JPS61257187A - サケカルシトニン誘導体遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、サケカルシトニン誘導体を製造するための
遺伝子系に関し、さらに詳しくは、サケカルシトニン誘
導体をコードする遺伝子及びその製造方法、サケカルシ
トニン誘導体とメタピロカテカーゼ又はその部分との融
合蛋白質をコードするＤＮＡ断片、このＤＮＡ断片を含
有するプラスミド、並びにこのプラスミドにより形質転
換された大腸菌に関する。

〔従来の技術〕

カルシトニンは、Ｃ末端がアミド化された３２個のアミ
ノ酸からなるペプチドであり、高カルシラム血症、Ｐａ
ｇｅｔ　（ベージェット）病について治療効果が認めら
れている。このポリペプチドには、骨吸収抑制作用、骨
新生促進作用も確認されており老人性の骨粗Ｎ症に対し
ても有望視されている。

現在すでにカルシトニンは、ブタ、ウシ、ヒト、ラット
、ニワトリ、サケ、ウナギから分離され、それぞれ構造
が明らかにされている。

由来する生物種間におけるカルシトニンの血中での生理
活性を比較すると魚類の翅後腺から得られるものは、哺
乳類の甲状腺由来のものに比較して約３０倍の比活性を
示し、効力の持続時間も長い。この理由としてサケカル
シトニンにおいては、他のカルシトニンと較べて血中で
不活性化されにくいことが、例えば、Ｈ，Ｃｏｐｐ等、
カルシトニン、プロシーディンゲス・オブ・セカンド・
インターナショナル・シンポジウム（Ｃａｌｃｉｔｏｎ
ｉｎ＋　Ｐｒｏｃ。

２ｎｄ、　Ｉｎｔ、　Ｓｙｍｐｏ、）ロンドン、ハイネ
マン２８１（１９８１）により報告されている。このた
め、サケカルシトニンが特に医薬として使用するのに有
利である。現在治療用のカルシトニンとして市販されて
いるものは、ブタ、サケ、ウナギのカルシトニンである
が、これらは生体から抽出したりまたは化学的に合成す
ることによって得られている。しかしその生産量はわず
かでありまた高価である。

従ってサケカルシトニンを経済的、且つ大量に製造する
ことができる新規な方法の開発が強く望まれている。更
にカルシトニンの生理活性を有し、より容易に製造し得
るその誘導体の開発もまた要望されている。

このような目的を達成するためには遺伝子操作技術を用
いる方法が最も好ましい。特開昭５８−２０３９５３に
はヒトカルシトニンの化学合成遺伝子と大腸菌における
その発現が記載されている。特表昭５８−５０１１２１
にはヒトカルシトニンの前駆体遺伝子が記載されている
。特表昭５９−５０１０９５にはヒトカルシトニンの化
学合成遺伝子とその発現について記載されている。また
、特表昭５９−５０１２４３には天然由来ヒトカルシト
ニン遺伝子及びその発現について記載されている。

しかしながら、サケカルシトニン遺伝子又はその誘導体
の遺伝子の合成及び大腸菌における発現についてはまだ
記載されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この発明は、前記のごとく最も有望視されているサケカ
ルシトニンを経済的、且つ大量に製造するための新規な
方法を開発する事を最終目的とし、その前提としてサケ
カルシトニン誘導体遺伝子系を提供する事を目的とする
。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、次のアミノ酸配列： Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
ＧｌｎＴｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｙ　　　’ で表わされるサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝
子及びその製造方法；この遺伝子及びメチオニンのコド
ンＡＴＧを介してその上流に位置するメタピロカテカー
ゼ遺伝子又はその部分から成るＤＮＡ断片；このＤＮＡ
断片をプロモーター系とターミネータ−系との間に有す
るプラスミド；並びにこのプラスミドにより形質転換さ
れている大腸菌を提供することにより解決される。

〔具体的な説明〕

（１１カルシトニン″亭′告゛　云　とそのＡこの発明
に係るサケカルシトニン誘導体は次のアミノ酸配列： ＋　　　　！　　　　３　　　４　　　５　　　　＆　
　　　？　　　　ＩＩ　　　　９　　　１０Ｃｙｓ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａ
ｌ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＩＩ　　　　Ｉｆ　　　ＩＩ　　　
１４　　　Ｉｓ　　　１６　　１？　　　１８　　１９
　　　！０Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ！ｌ　　　０
　　２２　　　ｆｆ１４　　　！Ｓ　　　！＆　　　！
？　　　！ｌ　　　！９１１１Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ
　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｙ３１　　　３ｍ　　　　！３ Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ を有し、天然サケカルシトニンＩの３２個のアミノ酸の
Ｃ末端に追加のアミノ酸であるグリシンを有する。

このペプチドをコードする構造遺伝子中には５個の反復
するロイシン（Ｌｅｕ）を含む領域が存在し、このよう
な強いホモロジーを有する二重鎖ポリヌクレオチドは合
成が困難であると言われていた（例えば、Ｊ、ウインダ
ス等、ユニりレインク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）＋　１０＋６６
３９　（１９８２）参照〕。

このアミノ酸配列には、遺伝暗号の縮重の故に、この蛋
白質の暗号を構成するヌクレオチド配列が多数存在する
。この様な場合には大腸菌の中でよく使用されている、
あるいは高発現をしている蛋白質において好んで用いら
れているトリヌクレオチドコドンを使用することが一般
にすすめられている。しかしサケカルシトニンのように
、同一アミノ酸が反復して存在する領域を持つ構造遺伝
子の場合には、特定のヌクレオチド配列の選択では目的
とする遺伝子を合成することはできない。このため本発
明においては、第一に構造遺伝子の合成に係るオリゴヌ
クレオチド相互のハイブリダイゼーションの強さを理論
的に求め、第二に好ましくないハイブリダイゼーション
の自由エネルギーを上回るような値を、オリゴヌクレオ
チドの正しい相補的な接続部位に与えるようにアミノ酸
のコドンを選択することによって好ましいヌクレオチド
配列を例えば次のように決定する。

玉鎖：　ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ−負鎖
：　ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ−ＴＧＣＧ
ＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＣ；ＡＧＴ−ＡＣＧＣＡＡ
ＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ−ＣＡＧＧＡＡＴＴＡ
ＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ−ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡ
ＴＴＣＧＡＣＧＴＴ−ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣ
ＡＡＣＡＣＴ−ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＧ
ＴＧＡ−ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡ
ＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡこの遺伝子のヌクレオ
チド配列の最初にメチオニンのコドンを、末端に終止コ
ドンを付加することが好ましく、特に終止コドンは複数
使用することが好ましい。また配列の両端及び内部にい
くつかの制限酵素認識部位及び切断部位を組み入れるこ
とが好ましい。上流側末端の制限酵素切断部位のヌクレ
オチド配列を選択することにより、構造遺伝子を効果的
にｍＲＮＡへ転写させることができる。

制限酵素切断部位を付加した好ましい具体例を第１Ａ及
びＢ図に示す。

上記のような遺伝子の合成に当っては、（１）該遺伝子
の塩基配列の部分を構成する複数のオリゴヌクレオチド
フラグメントを合成し、（２）該フラグメントを連結す
ることによって複数のサブブロックを作製し、（３）該
サブブロックを連結するのが好ましい。

以下に構造遺伝子の人工合成における配列の確立及び製
造法についてさらに詳細に述べる。

大腸菌内で、高発現される蛋白質において好んで用いら
れるトリプレットコドン（例えば、ＲｏＧｒａｎ　ｔｈ
ａａ＋等ニュークレインク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）＋　　９４
３　（１９８１）参照）をサケカルシトニン誘導体のア
ミノ酸配列にあてはめて好ましい二本鎖ヌクレオチド配
列を選び、さらにそのＮ末端に遺伝子の転写と翻訳の開
始をコードする部分、必要に応じて挿入された融合さる
べきポリペプチドをコードする部分、及びメチオニンの
コドンを、Ｃ末端に翻停止コドンを、更にまたプラスミ
ドベクターに挿入するためのヌクレオチド配列を両端に
付加する。この二本鎖ヌクレオチド配列を適当な長さの
オリゴヌクレオチドに分割する。

本発明者らは、オリゴヌクレオチドの接着と結合にかか
わる反応、アニーリング反応とライゲーション反応、を
常に好結果に導く構造遺伝子のヌクレオチド配列を見い
出した。また、結合を行うために集合された複数のオリ
ゴヌクレオチド相互において、設定された接着部位のハ
イブリダイゼーションの自由エネルギーが他のすべての
好ましくないクロスハイフ゛リダイゼーションを与える
自由エネルギーより充分に負の値であれば反応において
常に好結果が得られることを本発明者らは見い出した。

ハイブリダイゼーションの自由エネルギーの値は、ＲＮ
Ａのヌクレオチド配列におけるアテエニュエーター構造
のハイブリダイゼーションの強さを推定する計算方法〔
例えば、１．　Ｔｉｎｏｃｏ、　Ｊｒ等ネイチュアー・
二ニー・バイオロジー（ＮａｔｕｒｅＮｅｗ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）　２４６４０　（１９７３）参照〕を用いて求
められる数値で代替することが行われているようである
。本発明者らは、コンピューターを用いて第一に上記に
設定した７塩基からなるオリゴヌクレオチドの接着部位
についてハイブリダイゼーションの数値を求め、次に前
記のようにして選んだ二本鎖ヌクレオチド配列を構成す
るオリゴヌクレオチド相互のクロスハイブリダイゼーシ
ョンについて数値を求めた。両者の数値の比較により、
クロスハイブリダイゼーションが正しい接着に優先する
と判定された部分について、アミノ酸のトリプレットコ
ドンを縮重する他のコドンに置き換え、二本鎖ヌクレオ
チド配列を修正した。このような修正操作を繰り返すこ
とにより好ましいヌクレオチド配列を設定した。

第２図は従来から一般的にすすめられている方法によっ
て選択した二本鎖ヌクレオチド配列であり、第　ＩＡ、
Ｂ図はそれを修正した本発明の二本鎖ヌクレオチド配列
の例である。

具体的にはオリゴヌクレオチドＵ３及びＣ４を、Ｕ３１
及び０４１に修正した。これらのオリゴヌクレオチドは
次の様な関係にある。

−３Ｕ−４ Ｕ−３１Ｕ−４１ 対応する負値Ｌ３及びＬ４についても対合するようにＬ
３１及びＬ４１に修正する。

第２図のヌクレオチド配列に基づいてサケカルシトニン
遺伝子を合成する事は困難である。この配列においては
５つの反復するロイシンを含む領域の遺伝子を実質的に
得る事ができない。

また構造遺伝子は、クロスハイブリダイゼーションを少
なくするためにサブブロックを作製して段階的に集合、
連結することができる。サブブロック相互の接着部１位
、とじては、自由エネルギーの負の値の大きい部位を選
ぶことが好ましい。

第５図のように従来の方法に従っても目的とする遺伝子
を得る事はできるが、この方法においては合成収率が非
常に低い。

設計されたオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル法
により小ユニットから作り上げる方法、及び酵素、を用
いてオリゴヌクレオチドを連結していく方法は公知であ
る〔例えば、Ｈ，Ｈｓｉｖｎｇ等、ニュークしインク・
アシズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ）　６　１３７１　（１９７９）　、および
Ｋ。

Ａｇａｒｗａｌ等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ）　　
２２７　２７（１９７０）参照〕、オリゴヌクレオチド
を合成するためには固相ホスホトリエステル法を用いる
ことが好ましい。

１例として、オリゴヌクレオチドし−３１を合成する方
法を示せば、まず樹脂担体上に３′位の水酸基を用いて
固定されたベンゾイルシチジンの５′位の水酸基と、核
酸塩基、インターヌクレオチドリン酸基と５′位の水酸
基が保護されたダイマーユニットシチジン−グアノシン
（ＣＧ）のグアノシンの３′位の水酸基とを、リン酸基
の活性化剤を用いて縮合させる。

次に新しく付加したシチジンの５′位の水酸基の保護基
を除去してダイマーユニットアデノシン−アデノシン（
ＡＡ）と縮合させる。このようにして以下、ＡＣ％ＣＣ
，ＣＣ５ＴＴ、ＡＣのダイマーユニットを順次縮合させ
ることによって保護基を含むオリゴヌクレオチドし−３
１が合成される。

オリゴヌクレオチドし−３１は、担体樹脂につながるベ
ンゾイルシチジンの３′位の、核酸塩基、インターヌク
レオチドリン酸基とオリゴヌクレオチド鎖の先端のアデ
ノシンの５′位に存在する保護基をすべて除去すること
によって得られる。

オリゴヌクレオチドを連結して構造遺伝子を合成するた
めには、鴎素反応を用いることが好ましい、酵素ポリヌ
クレオチドキナーゼとアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）
を用いてオリゴヌクレオチドにリン酸基を付加する。こ
のオリゴヌクレオチドの複数を一旦加熱しさら、に再冷
却することによって物理的に凝集させ、酵素、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドリガーゼを作用させて、オリゴヌクレオチ
ド相互の５′末端のリン酸基と３′末端の水酸基とを縮
合させることにより遺伝子の一部を構成するサブブロッ
クを合成することができる。構造遺伝子はサブブロック
相互を同様に縮合させることにより製造できる。

なお、この発明において、サケカルシトニン誘導体の遺
伝子をＣ７０と称する。

プラスミドｐＨＴ２中にサケカルシトニン誘導体構造遺
伝子ＣＴ２を含有するプラスミドをｐＳＣＴ　２と称す
る。

このようにして得たプラスミドｐＳＣＴ　２をＥ、コリ
菌株ＲＲＩに形質転換することによって、それぞれ形質
転換株を得る。プラスミドｐＳＣＴ　２を含をする形質
転換株をＲＲＩ／ｐＳＣＴ２と称する。この菌株ＲＲＩ
／ｐＳＣＴ２は漱工研菌寄第７７７５号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−７７７５）として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。

（２）融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片一般にカルシ
トニンのような低分子量ペプチドを大腸菌で生産するに
は、まず他の蛋白質と融合した安定な高分子量蛋白質と
して採取し、これをイン−ビトロで切断して所望の低分
子量ペプチドを得ることが得策であると言われている。

このような融合蛋白質を構成する蛋白質として、本発明
のサケカルシトニン誘導体の生産においては精製の便利
等の観点からメタビロカテカーゼ又はその部分を用いる
のが好ましい。また、融合蛋白質を採取した後にこれを
切断して目的とするカルシトニン誘導体を得るために切
断部位、すなわちカルシトニン誘導体の第１アミノ酸と
メタビロカテカーゼ蛋白質のＣ末端アミノ酸の間にメチ
オニンを介在せしめるのが好ましい。

従って、本発明においては、この部分のＤＮＡ断片とし
て、例えばサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子
及びメチオニンのコドンＡＴＧを介してその上流に位置
するメタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分からなるＤ
ＮＡ断片を用いることができる。このメタビロカテカー
ゼ遺伝子又はその部分は、高い翻訳効率を得るため、メ
タピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列と、メタピロカテカ
ーゼ構造遺伝子又はその部分とから成ることが好ましい
。

メタビロカテカーゼ構造遺伝子部分の大きさは広範囲に
変えることができ、例えばメタピロカテカーゼの約３５
〜２００個のアミノ酸をコードする構造遺伝子を使用す
ることができる。この発明において、メタピロカテカー
ゼの３７個、９７個、１４２個、及び１９７個のアミノ
酸をコードする構造遺伝子を用いた場合、いずれも本発
明のサケカルシトニン誘導体のペプチドを含む融合蛋白
質が発現されることが確認された。

（３）光里工旦困亙上 本発明の発現プラスミドは、大腸菌又はファージのプロ
モーター系、前記融合蛋白質遺伝子、及びターミネータ
−系をこの順序で含む大腸菌プラスミドである。プロモ
ーター系として、例えばｌａｃＵＶ５系、ＰＬ系、ｔａ
ｃ系等を使用することができ、又ターミネータ−として
例えばλｔ　ＬＩ％　ｔｒｐ　ａ等を使用することがで
きる。

具体的には、このような発現プラスミド系として、例え
ば次の表に示すものを挙げることができプラスミド　プ
ロ　　　ターミ　　融合蛋白質のモーター　ネーター　
アミノ酸数 ｐＬＭＣ２ｌａｃＵＶ５　　Ａ　ｔ　Ｌｌ　　　　２３
１ｐＰＭＣ２Ｐ　Ｌ　　　　λｔＬ＋　　　　２３１ｐ
ＴＭＣ２ｔａｃ　　　　ｔｒｐ　ａ　　　　１７６ｐＴ
ＭＣ２２ｔａｃ　　　　ｔｒｐ　ａ　　　　　７１上記
のごとき発現プラスミドにより融合蛋白質を発現せしめ
るために使用する宿主大腸菌として、例えばＲ８７９１
株、１８１０１株、ＪＭ１０３株、０６００株、ＲＲ１
株、ＳＭ３２株、Ｗ３１１０株等を使用することができ
る。

（５）　　　　プラスミドの　１　び　　のｆＪｉ本発
明において前記のプラスミドを０作製する場合、カルシ
トニン誘導体構造遺伝子を含有する前記プラスミドｐＳ
ＣＴ　２から適当な制限酵素によって該構造遺伝子を含
むＤＮＡ断片を切り出し、これを適当な発現用プラスミ
ドに組み込む。

本発明の発現プラスミドの作製の系統図を第７図及び第
８図に示す。これらの図中、（ｐＳＣＴ　２　）はカル
シトニン構造遺伝子を含む出発プラスミドであり、箱で
囲んだプラスミドは本発明の発現プラスミドである。

プラスミドｐｓＬＭＫ１はプロモーター１ａｃ［ＩＶ５
及びメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有する
プラスミドであり、このプラスミドを有する大腸菌株エ
シェリシ＋’コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ）　ＨＢＩＯＩ　／ｐｓＬＭＫ１がＦｌ！ＲＭ　Ｐ−
７６１６として、Ｗ３１１０／ｐｓＬＭＫ１がＦＥＲＭ
　Ｐ−７６１７として、ＲＲＩ／ｐｓｉ、ＭＫＩがＦｌ
ｌ！ＲＭ　Ｐ−７６１８として、そしてＲＢ７９１／ｐ
ｓＬＭＫ１がＦＥＲＭ　Ｐ−７６１９としてそれぞれ工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

プラスミドｐＨＴ３はプロモーターＰＬおよびメタピロ
カテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有するプラスミドで
あり、これを有する大腸菌ニジエリシャ・コリ　　　（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）　　　ＨＢ　　
１０１／ｐＨＴ３が　Ｆｌｌ！ＲＭ　　Ｐ−７７７６と
して、Ｃ６００／　ｐＨＴ３がＦＥＲＭ　Ｐ−７７７７
として、そして日１１０／ｐＨＴ３がＦＥＲＭ　Ｐ−７
７７８としてそれぞれ前記寄託機関に寄託されている。

プラスミドｐｓＴ２１はトリプトファン・プロモーター
／オペレーター系（ｔｒｐ　Ｐｌｏ）及びリーダー領域
を含有するプラスミドである。

プラスミドｐＴｃｃＭｌはｔａｃプロモーター及びメタ
ピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）を含有するプラスミ
ドであり、これを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＲＢ７９１／ｐ
ＴｃｃＭ１がＦＥＲＭＰ−７７８０として、そしてＪＭ
１０３／　ｐＴｃｃＭｌがＦＥＲＭ　Ｐ−７７８１とし
て、前記の寄託機関に寄託されている。

プラスミドｐＵＣ９は公知のプラスミドである（Ｊ、ビ
ニライ及びＪ、メッシング、ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｖｏｌ
　１９，２５９−２５８頁、（１９８２）　）。

プラスミドＬＭＣ２ 実施例１　〔第７図、第９図（Ａ）〕に詳細に記載する
方法により、プラスミドｐｓＬＭＫ１と、ｐＳＣＴ　２
とから発現プラスミドｐＬＭＣ２を作製する。なお、プ
ラスミドｐＳＣＴ　２は実施例１２に記載する方法によ
り作製する。このプラスミドｐＬＭＣ２には１ａｃｌｌ
Ｖ５プロモーター及びそれに続くメタピロカテカーゼ遺
伝子（Ｃ２３０）の部分の下流にフレームが整合するよ
うにサケカルシトニン誘導体の遺伝子が組み込まれてお
り、さらにその下流にλｔＬＩターミネーターが存在す
る。メタビロカテカーゼの構造遺伝子とサケカルシトニ
ン誘導体の構造遺伝子との連結部位は第９図Ｂに示す塩
基配列を有する。このプラスミドの構造遺伝子部分はメ
タビロカテカーゼの１９７個のアミノ酸、メチオニン、
及びサケカルシトニン誘導体の３３個のアミノ酸（合計
２３１個のアミノ酸）から成る融合蛋白質をコードする
。

このプラスミドを含む大腸菌ニジエリシャ・コリ（Ｅｓ
、ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）ＪＭ１０３　／ｐＬ
ＭＣ２は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第８２２０号（ＦＯＲＭ　Ｐ−９２２０）として寄託
されている。

このプラスミドにより大腸菌ＲＲＩを形質転換し、ＬＢ
培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃ
ｔｏｐｙｒａ−ｎｏｓｉｄｅ　；以下ＩＰＴＧと略す）
。存在下及び非存在下で培養し、菌体を集め、これらの
菌体から蛋白質を抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけたところ、Ｉ　ＰＴＧ存在下で約２５
．０００ダルトンの蛋白質が誘導されていることが確認
された。

また、この蛋白質はサケカルシトニンＩに対する抗体と
反応することがウェスタンプロット法により確認され、
前記約２５．０００ダルトンの発現生成物がメタピロカ
テカーゼの部分とサケカルシトニン誘導体との融合蛋白
質であることが確認された。

プラスミドＰＭＣ２ 実施例２（第７図、第１０図）に詳細に記載する方法に
よりプラスミドｐＬＭＣ２とｐＨＴ３１　とから発現プ
ラスミドｐＰＭＣ２を作製する。なお、プラスミドｐＨ
７３１はプラスミドｐＨ７３から参考例１に記載する方
法により作製する。このプラスミドはＰＬプロモーター
及びそれに続くメタビロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）
の部分下流にフレームが整合するようにサケカルシトニ
ン誘導体遺伝子が組み込まれており、さらにその下流に
λｔＬターミネーターを有する。このプラスミドの構造
遺伝子部分はメタピロカテカーゼの１９７個のアミノ酸
、メチオニン、及びサケカルシトニン誘導体の３３個の
アミノ酸（合計２３１個のアミノ酸）からなる融合蛋白
質をコードする。

このプラスミドを含む大腸菌ニジエリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＲＲＩ／ｐＰＭＣ２
は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第？
２２２号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２２２）として寄託されて
いる。

このプラスミドｐＰＭＣ２により形質転換された大腸菌
は分子量約２５，０００ダルトンのメタピロカテカーゼ
の部分とサケカルシトニン誘導体とから成る融合蛋白質
を生産することが前記のようにして確認された。

プラスミドＴＭＣ２ 実施例７　（第８図、第１３図）に詳細に記載する方法
によりプラスミドｐＴＣＣＭ＾ＸとｐＵｃＴ２２とから
発現プラスミドｐＴＭＣ２を作製する。なお、プラスミ
ドｐＴＣＣＭＡＸは実施例６（第８図、第１３図Ａ）に
記載する方法により、プラスミドｐＴｃｃＭ１から作製
する。またプラスミドｐＵｃＴ２２は実施例３〜５、及
び参考例２（第８図、第１１図、第１２図、第１７図）
に記載する方法によりプラスミドｐＳＣＴ　２、ｐＵｃ
９５．　ｐｓＴ２１、及びｐＢＲ３２２より作成する。

プラスミドｐＴＭＣ２にはｔａｃプロモーター及びそれ
に続くメタビロカテカーゼ遺伝子の部分の下流にフレー
ムが整合するようにサケカルシトニン誘導体の構造遺伝
子が組み込まれており、さらにその′下流にｔｒρａタ
ーミネータ−が存在する。メタピロカテカーゼの部分を
コードする領域とサケカルシトニン誘導体をコードする
領域との連結部分の塩基配列を第１３図Ｂに示す。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタビロカテカーゼ
の１４２個のアミノ酸、メチオニン、及びサケカルシト
ニンの３３個のアミノ酸（合計１７６個のアミノ酸）か
ら成る融合蛋白質をコードする。

このプラスミドを含む大腸菌ニジエリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＪＭ１０３／　ｐＴ
ＭＣ２は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第９２２３号（ＦＢＩ？Ｍ　Ｐ−９１２３）として寄託
されている。

プラスミドｐＴｌ’１ｃ２２ 実施例８及び９（第８図、第１４図）に詳細に記載する
方法により、プラスミドｐＴＭｃ１２とプラスミドｐＴ
ＣＣＭＡＸとから発現プラスミドｐＴＭＣ２２を作製す
る。このプラスミドｐＴＭＣ２２にはｔａｃプロモータ
ー及びそれに続くメタビロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０
）の部分の下流にフレームが整合するようにサケカルシ
トニン誘導体の遺伝子が組み込まれており、さらにその
下流にｔｒｐ　ａターミネータ−が存在する。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタピロカテカーゼ
の３６個のアミノ酸、メチオニン、及びサケカルシトニ
ン誘導体の３３個のアミノ酸（合計７１個のアミノ酸）
から成る融合蛋白質をコードする。

プラスミドＴＭＣ３２ 実施例１０　（第８図、第１５図）に詳細に記載する方
法により、プラスミドｐＴＭｃ１２と９７ＭＣ２２とか
ら発現プラスミドｐＴＭＣ３２を作製する。このプラス
ミドｐＴＭＣ３２にはｔａｃプロモーター及びそれに続
くメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）の部分の下流
にフレームが整合するようにサケカルシトニン誘導体の
遺伝子が組み込まれており、さらにその下流にｔｒｐ　
ａターミネータ−が存在する。

このプラスミドの構造遺伝子部分はメタピロカテカーゼ
の９７個のアミノ酸、メチオニン、及びサケカルシトニ
ン誘導体の３３個のアミノ酸（合計１３１個のアミノ酸
）から成る融合蛋白質をコードする。

このプラスミドを含む大腸菌ニジエリシャ・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　ＪＭ１０９／　９７
ＭＣ３２は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第嘗λ２１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−？２２　／　）とし
て寄託されている。

プラスミドｐＴＭＣ２，９７ＭＣ２２又は９７ＭＣ３２
のいずれかによって形質転換された大腸菌Ｒ８７９１株
のそれぞれを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地で一夜培養し、この培養液０．０５ｍ１を５ｍｌの
同培地に加え、３７℃にて振とう培養を行った。

いずれの菌株についてもＩＰＴＧにより誘導を行う場合
と行わない場合について試験した。誘導を行う場合には
終濃度が１ｍＭとなるようにＩ　ＰＴＧを加えた。培養
は合計８時間行った。

培養後、培養液菌体を集め、その全蛋白質を抽出し、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。

その結果、ｐＴＭＣ２を有する株では分子量約１９．０
００、ｐＴＭＣ３２を有する株では分子量約１４．００
０のそれぞれの蛋白質が、ＩＰＴＧの添加により顕著に
誘導されていることが見出された。（ｐＴＭＣ２２を有
する株では分子量約８．０００の蛋白質の著量の生成は
認められなかった。） 前記の各種の発現プラスミドを大腸菌に導入することに
より融合蛋白質生産性の大腸菌株を得ることができる。

このための宿主として、例えばＲ８７９１株、ＪＭ１０
３株、Ｗ３１１０株、ＲＲ１株、ＳＭ３２株等を使用す
ることができ、例えばプラスミドｐＬＭＣ２を用いる場
合の宿主としては一３１１０株及びＲ８７９１株が好ま
しい。

培養は常法に従って、例えばＬＢ培地中で好気的条件下
で行う。目的プラスミドを含有する宿主を維持するため
、培地中にはアンピシリンを例えば５０μｇ　／　ｍ　
１程度添加するのが好ましい。菌体濃度が所望壇度、例
えば５５０ｎｍにおける光学濃度０．３〜０．６に達し
たとき誘導剤として１、例えばＩＰＴＧを、例えば最終
濃度が１ｍＭとなるように添加し、さらに数時間、例え
ば２〜８時間培養する。

培養終了後、遠心分離、濾過等の常法に従って菌体を分
離し、所望によりこの菌体を適当な緩衝液、例えば５０
ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液ｐ　Ｈ７
，５により洗浄する。次にこの菌体を、リゾチーム処理
、超音波処理等の常法に従って破砕し、遠心分離により
沈澱画分を回収する。所望によりこの沈澱を例えば５０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ　Ｈ７，５に再懸濁し、再
度遠心分離して沈澱を回収することにより洗浄する。

このような処理により、大部分の目的融合蛋白質が沈澱
画分中に回収され、夾雑蛋白質が上清画分中に溶存し、
除去される。このような簡単な操作によって目的とする
融合蛋白質を夾雑蛋白質から分離することができること
が、サケカルシトニン誘導体をメタピロカテカーゼとの
融合蛋白質として発現させるこの発明の大きな特徴の１
つである。

次に、こうして得られた不溶性画分をさらに精製するた
め、塩酸グアニジン水溶液に溶解し、この溶液を透析し
て塩酸グアニジンを除去することにより融合蛋白質を沈
澱せしめ、遠心分離等の方法により回収する。所望によ
り、この沈澱を塩酸グアニジン溶液に再溶解し、クロマ
トグラフィー、例えばセファデックス０７５カラムクロ
マトグラフイーによりさらに精製することができる。

次に、このようにして回収した融合蛋白質を、そのメチ
オニン部分において常法に従ってＣＮＢｒにより切断し
、目的とするサケカルシトニン誘導体を遊離せしめる。

最後に、このサケカルシトニン誘導体を、常法に従って
精製する。この精製においては、例えばＣＡＲＰカラム
クロマトグラフィー、ＴＳＫＧ　２００ＯＳ−カラムク
ロマトグラフィー等が適当である。

＋？）ｌされたサケカルシトニン嘴　体のアミノ酸分析
の結果を次の表に示す。

以下余日 表中Ｇｕｙの理論値はＣ末端にｃｘｙを有するものとし
た場合の値である。本発明により得られたペプチドのア
ミノ酸組成は目的のサケカルシトニン誘導体の計算値と
よく一致した。

またアミノ酸シーケンサ−によりアミノ酸配列の決定を
行ったところ、すべてのアミノ酸配列が目的物のそれと
同一であることが１ｉ１！認された。

本発明のサケカルシトニン誘導体はそれ自体としてカル
シトニンとしての生理活性を有する。その活性の強さは
哺乳動物に対してサケカルシトニンの１／７程度でヒト
カルシトニンと同等又はそれ以上である。従って本発明
のサケカルシトニン誘導体は、医薬として有用である。

この生理活性は次の様にして証明された。

Ｃｒｊ　：Ｗｉｓｔａｒラット　（日本チャーシス・リ
バー株式会社）を３週齢で雄のみ１２０匹購入し、１週
間馴化飼育した後、健康な動物を４週齢で１１０匹使用
した。

動物は温度２２±２℃、温度５５±１０％、換気１時間
１３回、照明１日１２時間（午前７時〜午後７時）に自
動調節した飼育室で飼育した。動物は金属製網ケージ（
２５０Ｘ　３５０　Ｘ　２００ｍｍ：日本ケージ株式会
社）に５匹ずつ収容し、同型飼料（ＭＦ？オリエンタル
酵母工業株式会社）および水道水（御殿場重言水道）を
自由に摂取させた。

被験化合物として、本発明の方法により調製したサケカ
ルシトニン誘導体（白色凍結乾燥品）（ＳＧＥ−１と称
する）、及び市販のサケカルシトニンＩ（白色凍結乾燥
品）（ＣＴと称する）を使用した。

これらの被験物質を下記の溶媒に溶解し、１０、０００
　ｎ　ｇ　／　ｍの被験液を調製した。

クエン酸ナトリウム　　　１．３ｍＭ クエン酸　　　　　　　　２２ｍＭ 塩化ナトリウム　　　　　１２０ｍＭ ゼラチン　　　　　　　　０．１６％ ｐ　Ｈ６，０ ＳＧＥ−１は最高投与量を４００　ｎ　ｇ　／　ｋｇと
し、以下公比、尼−で２８３．２００，１４１，１００
．７１および５０ｎｇ／ｋｇの７用量を、ＣＴは最高投
与量を４０ｎｇ／ｋｇとし、以下公比２で２０．１０お
よび５ｎｇ／ｋｇの４用量を設定した。被験液は投与液
量が体重１００ｇにつき１ｍｌになるように各用量につ
いて溶媒を用いて希釈調製した。

動物は被験法投与前日の午後６時より絶食し、無作為に
１１０匹を１群１０匹として１１群にふり分け、体重を
測定した。この体重をもとに被験液を体重をもとに被験
液を体重１００ｇあたり１．０ｍｆの割合で尾静脈内投
与した。投与後正確に１時間経過した時から動物をエー
テル麻酔下で腹大動脈より採血した。血液は室温で約１
時間放置してから、３０００ｒｐｍ　１０分間遠心分離
し、血清を採取した。得られた血清はＯ−Ｃｒｅｓｏｌ
ｐｈｔｈａｉｅｉｎ　Ｃｏｎｐｌ−ｅｘｏｎｅ法でのカ
ルシウム濃度測定に用いた。カルシウム濃度測定には臨
床検査自動分析装置ＪＣＡ−ＶＸ１０００　（日本電子
株式会社）を用い、二重測定した平均値をカルシウム濃
度測定値とした。　　　　　−得られたデータは、まず
Ｂａｒｔｌｅｔの方法で各群の等分散性の検定を行い、
等分散性は否定されなかったので２×３点の平行線検定
によりＣＴに対する５ＧＥ−１の比活性を求めた。結果
を次の表に示す。

ＣＴ投与群では１０〜４０ｎｇ／ｋｇで直線的な用量相
関がみられ、５ＧＥ−１では５０〜２８３　ｎ　ｇ　／
　ｋｇで同じく直線的な用量相関がみられた。平行線検
定法では各用量とも同数のサンプルが必要であるので５
ＧＥ−１の５０ｎｇ／ｋｇ群は検定には使用できない。

そのため、ＣＴは１０　、２０および４０ｎｇ／ｋｇ群
、５ＧＥ−１はＣＴと公比を同じにするため、７１　、
１４１および２８３ｎｇ／ｋｇ群を用いて２×３点の平
行線検定を行った。その結果単位重量あたりＣＴに対し
て５ＧＥ−１は約０．１４倍の活性に相当し、９５％信
頼限界は約０．１１〜０．１７倍であった。

本発明のサケカルシトニンはまた、その３３位のグリシ
ンを公知の方法、例えばカルボキシペプチダーゼＹによ
りアミドに転換することにより、・（Ｋ、ブレラダン、
Ｆ、ウィドマー及びＪ、Ｔ、ヨハンセン、カールスベル
グ・リサーチ・コミュニケーション（Ｃａｒｌｓｂｅｒ
ｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｎ＋ｍｕｎ、＋　４５＋２３７　；　
４５＋３６１（１９８０）　）　、３２位のプロリンが
アミド化された天然サケカルシトニンＩに転換すること
ができる。すなわち、本発明のサケカルシトニンに活性
の高いサケカルシトニン■を製造するための中間体とし
て有用である。

ス１１０エ　プラスミドＬＭＣ２の　１（７。

第１皿） ２０μｇのｐＳＣＴ　２を１５０μｌの厘Ｉ緩衝液中で
３０ユニツトの旦ＬＩで３７℃、３時間消化した後、エ
タノールで沈澱させた。０．０２０Ｄｚａ。ユニットの
）旦■リンカ−ｄ　（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）を１０ｍＭＡ
ＴＰを含む１０ｕｌのキナーゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！　Ｓｐ　Ｈ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！
ｚ　、１０ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタノール）中で４
ユニツトの　Ｔ４キナーゼと３７℃、１時間反応させた
。

この反応液５μｌと１匹■で消化したＤＮＡとを２０ｐ
ｌのＴ４リガーゼ緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
ｐＨ７，６，６，６ｍＭ）’ＩｇＣ１ｔ　、１０ｍＭジ
チオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰ）中で３５０ユニ
ツトのＴ４リガーゼと共に２２℃、５時間反応させた後
エタノールで沈澱させた。沈澱を５０μｌの５ａｌＩ緩
衝液（１０ｍＭ　ＴｒＬｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，７ｍ
　Ｍ　ＭｇＣｌ　ｇ、１７５ｍＭ　ＮａＣｊ！　、　０
．２ｍＭＨＤＴＡ。

７ｍＭメルカプトエタノール ツトのＳａｌＴで３７℃、３時間消化した。反応溶液を
６％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、６００ｂｐの
ＤＮＡ断片（１）を泳動溶出により単離した。

１ａＩｇのｐｓＬＭＫｌを１００μｌの５且１緩衝液中
で４０ユニツトのＳａｌｌで３７℃、５時間消化した後
、エタノールで沈澱させた。これを２００μβの５　０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（　ｐＨ　８．　０　）
に溶解し、０、０４ユニツトのアルカリホスホターゼで
６５℃３０分間反応させた後フェノールで処理し、エタ
ノールで沈澱させた（２）。

（１）のＤＮＡ断片（約０．　５μｇ）と（２）のＤＮ
Ａ断片（約Ｌａｇ）をＥｌｕｔｉｐ−ｄ　（商標）　（
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）カラムで精
製した後、エタノールで沈澱させた。これを２０μｌの
Ｔ４リガーゼ緩衝液に溶解し、３５０ユニツトのＴ４リ
ガーゼを加え１６℃、５時間反応させた。この反応溶液
５μｌを用い大腸菌ＲＲＩ株を形質転換した。５０μｇ
　／　ｍ　Ｉｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で得
られた株の中から１％カテコール水溶液の噴霧により黄
色を呈さないものを選択した。これらの株よりプラスミ
ドを抽出し、匡吐Ｉ，旦旦Ｉ，且且■／人■Ｉの消化パ
ターンより目的のプラスミドｐＬＭＣ　２を選択した。

１施■１　ブースミドＰＭＣ　２の　１（　７゛。

第１０図） ２０μｇのｐＬＭＣ　２を２００μｌの１遅Ｊ緩衝液中
で４０ユニツトの下刃」で３７℃で３時間消化した後、
エタノ“−ルで沈澱させた。反応溶液を０．　７％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、６００ｂｐのＤＮＡ断片（
１）を泳動溶出により単離した。

２０μｇのｐＨＴ３１を２００μ２の一影１工Ｉ緩衝液
中で４０ユニツトのＳａｌＩで３７℃で３時間消化した
後に、エタノールで沈澱させた。これを２００μβの５
　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　　（ｐ　Ｈ　８．　
０　）緩衝液に溶解し、０．０４ユニツトのアルカリホ
スホターゼで６５℃、３０分間反応させた後、フェノー
ルで処理し、エタノールで沈澱させた。この反応溶液を
０．　７％アガロースゲル電気泳動し、５．　２　Ｋ　
ｂのＤＮＡ断片（２）を泳動溶出により単離した。

（１）のＤＮＡ断片（約３μｇ）と（２）のＤＮＡ断片
（約５．５Ｋｂ）をＥｌｕｔｉｐ−ｄＴＭ（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ　＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）カラムで精製した後エ
タノールで沈澱させた。これを２０μｌのＴ４リガーゼ
緩衝液に溶解し、３５０ユニツトのＴ４リガーゼを加え
１２℃で２４時間反応させた。

この反応溶液１０μｌを用い大腸菌ＲＲＩ株を形質転換
し、３２℃で５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒
天培地上で一晩培養した。これをさらに４２℃で１時間
培養後、１％カテコール水溶液の噴霧により黄色を呈さ
ないものを選択した。

５０μｇ　／　ｍ　１のアンピシリンを含むＬＢ培地で
一晩培養し、同組成の培地に１％接種し、さらに培養し
た。ＯＤ，、。＝０．３において３２℃から４２℃に昇
温しさらに３時間培養した。培養液１ｍｌｌを遠心し、
沈澱を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、２５．０００ダルトンの蛋白質が大きく誘導
される株を選択した。これらの株からプラスミドを抽出
し、５．　２　Ｋ　ｂ前後のプラスミドを検索した。次
にＳａｉｌ消化パターンにより予想される大きさのＤＮ
Ａ断片を示すものを選択した。これらのプラスミドで大
腸菌ＳＫ３８３株を形質転換し、その株からプラスミド
を抽出し、Ｃ１ａＩの消化パターンにより目的のプラス
ミドを選択した。

ノＥＪｉセ１」ユ　プラスミドＳＣＴ１２の乍１第８゛
。

第１１図） 大腸菌ＳＫ３８３／　ｐＳＣＴ　２株から得られたプラ
スミドＤＮＡ５，ｃｏｇを１００１！（７）旦１ａ　Ｉ
　９５４衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ！！、ｐ　Ｈ
　７．　５、７　ｒｒｔＭ　ＭｇＣｌｚ　、７ｍＭ２−
メルカプトエタノ　・ル）中２８ユニツトのＣ１ａＩと
共に３７℃、５０分間反応させた後、フェノール抽出を
行い、エタノールにより沈澱させた。次にこれを０．２
ｍＭのｄＧＴＰ．　ｄＡＴＰ，　ＴＴＰ，　ｄＣＴＰを
含む２０μｌの二フクトランスレーション緩衝液（　５
　０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！、ｐ　Ｈ　７．　２
、１０ｍＭＭｇＳＯｎ　、１　ｍＭジチオスレイトール
）に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■・ラージフラ
グメント５ユニツトを加え、２２℃、３０分間反応させ
た。フェノール抽出およびエタノール沈澱を行った後、
活性化した５ａｌｌリンカ−０，０２０Ｄとともにリガ
ーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ７０
０ユニツトを加え、１２℃、１２時間反応を行った後、
エタノール沈澱を行った。これをΣａｌｌ緩衝液５０μ
ｌに溶解し、２４ユニツトの主１Ｉを加えて３７℃、１
２０分間反応させた。

６５℃、１０分間の熱処理を行い、さらにエタノール沈
澱を行った。これをリガーゼ緩衝液２００μｌに溶解し
、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ１７０ユニツトを加えて　２２℃
、５時間反応を行った。この反応液５０μｌを用い、０
８１０１株の形質転換を行った。

アンピシリン５０μｇ／ｍｌｌを含むＬＢ寒天培地上で
得られた形質転換株からホルメス及びクイグレイの方法
（Ｄ、Ｓ、ホルメス及びＭ、クイグレイ、アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ
、）Ｖｏｌ　１１４．１９３−１９７（１９８１）　）
によって抽出したプラスミドのうち、Ｓａｌ　Ｉ消化、
および５ａｌＩ−Ｈｐａに重消化のパターンにより、目
的のプラスミドｐｓｃＴ１２を選択した。

−：：！；：：１．１）１；（１−：１；！１）［，２
，；１ユ　プラスミドＵＣＴ１２の　曹　（８・。

第１２図） （ｉ）１０μｇのｐＵｃ９をＨｉｎｄＩ［Ｉ緩衝液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ／！　、　ｐ　Ｈ７，５，７ｍＭ
　ＭｇＣｊ！　ｚ　。

６０　ｍＭ　ＮａＣ１）１００．ｃｌに溶解し、３５ユ
ニツトのＨｉｎｄＩ［Ｉを加えて３７℃、２時間反応さ
せて消化した後、エタノール沈澱を行った。

（ｉｉ　）この沈澱にニックトランスレーション緩衝液
２０ｔｔｌを加え、各２ｍＭのｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ＴＰＰを含む溶液２μｌ、および大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメント２．５ユ
ニツトを加え、２２℃、３０分間の反応を行い、反応終
了後フェノール抽出およびエタノール沈澱を行った。

（ｉｉｉ　）これにリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊ！、ＡＴＰＳｐＨ７，６）２０μｌおよび活
性化したＸｈｏＩリンカ−ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）０．
０２０　Ｄを加えて混合し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ
３５０ユニットを加え、１２℃で１２時間反応を行った
。

（１ｖ）この反応物をエタノール沈澱させた後、１００
μｌの旦ａｌｌ緩衝液に溶解した。この溶液にΣａｌＩ
およびＸｈｏＩをそれぞれ２５ユニット加え、３７℃で
４時間反応させた。

（ｖ）これに５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ’緩衝液
（ｐＨ８，０）１００μｌおよび大腸菌アルカリホスフ
ァターゼ０．０４ユニツトを加え、６５℃、３０分間の
反応を行った。続いて２回のフェノール抽出およびエタ
ノール沈澱を行い、この沈澱を２００　ｐ　ＩｔのＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、ｌ　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　、　ｐ　Ｈ８，０）に溶解した。

（ｖｉ）２０μＨのｐｓｃＴ１２を１００．ｃｌの且ｇ
Ｉ緩衝液に溶解し、１匹Ｉ３５ユニットを加え、３７℃
で４時間反応させて消化した後、エタノール沈澱を行っ
た。

（ｖｉ　）この消化物に対す４及ｈｏＩリンカ−の付与
および狂ＩＳＸ橡Ｉによる消化を、（ｉｉｉ　）、（ｉ
ｖ）に示したものと同様の方法により行った。さらにこ
の全量を、６％ポリアクリルアミド電気泳動に供し、エ
チジウムブロマイドで染色した後、約１２０ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを電気泳動溶出により回収した。

（ｖｉｉ）回収したフラグメント溶液に、（Ｖ）で獲・
　られたＤＮＡ溶液５０ｐｌを加え、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ
カラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ）に
よる処理を行った後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた
。

（ｉｘ）この沈澱にリガーゼ緩衝液を２０μ！、及びＴ
４　ＤＮＡリガーゼを８０ユニット加え、１６℃で１０
時間反応させた。

（ｘ）この反応液５μｌを用い、大腸菌１（８１０１株
に対して形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌｌのアンピシ
リンを含むＬＢ寒天培地（１％バタトトリプトン、０．
５％酵母エキス、１％ＮａＣ１、ｐ　Ｈ７，４，１，５
％寒天）上で生育するコロニーを得た。

（ｘｉ）得られた形質転換株から、ホルメス及びクイグ
レイ（前掲）の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、
その大きさおよび制限酵素開裂パターンがｐＵｃＴ１２
と一致するプラスミドを選択した。

フ０１倒」ユ　プラスミドｐＨｃＴ２２の作１！（第８
図第１２図） １０℃ｇのｐｔｌｃＴ１２を１００μβのＥｃｏＲＩ緩
衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　ＸｐＨ７，５，
７ｍＭ　ＭｇＣｌ！２．１００ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　、７　
ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶解し、２２ユニ
ツトのＥｃｏＲＩを加え、３７°Ｃで２時間反応させて
消化した後、エタノール沈澱を行った。この沈澱を１０
０μｌのＢａａ旧緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ
　、　ｐ　Ｈ８，０，７ｍＭＭｇＣＩｌｚ、１００ｍＭ
　ＮａＣｊ？　、　２　ｍＭ　２−　メ／Ｌ／カフ”ト
エタノール）に溶解し、２４ユニツトのＢａｍ旧を加え
、３７℃で２時間反応させて消化した。この旦ｃｏＲＩ
一旦憇旧二重消化物について、実施例４（ｖ）と同様の
方法により、５′末端の脱リン酸を行い、エタノール沈
澱を行った（１）。

３０℃ｇのｐＫＴＬ　１を１００μｌの１並ＲＩ緩衝液
に溶解し、ＥｃｏＲＩ９０ユニットを加え、３７℃で４
時間反応させて消化した後、エタノール沈澱を行った。

この沈澱を１００μｌのＢａｍ旧緩衝液に溶解し、７２
ユニツトのＢａｍ旧を加え、３７℃で２時間反応させて
消化した後、エタノール沈澱を行った。この消化物を１
％アガロースゲル電気泳動（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｂｏ
ｒａｔｅｓ　１　ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐ　Ｈ８，３）に供
し、エチジウムブロマイドで染色した後、約６００ｂｐ
のＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出により回収した。

回収したフラグメントはＥｌｕｔｉｐ−ｄカラムによる
処理を行った後、エタノールで沈澱させ、５０μ！のり
ガーゼ緩衝液に溶解した。

このフラグメント溶液２５μｌを前記のＤＮＡ消化物（
１）に加えて混合し、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼを８０
ユニット加え、１５℃で６時間反応させた。

この反応物を５μ！用い、大腸菌ＩＩ　８１０１株に対
して形質転換を行い、５０℃ｇ　／　ｍ　７！のアンピ
シリンを含むＬＢ寒天培地上で生育するコロニーを得た
。得られた形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、
その大きさおよび制限酵素開裂パターンがｐＵｃＴ２２
と一致するプラスミドを選択した。

ＩＬ例」ユ　プラスミ）’　ＴＣＣＭＡＸの乍＋（第８
図。

第１３図） ５μｇのｐＴｃｃＭｌを５０ｔｔｌの人胆■緩衝液（１
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　　ｐＨ８，０，７ｍＭ
　　ＭｇＣｌ１．．６０ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール）に溶解し、２０ユニツトのＡｖａ
ｌを加え、３７℃、２時間の反応により消化した後、エ
タノール沈澱を行った。この沈澱を２０μｌのニックト
ランスレーション緩衝液に溶解し、２ｍＭのｄＧＴＰお
よびｄＣＴＰを含む溶液２μｌ、および大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＫｌｅｎｏ−フラグメント２．５ユニツトを
加え、２２℃、３０分間の反応を行い、さらにエタノー
ルによりＤＮＡを沈澱させた。沈澱を２００μｌの８１
緩衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６，５０ｍ
Ｍ　ＮａＣｊ２、ｌ　ｍＭ　Ｚｎ５Ｏｎ、５０％グリセ
ロール）に溶解し、３ユニツトの８１ヌクレアーゼを加
えて、３７℃、１０分間の反応を行った。この反応物に
ついて、フェノール抽出およびエタノール沈澱を行った
。さらに実施例４　（ｉｉ　、　１ｉｉ）と同様の方法
によりＸｈｏＩリンカ−の付与を行った。この反応物を
用いて大腸菌ＪＭ１０３株に対する形質転換を行い、５
０℃ｇ１ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生
育するコロニーを得た。

得られた形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、そ
の大きさおよび制限酵素開裂パターンがｐＴＣＣＭＡＸ
と一致するプラスミドを選択した。

】【刃Ｅｆ１１ユ　プラスミドＴＭＣ２の乍１夏（第８
図。

第１３図） （ｉ＞１０℃ｇのｐＵｃＴ２２を５０μｌの入屁Ｉ緩衝
液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、ｐ　Ｈ７，５，７
ｍＭＭｇＣｌ　ｚ、１００　ｍＭ　ＮａＣ１、７ｍＭ　
２−メルカプトエタノール）に溶解し、２５ユニツトの
又ｈｏｌを加えて３７℃、２時間反応させた後、エタノ
ール沈澱を行った。

（ｉｉ　）実施例４（ｉｉ）と同様の手法により、Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメントによる処理を行い、エタノール沈
澱を行った。

（ｉｉｉ　）この沈澱にリガーゼ緩衝液２０μ！、およ
び活性化した旦■Ｉリンカ−０，０５０Ｄを加えて混合
し、さらにＴ、ＤＮＡリガーゼ３５０ユニツトを加え、
１２．５℃で１０時間反応を行った。

（ｉｖ　）この反応物をエタノール沈澱させた後、５０
μｌの１μｍ緩衝液に溶解し、１８ユニツトの匡Ｉおよ
び２４ユニツトのＢａｎ１ｌ［を加え、３７℃で２時間
反応させた。

（ｖ）この消化物全量を１％アガロースゲル電気泳動に
供し、エチジウムブロマイドで染色した後、約６９０Ｍ
のＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出により回収した。

（ｖｉ）５μｇのｐＴＣＣＭＡＸを５０ｐＨのＸｈｏｌ
緩衝液に溶解し、２５ユニツトのＸｈｏｌを加えて３７
℃、２時間反応させた後、エタノール沈澱を行った。

（ｖｉ）実施例４　（ｉｉ　）と同様の手法により、Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメントによる処理を行った。

（ｖｉｉ）この線状ＤＮＡに対するＨｐａＩリンカ−の
付与および旦ａｎｎｌによる消化を、（ｉｉｉ）＋（ｉ
ｖ　）と同様の方法により行った。

（ｉｘ　）この消化物の半量を１％アガロースゲル電気
泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、約３
．４　Ｋ　ｂのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶出によ
り回収した。

（ｘ）得られたＤＮＡ溶液を、（ｖ）で得られたＤＮＡ
と混合し、これをＥｌｕｔｉｐ−ｄにより処理した後、
エタノール沈澱を行った。

（ｘｉ）この沈澱にリガーゼ緩衝液２０μｌおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ１７０ユニットを加え、１６℃、８時間
の反応を行った。

（ｘ　ｉｉ　）反応物の半量を０．７％アガロースゲル
電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色した後、
約４．　Ｉ　Ｋ　ｂのＤＮＡフラグメントを電気泳動溶
出により回収した。

（ｘ　ｉｉｉ　）回収したＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１
０３株に対して形質転換を行い、５０μｇ　／　ｍ　Ｉ
ｔのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育するコロ
ニーを得た。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡ
を抽出し、その大きさが約４．ＩＫｂＯものを選択した
。

去ｍユ　ブースミドＴＭＣ１２の　ｍ）３μｇの９７Ｍ
Ｃ２を１００μｌの基底■緩衝液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−Ｈ（Ｊ　　、ｐＨ７，５，７ｗＭ　　　ＭｇＣｊ！
　ｔ　　。

１００ｎ＋Ｍ　　ＮａＣ１，７ｎ＋Ｍ　２−メルカプト
エタノール）中、１０ユニツトのＸｈｏｌを用いて３７
℃で、１５時間消化した。エタノール沈澱の後、各々０
．２ｍＭのｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰＳＴＴＰ　５ｄＣＴＰ
を含む二ｙクトランスレーション緩衝液２０μｌに溶解
し、ＤＮＡポリメラーゼ！クレノウ断片２ユニットを加
え、２２℃で３０分間反応させた。フェノール抽出およ
びエタノール沈澱の後、活性化したＨｐａＩリンカ−ｄ
ＧＴＴＡＡＣ１ｇｇとともに２０μ！のりガーゼ緩衝液
に溶解し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを７００ユニット加えて
、２２℃で８時間反応を行った。この反応液を用いて大
腸菌ＪＭ　１０３株を形質転換し、ｐＴＭｃ１２を有す
る形質転換株を選択した。

２０　Ｄ　ｇ　（７）　ｐＴＣＣＭＡＸを１００＃ｊ！
　（７）Ｈｉｎｄｍ緩衝液中、６０ユニツトのＸｈｏｌ
および５０ユニツトのＨ３ｎｄｌｆｆにより、３７℃で
３時間消化した。これをポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供した後、約６４０ｂｐのＤＮＡ断片を電気泳動溶
出により単離した。エタノール沈澱の後、このＤＮＡ断
片を１００　μｌの５ａｕ３ＡＩで緩衝液（１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　。

ｐＨ７，５，７ｍＭ　　Ｍｇ（１ｇ　、１００ｍＭ　　
ＮａＣｊ！　）中、１６ユニツトの５ａｎ３ＡＩで２時
間消化した。さらにエタノール沈澱を行い、この沈澱を
、０．２ｍＭのｄＧＴＰ。

ｄＡｔｐＳＴＴＰ　＜ｄｃＴを含むニックトランスレー
ション緩衝液２０μｌに溶解し、ＤＮＡポリメラーゼ■
クレノウ断片２ユニットを加え、２２℃で３０分間反応
させた。フェノール抽出、エタノール沈澱の後、活性化
したＨｐａｌルミｌリンカｇとともに２０μｌのりガー
ゼ緩衝液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを７００ユニッ
ト加えて、１２℃、１２時間の反応を行った。エタノー
ル沈澱の後、この反応物を５０μｌの旦肚■緩衝液（１
０＋ｗＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ！　、、ｐＨ７，５，７ｍＭ
　　ＭｇＣＪ　ｚ　、　１００ｍＭ　ＫＣＩ　。

？＋ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶解し、１８
ユニツトの厘■により、３７℃で２時間消化した。

さらにエタノール沈澱を行った後、これを５０μｉのＥ
ｃｏＲＩ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、ｐＨ
７，５，７ｍＭＭｇＣｌ　ｔ　、１００　ｍＭ　ＮａＣ
ｌ１７ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に溶解し、２
０ユニツトのＥｃｏＲＩにより、３７℃で２時間消化し
た。これをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後
、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片（断片Ａ）を電気泳動溶出
により単離した。

１０μｇのｐＴＭｃ１２をＰｓｔＩ緩衝液（１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣｊ
！ｚ　、１００ｗＭ　　ＮａＣ１。

７ｍＭ２−メルカプトエタノール）１００μ！中、４５
ユニツトのＰｓｔＩを用い、３７℃で２時間消化した。

得られたｐＴＭｃ１２ののヱｓｔｌ消化物５μｇをエタ
ノール沈澱させ、■００μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中、３
０ユニツトのＥｃｏＲＩにより、３７℃で３時間消化し
た。さらにエタノール沈澱を行った後、これを１００．
ｕの」Ｉ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７
，５，７ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、７＋ａＭ　２−メルカプ
トエタノール）に溶解し、２０ユニツトのＣ１ａｌによ
り、３７℃で２時間消化した。これをアガロースゲル電
気泳動に供した後、約１５００　ｂ　ｐのＤＮＡ断片（
断片Ｂ）を電気泳動溶出により単離した。

ρＴＭＣ１２の上１０消化物５μｇを１００μｌの且匹
■緩衝液中、２４ユニツトの且ｐｚＴを用い、３７℃で
３時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供し
た後、約１８００ｂｐのＤＮＡ断片（断片Ｃ）を電気泳
動溶出により単離した“。

上記ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ、Ｃを混合し、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ
（商標）カラムで処理し、エタノール沈澱を行った後、
２０μｌのりガーゼ緩衝液中、７００ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、１２℃、１２時間の反応を行った
。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ　１０３株を形質転換
し、９７ＭＣ２２を有する形質転換株を選択した。

大旌勇烈、プラスミドＴＭＣ３２の　ｍ第１５図） ２０μｇのｐＴＭｃ１２を１００μβの狂■緩衝液（１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、、ｐＨ７，５，７ｍＭ
　　ＭｇＣｊ！　ｚ　、６０＋＋＋ＭＫＣＩ、　７ｍＭ
　２−メルカプトエタノール）中、３０ユニツトのＡａ
ｔｎを用い、３７℃で２．５時間消化した。これをポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に供し、約４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を電気泳動溶出により単離した。このＤＮＡ断
片を１００μｌの肋■緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ　、７ｍＭ　　ＭｇＣｊ２　ｔ　、２０ｍＭＮａＣ
１，７ｍＭ　　２−メルカプトエタノール）中、２４ユ
ニツトのＡｌｕｌにより、３７℃で３時間消化した。こ
れをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、２４５ｂ
ｐのＤＮＡ断片（断片Ａ）を電気泳動溶出により単離し
た。

１０μｇの９７ＭＣ２２を１００μｌのヱ旦■緩衝液中
、４５ユニツトのＰｓｔｌを用いて、３７℃で１６時間
消化した。得られた９７ＭＣ２２のヱｓｔＩ消化物５μ
ｇをエタノール沈澱させ、１００μｌのＰｖｕＩＩ緩衝
液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ２、ｐＨ７，５，７ｍＭ
　ＭｇＣｊ！　ｚ、６０ｍＭ　ＮａＣ１、７ｍＭ　２−
メルカプトエタノール）中、３０ユニツトのＰｖｕＩ［
を用い、３７℃で２時間消化した。これをアガロースゲ
ル電気泳動に供した後、約１８００ｂｐのＤＮＡ断片（
断片Ｂ）を電気泳動溶出により単離した。

９７ＭＣ２２の上１０消化物５μｇを１００μβの旦匹
Ｉ緩衝液中、２４ユニツトの１匹■を用い、３７℃で２
時間消化した。エタノール沈澱の後、これを１００　ｕ
　ＩＩのＮｄｅＩ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ２
５ｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｔ　、　１７５ｍ
Ｍ　Ｎａ（Ｊ　、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール）
に溶解し、１８ユニツトのＮｄｅＩを加えて、３７℃で
９時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供し
た後、約１８２０ｂｐのＤＮＡ断片（断片Ｃ）を電気泳
動溶出により単離した。

上記ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ、Ｃを混合し、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ
（商標）カラムで処理し、エタノール沈澱を行った後、
２０μ！のりガーゼ緩衝液中、３５０ユニツトのＴ、Ｄ
ＮＡリガーゼを加えて１２℃、１７時間の反応を行った
。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０３株の形質転換し
、ｐＴＭＣ３２を有する形質転換株を選択した。

ｍυ２．サケカルシトニン峰導体の牢　１（１）培養 プラスミドｐＴＭＣ２を含有する大腸菌Ｒ８７９１株を
５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地ｍ
ｆ中で３７℃にて、試験管（５ガ・ｌ×２本）中で１晩
振とう培養した。次にこの培養液ＩＱｍｌを１１の同じ
培地に接種し、２時間培養した後にＩＰＴＧを最終濃度
が１ｍＭとなるように添加し、さらに６時間培養した。

（２）融合蛋白質の単離 前記のようにして得た培養液を遠心分離し、５０ｍＭリ
ン酸カリウム暖衝液（ｐ）１７．５）で洗浄することに
より約９．５ｇの菌体を得た。

この菌体を５０ｍ１！の１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５０
ｍＭリン酸カリウム暖衝液に懸濁し、これに１００ｍｇ
のリゾチームを加えて水中に３０分間置き、さらに３０
分間超音波処理することにより破砕したこれを１５００
０ｒｐ＋＊にて３０分間遠心し不溶性画分を得た。この
不溶性画分を５０ｍＡ！の７Ｍ塩酸グアニジン水溶液に
懸濁し、０℃で３０分間静置し融合蛋白を可溶化した。

この水溶液を２１の蒸留水に対し、１晩透析すると融合
蛋白は不溶性の白色沈澱となった。これを遠心し、沈澱
物を融合蛋白画分として回収した。回収した沈澱を４Ｍ
塩酸グアニジン水溶液に溶解し、セファデックス０７５
カラムクロマトグラフイーにかけた。このカラムは内径
２．５　ａｍ、高さ４５備、ベッド体積２２０　ｍ　ｌ
！であった。溶出は４Ｍ塩酸グアニジン水溶液で行った
。第１８図にその溶出パターン（Ａ）、及び各両分のＳ
ＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲルパターンＣ
Ｂ）を示す。約２０．０００ダルトンに相当する両分に
融合蛋白がほぼ単一バンドとして溶出され、夾雑蛋白質
とよく分離されている。

融合蛋白が見かけ上実際よりも高分子量の両分にも多く
溶出されるのは会合等の理由によるものではないかと考
えられる。

このカラムクロマトグラフィーにおける排除体積画分か
ら融合蛋白画分まで（Ｎ分磁１７〜２０）を回収し、次
の段階でさらに処理した。

（３）　　サケカルシトニン誘導体の単離上記のように
して得られた融合蛋白質含有画分を蒸留水２１に対して
１晩透析した後１４．ＯＯＯｒｐｍにて３０分間遠心分
離した。得られた沈澱を次のようにしてＣＮＢｒで処理
することによりメタピロカテカーゼとサケカルシトニン
誘導体を切断した。

すなわち、この沈澱に２０ｍ１の７０％蟻酸及び５００
ｍｇのＣＮＢｒを加え、混合した後、室温暗所にて２４
時間反応させた。反応終了後１８０ｍｊ？の水を加え、
凍結乾燥することにより白色粉末を得た。

この粉末を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解
し、ＲＰ３０４カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いる
ＨＰＬＣにより分画を行った。溶出０．１％ＴＦＡを含
む２６％〜４４％のア七ト二トリル水溶液の直線的濃度
勾配法により溶出した。その溶出の様子を第１９図Ａに
示す。こうして、市販サケカルシトニン■とほぼ一致す
るリテンションタイムをもつピーク画分を分取した０分
取した両分をさらに精製するためにＯ，ＯＳ％ＴＦＡ水
溶液を用いてＴＳＫＧ２０００ＳＷカラム（東洋曹達製
）による書ＨＰＬＣにかけて市販サケカルシトニンＩと
一致する分子量のピークを分取した（第１９図Ｂ）０分
取した試料の精製度をＲＰ３０４カラムによるＨＰＬＣ
及びＴＳＫＧ　２０００　ＳＷカラムによるＨＰＬＣの
溶出パターンにより検討した。

これら両ＨＰＬＣにおいても市販サケカルシトニンＩと
ほぼ一致するリテンションタイムをもつ単一ピークを示
した。

１施■ｕ、サ　カルシトニン　　　゛　−の金底 フラグメントの合成 第１Ａ及びＢ図に本発明のサケカルシトニン誘導体遺伝
子の配列の例を、第２図に比較の為の配列を示した。こ
れら第１Ａ及びＢ図及び２図に示した２３個のオリゴヌ
クレオチドの化学合成は、ホスホトリエステル固相法を
用いて行った。例えば、オリゴヌクレオチドＬ−３１の
完全に保護されたオリゴヌクレオチドを合成するために
は、４０ｍｇ（２，２μｍａｉｌ　）のシトシンヌクレ
オシドに１５ｍｇずつのＣＧ、ＡＡと、１０ｍｇずつの
ＡＣ，ＣＣ，ＣＣ５ＴＴ、ＡＴのダイマーユニットを順
次反応させた。

一回の縮合操作を示せば、縮合には２０　ｍ　ｇ　ｖ；
ｉ２．４．１６−ドリメチルベンゼンスルホニルー３−
二トロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）を用い３５０μｉの無
水ピリジン中で室温にて１時間反応させた０反応後、固
形物をピリジンで洗浄し、ジメチルアミノピリジンを触
媒として用いて１０％の無水酢酸ピリジン溶液中で室温
にて３分間キャンピング反応を行った。ピリジン、ジク
ロルメタン溶液でそれぞれ洗浄した後、３％ＴＣＡのジ
クロルメタン溶液１０ｍＩ！で固形物を洗う事により５
′末端の保護基であるジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）
基を除去した。このあと、ジクロルメタン、テトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）で洗浄し、ピリジンと共に共沸脱水
を行う事によって反応容器中の水分を完全に除き、次の
回の縮合反応へと続けた。ＤＭＴｒ基の除去率によって
算出した平均の縮合収率は９１％であった。

次に４０　ｍ　ｇのヌクレオシドレジンにより連続縮合
反応によって合成したＬ−３１の保護基を含むオリゴヌ
クオチドに対して、０．５　Ｍのピリジンアルドキシム
とテトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）の５０％ジオキサ
ン水溶液を１．５ｍｆ加え、３０℃で２日間反応した。

濃縮して溶媒を回収した後、封管中で２２％アンモニア
を含むピリジン水溶液２ｍｌと５５℃で５時間反応した
。

これらの反応により、ヌクレオシドとレジンとの結合が
切断され、インターヌクレオチド結合のリン酸基の保護
基と核酸塩基の保護基が除去された。

レジンを濾別により取り除き、減圧濃縮によってアンモ
ニアを除去した後、得られた５′末端に保護基を含むオ
リゴヌクレオチドをＣ−１８デイスポーザブルカラム５
ｅｐｐａｋ　（讐ａｔｅｒｓ）にかけた。

１５％の濃度のアセトニトリル水溶液２０ｍｌ１をカラ
ムに流した後、３０％のアセトニトリル水溶液’１ｍｌ
をカラムに加えると目的物が溶離、流出する。

溶離した両分に等量の酢酸を加え半時間室温で反応して
ＤＭＴｒ基を除去した。エーテル抽出、共沸脱水によっ
て酢酸を除去した後溶媒をエタノールに置換し、３，０
００回転で１０分間遠心する事によりオリゴヌクレオチ
ドを沈下させた。上滑を除去した後、減圧によってエタ
ノールを除き、蒸留水１００μｌに溶解した。

ＨＰＬＣによる精製はμＢｏｎｄｐａｋ　Ｃ−１８（Ｗ
ａｔｅｒｓ）カラムを用いて０．１　Ｍ　トリエチルア
ミンアセテート水溶液と、アセトニトリルの溶媒系で行
った。

アセトニトリル濃度を１０％より開始し、１分毎に０．
６％の勾配で６０分間上昇させた。溶出は１分間あたり
１ｍｊ２の流速で行い目的とするピークのものをフラク
ションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ）で集めて凍結乾燥し
た。

３回に分けて分取操作を行う事により、精製されたし−
３１のオリゴヌクレオチドを２１０Ｄ（２６０ｍμで測
定）得た。

同様にして、他のオリゴヌクレオチドも合成した。合成
したフラグメントに対しては１次元ホモクロマトグラフ
ィー法によって純度を確認した。

２１個のオリゴヌクレオチドの物理的性状として１次元
ホモクロマトグラフィーにおけるＲ２値を示す。

配　　列　　　　　　Ｒｅ　値 Ｕ　１　１６ｍｅｒ　　ＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡ
ＴＣＯ，１４Ｕ　１１　１９ｍｅｒ　　ＧＴＴＡＡＣＡ
ＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴ　　　Ｏ，０９Ｕ　２　１７ｍ
ｅｒ　　ＴＣＴＣＴＡＣＴＴＧＣＧＴＴＣＴＧ　　　　
Ｏ，１７Ｕ　３　１５ｎ＋ｅｒ　　ＧＧＴＡＡＡＣＴＧ
ＴＣＣＣＡＧ　　　　　Ｏ，２０Ｕ３１　１５＋ｍｅｒ
　　ＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧ　　　　　Ｏ，１
９Ｕ　４　１５１ｗｅｒ　　ＧＡＡＣＴＧＣＡＴＡＡＧ
ＣＴＧ　　　　　Ｏ，２１Ｕ４１　１５ｍｅｒ　　ＧＡ
ＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧ　　　　　　Ｏ，１７Ｕ　
５　　１５ｍｅｒ　　ＣＡＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴ
　　　　　　Ｏ，１５Ｕ　６　　１７ｍｅｒ　　ＡＣＣ
ＡＡＣＡＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧ　　　　Ｏ，１０Ｕ　７
　　１８ｍｅｒ　　ＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＡＧ
ＡＴ　　　　Ｏ，１０Ｌ　１　　８ｍｅｒ　　ＣＡＣＡ
ＴＧＴＴ　　　　　　　　　　　Ｏ，２６Ｌ１１　１５
ｍｅｒ　　ＣＡＣＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡ　　　　　
　Ｏ，１４Ｌ　２　　１７ｍｅｒ　　ＡＡＧＴＡＧＡＧ
ＡＧＡＴＴＧＧＡＧ　　　　Ｏ，１０Ｌ　　３　　　１
５ｎ＋ｅｒ　　　ＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＡＣＧＣＯ，
１１Ｌ３１　１５ｍｅｒ　　ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡ
ＣＧＣ０，１３Ｌ　４　　１５ｍｅｒ　　ＧＣＡＧＴＴ
ＣＣＴＧＧＧＡＣＡ　　　　　　Ｏ，１３Ｌ４１　１５
ｍｅｒ　　ＧＴＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡ　　　　　
　Ｏ，１５Ｌ　５　　１６ｍｅｒ　　ＴＡＡＧＴＴＴＧ
ＣＡＧＣＴＴＡＴ　　　　　Ｏ，１４Ｌ　６　　１７ｍ
ｅｒ　　ＣＡＧＴＧＴＴＧＧＴＡＣＧＣＧＧＧ　　　　
Ｏ，０８Ｌ　７　　　Ｉ４ｍｅｒ　　ＡＧＧＴＧＴＡＣ
ＣＡＧＡＡＣＯ，１？Ｌ　８　　１３ｍｅｒ　　ＣＧＡ
ＴＣＴＡＴＴＡＡＣＣＯ，２１また半数のフラグメント
に対しては２次元ホモクロマトグラフィー法（たとえば
、ＲｌＢａｍｂａｒａ等、ニュークレイツク・アシズ・
リサーチ（ＮＡＲ）　　１３３１　（１９７４）参照）
又はマクサム、ギルバート法（たとえば、Ａ、　Ｍａｘ
ａｍ等、メンズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６５４９９（１９
８０）参照）によって純度と塩基配列を確認した。

フラグメントによるサブブロックの　１第３回に酵素反
応によって作製したサブブロックの一部を示す。すなわ
ち、例えばサブブロック３−５を作製するためには、サ
ブブロックを構成する１０個のフラグメントそれぞれ１
００ｐ　ｍ　ｌを蒸留水で希釈して９μｌとし、１Ｏｐ
ｃｉのｒ〔γ−４，３２戸）　ＡＴＰ　　（３１００ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）を加え、溶液を５０　ｍ　Ｍ　ＴｒｉＳ
塩酸、ｐＨ９，６，１０ｍ　Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｚ２ｍＭ
スペルミン、１００ｍＭ　ＫＣｊ！　、　１０　ｍＭＤ
ＴＴになる様に調整し、４単位のポリヌクレオチドキナ
ーゼを加え全容積を１５μｌとした。

３７℃で３０分間反応する事により５′末端を３７Ｐで
ラベルした。次にすべての５′末端をリン酸化するため
にｌｎｍｏＪのＡＴＰと１単位のポリヌクレオチドキナ
ーゼを加え３７℃で６０分間反応させた。

反応後１０個のフラグメントを混合し、Ｃ−１８デイス
ポーザブルカラム５ｅｐｐａｋ　（Ｗａ　ｔｅｒｓ）を
用いて前述した方法で精製した。溶離したＤＮＡ溶液を
濃縮しエタノール沈澱処理を行ってＤＮＡを沈下させた
。上清を除去した後、減圧によってエタノールを除き乾
固物を４０μ２のリガーゼ緩衝液（２５ｍＭ　Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジンＮ’−２−エタンスルホン
酸（ＨＥＰＥＳ）　　ｐＨ７，８，７，５ｍＭＭｇＣｊ
ｌ！ｚ）に溶解した。この溶液を１．５ｍＩ！容エッペ
ンドルフチューブに入れ、６５℃で１０分間、４２℃で
３０分間加熱した後、０℃において１０個のフラグメン
トを接着させた。このＤＮＡ溶液を０．２ｍＭのＡＴＰ
、６ｍＭのＤＴＴを含むリガーゼ緩衝溶液とし、Ｔ４リ
ガーゼ８単位を加え、全容量を５０μｌとし、１２℃で
１６時間反応させた。

反応溶液を一部取り出し１２％のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で検討した。ゲルは７Ｍ尿素を含んだものと
含まないものの２種類を用い、電気泳動を行った後ラジ
オオートグラフィーを行い、デンシトメーター（Ｈｅｌ
ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて反応物の
組成を検討した。その結果７８塩基と９３塩基に相当す
るＤＮＡが１５％と２７％の割合で生成していた。同様
にして他のサブブロックを合成した。

第２図のヌクレオチド配列に基づくサブブロックは、３
−１．３−２であり、５つの反復するＬｅｕのトリヌク
レオチドコドンはフラグメントＵｌ、Ｌ２．Ｕ２．Ｌ３
．Ｕ３．Ｌ４．Ｕ４゜Ｌ５上に存在する。

合成収率は次の通りであった。

サブブロック　　　　　収率（％） ３−１　　　　　　　　０．３ この表から明らかなごとく、本発明により修正する前の
塩基配列を有するサブブロック３−１、及び３−２の収
率は非常に低かったが、この発明に係るその他のサブブ
ロックの収率は十分に高かった。

サブブロークによる　゛　−の１゛告 サブブロツクを集合、連結してヌクレオチド配列の全体
を製造した。

すなわち、サブブロック３−５と３−７のりガーゼ反応
終了後の反応液各４５μｌを１．５ｒｎＩ！容エツベン
ドルフチユーブ内で混合し、６５℃で１０分間、４２℃
で３０分間加熱した後、０℃においてサブブロックＤＮ
Ａ相互を接着させた。このＤＮＡ溶液に新たに３Ｏｎｍ
ｏｌｌのＡＴＰと５００ｎｗｏＪのＤＴＴを加えＴ４リ
ガーゼ１２単位を加えて全量を１００μｌとし１２℃で
１６時間反応させた。

反応物の組成を検討すると１１３塩基と１１５塩基の対
合に相当するＤＮＡが全体の２３％の割合で生成してい
た（第４図参照）。

次に上記の反応溶液全量を７Ｍ尿素を含む１２％のポリ
アクリルアミド電気泳動により分離した。

ラジオオートグラフィーにより目的のＤＮＡを確認した
のち、その部分のゲル片を切り出して透析チューブに入
れ、８９ｍＭ）リスホウ酸、２ｍＭＨＤＴＡ緩衝液を満
たしシールした後、同緩衝液中で５０Ｖの定電圧で１２
時間電気泳動する事によりゲル中のＤＮＡを溶出させた
。次にＤＮＡを透析チューブより取り出し凍結乾燥し、
乾固物を１００μｌの蒸留水に溶解して、イオン交換デ
ィスポーザブルカラムＥｌｕｔｉｐ−ｄ（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いて精製した。こ
うしてサケカルシトニン遺伝子を含有するＤＮＡ断片を
得た。

また、オリゴヌクレオチドを段階的に集合連結してい〈
従来の手法においては、第５図に示したような精製した
小ブロックを順次凍結していく方法も一般的に行なわれ
ている（たとえば、Ａ。

Ｇｄｄｓｔｅｉｎ等、バイオケミストリニ（Ｂｉｏｃｈ
ｍｉｓｔｒｙ）、田、６０９６　（１９８０）参照）。

第１Ａ及びＢ図のヌクレオチド配列を用い第５図の方法
でヌクレオチド配列の全体を製造したところ、それぞれ
５０ｐｍｏβのフラグメントを使用して１２２塩基と１
１６塩基が対合したＤＮＡが０．２ｐ　ｍｏｊｌ’得ら
れた。

製造した全遺伝子はすべてＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼとＡＴＰを用いて５′末端をリン酸化した。

プラスミドｐＨＴ２の１匹■、−１２ａｌ断片に、旦μ
ｍ、Ｃ１ａｌの制限酵素認識配列が再生するようにサケ
カルシトニン遺伝子を組み込んだ組み替えプラスミドを
造成した（第６図参照）。

すなわち、ｐＨＴ２の２０μｇをｉｏｏμＥのＣｌａｌ
反応液（６ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸、ｐ　Ｈ７，９，６ｍ
ＭＭｇＣ１ｔ　、　５０　ｍＭ　ＮａＣ４）中で制限酵
素−（ＪａＩを１０単位加え３７℃６０分間反応を行い
エタノール沈澱処理によってＤＮＡを沈下させた。

このＤＮＡ沈澱を１００μｌのｕ１反応液（１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ塩酸、ｐ　Ｈ７，５、？　ｍＭ　ＭｇＣｊ２　
ｔ　、１００ｍＭ　ＫＣｌ１．７　ｍＭ　βメルカプト
エタノール）に溶解し制限酵素ＨｐａＩを１５単位加え
て３７℃９０分間反応を行った。さらに反応液に、大腸
菌アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）０．０８単位を
加え６５℃３０分間反応させて５′末端を脱リン酸化し
た。反応液を１００μｌのフェノールで洗浄したあと０
．７％アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）を行い、大き
なりＮＡ断片を電気泳動法によって回収した。

このようにして得たｐＨ７２のＣ１ａｌ、１之ｌ断片Ｄ
　Ｎ　Ａ　０．５　ｐ　ｍｏｆと、５′末端にリン酸基
を含むサケカルシトニン遺伝子０．５ｐｍｏ／を、Ｔ、
ＤＮＡライゲーション反応液２０　ｐｉ　（２５ｍＭ　
ＨＥＰＥＳ。

ｐＨ７，８，７，５ｍＭ　Ｍｇ＋ｌｚ　、０．２ｍＭ　
　ＡＴＰ。

６ｍＭ　ＤＴＴ）に溶解して、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ３単
位と２０℃１６時間反応し、そのうちの１０μ２を用い
て大腸菌株ＲＲＩに形質転換させ１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンに耐性の形質転換体を選んだ。第３図のサブ
ブロック３−５と３−７を連結した遺伝子の形質転換株
をＲＲＩ／ｐＳＣＴ　２と命名した。

上記形質転換株のプラスミド中のサケカルシトニン遺伝
子の塩基配列は次のようにして分析した。

すなわち、ｐＳＣＴ　２のプラスミドＤＮＡ１５μｇを
１５単位の制限酵素ＨｐａＩを用いて切断し、大腸菌ア
ルカリフォスファターゼにより５′末端を脱リン酸化し
た後γ〔γ−：、３ミＰ）ＡＴＰ及びポリヌクレオチド
キナーゼを用いて５′末端を３２ｐラベルした。次に１
５単位の制限酵素Ｂａｎ旧を用いて分解後目的とするＤ
ＮＡ断片を精製し、マクサム、ギルバート法により塩基
配列を決定した。

その結果、プラスミドは設計通りの塩基配列を有してい
た。

ｐＨ７３プラスミド５μｇ及び１５ユニツトのＢａｎ旧
を緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，０，７
１ＩＩＭＭｇ（１，，１００ｍＭ　Ｍａｃｅ　、２ｍＭ
　β−メルカプトエタノール）２０μ！中で３時間反応
させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ｐＨ７，２，１０ｍＭ　ＭｇＣｊ
、　、　０．１ｍＭ　ＤＴＴ。

８０μＭ　ｄＮＴＰ）　２０μ！中、１ユニツトのフレ
ノウ断片と２２℃で０．５時間反応させた。フエノール
処理後、エタノール沈澱を行った。沈澱物を、緩衝液（
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ’　ｐＨ７，５、？ｍＭＭ
ｇＣｊ２．．６０ｍＭ　ＮａＣｊ２　、７ｍＭ　　２−
メルカプトエタノール）２０μρ中、２０ユニツトのヱ
ｙｕｌｌと３７℃で３時間反応させた。エタノール沈澱
後、沈澱物を緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ
７，６，６，６ｍＭＭｇＣｊ！ｚ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、
１ｍＭ　ＡＴＰ）２０μβ中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ２
．８ユニツトと共に１５℃で２００時間反応せた。この
反応物を用いて、ニジエリシャ・コリ８８１０１株を形
質転換した。アンピシリン耐性形質転換株の中から、第
１６図に示すような　ｐＨ７３１プラスミドをもつ菌株
を単離した。

１３μｇのｐｓＴ２１を４０μｌの担ゴコ緩衝液中で１
８ユニツトのＬＬＬＬ’　Ｉで３７℃３時間消化した後
エタノールで沈澱させた。これを８０＃ＭｄＮＴＰを含
む２５μｌのニックトランスレージ日ン緩衝液中で２ユ
ニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌ−ｅｎｏｗフラグ
メントと室温で３０分間反応させた。

反応後、７０℃で５分間処理した後、フェノールで処理
し、エタノールで沈澱させた。沈澱を４０μｌの旦…Ｉ
緩衝液に溶解し、６ユニツトのＴｈ■で３７℃１．５時
間消化した後、エタノールで沈澱させた。これを０．０
２０Ｄｚａｏユニツト（７）Ｈｉｎｄｌｎリンカ−と２
０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液中で３５０ユニツトのＴ４
リガーゼで２２℃６時間反応させ、エタノールで沈澱さ
せた。これを４０μｌの１１ｉＢｄＩ［［緩衝液中で５
０ユニツトのＨｉｎ　ｄｎｌで３７℃１．５時間消化し
た。これを６％アクリルアミドゲル電気泳動し、２００
ｂｐのＤＮＡ断片（１１を泳動溶出により単離した。

３μｇのｐＢＲ３２２を４０μｌの」旦ｄｌ［［緩衝液
で５０ユニツトのＷｉｎ　ｄＩ［で３７℃３時間消化し
た後、エタノールで沈澱させた。これを２００μｌの５
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）に溶解
し、０．０４ユニツトのアルカリホスホターゼで６５℃
３０分間反応させた後、フェノールで処理し、ＤＮＡ断
片（２）をエタノールで沈澱させた。

ＤＮＡ断片（１）（約０．５μｇ）とＤＮＡ断片（２）
（約３ｔｔｇ）をＥｌｕｔｉｐ−ｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）カラムで精製した後、エタ
ノールで沈澱させた。

これを２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶解し、３５０
ユニツトのＴ４リガーゼを加え１６℃、８時間反応させ
た。３μｉのこの反応溶液（約０．６μｇＤＮＡを含む
）を用い大腸菌ＲＲＩ株を形質転換した。５０μｇ　／
　ｍ　１アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で得られた株
の中から１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天培地で生育できない株を選択した。これらの株から
プラスミドを抽出し、４．４Ｋｂ前後のプラスミドを検
索した。さらＬ　Ｈｔｎ　ｄｎＩ、　　Ｒｓａ　Ｉ　５
Ｈｉｎｆ　Ｉ　ｓ　　ＥｃｏＲＩ／　Ｂａａ旧の消化パ
ターンにより目的のプラスミドを選択した。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ、及び１８図は、この発明に従って設計された、
サケカルシトニン誘導体の遺伝子（構造遺伝子及びその
周辺部分を含む）の全体図であり；第２図は、従来技術
に従って設計されたサケカルシトニン誘導体の遺伝子（
構造遺伝子及びその周辺部分を含む）の全体図であり； 第３図は、サケカルシトニン誘導体遺伝子の合成過程で
使用したサブブロックの構成図であって、・印は酵素に
よるリン酸基の付加を示し；第４図は、方式（Ｉ）に従
って、サブブロック３−５と３−７とからサケカルシト
ニン誘導体遺伝子が生成することを確認するラジオオー
トグラム図であり； 第５図は、従来技術の手法に従ってサブブロックを作製
し、これを集合、連結してカルシトニン誘導体遺伝子を
合成する工程を示し； 第６図は、出発プラスミドｐ）ＩＴ２と、この発明のサ
ケカルシトニン誘導体遺伝子ＣＴ２を含有するＤＮＡ断
片から組換プラスミドｐＳＣＴ　２を造成する場合の工
程図であり； 第７図及び第８図は本発明のプラスミド作製の系統図で
あり； 第９図はプラスミドｐＬＭＣ２の作製（Ａ）、及びメタ
ピロカテカーゼ（Ｃ２３０）コード領域とサケカルシト
ニン（ＣＴ）コード領域との連結部の塩基配列（Ｂ）を
示し； 第１０図はプラスミドｐＰＭＣ２の作製を示し；第１１
図はプラスミドｐｓｃＴ１２の作製を示し；第１２図は
プラスミドｐＵｃＴ２２の作製を示し；第１３図はプラ
スミドｐＴＭＣ２の作製（Ａ）、及びメタピロカテカー
ゼ（Ｃ２３０）コード領域とサケカルシトニン誘導体（
ＣＴ）コード領域との連結部の塩基配列（Ｂ）を示し； 第１４図はプラスミドｐＴＭＣ２２の作製を示し；第１
５図はプラスミドｐＴＭＣ３２の作製を示し；第１６図
はプラスミドｐｉ（Ｔａ２の作製を示し；第１７図はプ
ラスミドｐＫＴＬ　１の作製を示し；第１８図はセファ
デックスＧ−７５カラムクロマトグラフィーにおける融
合蛋白質の溶出（Ｂ）、及び各画分のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動のゲルパターン（Ａ）を示′シ；
そして第１９図はＣＮＢｒ処理生成物のＲＰ３０４によ
るＣ４逆相ＨＰＬＣのパターン（Ａ）、及びこれによっ
て精製された両分のＴＳＫＧ　２００ＯＳ−カラムを用
いるＨＰＬＣ（Ｂ）を示す。 １３　　　Ｌ４ １］−Ｌ４１ Ｌ６−　１７−１８− 第３図 フロントライン□ マーカー （塩基数） ボトムライン 比ｐＲＩ ＄６図 ＥｃｏＲｌ 第１１図 〈 い 画分Ｎ０ （Ａ） 画分煮 第１８図 時間ω） （Ａ） 第１９図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 で表わされるサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝
   子。 ２、次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ−負鎖：
   【遺伝子配列があります】 から成る特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 で表わされるサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝
   子の製造方法であって、（１）該遺伝子の塩基配列の部
   分を構成する複数のオリゴヌクレオチドフラグメントを
   合成し、（２）該フラグメントを連結することによって
   複数のサブブロックを作製し、（３）該サブブロックを
   連結する段階を含んで成る方法。 ４、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 から成るサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子、
   及びメチオニンのコドンＡＴＧを介してその上流に位置
   するメタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分から成るＤ
   ＮＡ断片。 ５、前記メタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分がメタ
   ピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列及びメタピロカテカー
   ゼ構造遺伝子の全部又は上流部分から成る特許請求の範
   囲第４項記載のＤＮＡ断片。 ６、前記メタピロカテカーゼ構造遺伝子の上流部分がメ
   タピロカテカーゼのＮ端の約３５〜２００個のアミノ酸
   をコードする遺伝子である特許請求の範囲第５項記載の
   ＤＮＡ断片。 ７、前記メタピロカテカーゼのＮ端のアミノ酸が１９７
   個のアミノ酸から成る特許請求の範囲第６項記載のＤＮ
   Ａ断片。 ８、前記メタピロカテカーゼのＮ端のアミノ酸が１４２
   個のアミノ酸から成る特許請求の範囲第６項記載のＤＮ
   Ａ断片。 ９、前記メタピロカテカーゼのＮ端のアミノ酸が９７個
   のアミノ酸から成る特許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ
   断片。 １０、前記メタピロカテカーゼのＮ端のアミノ酸が３７
   個のアミノ酸から成る特許請求の範囲第６項記載のＤＮ
   Ａ断片。 １１、大腸菌又はファージのプロモーター系、メタピロ
   カテカーゼ遺伝子又はその部分、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 から成るサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子、
   及びターミネーターをこの順序で含んで成るプラスミド
   。 １２、前記プロモーター系が、ｌａｃＵＶ５、Ｐ＿Ｌ、
   又はｔａｃ系である特許請求の範囲第１１項記載のプラ
   スミド。 １３、ターミネーターがλｔ＿Ｌ＿１、又はｔｒｐａで
   ある特許請求の範囲第１１項記載のプラスミド。 １４、プラスミドｐＰＬＭＣ２、プラスミドｐＰＭＣ２
   、プラスミドｐＴＭＣ２、プラスミドｐＴＭＣ２２、又
   はプラスミドｐＴＭＣ３２である特許請求の範囲第１１
   項記載のプラスミド。 １５、大腸菌又はファージのプロモーター系、メタピロ
   カテカーゼ遺伝子又はその部分、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 から成るサケカルシトニン誘導体をコードする遺伝子、
   及びターミネーターをこの順序で含んで成るプラスミド
   により形質転換された大腸菌。 １６、前記大腸菌がＲＢ７９１、ＨＢ１０１株、ＪＭ１
   ０３株、Ｃ６００株、ＲＲ１株、ＳＭ３２株、又はＷ３
   １１０株である特許請求の範囲第１５項記載の大腸菌。 １７、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
   ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＬＭＣ２（微工研菌寄第８２
   ２０号）、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
   ａ　ｃｏｌｉ）ＲＲ１／ｐＰＭＣ２微工研菌寄第８２２
   ２号）、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
   　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＴＭＣ２（微工研菌寄第８
   ２２３号）、エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
   ｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＴＭＣ２２、又はエシ
   ェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
   ＪＭ１０３／ｐＴＭＣ３２（微工研菌寄第８２２１号）
   である特許請求の範囲第１６項記載の大腸菌。