達製
）による過ＨＰＬＣにかけて市販サケカルシトニン■と
一致する分子量のピークを分取した（第１９図Ｂ）。分
取した試料の精製度をＲＰ３０４カラムによるＨＰＬＣ
及びＴＳＫＧ　２００ＯＳＷカラムによるＨＰＬＣの溶
出パターンにより検討した。

これら両ＨＰＬＣにおいても市販サケカルシトニン■と
ほぼ一致するリテンションタイムをもつ単一ピークを示
した。

尖施開旦、ウナギカルシトニン　　体の１′告（１）培
養 プラスミドｐＣＴＭ　４を含有する大腸菌ＪＭ１０３株
を５０　ｐ　ｇ　／ｍｌｌのアンピシリンを含むＬＢ培
地ｌＱｍｌ中で、３７℃にて１晩振とう培養した。

次にこの培養液１０ｍ１を１１の同じ培地に接種し、６
時間３７℃にて培養し０Ｄｓｓｏが約０．５に達した時
ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように添加し、さら
に６時間培養した。

（２）融合蛋白質の単離 前記のようにして得た培養液を６００Ｏｒｐｍにて１５
分間遠心分離することにより菌体を回収した。これに５
　Ｑ　ｍ　ｇのリゾチームを添加して５０ｍＭｇン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７，５，１０ｍＭのＥＤＴＡを含有
）に懸濁して５０ｍｆとし、０℃にて３０分間置き、さ
らに１５分間ずつ２回超音波処理することにより破砕し
た。これを１０．００Ｏｒｐｍにて３０分間、４℃で遠
心分離することにより上清（第２０図中５−１）と不溶
性画分（第２０図中Ｐ−１）とに分けた。第２０図に示
すごとく、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて、大部分の蛋白質が不溶性画分に存在した。この
不溶性画分を５０ｍＡの上記と同じリン酸緩衝液に再懸
濁し、これを１０．０．ＯＯｒｐｍにて３０分間４℃で
遠心分離することにより上清（第２０図中５−２）と不
溶性画分（第２０図中Ｐ−２）とに分けた。第２０図に
示すように約１９１００ダルトンの目的とする融合蛋白
質を含む蛋白質の多くが不溶性画分に存在した。

この不溶性画分を５０ｍＡの７Ｍ塩酸グアニジン水溶液
に懸濁し、０℃にて３０分間静置して母台蛋白質を可溶
化した。この可溶化画分には主として目的融合蛋白質が
含まれていた（第２０図中５Ｐ−３）。これを８＋　０
００ｒｐ帽にて１５分間遠心分離して融合蛋白質を含む
上清液を得た。この液を蒸留水に対して透析して塩酸グ
アニジンを除去することにより融合蛋白質を析出せしめ
た。この沈澱に約５０ｍ１の蒸留水を加えた後凍結乾燥
し、約２８０ｍｇの淡黄色粉末を得た。

（３）　　ウナギカルシトニン誘導体の単離これに２０
ｍｆの７０％蟻酸を加えさらに５００ｍｇのＣＮＢｒを
加えて室温、暗所に一装置くことにより融合蛋白質を切
断し、ウナギカルシトニン誘導体ペプチドをメタピロカ
テカーゼ蛋白質から遊離せしめた。次にこの混合物を水
で希釈した後凍結乾燥し、約２６０ｍｇの白色粉末を得
た。

次にこの凍結乾燥粉末に２０ｍｆ０．１％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）を加え、０１８カラムによりクロマトグ
ラフ処理した。０．１％ＴＦＡ中１０％〜５０％Ｃｌ３
ＣＮによる直線グラジェント溶出を行って両分を分取し
た。この様子を第４図に示す。採取した両分をＲＰ−３
０４カラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（
逆相ＨＰＬＣ）を用いて分析し、サケカルシトニンＩ標
品とほぼ同じリテンションタイムを有する両分（第２１
図中矢印で示す）を分取した。次にこの画分をＴＳＫ−
Ｇ２０００ＳＷを用いるゲル濾過ＨＰＬＣにより０．０
５％ＴＦＡ中で精製した。

この様子を第２２図に示す。サケカルシトニンＩ標品と
ほぼ同じ分子量を有する両分を分取し、半調製用ＲＰ−
３０４カラムを用いる逆相ＨＰＬＣによりさらに２回精
製し、サケカルシトニン■標品とほぼ同じ分子量を有す
る画分を分取した。この２回目の逆相ＨＰＬＣの様子を
第２３図に示す。このウナギカルシトニン誘導体含有画
分をＲＰ３０４逆相）ＩＰＬｃ及びＴＳＫ−Ｇ２０００
　ＳＷゲル濾過ＨＰＬＣにより分析したところ、それぞ
れ第２４図（Ａ）及び（Ｂ）に示す通り、サケカルシト
ニン■標品とほぼ同一の分子量を示す単一ピークが得ら
れ、均一なウナギカルシトニン誘導体が得られたことが
確認された。この均一な両分を凍結乾燥することに・よ
り２００μｇのウナギカルシトニン誘導体の白色粉末が
得られた。

第１図に本発明のサケカルシトニン誘導体遺伝子の配列
を示す。これらのオリゴヌクレオチドの化学合成は、ホ
スホトリエステル固相法を用いて行った。例えば、オリ
ゴヌクレオチドし−３１の完全に保護されたオリゴヌク
レオチドを合成するためには、４０ｍｇ　（２，２１１
ｔｓｏｌｌ　）のシトシンヌクレオシドに１５ｍｇずつ
のＣＧ、ＡＡと、１０ｍｇずつのＡＣ，ＣＣ５ＣＣ，Ｔ
ＴＳＡＴのダイマーユニットを順次反応させた。

一回の縮合操作を示せば、縮合には２０ｍｇの２．４．
１６−）ツメチルベンゼンスルホニル−３ニトロトリア
ゾリド（ＭＳＮＴ）を用い３５０μｌの無水ピリジン中
で室温１時間反応した。反応後、固型物をピリジンで洗
浄し、ジメチルアミノピリジンを触媒として用いて１０
％の無水酢酸ピリジン溶液中で室温３分間キャッピング
反応を行った。

ピリジン、ジクロルメタン溶液でそれぞれ洗浄後、３％
ＴＣＡのジクロルメタン溶液１０ｍｊ！で固型物を洗う
事により５′末端の保護基であるジメトキシトリチル（
ＤＭＴｒ）基を除去した。このあと、ジクロルメタン、
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で洗浄し、ピリジンと共
沸脱水を行う事によって反応容器中の水分を完全に除き
、次の回の縮合反応へと続ける。ＤＭＴｒ基の除去率に
よって算出した平均の縮合収率は９１％であった。

次に４０　ｍ　ｇのヌクレオシドレジンにより連続縮合
反応によって合成したＬ−３１の保護基を含むオリゴヌ
クオチドに対して、０．５　Ｍ’のピリジンアルドキシ
ムとテトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）の５０％ジオキ
サン水溶液を１．５ｍｌ加え、３０℃で２日間反応した
。濃縮して溶媒を回収した後、封管中で２２％アンモニ
アを含むピリジン水溶液２ｍｌと５５℃で５時間反応し
た。

これらの反応により、ヌクレオシドとレジンとの結合が
切断され、インターヌクレオチド結合のリン酸基の保護
基と核酸塩基の保護基が除去された。

レジンを濾別により取り除き、減圧濃縮によってアンモ
ニアを除去した後、得られた５′末端に保護基を含むオ
リゴヌクレオチドをＣ−１８デイスポーザブルカラム５
ｅｐｐａｋ　（讐ａ　ｔｅｒｓ）にかけた。

１５％の濃度のアセトニトリル水溶液２０ｍｊ？をカラ
ムに流した後、３０％のアセトニトリル水溶液２ｍｌを
カラムに加えると目的物が溶離、流出する。

溶離した百分に等量の酢酸を加え半時間室温で反応して
ＤＭＴｒ基を除去した。エーテル抽出、共沸脱水によっ
て酢酸を除去した後溶媒をエタノールに置換し、ａ、ｏ
ｏｏ回転で１０分間遠心する事によりオリゴヌクレオチ
ドを沈下させた。上清を除去した後、減圧によってエタ
ノールを除き、蒸留水１００μｌに溶解した。

ＨＰＬＣによる精製は＃Ｂｏｎｄｐａｋ　Ｃ−１８（ｌ
ｌａｔｅｒｓ）カラムを用いて０．１　Ｍ　）リエチル
アミンアセテート水溶液と、アセトニトリルの溶媒系で
行った。

アセトニトリル濃度を１０％より開始し、１分毎に０．
６％の勾配で６０分間上昇させた。溶出は１分間あたり
１ｍｊ！の流速で行い目的とするピークのものをフラク
ションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ）で集めて凍結乾燥し
た。

３回にけて分取操作を行う事により１．精製されたＬ−
３１のオリゴヌクレオチドを２１０Ｄ（２６０ｍＭで測
定）得た。

同様にして、他のオリゴヌクレオチドも合成した。合成
したフラグメントに対しては１次元ホモクロマトグラフ
ィー法によって純度を確認した。

オリゴヌクレオチドの物理的性状として１次元ホモクロ
マトグラフィーにおけるＲ１値を示す。

配　　列　　　　　　Ｒ１値 Ｕ　１　１６ｍｅｒ　　ＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡ
ＴＣＯ，１４Ｕ　２　１７ｍｅｒ　　ＴＣＴＣＴＡＣＴ
ＴＧＣＧＴＴＣＴＧ　　　　Ｏ，１７Ｕ　３１　１５ｍ
ｅｒ　　ＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧ　　　　　０
．１９Ｕ４１　　１５ｍｅｒ　　　ＧＡＡＴＴＡＣＡＴ
ＡＡＧＣＴＧ　　　　　　　　Ｏ，１７Ｕ　５　１５ｍ
ｅｒ　　ＣＡＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴ　　　　　Ｏ
，１５Ｕ　６　１７ｍｅｒ　　ＡＣＣＡＡＣＡＣＴＧＧ
ＴＴＣＴＧＧ　　　　Ｏ，１０Ｕ　７　１８ｍｅｒ　　
ＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＡＧＡＴ　　　Ｏ，１０
Ｌ　１　　８　ｖａｅｒ　　ＣＡＣＡＴＧＴＴ　　　　
　　　　　Ｏ，２６Ｌ　２　１７ｍｅｒ　　ＡＡＧＴＡ
ＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧ　　　　Ｏ，１０Ｌ　３１　
１５ｍｅｒ　　ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣＧＣＯ，１
３Ｌ　４　１５ｍｅｒ　　ＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡ
ＣＡ　　　　　Ｏ，１３Ｌ４１　　１５ｍｅｒ　　　Ｇ
ＴＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡ　　　　　　　　　Ｏ，
１５Ｌ　５　１６ａ＋ｅｒ　　ＴＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧ
ＣＴＴＡＴ　　　　Ｏ，１４Ｌ　６　１７ｗｅｒ　　Ｃ
ＡＧＴＧＴＴＧＧＴＡＣＧＣＧＧＧ　　　　Ｑ、０８Ｌ
　７　１４ｍｅｒ　　ＡＧＧＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＣＯ
，１７Ｌ　８　１３ｍｅｒ　　ＣＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡ
ＣＣＯ，２１また半数のフラグメントに対しては２次元
ホモクロマトグラフィー法（たとえば、Ｒ，Ｂａａ＋ｂ
ａｒａ等、ＮＡＲ上３３１　（１９７４）参照）又はマ
クサム、ギルバート法（たとえば、Ａ、　Ｍａｘａｓ等
、メソズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ｔ！ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６５４９９（１９８０
）参照）によって純度と塩基配列を確認した。

第２図に酵素反応によって作製したサブブロックを示す
。例えばサブブロック３−５を作製するためには、サブ
ブロックを構成する１０個のフラグメントそれぞれ１０
０ｐ　ｍ　Ｊを蒸留水で希釈して９μｍとし、１０ＩＩ
ｃｉのｒ　−（”　ｐ）　ＡＴＰ（３１００ｃｉ／−Ｉ
Ｉｌｏｌ）を加え、溶液を５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸、
ｐＨ９，６，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、２ｍＭスペルミン
、１００ｍＭ　　ＭＣＩ！　、　１０ｍＭＤＴＴになる
様に調整し、４単位のポリヌクレオチドキナーゼを加え
全容積を１５μｌとした。３７℃で３０分間反応する事
により５′末端を３２　ｐでラベルした。次にすべての
５′末端をリン酸化するために１ｎｍｏｊ２のＡＴＰと
１単位のポリヌクレオチドキナーゼを加え３７℃で６０
分間反応させた。

反応後１０個のフラグメントを混合し、ｃ−１８デイス
ポーザブルカラム５ｅｐｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）を用い
て前述した方法で精製した。溶離したＤＮＡ溶液を濃縮
しエタノール沈澱処理を行ってＤＮＡを沈下させた。上
滑を除去した後減圧によってエタノールを除き乾固物を
４０ｔｔｌｌのりガーゼ緩衝液（２５ｍＭＮ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジンＮ’−２−エタンスルホン酸（
Ｈ１ｌｉＰＨ３）　ｐＨ７，８，７，５ｍＭＭｇＣｊ！
　ｚ）に溶解した。この溶液を１．５ｒｒｌ容エツペン
ドルフチユープに入れ、６５℃で１０分間、４２℃で３
０分間加熱した後、０℃において１０個のフラグメント
を接着させた。このＤＮＡ溶液を０．２ｍＭのＡＴＰ、
６ｍＭのＤＴＴを含むリガーゼ緩衝溶液とし、Ｔ４リガ
ーゼ８単位を加え、全容量を５０μｉとし、１２℃で１
６時間反応させた。

反応溶液を一部取り出し１２％のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で検討した。ゲルは７Ｍ尿素を含んだものと
含まないものの２種類を用い、電気泳動を行った後ラジ
オオートグラフィーを行い、デンシトメーター（Ｈｅｌ
ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて反応物の
組成を検討した。その結果７８塩基と９３塩基に相当す
るＤＮＡが１５％と２７％の割合で生成していた。同様
にして他のサブブロックを合成した。

合成収率は次の通りであった。

サブブロック　　　　　　　（％） サブブロックを集合、連結してヌクレオチド配列の全体
を製造した。すなわち、サブブロック３−５と３−７の
りガーゼ反応終了後の反応液各４５μｌを１．５ｒｒｌ
容エフペンドルフチユーブ内で混合し、６５℃で１０分
間、４２℃で３０分間加熱した後、０℃においてサブブ
ロックＤＮＡ相互を接着させた。このＤＮＡ溶液に新た
に３０　ｎｍｏｌのＡＴＰと５００　ｎ　ｖａｏｌｌの
ＤＴＴを加えＴ４リガーゼ１２単位を加えて全量を１０
０μｌとし１２℃で１６時間反応させた。

反応物の組成を検討すると１１３塩基と１１５塩基の対
合に相当するＤＮＡが全体の２３％の割合で生成してい
た（第３図参照）。

次に上記の反応溶液全量を７Ｍ尿素を含む１２％のポリ
アクリルアミド電気泳動により分離した。

ラジオオートグラフィーにより目的のＤＮＡを確認した
のち、その部分のゲル片を切り出して透析チューブに入
れ、８９ｍＭトリスホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ緩衝液を満
たしシールした後、同緩衝液中で５０Ｖの定電圧で１２
時間電気泳動する事によりゲル中のＤＮＡを溶出させた
。次にＤＮＡを透析チューブより取り出し凍結乾燥し、
乾固物を１００μｌの蒸留水に溶解して、イオン交換デ
ィスポーザブルカラムＥｌｕｔｉｐ−ｄ（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いて精製した。

製造した全遺伝子はすべてＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼとＡＴＰを用いて５′末端をリン酸化した。

プラスミドｐＨＴ２の旦ｐａＩ−Ｃ１ａｌ断片に且匹１
１Ｃ工ａｌの制限酵素認識配列が再生するようにサケカ
ルシトニン遺伝子を組み込んだ組み替えプラスミドを造
成した（第４図参照）。

すなわち、ｐＨＴ２の２０ｕｇを１００　、Ｉｆ　Ｉｔ
のＣｊ！ａ１反応液（６ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ７，
９，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５０　ｍＭ　ＮａＣ１）中で
制限酵素Ｃ１ａｌを１０単位加え３７℃６０分間反応を
行いエタノール沈澱処理によってＤＮＡを沈下させた。

このＤＮＡ沈澱を１ＯＯＩＩＩ！の旦…１反応液（１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣｊ！
　２．１００ｍＭＸｃｊ２．７ｍＭ　βメルカプトエタ
ノール）に溶解し制限酵素且匹Ｉを１５単位加えて３７
℃９０分間反応を行った。さらに反応液に、大腸菌アル
カリフォスファターゼ（ＢＡＰ）０、ＨＢ単位を加え６
５℃３０分間反応させて５′末端を脱リン酸化した。反
応液を１００μｌのフェノールで洗浄したあと０．７％
アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）を行い、大きなりＮ
Ａ断片を電気泳動法によって回収した。

このようにして得たｐＨＴ２のＣｌ　ａ　Ｉ　−１匹Ｉ
断片Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５　ｐ　ｍｏＩｌと、５′末端に
リン酸基を含むサケカルシトニン誘導体遺伝子０．５ｐ
ｍｏｆを、Ｔ、ＤＮＡライゲーション反応液２０ｔｔｌ
！　　（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　、　ｐＨ７，８，７，
５ｍＭ　ＭｇＣｊ２ｚ　、０．２ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐ、
５ｍＭＤＴＴ）に溶解して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３単位
と２０℃１６時間反応し、そのうちの１０μｌを用いて
大腸菌株ＲＲＩに形質転換させ１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンに耐性の形質転換体を選んだ。第２図のサブブ
ロック３−５と３−７を凍結した遺伝子の形質転換株を
ＲＲＩ／ｐＳＣＴ　２と命名した。

上記形質転換株のプラスミド中のサケカルシトニン誘導
体遺伝子の塩基配列は次のようにして分析した。

すなわち、ｐＳＣＴ　２のプラスミドＤＮＡ１５μｇを
１５単位の制限酵素Ｈｐａｌを用いて切断し、大腸菌ア
ルカリフォスファターゼにより５′末端を脱リン酸化し
た後γ−（”ｐ）ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて５′末端を″′Ｐラベルした。次に１５単位の
制限酵素ＢａｍＨＩを用いて分解後目的とするＤＮＡ断
片を精製し、マクサム、ギルバート法により塩基配列を
決定した。その結果、プラスミドは設計通りの塩基配列
を有していた。

ｐＨ７３ブラスミ゛ド５μｇ及び１５ユニツトのＢａｓ
旧を緩衝液（１０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＩＪ　ｐＨ８，
０，７ｍＭＭｇＣｅ　ｚ、１００ｍＭ　ＭａｃＩｌ、　
２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）２０μｌ中で３時
間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ＪｐＨ７，２，１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｚ　、０．１ａ＋Ｍ　ＤＴＴ。

８０μＭ　ｄＮＴＰ）　２０．μβ中、１ユニツトのフ
レノウ断片と２２℃で０，５時間反応させた。フェノー
ル処理後、エタノール沈澱を行った。沈澱物を、緩衝液
（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！　ｐＨ７，５，７ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ、６０ｍＭ　ＮａＣ１、７ｍＭ　　２−メル
カプトエタノール）２０ｔｔ１１中、２０ユニ７トのＰ
ｖｕＩｒと３７℃で３時間反応させた。エタノール沈澱
後、沈澱物を緩衝液（６６ｎ＋Ｍ↑ｒｉｓ−ＨＣｊ！　
ｐＨ７，６，６，６ｍＭＭｇ（１，、Ｉ　ＱｍＭ　Ｄ　
ＴＴ、　１ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ）　２０　μｍ中、Ｔ、Ｄ
ＮＡリガーゼ２．８ユニツトと共に１５℃で２００時間
反応せた。この反応物を用いて、エシェリシャ・コリ８
８１０１株を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換
株の中から、第１４図に示すような　ｐＨ７３１プラス
ミドをもつ菌株を単離した。

１３μｇのｐｓＴ２１を４０μｌの匡■緩衝液中で１８
ユニツトのＨｉｎｆ　Ｉで３７℃３時間消化した後エタ
ノールで沈澱させた。これを８０μＭ　　ｄＮＴＰを含
む２５μｌのニックトランスレーション緩衝液中で２ユ
ニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌ−ｅｎｏｗフラグ
メントと室温で３０分間反応させた。

反応後、７０℃で５分間処理した後、フェノールで処理
し、エタノールで沈澱させた。沈澱を４０μｌの旦はり
緩衝液に溶解し、６ユニツトのＨｐａＩで３７℃１．５
時間消化した後、エタノールで沈澱させた。これを０．
０２０ＤＺ＆。ユニ、ットの旧ｎｄＩ［［リンカ−と２
０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液中で３５０ユニツトのＴ４
リガーゼで２２℃６時間反応させ、エタノールで沈澱さ
せた。これを４０ａｌｌのＨｉｎｄＩ［Ｉ緩衝液中で５
０ユニツトのＨｉｎｄｕＩで３７℃１．５時間消化した
。これを６％アクリルアミドゲル電気泳動し、２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片（１）を泳動溶出により単離した。

３μｇのｐＢＲ３２２を４０　μｍ　（７）Ｈｉｎｄｌ
ｌ［緩衝液で５０ユニツトの１１ｉｎｄＩ［［で３７℃
３時間消化した後：エタノールで沈澱させた。これを２
００μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，
０）に溶解し、０．６４ユニツトのアルカリホスホター
ゼで６５℃３０分間反応させた後、フェノールで処理し
、ＤＮＡ断片（２）をエタノールで沈澱させた。

ＤＮＡ断片（１）（約０．５μｇ）とＤＮＡ断片（２）
（約３μｇ）をＥｌｕｔｉｐ−ｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）カラムで精製した後、エタノ
ールで沈澱させた。

これを２０μβのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、３５０
ユニツトのＴ４リガーゼを加え１６℃、８時間反応させ
た。３μβのこの反応溶液（約０．６μｇＤＮＡを含む
）を用い大腸菌ＲＰＩ株を形質転換した。５０μｇ　／
　ｍ　ｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で得られた株
の中から１５μｇ　／　ｍ　ｌのテトラサイクリンを含
むＬＢ寒天培地で生育できない株を選択した。これらの
株からプラスミドを抽出し、４．４　Ｋｂ前後のプラス
ミドを検索した。さらニＨｉｎｄｌｎ、Ｒｓａ　Ｉ　％
坦コ〕、旦ｃｏＲＩ／旦憇　旧の消化パターンにより目
的のプラスミドを選択した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に従って設計された、サケカルシト
ニン誘導体の遺伝子（構造遺伝子及びその周辺部分を含
む）の全体図である。 第２図は、サケカルシトニン誘導体遺伝子の合成過程で
使用したサブブロックの構成図であって、・印は酵素に
よるリン酸基の付加を示す。 第３図は、方式（Ｉ）に従って、サブブロック３−５と
３−７とからサケカルシトニン誘導体遺伝子が生成する
ことを確認するラジオオートグラム図である。 第４図は、出発プラスミドｐＨＴ２と、サケカルシトニ
ン誘導体遺伝子ＣＴ２を含有するＤＮＡ断片から組換プ
ラスミドｐＳＣＴ　２を造成する場合の工程図である。 第５図及び第６図は本発明のプラスミド作製の系統図で
ある。 第７図はプラスミドＩ）ＬＭＣ２の作製（Ａ）、及びメ
タピロカテカーゼ（Ｃ２３０）コード領域とサケカルシ
トニン（ＣＴ）コード領域との連結部の塩基配列（Ｂ）
を示す。 第８図はプラスミドｐＰＭＣ２の作製を示す。 第９図はプラスミドｐｓｃＴ１２の作製を示す。 第１０図はプラスミドｐＵｃＴ２２の作製を示す。 第１１図はプラスミドｐＴＭＣ２の作製（Ａ）、及びメ
タピロカテカーゼ（Ｃ２３０）コード領域とサケカルシ
トニン誘導体（ＣＴ）コード領域との連結部の塩基配列
（Ｂ）を示す。 第１２図はプラスミドｐＴＭＣ２２の作製を示す。 第１３図はプラスミドｐＴＭＣ３２の作製を示す。 第１４図はプラスミドｐＨ７３１の作製を示す。 第１５図はプラスミドｐＫＴＬ・１の作製を示す。 第１６図はサケカルシトニン誘導体遺伝子の塩基配列及
びサケカルシトニン誘導体のアミノ酸配列、ウナギカル
シトニン誘導体遺伝子の塩基配列及びウナギカルシトニ
ン誘導体のアミノ酸配列、プライマーオリゴヌクレオチ
ド、並びにプローブオリゴヌクレオチドの関係を示す。 第１７図（Ａ）はファージＣＴＭ４１とプラスミドｐＴ
ｃｃＭ１とからのプラスミドｐＣＴＭ４の作製を示し、
（Ｂ）はｐＴｃｃＭ１由来ＤＮＡ断片とＣＴＭ４１由来
ＤＮＡ断片との連結部の塩基配列を示す。 第１８図はセファデックスＧ−７５カラムクロマトグラ
フイーにおける融合蛋白質の溶出（Ｂ）、及び各画分の
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲルパターン
（Ａ）を示す。 第１９図はＣＮＢｒ処理生成物のＲＰ３０４によるＣ４
逆相肝ＬＣのパターン（Ａ）、及びこれによって精製さ
れた両分のＴＳＫ　Ｇ−２００ＯＳＷカラムを用いるＩ
Ｐ（Ｂ）を示す。 第２０図は、プラスミドｐＣＴＭ　４を含有する大腸菌
により生産された融合蛋白質の精製過程を示す。 第２１図はウナギカルシト・ニン誘導体のＣ１８カラム
クロマトグラフィーによる精製の様子を示す。 第２２図はＣ１８カラムからの溶出画分のＴＳＫ−Ｇ２
００Ｏ５Ｗカラムを用いるゲル濾過による精製の様子を
示す。 第２３図は、ＲＰ−３０４カラムを用いる逆相ＨＰＬＣ
による精製の様子を示す。 第２４図は、最終画分のＲＰ３０４逆相ＨＰＬＣによる
分析の結果（Ａ）及びＫＳＫ−Ｇ２００ＯＳ−ゲルによ
る分析の結果（Ｂ）を示す。 フロントラインーーーーーーーーーーーーーマーカー （塩基数） ボトムライン ３−Ａ　３−７　反応後 第３図 旨ρＲ１ 第４図 第５図 Ｅｑ旧Ｉ 第９図 第１４図 ０９こ■ λ　＝さ 時間（分） （Ａ） 第１９図 時間（分） （Ｂ） 第１９図 Ｓ−Ｉ　Ｐ−Ｉ　Ｓ−２Ｐ−２５Ｐ−３１第２０図 フラクシヨン 第２１図 第２３図 第２４図（Ａ） 番 第２４図（Ｂ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列（ I ）： 【アミノ酸配列があります】 （配列中、ＸはＡｓｎ又はＡｓｐを表わし、ＹはＴｈｒ
   又はＶａｌを表わし、そしてＺはＳｅｒ又はＡｌａを表
   わす、）で表わされる魚類カルシトニン誘導体。 ２、次のアミノ酸配列（II）： 【アミノ酸配列があります】 で表わされるサケカルシトニン誘導体である特許請求の
   範囲第１項記載の魚類カルシトニン誘導体。 ３、次のアミノ酸配列（III）： 【アミノ酸配列があります】 で表わされるウナギカルシトニン誘導体である特許請求
   の範囲第１項記載の魚類カルシトニン誘導体。 ４、次のアミノ酸配列（ I ）： 【アミノ酸配列があります】 （式中、ＸはＡｓｎ又はＡｓｐを表わし、ＹはＴｈｒ又
   はＶａｌを表わし、そしてＺはＳｅｒ又はＡｌａを表わ
   す、）で表わされる魚類カルシトニン誘導体の製造方法
   であって該魚類カルシトニン誘導体をコードする遺伝子
   と他の蛋白質をコードする遺伝子を含有しこれらの遺伝
   子を大腸菌中で発現することができるプラスミドにより
   形質転換された大腸菌を培養して該魚類カルシトニン誘
   導体と該他の蛋白質とを含んで成る融合蛋白質を生成せ
   しめ、この融合蛋白質を回収し、回収された融合蛋白質
   を切断して前記魚類カルシトニン誘導体を遊離せしめ、
   そしてこれを採取することを特徴とする方法。 ５、大腸菌又はファージのプロモーター系、メタピロカ
   テカーゼ遺伝子又はその部分、次のアミノ酸配列（II）
   ： 【アミノ酸配列があります】 から成るサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子、
   及びターミネーターをこの順序で含んで成るプラスミド
   により形質転換された大腸菌を培養して培養菌体内にメ
   タピロカテカーゼ又はその部分とサケカルシトニン誘導
   体とを含んで成る融合蛋白質を生成せしめ、該培養菌体
   から該融合蛋白質を回収し、この融合蛋白質を切断して
   前記サケカルシトニン誘導体を遊離せしめ、そしてこの
   サケカルシトニン誘導体を採取することを特徴とする特
   許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記サケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子が
   次の塩基配列： 正鎖：【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記メタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分がメタ
   ピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列及びメタピロカテカー
   ゼ構造遺伝子の全部又は上流部分から成る特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ８、前記メタピロカテカーゼの部分がメタピロカテカー
   ゼのＮ端の約３５〜２００個のアミノ酸から成る特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 ９、前記プロモーター系が、ｌａｃＵＶ５、Ｐ＿Ｌ、又
   はｔａｃ系である特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０、ターミネーターがλｔ＿Ｌ＿１、又はｔｒｐａで
   ある特許請求の範囲第５項記載の方法。 １１、前記大腸菌がＲＢ７９１、ＨＢ１０１株、ＪＭ１
   ０３株、Ｃ６００株、ＲＲ１株、ＳＭ３２株、又はＷ３
   １１０株を宿主とする特許請求の範囲第５項記載の方法
   。 １２、前記形質転換された大腸菌がエシェリシャ・コリ
   （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐ
   ＬＭＣ２（微工研菌寄第８２２０号）、エシェリシャ・
   コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＲＲ１／ｐ
   ＰＭＣ２（微工研菌寄第８２２２号）、エシェリシャ・
   コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３
   ／ｐＴＭＣ２、（微工研菌寄第８２２３号）エシェリシ
   ャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１
   ０３／ｐＴＭＣ２２、又はエシェリシャコリ（Ｅｓｃｈ
   ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＴＭＣ３２
   （微工研菌寄第８２２１号）である特許請求の範囲第５
   項記載の方法。 １３、大腸菌プロモーター系、メタピロカテカーゼ遺伝
   子又はその部分、次のアミノ酸配列（III）：【アミノ
   酸配列があります】 から成るウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝子
   をこの順序で含んで成るプラスミドにより形質転換され
   た大腸菌を培養して培養菌体内にメタピロカテカーゼ又
   はその部分とウナギカルシトニン誘導体とを含んで成る
   融合蛋白質を生成せしめ、該培養菌体から該融合蛋白質
   を回収し、この融合蛋白質を切断して前記ウナギカルシ
   トニン誘導体を遊離せしめ、そしてこのウナギカルシト
   ニン誘導体を採取することを特徴とする特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 １４、前記ウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝
   子が次の塩基配列： 正鎖：【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、前記メタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分がメ
   タピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列及びメタピロカテカ
   ーゼ構造遺伝子の全部又は上流部分から成る特許請求の
   範囲第１３項記載の方法。 １６、前記プロモーター系がｔａｃ系である特許請求の
   範囲第１３項記載の方法。 １７、前記大腸菌がＲＢ７９１、ＨＢ１０１株、ＪＭ１
   ０３株、Ｃ６００株、ＲＲ１株、ＳＭ３２株、又はＷ３
   １１０株を宿主とする特許請求の範囲第１３項記載の方
   法。 １８、前記形質転換された大腸菌がエシェリシャ・コリ
   （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐ
   ＣＴＭ４（微工研菌寄第８２３９号）である特許請求の
   範囲第１３項記載の方法。