JP2740417B2 - ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 - Google Patents
ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はポリペプチドホルモン、
ヒト神経成長因子(ＮＧＦ)、組換え技術を用いたその調
製法、およびそれを含有する組成物に関する。 【０００２】 【従来の技術】 Ａ．神経成長因子 分子量〜１３０,０００の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特に雄マウスの唾液
腺に豊富に存在しており、通常神経成長因子(Ｎerve
Ｇrowth Ｆactor)と呼ばれている。この蛋白質が演じ
る主要な神経活性は、感覚レセプター(受容体)から脳へ
インパルスを伝える神経細胞、感覚ニューロンの大きさ
および循環系、腺、平滑筋およびその他の器官の機能的
活性を調節している自律神経系を構成している２種の内
の１つ、交感神経ニューロンの大きさを増大させる能力
を有する点にある。マウスの唾液腺から、中性pＨで抽
出して得られるＮＧＦは７Ｓ ＮＧＦとして知られてお
り、α、βおよびγサブユニットと呼ばれる３つのサブ
ユニットで構成されている。７Ｓ ＮＧＦの全体として
の神経活性は、非共有結合性の力で互いに結合している
２個の同一の１１８アミノ酸ペプチドのダイマーである
βサブユニットによってもたらされる。このサブユニッ
トは２．５Ｓ ＮＧＦとも呼ばれる。γサブユニットは
生物活性を持っていない。しかし、このγサブユニット
はアルギニンエステロペプチダーゼである。ＮＧＦの合
成における初期の遺伝子産物は、γサブユニットで開裂
されるプレプロ−ＮＧＦポリペプチドである。このγサ
ブユニットは、マウスに於いて傷の治療を促進させるこ
とがわかった。 【０００３】最近、第３のＮＧＦ成分(分子量〜１１６,
０００)がマウスの唾液腺から分離され、プラスミノー
ゲン活性化剤としての性質を有することが報告された。
即ち、この成分はプラスミノーゲンをプラスミンに変換
するので、血餅の溶解に利用し得ることを示唆している
(欧州特許出願７８３００６５６.２(公開番号０００２
１３９Ａ１)参照:発明の名称、「神経成長因子およびそ
の調製法」、出願日、１９７８年１１月２２日、公開、
１９７９年５月３０日)。 【０００４】既述した様に、ＮＧＦの神経活性はβサブ
ユニット(以下、βＮＧＦと言う)によってもたらされ
る。これは、中枢性アドレナリン作用性ニューロンの切
断された軸索の再生性再発芽を顕著に促進し、損傷を受
けた軸索の修復に有用な性質を持っていることがわかっ
た。 【０００５】Ｂ．組換えＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ技術は、一応成熟期に達したと言える。分
子生物学者は、各種のＤＮＡ配列をある程度容易に組換
え、形質転換された微生物および細胞培養株中で多量の
外来性蛋白質産物を生産し得る新しいＤＮＡ体をつくる
ことができる。一般的な手技手法は、各種のＤＮＡの平
滑末端あるいは粘着末端フラグメントをインビトロで結
合させ、特定の生物に形質転換するのに有用な強力な発
現ベクターを調製し、所望の外来性産物を効率的に合成
させることである。しかし、産物によっては、それを生
産する方法は依然として回りくどいものであり、常に成
功を予見し得る程には、この科学は進歩していない。事
実、基礎的な実験に基づくことなく、成功すると予想す
る者は、著しい実施不能の危険をおかしてそうするので
ある。 【０００６】主要な要素、即ち複製起源、１種またはそ
れ以上の表現型選択特性、発現プロモーター、外来性遺
伝子の挿入および残留ベクターのＤＮＡ組換えは、通常
宿主細胞の外で行なう。得られた組換え複製可能発現ベ
クターまたはプラスミドを形質転換によって細胞に導入
し、その形質転換体を増殖させることによって多量の組
換えビヒクルを得る。暗号化されているＤＮＡ情報の転
写および翻訳を支配している部分に関して適切な位置に
この遺伝子が挿入された場合は、この得られた発現ベク
ターは、挿入された遺伝子が暗号化しているポリペプチ
ド配列を生産するのに有用である。この過程は発現と呼
ばれる。要すれば宿主細胞を溶解させ、他の蛋白質から
分離精製して生産物を回収することができる。 【０００７】実際には、組換えＤＮＡ技術を使って全て
外来性のペプチドを発現させることができ(いわゆる直
接発現)、あるいはまた、ホモローガス(同種の)ポリペ
プチドのアミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス
(異種の)ポリペプチドを発現させることもできる。後者
の場合、目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂
されるまで、融合したホモローガス／ヘテロローガスポ
リペプチド内で不活性化されていることがある。 【０００８】同様に、遺伝および細胞生理を研究するた
めの細胞培養または組織培養の技術も非常に進歩してい
る。単離した正常細胞から、続々と継代(移植)して調製
した耐久セルラインを保持する手技手法を使用すること
ができる。研究に使用するには、この様なセルラインは
液体培地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄
養物を含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量
生産のためのスケールアップには機械的な問題があるだ
けである。 【０００９】同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化
学は有用な、実は必要な補助学問である。所望の蛋白質
を生産する細胞は、何百という他の蛋白質、細胞代謝の
内性産物をも生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の
蛋白質から分離しておかないと、他の化合物と同様、所
望の蛋白質による治療過程でヒトや動物に投与されると
毒性を現わすことがある。従って、当面の特定の系に適
した分離法を計画し、所望の用途に使用できる均質な安
全な生産物を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となっ
てくる。蛋白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、
そしてそれを特定化して、細胞が確実に、変化したり変
異することなく、忠実にそれを生産したことを確かめる
のにも必要である。この科学分野は更に、バイオアッセ
イや安定性試験を計画したり、臨床試験やマーケティン
グを行なう前にやらなければならないその他の手続きに
も関係している。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来、抽出
技術や合成によって、実質的に純粋な形で単離されたこ
とのないヒトＮＧＦのβサブユニットを提供するもので
ある。本発明者らは、意外にも、融合したホモローガス
蛋白質(自己蛋白質)を含んでいない成熟(mature)ポリペ
プチドの形で、β−ＮＧＦをＥ．coli(大腸菌)でヘテロ
ローガス蛋白質(外来性蛋白質)として発現させ得ること
を見い出した(これは、外来性蛋白質として認識する細
胞酵素から保護する必要があるかも知れないものであ
る)。本発明者らは、ＮＧＦのβサブユニットは、Ｅ．c
oli中で成熟蛋白質として直接発現される最も小さな蛋
白質であると信じている。 【００１１】本発明に係るβ−ＮＧＦは、神経障害の治
療またはそれに関連するその他の有用な目的に使用する
ことができる。天然に分泌されるヒトβ−ＮＧＦと同じ
であり、しかも哺乳動物由来の他の蛋白質を含んでいな
いので、ヒト以外の動物由来のペプチドホルモンをヒト
の病気の治療に使う場合と違って、本発明のβ−ＮＧＦ
が治療中に免疫原性反応をひき起すということはない。
更に、組織抽出物として得たβ−ＮＧＦに付随してお
り、それを含む組成物に望ましくない生物活性を示す哺
乳動物起源の他の蛋白質を実質的に含んでいないのが本
発明のβ−ＮＧＦであり、これは外来性蛋白質として得
られるからである。 【００１２】更に本発明は、このポリペプチドを発現し
得る形で暗号化している遺伝子配列を含んでいる複製可
能なＤＮＡ発現ベクターを提供するものである。更にま
た本発明は、この様なベクターで形質転換された微生物
株またはセルラインの様な組換え宿主細胞、およびそれ
らの培養物を提供するものである。さらに本発明は、得
られたこのポリペプチドを含有している非経口投与用の
組成物を提供するものである。 【００１３】従って、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋
白質を実質的に含んでいないヒトβ−ＮＧＦを得ること
にあり、もう一つの目的は、天然資源から抽出によって
得ることができる量より多量のヒトβ−ＮＧＦを得るこ
とにある。 【００１４】図面の説明 図１〜図３はマウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸
配列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺
伝子の特定の断片(セグメント)の相補ＤＮＡ鎖を示して
いる。図４は、β−ＮＧＦmＲＮＡの断片を含んでいる
クローンのノーザンブロット分析を示している。図５
は、マウスＮＧＦ遺伝子の部分的制限地図、および本発
明によって組み立てられたプラスミドのヌクレオチド配
列とマウスＮＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列とのおおよ
その一致を示している。図６〜図７は、組換えファージ
λhＮ８の物理的地図およびヒトゲノムを囲っている領
域を示している。図８〜図１２はヒトβＮＧＦ染色体遺
伝子のヌクレオチド配列を示している。図１３〜図１４
は、ヒトおよびマウスのプレプロ−βＮＧＦ遺伝子のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示してい
る。図１５〜図１６は、ヒトβＮＧＦの発現のために組
み立てられた遺伝子を示している。図１７〜図１９は、
ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli を形質転換
するためのプラスミドphβＮＧＦtrp１の組み立て工程
の一部を示している。 【００１５】 【課題を解決するための手段】 Ａ．宿主細胞の培養およびベクター ＤＮＡ配列を、それを発現することのできる他の配列に
有効に結合した場合、そのＤＮＡ配列を発現することが
できるベクターを発現ベクターと言う。常にはっきりと
記載することはしないが、この発現ベクターは、エピソ
ームとして、あるいは染色体ＤＮＡの組込み部分とし
て、宿主生物中で複製できるものでなければならない。
言うまでもなく、複製能を持たないものは有効に使用で
きない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であり、
この用語は特定の配列に用いられるだけでなく、その用
語には、そこに含まれる特定のＤＮＡ暗号を発現するこ
とができる全ゆるＤＮＡ配列が含まれている。一般に、
組換えＤＮＡ技術で用いられる発現ベクターはプラスミ
ドの形であることが多い。このプラスミドは、環状の２
本鎖ＤＮＡループであって、そのベクターの形では、染
色体に結合していないものを言う。プラスミドは、ベク
ターの最も普通に用いられる形であるので、本明細書に
於いては、プラスミドとベクターを交換可能な用語とし
て用いる。しかし本発明に於いては、同じ機能を有す
る、当技術分野で知られている、あるいは今後知られ得
る他の形の発現ベクターも含まれると解釈すべきであ
る。 【００１６】本明細書に於いて組換え宿主細胞とは、組
換えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベクターで形質
転換された細胞を意味する。 【００１７】本明細書に記載した方法およびベクター
は、広範囲の真核性および原核性の生物の宿主細胞に使
用することができる。 【００１８】勿論、一般的に、本発明に有用なベクター
を組み立てるに際し、ＤＮＡ配列をクローニングするの
に原核生物が好ましい。特にＥ．coli Ｋ１２株２９４
(ＡＴＣＣＮo．３１４４６)が特に好ましい。使用し得
るその他の微生物株として、Ｅ．coli Ｂ、Ｅ．coli
Ｘ１７７６(ＡＴＣＣＮo．３１５３７)などのＥ．coli
株が含まれる。これらは限定する意味で挙げたのではな
く、単なる例示に過ぎないことは言うまでもない。 【００１９】原核生物は発現にも使用することができ
る。上記の菌株の他、Ｅ．coli Ｗ３１１０(Ｆ-,λ-,
原栄養性、ＡＴＣＣＮo．２７３２５)、Ｂacillus sub
tilusの様な桿菌類、Ｓalmonella typhimuriumやＳerr
atia marcescens の様な腸内細菌群および各種のシュ
ードモナス種を使用することができる。 【００２０】一般に、これらの宿主に関しては、その宿
主細胞と適合し得る種由来のレプリコンおよび調節配列
を含んでするプラスミドベクターが使用される。このベ
クターはもともと、形質転換細胞に表現形質(表現型)の
選択性を付与することのできる標識化配列と共に複製部
位を持っている。例えば、Ｅ．coliは、Ｅ．coli種由来
のpＢＲ３２２を使って形質転換される(Ｂolivarら、Ｇ
ene ２:９５(１９７７))。pＢＲ３２２はアンピシリン
およびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでお
り、従って、これは形質転換細胞を同定するための簡単
な手段となる。このpＢＲ３２２プラスミドやその他の
微生物プラスミドは、その微生物がそれ自身の蛋白質を
発現するのに使用することのできるプロモーターを含ん
でいなければならず、あるいは含む様に改良されなくて
はならない。組換えＤＮＡの組み立てに通常用いられる
プロモーターにはβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)お
よびラクトースプロモーター系(Ｃhangら、Ｎature ２
７５:６１５(１９７８);Ｉtakuraら、Ｓcience １９
８:１０５６(１９７７);Ｇoeddelら、Ｎature ２８１:
５４４(１９７９))およびトリプトフアン(trp)プロモー
ター系(Ｇoeddelら、Ｎucleic Ａcids Ｒes．８:４０
５７(１９８０);ＥＰＯ Ａppl Ｐubl Ｎo．００３６
７７６)がある。これらが最も普通に用いられている
が、その他の微生物プロモーターも発見され、使用され
ており、それらのヌクレオチド配列は詳細に発表されて
いるので、当業者であれば、それらをプラスミドベクタ
ーに機能的に結合させることができる(Ｓiebenlistら、
Ｃell ２０:２６９(１９８０))。 【００２１】原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微
生物も使用することができる。Ｓaccharomyces cerevi
siae、普通のパン酵母は、真核微生物中最もよく使用さ
れるものであるが、その他の多くの株も使用される。Ｓ
accharomyces中で発現させるには、例えばプラスミドＹ
Ｒp７(Ｓtinchcombら、Ｎature ２８２:３９(１９７
９);Ｋingsmanら、Ｇene ７:１４１(１９７９);Ｔsche
mperら、Ｇene １０:１５７(１９８０))がよく用いら
れる。このプラスミドは、トリプトフアンを生産する能
力を欠いている酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮ
o．４４０７６またはＰＥＰ４−１(Ｊones,Ｇenetics
８５:１２(１９７７))にとって選択マーカーとなるtrp
１遺伝子をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの
特徴としてのtrp１損傷が存在することは、トリプトフ
アンの非存在下に発育させることによって形質転換体を
検出する有効な環境を提供することになる。 【００２２】酵母ベクター中の適切な促進(promoting)
配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Ｈitzeman
ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２５５:２０７３(１９８０))ま
たは他の解糖酵素(Ｈessら、Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒe
g．７:１４９(１９６８);Ｈollandら、Ｂiochemistry
１７:４９００(１９７８))、例えばエノラーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベー
トキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど
のプロモーターが含まれる。好適な発現プラスミドを組
み立てるに際し、これらの遺伝子の終了(termination)
配列もまた、発現ベクターに、発現しようとする配列の
３'に結合させてmＲＮＡのポリアデニル化および終了を
提供する。発育条件によってコントロールされる、もう
１つの転写における有利性を持った他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関与する分解酵
素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利
用に関与する酵素(Ｈolland、前記)などのプロモーター
領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起源お
よび終了配列を含んでいる全てのプラスミドベクターが
適している。 【００２３】微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も
宿主として使用することができる。原則として、脊椎動
物および無脊椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。
しかし、脊椎動物細胞が最も興味があり、脊椎動物細胞
の培養増殖(組織培養)が最近では常套手段となって来た
(Ｔissue Ｃulture,Ａcademic Ｐress,Ｋruseおよび
Ｐatterson，editors(１９７３))。この様な有用な宿主
細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チャイニー
ズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系、Ｗ１３８、ＢＨ
Ｋ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系などである。この
様な細胞の発現ベクターは、通常、(要すれば)複製起
源、発現しようとする遺伝子の前に位置するプロモータ
ー、必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡ組み継ぎ(スプ
ライス)部位、ポリアデニル化部位、転写終了配列など
を含んでいる。本明細書では、好ましい態様を記載した
が、本発明がその様な例示した配列に限定されるものと
解釈してはならない。 【００２４】哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクタ
ー上の調節機能はウイルスから提供されることが多い。
例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウイルス２から誘導され、シミアンウイルス４０
(ＳＶ４０)から導かれることが最も多い。古い、そして
新しいＳＶ４０ウイルスのプロモーターは、共にこのウ
イルスから、ＳＶ４０ウイルスの複製起源を含んでいる
フラグメントとして簡単に得られるという理由で特に有
用である(Ｆiersら、Ｎature ２７３:１１３(１９７
８))。ＨindIIIサイト(部位)からウイルスの複製起源内
に存在しているＢglＩサイトに至る約２５０bp配列を含
んでいるならば、それより小さいあるいは大きいＳＶ４
０フラグメントも使用することができる。更に、所望の
遺伝子配列と正常通り結合しているプロモーターまたは
調節配列をこの様な調節配列が宿主細胞に適合する限
り、使用することができ、またそれが好ましいことが多
い。 【００２５】複製起源は、ＳＶ４０または他のウイルス
(例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど)が誘
導される様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み
立てることにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機
構により提供することができる。このベクターが宿主細
胞染色体に組み込まれたら、後者は十分であることが多
い。 【００２６】Ｂ．使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞として使用
する場合は、Ｇrahamらの燐酸カルシウム沈澱法(Ｇraha
mおよびＶan der Ｅb,Ｖirology ５２:５４６(１９
７８))によってトランスフェクションを行なう。しか
し、核注入またはプロトプラスト融合などの、ＤＮＡを
細胞に導入する他の方法も使用することができる。 【００２７】原核細胞または実質的な細胞壁構造を持っ
た細胞を使用する場合、好ましいトランスフェクション
の方法は、Ｃohenらの塩化カルシウムを用いたカルシウ
ム処理である(Ｃohen,Ｆ．Ｎ．ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．(ＵＳＡ),６９:２１１０(１９７２))。 【００２８】所望の暗号配列および調節配列(control
sequence)を含んでいる好適なベクターを組み立てるに
は標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミドまた
はＤＮＡフラグメントを開裂し、修復(テイラー)し、所
望のプラスミドを形成する様に、希望の形に再結合す
る。 【００２９】開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理
することにより行なう。通常、約１μgのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメント、約２０μlの緩衝液、約１単
位の酵素を使用する(特定の制限酵素に対する適切な緩
衝液および基質の量は製造業者が指定している)。３７
℃で約１時間インキュベートする。インキュベートした
後、フェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を
除き、水性分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収
する。 【００３０】平滑末端が必要な場合は、Ｅ．coli ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ(Ｋlenow)１０単位で、１５℃で１５
分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱に付す。 【００３１】開裂したフラグメントの大きさによる分離
は、Ｇoeddelらの方法(Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａci
ds Ｒes．８:４０５７(１９８０))に従い、６％ポリア
クリルアミドゲルを使って行なう。 【００３２】結合(ライゲーション)には、正しく符合す
る様に末端を適当に修復したほぼ等モル量の所望の成分
を、ＤＮＡ０．５μg当たり約１０単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて処理する(開裂したベクターを成分とし
て用いる場合は、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予
め処理して開裂したベクターの再結合を防ぐのがよ
い)。 【００３３】ライゲーション混合物を使ってＥ．coli
Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、成
功した形質転換体をアンピシリン耐性について選択す
る。形質転換体からプラスミドを調製し、Ｍessingらの
方法(Ｍessingら、ＮucleicＡcids Ｒes．９:３０９
(１９８１))またはＭaxamらの方法(Ｍaxamら、Ｍethods
in Ｅnzymology ６５:４９９(１９８０))に従っ
て、制限酵素分析し、そして／または配列を決定する。 【００３４】 【実施例】 Ｃ．好ましい実施態様 以下に、Ｅ．coli中でポリペプチドを発現させる好まし
い態様について記載するが、これは本発明を例示するも
のであって、本発明がこれに限定されるものと解釈して
はならない。 【００３５】Ｃ．１． マウスのプロ−βＮＧＦを暗号
化しているcＤＮＡクローンの分離 ヒトＮＧＦのβサブユニットを暗号化している遺伝子を
得るために、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、マウスのβＮＧＦを暗号化しているクローンされた
cＤＮＡを用いることにした。 【００３６】cＤＮＡクローニング・アプローチには、
合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、図１〜
図３に示したマウスのβＮＧＦサブユニットの既知のア
ミノ酸配列を利用した:雄および雌のマウスの唾液腺に
存在するＮＧＦレベルの違いを、同定のもう１つの手段
として用いた。マウスのβＮＧＦアミノ酸配列の３つの
小さな部分を選び、それらを暗号化している全ての可能
性のある配列に相補的なオリゴヌクレオチド・プールを
Ｃrea等の方法(Ｎucleic Ａcids Ｒes．,８:２３３１
(１９８０))で合成した。この暗号鎖および相補鎖のヌ
クレオチド配列を図１〜図３に示す。 【００３７】合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼ
ーション・プローブとして用いて、マウスβＮＧＦcＤ
ＮＡクローンを、雄マウス唾液腺からのオリゴdＴ−プ
ライム化cＤＮＡバンクから分離同定する試みは失敗し
た。この結果は、βＮＧＦは雄マウスの唾液腺蛋白質の
０．１％の占めているが、そのmＲＮＡは同じ様に豊富
ではないことを示している。従って、まずβＮＧＦ特異
ヌクレオチド配列を豊富にするために、この蛋白質のカ
ルボキシ末端に近接した配列を表わしているプライマー
・プールを使って、雄の唾液腺からのポリＡ−含有(Ａ
＋)ＲＮＡの逆転写を特異的にプライムした。長さ２０
０bp以上のcＤＮＡ分子を、よく知られたプラスミドpＢ
Ｒ３２２にクローンした。cＤＮＡのプライミングにハ
イブリダイゼーション・プローブとして最初に使った
５'−32Ｐ−標識ＮＧＦプライマー・プールを使って、
全部で１０,０００個のクローンをスクリーニングした
結果、その内０．８％が、非常に厳重なハイブリダイゼ
ーション条件下で陽性信号を与えた。残りの９９．２％
の「プライム化」されたcＤＮＡバンクは、ポリＡ+ＭＳＧ
ＲＮＡの調製中に溶離した痕跡量のオリゴdＴによるプ
ライミングおよび自己プライミングにより生じたと思わ
れる。クローニング操作の際のＳ１ヌクレアーゼ処理が
末端プライマー配列を傷つけ、従って検出された陽性ク
ローンが少なかったのかも知れない。 【００３８】この最初のスクリーニングで陽性となった
クローンを、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、図１〜図３に示したオリゴヌクレオチドプール１よ
り上流のＤＮＡ配列から誘導した放射線標識化プライマ
ー・プール２および３を使ってスクリーニングした。更
に雄または雌マウスの唾液腺のいずれかからのポリＡ+
ＲＮＡから、プール１でプライム化した32Ｐ−cＤＮＡ
を二重フイルター上のプローブとして用いた。再びpＢ
Ｒ３２２中、オリゴヌクレオチド・プール２および３と
ハイブリッドを形成した全部で１０個の雄−特異的クロ
ーンを同定した。制限酵素分析の結果、１０個は全て共
通のＨaeIIIおよびＨinfＩフラグメントを持っているこ
とがわかった。本発明者らがpmβＮ−９Ｇ１と名付け
た、最も長いＤＮＡ挿入体(〜７００bp)を発現するプラ
スミドを含んでいるクローンの全配列を決定した。この
ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、ＮＨ
2−末端プロ−配列に加えて、１つの翻訳フレーム中に
期待するＮＧＦ配列を含んでいた(図６〜図７参照)。マ
ウスのＮＧＦcＤＮＡ配列を含んでいる細菌クローンの
組み立ておよび同定について、以降に詳述する。 【００３９】完全なＮＧＦmＲＮＡの大きさを決定する
ために、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
およびプライマー・エクステンション分析法を用いた。
ＮＧＦおよびプロペプチド配列を含んでいる長さ４７０
bpの32Ｐ−標識ＤＮＡフラグメント(ＲsaＩ−ＲsaＩ７
８９,図５参照)を、雄マウス唾液腺に特異な長さ約１３
００ヌクレオチドのＲＮＡ種と雑種形成させた。２つの
短い、２本鎖の、５'末端−標識化制限フラグメントを
用いたプライマー・エクステンション実験(図５の説明
参照)により、βＮＧＦmＲＮＡの５'末端は、本発明者
らのクローンの３'末端から下流の約３７０塩基を残し
て、pmβＮ−９Ｇ１cＤＮＡフラグメントの５'末端から
上流に約２３０塩基の所に位置づけられた。欠失５'配
列の〜３０ヌクレオチドを除く全てが、本発明者らがpm
βＮ−１６、Ｆ７およびpmβＮ−２１Ｂ５と名付けたク
ローンに含まれており、これらは、図５に示す様に、互
いに、そしてクローンpmβＮ−９Ｇ１と重複している。
これらは、cＤＮＡ合成をプライムするため、制限フラ
グメントの使用についてのより詳細な以下に記載の方法
で分離する。 【００４０】プライマー配列の３'末端から下流への３'
ポリＡ配列までの配列を含んでいるクローン化したcＤ
ＮＡを得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲル
上で、全ポリＡ+雄マウス唾液腺ＲＮＡを分画すること
により、βＮＧＦmＲＮＡを豊富化した。最も大きいサ
イズのフラクション、βＮＧＦcＤＮＡプローブとハイ
ブリダイズ(雑種形成)する配列を含むフラクションを、
オリゴdＴ−プライム化cＤＮＡ合成およびクローニング
に使用した。３,７００のクローンをスクリーニングし
た結果、４つの陽性ハイブリダイゼーションシグナルが
得られた。本発明者がpmβＮ−１２Ｅ４と名付けたクロ
ーンのヌクレオチド配列分析、および３'暗号化および
非翻訳配列に２３９ヌクレオチドを添加したpmβＮ−８
Ｂ３。オリゴdＴプライム化であるが、本発明者らのク
ローンはいずれも、第２のＤＮＡ鎖の不完全な合成また
は広範なＳ１ヌクレアーゼ処理のために、βＮＧＦmＲ
ＮＡの全３'非翻訳領域を含んでいなかった。ノーザン
・ブロット分析により、ポリＡ配列は本発明者らがクロ
ーンした配列から離れていないことがわかった(図４参
照)。豊富化したmＲＮＡからのオリゴdＴプライム化cＤ
ＮＡクローンの調製について以下に詳述する。 【００４１】Ｃ．２． ヒト染色体βＮＧＦ遺伝子の分
離および特性化 ヒト遺伝子ライブラリー(λＣharon ４Ａベクターに挿
入された、１５−２０kbの、部分的ＨaeIII／ＡluＩヒ
ト胎児肝臓ＤＮＡフラグメントからなる)を、放射活性
ハイブリダイゼーション・プローブとして、既述した４
７０bpマウスＮＧＦクローン化cＤＮＡフラグメント(pm
βＮ−９Ｇ１、ＲsaＩフラグメント)を用いてスクリー
ニングした。全部で２７組み換えファージをプラーグ純
化し、ＥcoＲＩ消化により部分的に特性化した:２７個
のファージは６つの異なるタイプの制限パターンを示し
た。各パターン種は、制限フラグメントを共有してお
り、従って同じゲノム領域を重複していると思われる。
γhβＮ８と名づけたファージの特性を、物理的マッピ
ングおよびヌクレオチド配列決定により調べた。図６〜
図７は、ファージ・マッピング、配列決定およびゲノム
・サザーン・ブロッティング実験によって得た。クロー
ンγhβＮ８の物理的地図およびヒトゲノム中のその配
列を画している領域を示している。サブクローンした、
重複しているＥcoＲＩおよびＨindIIIフラグメントから
誘導された１２,０００bpのヌクレオチド配列の部分を
図８〜図１２に示す。 【００４２】Ｃ．３． マウスβＮＧＦcＤＮＡとヒト
βＮＧＦ遺伝子の配列の比較 マウスのβＮＧＦcＤＮＡ配列は、成熟βＮＧＦを暗号
化する可能性を持った解読わくを含有しており、予想さ
れたアミノ酸配列は、マウスβＮＧＦの既知の配列に相
当している(Ａngeletti等、Ｂiochemistry,１２:９０
(１９７３)および１２:１００(１９７３))。意外にも、
このcＤＮＡ配列は、マウスβＮＧＦの報告されている
配列の末端に結合した、Ｃ−末端、アルギニン−グリシ
ンジペプチド延長部を予測している。 【００４３】ヒトβＮＧＦ遺伝子は、成熟マウスβＮＧ
Ｆアミノ酸配列と約９０％が相同(ホモローガス)なアミ
ノ酸配列を予測している領域を含んでおり、従ってこれ
は、ヒトβＮＧＦの遺伝子のための遺伝子でなければな
らない。ヒトβＮＧＦ蛋白質もまた、Ｃ−末端ジペプチ
ド延長部を持っている。 【００４４】ヒトとマウスのβＮＧＦ配列を並べると
(図１３〜図１４)、成熟マウス蛋白質の既知の配列から
かなりの遠くの上流まで広範な相同性が延びていること
がわかる。２２,０００ダルトンの生合成プロ−βＮＧ
Ｆプリカーサー(前駆体)の存在が証明されており(Ｂerg
erおよびＳhooter,Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．(ＵＳ
Ａ),７４:３６４７,(１９７７))、これは成熟蛋白質か
らヌクレオチド位置４１９および４２０(図１３〜図１
４参照)の潜在的なアルギニン−アルギニン開裂部位に
まで延びているかもしれない。このヌクレオチド配列で
予測される前駆体は、既に以前に検出されたものより長
い:後述する様に、全プレプロ−β−ＮＧＦ配列は分子
量２７,０００と予測され、プロ−配列は２５,０００ダ
ルトンと予測され、特異なアルギニン残基対が存在する
ことを考えると、２１,５００および１８,０００ダルト
ンのプロセッシング中間体が細胞内に存在する。 【００４５】Ｃ．４． 開始メチオニンコドンおよび信
号配列の位置づけ 蛋白質合成開始コドンであると指定するための候補とし
て３つのメチオニン残基が挙げられる(図１３〜図１４
のアミノ酸−１８７、−１２１および−１１９)。しか
し、いつくかの要因から、本発明者らの配列の−１２１
アミノ酸が実際の開始コドンとして使われていることを
強く暗示している。βＮＧＦは分泌された蛋白質である
ので、開始コドンの後には、このポリペプチドを小胞体
の内腔へと共同翻訳転移させる信号配列が続いていると
考えられる。アミノ酸−１２１から−１０４は、優れた
信号配列の候補である。これらの１８個のアミノ酸は正
しい長さであり、一続きの６個の完全に疎水性のアミノ
酸(ala−phe−leu−ile−gly−val)を含んでいる。信号
ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミノ酸であるala
−１０４と、−１０３位のglu残基の間で起り得る。プ
レ−アルファ・ラクトアルブミンの場合、信号ペプチダ
ーゼは同一のgln−ala配列(後)を開裂させ、同一のＮ−
末端glu残基を残すことが知られている。−１８７位のm
et残基に続く一連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ
酸を高率で含んでおり、これまで報告されている信号配
列のいずれにも似ていない。 【００４６】従って、−１２１のメチオニンがヒトおよ
びマウスのプレプロ−βＮＧＦの翻訳開始に使われる可
能性が最も高く、この場合２７,０００ダルトンのプレ
プロホルモンが生成する。もし信号ペプチドプロセッシ
ングが残基−１０４で起ったら、２５,０００ダルトン
のプロ−βＮＧＦが生成するであろう。 【００４７】 Ｃ．５． Ｅ．coli中でのヒトβＮＧＦの直接発現 λhβＮ８からのＥcoＲＩフラグメントをpＢＲ３２２で
サブクローンした。本発明者らがphβＮ８−Ｂ９と命名
したサブクローンプラスミドは、ヒトβＮＧＦサブユニ
ットを暗号化している配列の大部分を含んでいる２kbヒ
トＤＮＡ挿入体を含有していた。配列決定の結果、１０
個のＮＨ2−末端アミノ酸だけがこの配列から除かれて
いることがわかった。βＮＧＦ暗号配列をＥ．coliで発
現させるための本発明者らの方法は、phβＮ８−Ｂ９の
βＮＧＦ暗号部分から最も大きい可能なフラグメントを
切り取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の５'
および３'末端を、Ｅ．coli発現プラスミドに挿入する
のに適する様に修飾することであった。使用した発現系
は、pＨＧＨ２０７−１(Ｈ．de Ｂoerら，Ｐroc．Ｎa
t．Ａcad．Ｓci.，８０：２１−２５(Ｊan．１９８３))
のＴrpプロモーター系である。 【００４８】プラスミドphβＮ８−Ｂ９をＥcoＲＩおよ
びＨgiＡＩで消化し、〜３００bpフラグメントを消化混
合物から分離した。このフラグメントを図１５〜図１６
に示す。２工程の消化により生じる粘着末端も示してあ
る。発現のためのヒトβＮＧＦ配列の５'末端を組み立
てるために、１０個の欠失アミノ酸のためのコドン、開
始メチオニンコドン(ＡＴＧ)、およびリボソーム結合サ
イトの一部であり、制限エンドヌクレアーゼＸbaＩの開
裂サイトを含んでいる、該ＡＴＧに先行するヌクレオチ
ド群を付加した。この目的の為に４つのオリゴヌクレオ
チドを化学的に合成した。これらをオリゴヌクレオチド
Ｉ−ＩＶとして図１５〜図１６に示す。 【００４９】βＮＧＦ暗号領域の３'末端は以下の如く
修正した:図１５〜図１６に示した１個のＨgiＡＩ部位
(成熟ヒトβＮＧＦの１１１位(Ｖal)と１１２位(Ｌeu)
のアミノ酸)から下流の両ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列
を、Ａrg１１８およびＳalＩ粘着末端に続く終止コドン
(ＴＡＧ)を含む様に化学的に合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは図１５〜図１６のフラグメントＶおよび
ＶＩである。 【００５０】合成オリゴヌクレオチド１−ＶＩをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼおよびγ−32Ｐ−ＡＴＰで放射
活性標識し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、〜３００bp hβＮＧＦＤＮＡ
フラグメントと混合した。１０単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用い、１２℃で１２時間ライゲーション(結合)し
た。この混合物をフェノール抽出し、ＤＮＡを７０％エ
タノール中で沈澱させた。沈澱を乾燥し、制限エンドヌ
クレアーゼ緩衝液に溶解し、酵素ＸbaＩおよびＳalＩを
添加し、２時間消化した。 【００５１】ＤＮＡ混合物のプレパラティブゲル電気泳
動およびオートラジオグラフィーにより、放射活性のあ
る二重体(ダブレット)が〜３７０bpに存在することがわ
かった。溶離したＤＮＡフラグメントを、ＸbaＩおよび
ＳalＩで消化した後に細菌性アルカリホスファターゼで
処理したpＨＧＨ２０７−１と命名されたＨＧＨ−Ｔrp
発現プラスミドに結合させた(Ｔ４ＤＮＡリガーゼ)。こ
のアルカリホスファターゼ処理は、ＨＧＨフラグメント
がＴrp発現ベクターに再挿入されるのを防ぐ為に行なっ
た。このライゲーション混合物を使ってＥ．coli Ｋ１
２／２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)を形質転換した。寒
天平板上、アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性
のコロニーを選択した：２００のコロニーを、放射活性
の３００bpＥcoＲＩ／ＨgiＡＩプローブとのハイブリダ
イゼーションにより、ヒトβＮＧＦ配列の存在について
スクリーニングした。１２個の陽性コロニーを、ウエス
タン・ブロット上、ウサギの抗マウスβＮＧＦ抗体を使
って、その細胞抽出物中に免疫反応性βＮＧＦ分子が存
在するかどうかについて分析した。１個を除く全てのク
ローンが、陰性の対照抽出物と比較して、期待される分
子量の陽性信号を示した。これらのクローンの１個のＤ
ＮＡ配列を分析した結果、本発明者らによってphβＮＧ
Ｆtrp１と命名された、ヒトβＮＧＦを発現した最終的
なプラスミドが、当初に計画した構造を持っていること
が証明された。 【００５２】プラスミドphβＮ８−Ｂ９のＥcoＲＩおよ
びＨgiＡＩによる消化からプラスミドphβＮＧＦtrp１
の組み立てに至る一連の操作を図１７〜図１９に示し
た。プラスミドpＨＧＨ２０７−１は、プラスミドpＨＧ
Ｈ２０７をＢamＨＩで消化し、次いでＥcoＲＩで部分消
化することにより得られた(Ｈ．de Ｂoerら、上記)。tr
pプロモーターを含んでいる最も大きいフラグメントを
分離した。pＢＲ３２２から最も大きいＥcoＲＩ−Ｂam
ＨＩフラグメントを分離し、この２つのフラグメントを
結合させ、Ｅ．coli Ｋ１２／２９４(ＡＴＣＣ ３１４
４６)の形質転換に使用した。アンピシリンおよびテト
ラサイクリンの両者に耐性のあるクローンがpＨＧＨ２
０７−１を含んでいた。 【００５３】Ｃ．６． mＮＧＦcＤＮＡ配列を含んでい
る細菌クローンの組み立ておよび同定 各(１４塩基の)８つのプライマーのプール２種を化学的
に合成した。各プライマーは、アミノ酸９３−９６およ
び９７の１部のための潜在的mＲＮＡ配列と相補的であ
る。ポリ(Ａ+)ＲＮＡで特異的にcＤＮＡの合成をプライ
ムするのに１６オリゴヌクレオチドの混合物を用いた。
１００ミリモル(mモル)のＫＣl ５０μl中、８プライマ
ーの各プール２００ピコモル(pモル)(１μg)(総計４４
０pモル、２μg)を、ポリ(Ａ+)ＲＮＡ４０μgと、９０
℃、６８℃、４２℃および３７℃で４分間づつインキュ
ベートすることにより、アニーリングした。32Ｐ−標識
cＤＮＡを、５０mＭトリス(pＨ８．３)、１０mＭ ＭgＣ
l2、１０mＭ ＤＴＴ、５０mＭ ＫＣlの反応(系)１００
μl中で合成した。この反応系はアニーリングした混合
物の他に、５００μＭのdＡＴＰ、ＴＴＰ、dＧＴＰ、１
００μＭのdＣＴＰ、２０μＣiの[γ−32Ｐ]dＣＴＰ(２
０００Ｃi／mモル、Ａmersham)、０．５単位／μlのＲ
ＮＡsinおよび９０単位の逆転写酵素を含んでいた。最
初の鎖の合成は３７℃で６０分間であった。反応系を３
分間煮沸し、１分間氷でクエンチングし、マイクロフュ
ージ中で回転させた。上澄を同容量のddＨ2Ｏで希釈
し、ＫlenowＰolＩ １５単位を加え、１２℃で１８時
間、dscＤＮＡを合成した。フェノール／クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱を行なった後、標品を１５０μ
l中のＳ１ヌクレアーゼ１０3単位を用いて３７℃で１時
間消化した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル上の電気
泳動によりcＤＮＡを分画した。２つのサイズ範囲のcＤ
ＮＡを電気溶離した。長さ〜５５０bp(上)は１３２ngm
回収され、長さ２００〜５５０bp(下)は１８２ngm回収
された。全量２０ngmの各フラクションの３'−末端を、
末端ヌクレオチジル・トランスフェラーゼを用いて２０
−４０d(c)残基で延長させた。このd(c)−尾部形成cＤ
ＮＡを、同様にＰstＩ部位でd(Ｇ)残基を用いて延長さ
せたpＢＲ３２２(１５０ngm)とアニーリングした。アニ
ーリングは５０μlの１００mＭ ＮaＣl、１０mＭトリス
(pＨ７．５)、２５０mＭ ＥＤＴＡ中で行なった。混合
物を７０℃に加熱し、徐々に３７℃に冷却し(１６時
間)、次いで４℃に冷却した(６時間)。アニーリング混
合物の半分を使ってＥ．coli Ｋ−１２株２９４を形質
転換した。各サイズフラクション(上と下)からの５００
コロニーをフィルター・ハイブリダイゼーションにより
スクリーニングした。32Ｐ−標識プローブは１６プライ
マーの混合物(全１μg)から、公表されている方法によ
り、ポリヌクレオチドキナーゼ(Ｐ−ＬＢiochemicals)
および２００μＣiの[γ−32Ｐ]ＡＴＰ(５０００Ｃi／m
モル、Ａmersham)を用いた燐酸化により調製した。１
０,０００個のクローンを含んでいるフィルターを、プ
ライマー・ハイブリダイゼーション・ミックス(１００m
ＭトリスpＨ７．５、０．９Ｍ ＮaＣl、６mＭ ＥＤＴ
Ａ、１ＸＤenhardt's溶液、１００μＭ rＡＴＰ、１mＭ
ＮaＨ2ＰＯ4−Ｎaピロホスフェート、０．５％Ｎonidet
Ｐ−４０、０．１mg／ml酵母ＲＮＡ(ＳigmaＲ−６７５
０))中、〜１×１０8cpmの32Ｐ−標識プローブと、室温
で１８時間ハイブリッド形成させた。フィルターを、４
２℃で６×ssc中で３０分間(３回)洗浄し、強化スクリ
ーン(Ｄupont)を用いて−７０℃で１６時間、Ｘ線フイ
ルムに感光させた。約０．７−０．９％(上３７０、下
４６０)のコロニーを選択し、もとのプライミング部位
に対して５'である２つの追加の合成プライマーによる
２回目のスクリーニングにかけた。アミノ酸７４−７７
のための全ての潜在的mＲＮＡ配列に相補的な１２量体
を各４プライマーの２プールに合成した。各々８個の１
４量体２プール(アミノ酸５２−５８および５６の一部
のための潜在的mＲＮＡ配列に相補的)を同様にして合成
した。第１回のスクリーニングで選択した「上」および
「下」のコロニーから、３セットの同一のフィルターを作
成した。４つの合成オリゴヌクレオチドから、既述した
様にして32Ｐ−標識プローブを作成した。プライマー・
ハイブリダイゼーション・ミックス中、フィルターを
０．５×１０8cpmとハイブリッド形成させ、洗浄し、Ｘ
線フイルムに感光させた。５'オリゴヌクレオチド全て
とハイブリッド形成を行なった９つの陽性群(下から３
つ、上から６つ)がみつかった。ミニスクリーン手法で
プラスミドＤＮＡを分離し、最も大きい挿入体を持った
クローンを制限分析により決定した。pmβＮ−９Ｇ１と
名付けたプラスミドの塩基配列を、Ｍaxam−Ｇilbert法
によって完全に決定した。このcＤＮＡ挿入体は、１４
塩基のプライマー配列(図１〜図３、プール１)および全
量７１６bpを含んでいた。 【００５４】Ｃ．７． βＮＧＦメッセージに富むmＲ
ＮＡから調製されたオリゴdＴ−プライム化cＤＮＡクロ
ーン ０．０２５Ｍのクエン酸ナトリウム(pＨ３．８)中の２
％アガロースおよび６Ｍ尿素からなる変性アガロースゲ
ルにより、電気泳動によって２００μgのポリ(Ａ+)ＲＮ
Ａを分画した。リボソームバンド(帯)は、垂直のスライ
スをエチジウムブロマイドで染色することにより肉眼観
察し得る様にした。ゲルを０．５cmのスライスに切断
し、７０℃で融解し、フェノールで２回、クロロホルム
で１回、強力に抽出した。２回のエタノール沈澱の後、
そのペレットをddＨ2Ｏ ３０μlに溶解した。各フラク
ション(４Ｍ酢酸アンモニウム５μl(pＨ７．０)中)１μ
lを乾燥ニトロセルロースフィルターにスポットし、厳
重な条件下でドット・ハイブリダイゼーションによりス
クリーニングした。Ｋlenow Ｐol１反応系中、プライ
マーとして牛胸腺ＤＮＡフラグメントを用いて既知の方
法により、32Ｐ−標識プローブをpmβＮ−９Ｇ１挿入体
から調製した。このフィルターを、５０mＭ ＮaＰＯ4(p
Ｈ７．０)、５×Ｄenhardt's溶液、５×ＳＳＣ、５０μ
g／mlの超音波処理したニシン精子ＤＮＡ、１００μＭ
のrＡＴＰ、１mＭ ＮaＨ2ＰＯ4−ナトリウムピロホスフ
ェート、および５０％ホルムアミド中、４２℃で１８時
間、〜１０7cpmのハイブリッド形成させた。このフィル
ターを０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中、４２℃で２
０分間洗浄し(３回)、フイルムに感光させた。ハイブリ
ダイゼーションの結果、ＮＧＦメッセージはフラクショ
ン１１および１２にあることがわかった。フラクション
１１および１２のそれぞれ１０μlを用い、標準的な方
法でオリゴdＴ−プライム化cＤＮＡを調製した。５％ポ
リアクリルアミドゲル上の電気泳動の後、ゲルスライス
から６００bpより長いcＤＮＡを溶離した。フラクショ
ン１１から約４０ngmのcＤＮＡ、およびフラクション１
２からの２０ngmをd(Ｃ)−尾部形成し、d(Ｇ)−尾部形
成したpＢＲ３２２とアニーリングした。フラクション
１１から約３３００クローン、フラクション１２からの
１５００クローンを、pmβＮ−９Ｇ１からの32Ｐ−標識
内部ＨpaIIフラグメント(２１６bp)を使って、厳重な条
件下のフィルターハイブリダイゼーションにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フィルターを４２℃で
１８時間、５０×１０6cpmとハイブリッド形成させ、洗
浄し、既述した様にＸ線フイルムに感光させた。フラク
ション１２からの５つのクローンがこのプローブについ
て陽性であった。制限分析により、それらは同胞である
ことがわかった。pmβＮ−１２Ｅ４を、Ｍaxam−Ｇilbe
rt法により完全に塩基配列決定した。フラクション１１
からの２つのクローンが陽性であった。最大のpmβＮ−
８Ｂ３の塩基配列をＭaxam−Ｇilbert法により完全に決
定した。 【００５５】Ｃ．８． 医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−ＮＧＦは、このβ−ＮＧＦを適
当な担体と混合して、既知の方法で、有用な医薬組成物
に製剤化することができる。好適な担体、および他のヒ
トの蛋白質、例えばヒトの血清アルブミンを含んでいて
もよい製剤の調製法は、例えばＲemingtonのＰharmacen
tical Ｓciences(Ｅ．Ｗ．Ｍartinによる)に記載され
ている。この様な医薬組成物は、本発明の蛋白質の有効
量を適当な量の担体と共に含んでおり、患者に非経口投
与することができる。 【００５６】このヒトβ−ＮＧＦは、神経障害またはそ
の他の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかかっ
ている患者に非経口投与することができる。投与量およ
び投与割合は、例えばマウスの唾液腺から得られる同様
の製剤の臨床実験に現在使用されているものと同じであ
る。 【００５７】以上の記載は本発明の好ましい態様を述べ
たものであり、本発明がこれに限定されると解釈しては
ならない。
ヒト神経成長因子(ＮＧＦ)、組換え技術を用いたその調
製法、およびそれを含有する組成物に関する。 【０００２】 【従来の技術】 Ａ．神経成長因子 分子量〜１３０,０００の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特に雄マウスの唾液
腺に豊富に存在しており、通常神経成長因子(Ｎerve
Ｇrowth Ｆactor)と呼ばれている。この蛋白質が演じ
る主要な神経活性は、感覚レセプター(受容体)から脳へ
インパルスを伝える神経細胞、感覚ニューロンの大きさ
および循環系、腺、平滑筋およびその他の器官の機能的
活性を調節している自律神経系を構成している２種の内
の１つ、交感神経ニューロンの大きさを増大させる能力
を有する点にある。マウスの唾液腺から、中性pＨで抽
出して得られるＮＧＦは７Ｓ ＮＧＦとして知られてお
り、α、βおよびγサブユニットと呼ばれる３つのサブ
ユニットで構成されている。７Ｓ ＮＧＦの全体として
の神経活性は、非共有結合性の力で互いに結合している
２個の同一の１１８アミノ酸ペプチドのダイマーである
βサブユニットによってもたらされる。このサブユニッ
トは２．５Ｓ ＮＧＦとも呼ばれる。γサブユニットは
生物活性を持っていない。しかし、このγサブユニット
はアルギニンエステロペプチダーゼである。ＮＧＦの合
成における初期の遺伝子産物は、γサブユニットで開裂
されるプレプロ−ＮＧＦポリペプチドである。このγサ
ブユニットは、マウスに於いて傷の治療を促進させるこ
とがわかった。 【０００３】最近、第３のＮＧＦ成分(分子量〜１１６,
０００)がマウスの唾液腺から分離され、プラスミノー
ゲン活性化剤としての性質を有することが報告された。
即ち、この成分はプラスミノーゲンをプラスミンに変換
するので、血餅の溶解に利用し得ることを示唆している
(欧州特許出願７８３００６５６.２(公開番号０００２
１３９Ａ１)参照:発明の名称、「神経成長因子およびそ
の調製法」、出願日、１９７８年１１月２２日、公開、
１９７９年５月３０日)。 【０００４】既述した様に、ＮＧＦの神経活性はβサブ
ユニット(以下、βＮＧＦと言う)によってもたらされ
る。これは、中枢性アドレナリン作用性ニューロンの切
断された軸索の再生性再発芽を顕著に促進し、損傷を受
けた軸索の修復に有用な性質を持っていることがわかっ
た。 【０００５】Ｂ．組換えＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ技術は、一応成熟期に達したと言える。分
子生物学者は、各種のＤＮＡ配列をある程度容易に組換
え、形質転換された微生物および細胞培養株中で多量の
外来性蛋白質産物を生産し得る新しいＤＮＡ体をつくる
ことができる。一般的な手技手法は、各種のＤＮＡの平
滑末端あるいは粘着末端フラグメントをインビトロで結
合させ、特定の生物に形質転換するのに有用な強力な発
現ベクターを調製し、所望の外来性産物を効率的に合成
させることである。しかし、産物によっては、それを生
産する方法は依然として回りくどいものであり、常に成
功を予見し得る程には、この科学は進歩していない。事
実、基礎的な実験に基づくことなく、成功すると予想す
る者は、著しい実施不能の危険をおかしてそうするので
ある。 【０００６】主要な要素、即ち複製起源、１種またはそ
れ以上の表現型選択特性、発現プロモーター、外来性遺
伝子の挿入および残留ベクターのＤＮＡ組換えは、通常
宿主細胞の外で行なう。得られた組換え複製可能発現ベ
クターまたはプラスミドを形質転換によって細胞に導入
し、その形質転換体を増殖させることによって多量の組
換えビヒクルを得る。暗号化されているＤＮＡ情報の転
写および翻訳を支配している部分に関して適切な位置に
この遺伝子が挿入された場合は、この得られた発現ベク
ターは、挿入された遺伝子が暗号化しているポリペプチ
ド配列を生産するのに有用である。この過程は発現と呼
ばれる。要すれば宿主細胞を溶解させ、他の蛋白質から
分離精製して生産物を回収することができる。 【０００７】実際には、組換えＤＮＡ技術を使って全て
外来性のペプチドを発現させることができ(いわゆる直
接発現)、あるいはまた、ホモローガス(同種の)ポリペ
プチドのアミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス
(異種の)ポリペプチドを発現させることもできる。後者
の場合、目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂
されるまで、融合したホモローガス／ヘテロローガスポ
リペプチド内で不活性化されていることがある。 【０００８】同様に、遺伝および細胞生理を研究するた
めの細胞培養または組織培養の技術も非常に進歩してい
る。単離した正常細胞から、続々と継代(移植)して調製
した耐久セルラインを保持する手技手法を使用すること
ができる。研究に使用するには、この様なセルラインは
液体培地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄
養物を含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量
生産のためのスケールアップには機械的な問題があるだ
けである。 【０００９】同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化
学は有用な、実は必要な補助学問である。所望の蛋白質
を生産する細胞は、何百という他の蛋白質、細胞代謝の
内性産物をも生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の
蛋白質から分離しておかないと、他の化合物と同様、所
望の蛋白質による治療過程でヒトや動物に投与されると
毒性を現わすことがある。従って、当面の特定の系に適
した分離法を計画し、所望の用途に使用できる均質な安
全な生産物を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となっ
てくる。蛋白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、
そしてそれを特定化して、細胞が確実に、変化したり変
異することなく、忠実にそれを生産したことを確かめる
のにも必要である。この科学分野は更に、バイオアッセ
イや安定性試験を計画したり、臨床試験やマーケティン
グを行なう前にやらなければならないその他の手続きに
も関係している。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来、抽出
技術や合成によって、実質的に純粋な形で単離されたこ
とのないヒトＮＧＦのβサブユニットを提供するもので
ある。本発明者らは、意外にも、融合したホモローガス
蛋白質(自己蛋白質)を含んでいない成熟(mature)ポリペ
プチドの形で、β−ＮＧＦをＥ．coli(大腸菌)でヘテロ
ローガス蛋白質(外来性蛋白質)として発現させ得ること
を見い出した(これは、外来性蛋白質として認識する細
胞酵素から保護する必要があるかも知れないものであ
る)。本発明者らは、ＮＧＦのβサブユニットは、Ｅ．c
oli中で成熟蛋白質として直接発現される最も小さな蛋
白質であると信じている。 【００１１】本発明に係るβ−ＮＧＦは、神経障害の治
療またはそれに関連するその他の有用な目的に使用する
ことができる。天然に分泌されるヒトβ−ＮＧＦと同じ
であり、しかも哺乳動物由来の他の蛋白質を含んでいな
いので、ヒト以外の動物由来のペプチドホルモンをヒト
の病気の治療に使う場合と違って、本発明のβ−ＮＧＦ
が治療中に免疫原性反応をひき起すということはない。
更に、組織抽出物として得たβ−ＮＧＦに付随してお
り、それを含む組成物に望ましくない生物活性を示す哺
乳動物起源の他の蛋白質を実質的に含んでいないのが本
発明のβ−ＮＧＦであり、これは外来性蛋白質として得
られるからである。 【００１２】更に本発明は、このポリペプチドを発現し
得る形で暗号化している遺伝子配列を含んでいる複製可
能なＤＮＡ発現ベクターを提供するものである。更にま
た本発明は、この様なベクターで形質転換された微生物
株またはセルラインの様な組換え宿主細胞、およびそれ
らの培養物を提供するものである。さらに本発明は、得
られたこのポリペプチドを含有している非経口投与用の
組成物を提供するものである。 【００１３】従って、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋
白質を実質的に含んでいないヒトβ−ＮＧＦを得ること
にあり、もう一つの目的は、天然資源から抽出によって
得ることができる量より多量のヒトβ−ＮＧＦを得るこ
とにある。 【００１４】図面の説明 図１〜図３はマウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸
配列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺
伝子の特定の断片(セグメント)の相補ＤＮＡ鎖を示して
いる。図４は、β−ＮＧＦmＲＮＡの断片を含んでいる
クローンのノーザンブロット分析を示している。図５
は、マウスＮＧＦ遺伝子の部分的制限地図、および本発
明によって組み立てられたプラスミドのヌクレオチド配
列とマウスＮＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列とのおおよ
その一致を示している。図６〜図７は、組換えファージ
λhＮ８の物理的地図およびヒトゲノムを囲っている領
域を示している。図８〜図１２はヒトβＮＧＦ染色体遺
伝子のヌクレオチド配列を示している。図１３〜図１４
は、ヒトおよびマウスのプレプロ−βＮＧＦ遺伝子のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示してい
る。図１５〜図１６は、ヒトβＮＧＦの発現のために組
み立てられた遺伝子を示している。図１７〜図１９は、
ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli を形質転換
するためのプラスミドphβＮＧＦtrp１の組み立て工程
の一部を示している。 【００１５】 【課題を解決するための手段】 Ａ．宿主細胞の培養およびベクター ＤＮＡ配列を、それを発現することのできる他の配列に
有効に結合した場合、そのＤＮＡ配列を発現することが
できるベクターを発現ベクターと言う。常にはっきりと
記載することはしないが、この発現ベクターは、エピソ
ームとして、あるいは染色体ＤＮＡの組込み部分とし
て、宿主生物中で複製できるものでなければならない。
言うまでもなく、複製能を持たないものは有効に使用で
きない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であり、
この用語は特定の配列に用いられるだけでなく、その用
語には、そこに含まれる特定のＤＮＡ暗号を発現するこ
とができる全ゆるＤＮＡ配列が含まれている。一般に、
組換えＤＮＡ技術で用いられる発現ベクターはプラスミ
ドの形であることが多い。このプラスミドは、環状の２
本鎖ＤＮＡループであって、そのベクターの形では、染
色体に結合していないものを言う。プラスミドは、ベク
ターの最も普通に用いられる形であるので、本明細書に
於いては、プラスミドとベクターを交換可能な用語とし
て用いる。しかし本発明に於いては、同じ機能を有す
る、当技術分野で知られている、あるいは今後知られ得
る他の形の発現ベクターも含まれると解釈すべきであ
る。 【００１６】本明細書に於いて組換え宿主細胞とは、組
換えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベクターで形質
転換された細胞を意味する。 【００１７】本明細書に記載した方法およびベクター
は、広範囲の真核性および原核性の生物の宿主細胞に使
用することができる。 【００１８】勿論、一般的に、本発明に有用なベクター
を組み立てるに際し、ＤＮＡ配列をクローニングするの
に原核生物が好ましい。特にＥ．coli Ｋ１２株２９４
(ＡＴＣＣＮo．３１４４６)が特に好ましい。使用し得
るその他の微生物株として、Ｅ．coli Ｂ、Ｅ．coli
Ｘ１７７６(ＡＴＣＣＮo．３１５３７)などのＥ．coli
株が含まれる。これらは限定する意味で挙げたのではな
く、単なる例示に過ぎないことは言うまでもない。 【００１９】原核生物は発現にも使用することができ
る。上記の菌株の他、Ｅ．coli Ｗ３１１０(Ｆ-,λ-,
原栄養性、ＡＴＣＣＮo．２７３２５)、Ｂacillus sub
tilusの様な桿菌類、Ｓalmonella typhimuriumやＳerr
atia marcescens の様な腸内細菌群および各種のシュ
ードモナス種を使用することができる。 【００２０】一般に、これらの宿主に関しては、その宿
主細胞と適合し得る種由来のレプリコンおよび調節配列
を含んでするプラスミドベクターが使用される。このベ
クターはもともと、形質転換細胞に表現形質(表現型)の
選択性を付与することのできる標識化配列と共に複製部
位を持っている。例えば、Ｅ．coliは、Ｅ．coli種由来
のpＢＲ３２２を使って形質転換される(Ｂolivarら、Ｇ
ene ２:９５(１９７７))。pＢＲ３２２はアンピシリン
およびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでお
り、従って、これは形質転換細胞を同定するための簡単
な手段となる。このpＢＲ３２２プラスミドやその他の
微生物プラスミドは、その微生物がそれ自身の蛋白質を
発現するのに使用することのできるプロモーターを含ん
でいなければならず、あるいは含む様に改良されなくて
はならない。組換えＤＮＡの組み立てに通常用いられる
プロモーターにはβ−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)お
よびラクトースプロモーター系(Ｃhangら、Ｎature ２
７５:６１５(１９７８);Ｉtakuraら、Ｓcience １９
８:１０５６(１９７７);Ｇoeddelら、Ｎature ２８１:
５４４(１９７９))およびトリプトフアン(trp)プロモー
ター系(Ｇoeddelら、Ｎucleic Ａcids Ｒes．８:４０
５７(１９８０);ＥＰＯ Ａppl Ｐubl Ｎo．００３６
７７６)がある。これらが最も普通に用いられている
が、その他の微生物プロモーターも発見され、使用され
ており、それらのヌクレオチド配列は詳細に発表されて
いるので、当業者であれば、それらをプラスミドベクタ
ーに機能的に結合させることができる(Ｓiebenlistら、
Ｃell ２０:２６９(１９８０))。 【００２１】原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微
生物も使用することができる。Ｓaccharomyces cerevi
siae、普通のパン酵母は、真核微生物中最もよく使用さ
れるものであるが、その他の多くの株も使用される。Ｓ
accharomyces中で発現させるには、例えばプラスミドＹ
Ｒp７(Ｓtinchcombら、Ｎature ２８２:３９(１９７
９);Ｋingsmanら、Ｇene ７:１４１(１９７９);Ｔsche
mperら、Ｇene １０:１５７(１９８０))がよく用いら
れる。このプラスミドは、トリプトフアンを生産する能
力を欠いている酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮ
o．４４０７６またはＰＥＰ４−１(Ｊones,Ｇenetics
８５:１２(１９７７))にとって選択マーカーとなるtrp
１遺伝子をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの
特徴としてのtrp１損傷が存在することは、トリプトフ
アンの非存在下に発育させることによって形質転換体を
検出する有効な環境を提供することになる。 【００２２】酵母ベクター中の適切な促進(promoting)
配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ(Ｈitzeman
ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２５５:２０７３(１９８０))ま
たは他の解糖酵素(Ｈessら、Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒe
g．７:１４９(１９６８);Ｈollandら、Ｂiochemistry
１７:４９００(１９７８))、例えばエノラーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベー
トキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど
のプロモーターが含まれる。好適な発現プラスミドを組
み立てるに際し、これらの遺伝子の終了(termination)
配列もまた、発現ベクターに、発現しようとする配列の
３'に結合させてmＲＮＡのポリアデニル化および終了を
提供する。発育条件によってコントロールされる、もう
１つの転写における有利性を持った他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関与する分解酵
素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利
用に関与する酵素(Ｈolland、前記)などのプロモーター
領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起源お
よび終了配列を含んでいる全てのプラスミドベクターが
適している。 【００２３】微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も
宿主として使用することができる。原則として、脊椎動
物および無脊椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。
しかし、脊椎動物細胞が最も興味があり、脊椎動物細胞
の培養増殖(組織培養)が最近では常套手段となって来た
(Ｔissue Ｃulture,Ａcademic Ｐress,Ｋruseおよび
Ｐatterson，editors(１９７３))。この様な有用な宿主
細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チャイニー
ズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系、Ｗ１３８、ＢＨ
Ｋ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系などである。この
様な細胞の発現ベクターは、通常、(要すれば)複製起
源、発現しようとする遺伝子の前に位置するプロモータ
ー、必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡ組み継ぎ(スプ
ライス)部位、ポリアデニル化部位、転写終了配列など
を含んでいる。本明細書では、好ましい態様を記載した
が、本発明がその様な例示した配列に限定されるものと
解釈してはならない。 【００２４】哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクタ
ー上の調節機能はウイルスから提供されることが多い。
例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウイルス２から誘導され、シミアンウイルス４０
(ＳＶ４０)から導かれることが最も多い。古い、そして
新しいＳＶ４０ウイルスのプロモーターは、共にこのウ
イルスから、ＳＶ４０ウイルスの複製起源を含んでいる
フラグメントとして簡単に得られるという理由で特に有
用である(Ｆiersら、Ｎature ２７３:１１３(１９７
８))。ＨindIIIサイト(部位)からウイルスの複製起源内
に存在しているＢglＩサイトに至る約２５０bp配列を含
んでいるならば、それより小さいあるいは大きいＳＶ４
０フラグメントも使用することができる。更に、所望の
遺伝子配列と正常通り結合しているプロモーターまたは
調節配列をこの様な調節配列が宿主細胞に適合する限
り、使用することができ、またそれが好ましいことが多
い。 【００２５】複製起源は、ＳＶ４０または他のウイルス
(例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど)が誘
導される様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み
立てることにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機
構により提供することができる。このベクターが宿主細
胞染色体に組み込まれたら、後者は十分であることが多
い。 【００２６】Ｂ．使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞として使用
する場合は、Ｇrahamらの燐酸カルシウム沈澱法(Ｇraha
mおよびＶan der Ｅb,Ｖirology ５２:５４６(１９
７８))によってトランスフェクションを行なう。しか
し、核注入またはプロトプラスト融合などの、ＤＮＡを
細胞に導入する他の方法も使用することができる。 【００２７】原核細胞または実質的な細胞壁構造を持っ
た細胞を使用する場合、好ましいトランスフェクション
の方法は、Ｃohenらの塩化カルシウムを用いたカルシウ
ム処理である(Ｃohen,Ｆ．Ｎ．ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．(ＵＳＡ),６９:２１１０(１９７２))。 【００２８】所望の暗号配列および調節配列(control
sequence)を含んでいる好適なベクターを組み立てるに
は標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミドまた
はＤＮＡフラグメントを開裂し、修復(テイラー)し、所
望のプラスミドを形成する様に、希望の形に再結合す
る。 【００２９】開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理
することにより行なう。通常、約１μgのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメント、約２０μlの緩衝液、約１単
位の酵素を使用する(特定の制限酵素に対する適切な緩
衝液および基質の量は製造業者が指定している)。３７
℃で約１時間インキュベートする。インキュベートした
後、フェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を
除き、水性分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収
する。 【００３０】平滑末端が必要な場合は、Ｅ．coli ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ(Ｋlenow)１０単位で、１５℃で１５
分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱に付す。 【００３１】開裂したフラグメントの大きさによる分離
は、Ｇoeddelらの方法(Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａci
ds Ｒes．８:４０５７(１９８０))に従い、６％ポリア
クリルアミドゲルを使って行なう。 【００３２】結合(ライゲーション)には、正しく符合す
る様に末端を適当に修復したほぼ等モル量の所望の成分
を、ＤＮＡ０．５μg当たり約１０単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて処理する(開裂したベクターを成分とし
て用いる場合は、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予
め処理して開裂したベクターの再結合を防ぐのがよ
い)。 【００３３】ライゲーション混合物を使ってＥ．coli
Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、成
功した形質転換体をアンピシリン耐性について選択す
る。形質転換体からプラスミドを調製し、Ｍessingらの
方法(Ｍessingら、ＮucleicＡcids Ｒes．９:３０９
(１９８１))またはＭaxamらの方法(Ｍaxamら、Ｍethods
in Ｅnzymology ６５:４９９(１９８０))に従っ
て、制限酵素分析し、そして／または配列を決定する。 【００３４】 【実施例】 Ｃ．好ましい実施態様 以下に、Ｅ．coli中でポリペプチドを発現させる好まし
い態様について記載するが、これは本発明を例示するも
のであって、本発明がこれに限定されるものと解釈して
はならない。 【００３５】Ｃ．１． マウスのプロ−βＮＧＦを暗号
化しているcＤＮＡクローンの分離 ヒトＮＧＦのβサブユニットを暗号化している遺伝子を
得るために、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、マウスのβＮＧＦを暗号化しているクローンされた
cＤＮＡを用いることにした。 【００３６】cＤＮＡクローニング・アプローチには、
合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、図１〜
図３に示したマウスのβＮＧＦサブユニットの既知のア
ミノ酸配列を利用した:雄および雌のマウスの唾液腺に
存在するＮＧＦレベルの違いを、同定のもう１つの手段
として用いた。マウスのβＮＧＦアミノ酸配列の３つの
小さな部分を選び、それらを暗号化している全ての可能
性のある配列に相補的なオリゴヌクレオチド・プールを
Ｃrea等の方法(Ｎucleic Ａcids Ｒes．,８:２３３１
(１９８０))で合成した。この暗号鎖および相補鎖のヌ
クレオチド配列を図１〜図３に示す。 【００３７】合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼ
ーション・プローブとして用いて、マウスβＮＧＦcＤ
ＮＡクローンを、雄マウス唾液腺からのオリゴdＴ−プ
ライム化cＤＮＡバンクから分離同定する試みは失敗し
た。この結果は、βＮＧＦは雄マウスの唾液腺蛋白質の
０．１％の占めているが、そのmＲＮＡは同じ様に豊富
ではないことを示している。従って、まずβＮＧＦ特異
ヌクレオチド配列を豊富にするために、この蛋白質のカ
ルボキシ末端に近接した配列を表わしているプライマー
・プールを使って、雄の唾液腺からのポリＡ−含有(Ａ
＋)ＲＮＡの逆転写を特異的にプライムした。長さ２０
０bp以上のcＤＮＡ分子を、よく知られたプラスミドpＢ
Ｒ３２２にクローンした。cＤＮＡのプライミングにハ
イブリダイゼーション・プローブとして最初に使った
５'−32Ｐ−標識ＮＧＦプライマー・プールを使って、
全部で１０,０００個のクローンをスクリーニングした
結果、その内０．８％が、非常に厳重なハイブリダイゼ
ーション条件下で陽性信号を与えた。残りの９９．２％
の「プライム化」されたcＤＮＡバンクは、ポリＡ+ＭＳＧ
ＲＮＡの調製中に溶離した痕跡量のオリゴdＴによるプ
ライミングおよび自己プライミングにより生じたと思わ
れる。クローニング操作の際のＳ１ヌクレアーゼ処理が
末端プライマー配列を傷つけ、従って検出された陽性ク
ローンが少なかったのかも知れない。 【００３８】この最初のスクリーニングで陽性となった
クローンを、ハイブリダイゼーション・プローブとし
て、図１〜図３に示したオリゴヌクレオチドプール１よ
り上流のＤＮＡ配列から誘導した放射線標識化プライマ
ー・プール２および３を使ってスクリーニングした。更
に雄または雌マウスの唾液腺のいずれかからのポリＡ+
ＲＮＡから、プール１でプライム化した32Ｐ−cＤＮＡ
を二重フイルター上のプローブとして用いた。再びpＢ
Ｒ３２２中、オリゴヌクレオチド・プール２および３と
ハイブリッドを形成した全部で１０個の雄−特異的クロ
ーンを同定した。制限酵素分析の結果、１０個は全て共
通のＨaeIIIおよびＨinfＩフラグメントを持っているこ
とがわかった。本発明者らがpmβＮ−９Ｇ１と名付け
た、最も長いＤＮＡ挿入体(〜７００bp)を発現するプラ
スミドを含んでいるクローンの全配列を決定した。この
ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、ＮＨ
2−末端プロ−配列に加えて、１つの翻訳フレーム中に
期待するＮＧＦ配列を含んでいた(図６〜図７参照)。マ
ウスのＮＧＦcＤＮＡ配列を含んでいる細菌クローンの
組み立ておよび同定について、以降に詳述する。 【００３９】完全なＮＧＦmＲＮＡの大きさを決定する
ために、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
およびプライマー・エクステンション分析法を用いた。
ＮＧＦおよびプロペプチド配列を含んでいる長さ４７０
bpの32Ｐ−標識ＤＮＡフラグメント(ＲsaＩ−ＲsaＩ７
８９,図５参照)を、雄マウス唾液腺に特異な長さ約１３
００ヌクレオチドのＲＮＡ種と雑種形成させた。２つの
短い、２本鎖の、５'末端−標識化制限フラグメントを
用いたプライマー・エクステンション実験(図５の説明
参照)により、βＮＧＦmＲＮＡの５'末端は、本発明者
らのクローンの３'末端から下流の約３７０塩基を残し
て、pmβＮ−９Ｇ１cＤＮＡフラグメントの５'末端から
上流に約２３０塩基の所に位置づけられた。欠失５'配
列の〜３０ヌクレオチドを除く全てが、本発明者らがpm
βＮ−１６、Ｆ７およびpmβＮ−２１Ｂ５と名付けたク
ローンに含まれており、これらは、図５に示す様に、互
いに、そしてクローンpmβＮ−９Ｇ１と重複している。
これらは、cＤＮＡ合成をプライムするため、制限フラ
グメントの使用についてのより詳細な以下に記載の方法
で分離する。 【００４０】プライマー配列の３'末端から下流への３'
ポリＡ配列までの配列を含んでいるクローン化したcＤ
ＮＡを得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲル
上で、全ポリＡ+雄マウス唾液腺ＲＮＡを分画すること
により、βＮＧＦmＲＮＡを豊富化した。最も大きいサ
イズのフラクション、βＮＧＦcＤＮＡプローブとハイ
ブリダイズ(雑種形成)する配列を含むフラクションを、
オリゴdＴ−プライム化cＤＮＡ合成およびクローニング
に使用した。３,７００のクローンをスクリーニングし
た結果、４つの陽性ハイブリダイゼーションシグナルが
得られた。本発明者がpmβＮ−１２Ｅ４と名付けたクロ
ーンのヌクレオチド配列分析、および３'暗号化および
非翻訳配列に２３９ヌクレオチドを添加したpmβＮ−８
Ｂ３。オリゴdＴプライム化であるが、本発明者らのク
ローンはいずれも、第２のＤＮＡ鎖の不完全な合成また
は広範なＳ１ヌクレアーゼ処理のために、βＮＧＦmＲ
ＮＡの全３'非翻訳領域を含んでいなかった。ノーザン
・ブロット分析により、ポリＡ配列は本発明者らがクロ
ーンした配列から離れていないことがわかった(図４参
照)。豊富化したmＲＮＡからのオリゴdＴプライム化cＤ
ＮＡクローンの調製について以下に詳述する。 【００４１】Ｃ．２． ヒト染色体βＮＧＦ遺伝子の分
離および特性化 ヒト遺伝子ライブラリー(λＣharon ４Ａベクターに挿
入された、１５−２０kbの、部分的ＨaeIII／ＡluＩヒ
ト胎児肝臓ＤＮＡフラグメントからなる)を、放射活性
ハイブリダイゼーション・プローブとして、既述した４
７０bpマウスＮＧＦクローン化cＤＮＡフラグメント(pm
βＮ−９Ｇ１、ＲsaＩフラグメント)を用いてスクリー
ニングした。全部で２７組み換えファージをプラーグ純
化し、ＥcoＲＩ消化により部分的に特性化した:２７個
のファージは６つの異なるタイプの制限パターンを示し
た。各パターン種は、制限フラグメントを共有してお
り、従って同じゲノム領域を重複していると思われる。
γhβＮ８と名づけたファージの特性を、物理的マッピ
ングおよびヌクレオチド配列決定により調べた。図６〜
図７は、ファージ・マッピング、配列決定およびゲノム
・サザーン・ブロッティング実験によって得た。クロー
ンγhβＮ８の物理的地図およびヒトゲノム中のその配
列を画している領域を示している。サブクローンした、
重複しているＥcoＲＩおよびＨindIIIフラグメントから
誘導された１２,０００bpのヌクレオチド配列の部分を
図８〜図１２に示す。 【００４２】Ｃ．３． マウスβＮＧＦcＤＮＡとヒト
βＮＧＦ遺伝子の配列の比較 マウスのβＮＧＦcＤＮＡ配列は、成熟βＮＧＦを暗号
化する可能性を持った解読わくを含有しており、予想さ
れたアミノ酸配列は、マウスβＮＧＦの既知の配列に相
当している(Ａngeletti等、Ｂiochemistry,１２:９０
(１９７３)および１２:１００(１９７３))。意外にも、
このcＤＮＡ配列は、マウスβＮＧＦの報告されている
配列の末端に結合した、Ｃ−末端、アルギニン−グリシ
ンジペプチド延長部を予測している。 【００４３】ヒトβＮＧＦ遺伝子は、成熟マウスβＮＧ
Ｆアミノ酸配列と約９０％が相同(ホモローガス)なアミ
ノ酸配列を予測している領域を含んでおり、従ってこれ
は、ヒトβＮＧＦの遺伝子のための遺伝子でなければな
らない。ヒトβＮＧＦ蛋白質もまた、Ｃ−末端ジペプチ
ド延長部を持っている。 【００４４】ヒトとマウスのβＮＧＦ配列を並べると
(図１３〜図１４)、成熟マウス蛋白質の既知の配列から
かなりの遠くの上流まで広範な相同性が延びていること
がわかる。２２,０００ダルトンの生合成プロ−βＮＧ
Ｆプリカーサー(前駆体)の存在が証明されており(Ｂerg
erおよびＳhooter,Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．(ＵＳ
Ａ),７４:３６４７,(１９７７))、これは成熟蛋白質か
らヌクレオチド位置４１９および４２０(図１３〜図１
４参照)の潜在的なアルギニン−アルギニン開裂部位に
まで延びているかもしれない。このヌクレオチド配列で
予測される前駆体は、既に以前に検出されたものより長
い:後述する様に、全プレプロ−β−ＮＧＦ配列は分子
量２７,０００と予測され、プロ−配列は２５,０００ダ
ルトンと予測され、特異なアルギニン残基対が存在する
ことを考えると、２１,５００および１８,０００ダルト
ンのプロセッシング中間体が細胞内に存在する。 【００４５】Ｃ．４． 開始メチオニンコドンおよび信
号配列の位置づけ 蛋白質合成開始コドンであると指定するための候補とし
て３つのメチオニン残基が挙げられる(図１３〜図１４
のアミノ酸−１８７、−１２１および−１１９)。しか
し、いつくかの要因から、本発明者らの配列の−１２１
アミノ酸が実際の開始コドンとして使われていることを
強く暗示している。βＮＧＦは分泌された蛋白質である
ので、開始コドンの後には、このポリペプチドを小胞体
の内腔へと共同翻訳転移させる信号配列が続いていると
考えられる。アミノ酸−１２１から−１０４は、優れた
信号配列の候補である。これらの１８個のアミノ酸は正
しい長さであり、一続きの６個の完全に疎水性のアミノ
酸(ala−phe−leu−ile−gly−val)を含んでいる。信号
ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミノ酸であるala
−１０４と、−１０３位のglu残基の間で起り得る。プ
レ−アルファ・ラクトアルブミンの場合、信号ペプチダ
ーゼは同一のgln−ala配列(後)を開裂させ、同一のＮ−
末端glu残基を残すことが知られている。−１８７位のm
et残基に続く一連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ
酸を高率で含んでおり、これまで報告されている信号配
列のいずれにも似ていない。 【００４６】従って、−１２１のメチオニンがヒトおよ
びマウスのプレプロ−βＮＧＦの翻訳開始に使われる可
能性が最も高く、この場合２７,０００ダルトンのプレ
プロホルモンが生成する。もし信号ペプチドプロセッシ
ングが残基−１０４で起ったら、２５,０００ダルトン
のプロ−βＮＧＦが生成するであろう。 【００４７】 Ｃ．５． Ｅ．coli中でのヒトβＮＧＦの直接発現 λhβＮ８からのＥcoＲＩフラグメントをpＢＲ３２２で
サブクローンした。本発明者らがphβＮ８−Ｂ９と命名
したサブクローンプラスミドは、ヒトβＮＧＦサブユニ
ットを暗号化している配列の大部分を含んでいる２kbヒ
トＤＮＡ挿入体を含有していた。配列決定の結果、１０
個のＮＨ2−末端アミノ酸だけがこの配列から除かれて
いることがわかった。βＮＧＦ暗号配列をＥ．coliで発
現させるための本発明者らの方法は、phβＮ８−Ｂ９の
βＮＧＦ暗号部分から最も大きい可能なフラグメントを
切り取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の５'
および３'末端を、Ｅ．coli発現プラスミドに挿入する
のに適する様に修飾することであった。使用した発現系
は、pＨＧＨ２０７−１(Ｈ．de Ｂoerら，Ｐroc．Ｎa
t．Ａcad．Ｓci.，８０：２１−２５(Ｊan．１９８３))
のＴrpプロモーター系である。 【００４８】プラスミドphβＮ８−Ｂ９をＥcoＲＩおよ
びＨgiＡＩで消化し、〜３００bpフラグメントを消化混
合物から分離した。このフラグメントを図１５〜図１６
に示す。２工程の消化により生じる粘着末端も示してあ
る。発現のためのヒトβＮＧＦ配列の５'末端を組み立
てるために、１０個の欠失アミノ酸のためのコドン、開
始メチオニンコドン(ＡＴＧ)、およびリボソーム結合サ
イトの一部であり、制限エンドヌクレアーゼＸbaＩの開
裂サイトを含んでいる、該ＡＴＧに先行するヌクレオチ
ド群を付加した。この目的の為に４つのオリゴヌクレオ
チドを化学的に合成した。これらをオリゴヌクレオチド
Ｉ−ＩＶとして図１５〜図１６に示す。 【００４９】βＮＧＦ暗号領域の３'末端は以下の如く
修正した:図１５〜図１６に示した１個のＨgiＡＩ部位
(成熟ヒトβＮＧＦの１１１位(Ｖal)と１１２位(Ｌeu)
のアミノ酸)から下流の両ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列
を、Ａrg１１８およびＳalＩ粘着末端に続く終止コドン
(ＴＡＧ)を含む様に化学的に合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは図１５〜図１６のフラグメントＶおよび
ＶＩである。 【００５０】合成オリゴヌクレオチド１−ＶＩをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼおよびγ−32Ｐ−ＡＴＰで放射
活性標識し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、〜３００bp hβＮＧＦＤＮＡ
フラグメントと混合した。１０単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用い、１２℃で１２時間ライゲーション(結合)し
た。この混合物をフェノール抽出し、ＤＮＡを７０％エ
タノール中で沈澱させた。沈澱を乾燥し、制限エンドヌ
クレアーゼ緩衝液に溶解し、酵素ＸbaＩおよびＳalＩを
添加し、２時間消化した。 【００５１】ＤＮＡ混合物のプレパラティブゲル電気泳
動およびオートラジオグラフィーにより、放射活性のあ
る二重体(ダブレット)が〜３７０bpに存在することがわ
かった。溶離したＤＮＡフラグメントを、ＸbaＩおよび
ＳalＩで消化した後に細菌性アルカリホスファターゼで
処理したpＨＧＨ２０７−１と命名されたＨＧＨ−Ｔrp
発現プラスミドに結合させた(Ｔ４ＤＮＡリガーゼ)。こ
のアルカリホスファターゼ処理は、ＨＧＨフラグメント
がＴrp発現ベクターに再挿入されるのを防ぐ為に行なっ
た。このライゲーション混合物を使ってＥ．coli Ｋ１
２／２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)を形質転換した。寒
天平板上、アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性
のコロニーを選択した：２００のコロニーを、放射活性
の３００bpＥcoＲＩ／ＨgiＡＩプローブとのハイブリダ
イゼーションにより、ヒトβＮＧＦ配列の存在について
スクリーニングした。１２個の陽性コロニーを、ウエス
タン・ブロット上、ウサギの抗マウスβＮＧＦ抗体を使
って、その細胞抽出物中に免疫反応性βＮＧＦ分子が存
在するかどうかについて分析した。１個を除く全てのク
ローンが、陰性の対照抽出物と比較して、期待される分
子量の陽性信号を示した。これらのクローンの１個のＤ
ＮＡ配列を分析した結果、本発明者らによってphβＮＧ
Ｆtrp１と命名された、ヒトβＮＧＦを発現した最終的
なプラスミドが、当初に計画した構造を持っていること
が証明された。 【００５２】プラスミドphβＮ８−Ｂ９のＥcoＲＩおよ
びＨgiＡＩによる消化からプラスミドphβＮＧＦtrp１
の組み立てに至る一連の操作を図１７〜図１９に示し
た。プラスミドpＨＧＨ２０７−１は、プラスミドpＨＧ
Ｈ２０７をＢamＨＩで消化し、次いでＥcoＲＩで部分消
化することにより得られた(Ｈ．de Ｂoerら、上記)。tr
pプロモーターを含んでいる最も大きいフラグメントを
分離した。pＢＲ３２２から最も大きいＥcoＲＩ−Ｂam
ＨＩフラグメントを分離し、この２つのフラグメントを
結合させ、Ｅ．coli Ｋ１２／２９４(ＡＴＣＣ ３１４
４６)の形質転換に使用した。アンピシリンおよびテト
ラサイクリンの両者に耐性のあるクローンがpＨＧＨ２
０７−１を含んでいた。 【００５３】Ｃ．６． mＮＧＦcＤＮＡ配列を含んでい
る細菌クローンの組み立ておよび同定 各(１４塩基の)８つのプライマーのプール２種を化学的
に合成した。各プライマーは、アミノ酸９３−９６およ
び９７の１部のための潜在的mＲＮＡ配列と相補的であ
る。ポリ(Ａ+)ＲＮＡで特異的にcＤＮＡの合成をプライ
ムするのに１６オリゴヌクレオチドの混合物を用いた。
１００ミリモル(mモル)のＫＣl ５０μl中、８プライマ
ーの各プール２００ピコモル(pモル)(１μg)(総計４４
０pモル、２μg)を、ポリ(Ａ+)ＲＮＡ４０μgと、９０
℃、６８℃、４２℃および３７℃で４分間づつインキュ
ベートすることにより、アニーリングした。32Ｐ−標識
cＤＮＡを、５０mＭトリス(pＨ８．３)、１０mＭ ＭgＣ
l2、１０mＭ ＤＴＴ、５０mＭ ＫＣlの反応(系)１００
μl中で合成した。この反応系はアニーリングした混合
物の他に、５００μＭのdＡＴＰ、ＴＴＰ、dＧＴＰ、１
００μＭのdＣＴＰ、２０μＣiの[γ−32Ｐ]dＣＴＰ(２
０００Ｃi／mモル、Ａmersham)、０．５単位／μlのＲ
ＮＡsinおよび９０単位の逆転写酵素を含んでいた。最
初の鎖の合成は３７℃で６０分間であった。反応系を３
分間煮沸し、１分間氷でクエンチングし、マイクロフュ
ージ中で回転させた。上澄を同容量のddＨ2Ｏで希釈
し、ＫlenowＰolＩ １５単位を加え、１２℃で１８時
間、dscＤＮＡを合成した。フェノール／クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱を行なった後、標品を１５０μ
l中のＳ１ヌクレアーゼ１０3単位を用いて３７℃で１時
間消化した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈澱の後、５％ポリアクリルアミドゲル上の電気
泳動によりcＤＮＡを分画した。２つのサイズ範囲のcＤ
ＮＡを電気溶離した。長さ〜５５０bp(上)は１３２ngm
回収され、長さ２００〜５５０bp(下)は１８２ngm回収
された。全量２０ngmの各フラクションの３'−末端を、
末端ヌクレオチジル・トランスフェラーゼを用いて２０
−４０d(c)残基で延長させた。このd(c)−尾部形成cＤ
ＮＡを、同様にＰstＩ部位でd(Ｇ)残基を用いて延長さ
せたpＢＲ３２２(１５０ngm)とアニーリングした。アニ
ーリングは５０μlの１００mＭ ＮaＣl、１０mＭトリス
(pＨ７．５)、２５０mＭ ＥＤＴＡ中で行なった。混合
物を７０℃に加熱し、徐々に３７℃に冷却し(１６時
間)、次いで４℃に冷却した(６時間)。アニーリング混
合物の半分を使ってＥ．coli Ｋ−１２株２９４を形質
転換した。各サイズフラクション(上と下)からの５００
コロニーをフィルター・ハイブリダイゼーションにより
スクリーニングした。32Ｐ−標識プローブは１６プライ
マーの混合物(全１μg)から、公表されている方法によ
り、ポリヌクレオチドキナーゼ(Ｐ−ＬＢiochemicals)
および２００μＣiの[γ−32Ｐ]ＡＴＰ(５０００Ｃi／m
モル、Ａmersham)を用いた燐酸化により調製した。１
０,０００個のクローンを含んでいるフィルターを、プ
ライマー・ハイブリダイゼーション・ミックス(１００m
ＭトリスpＨ７．５、０．９Ｍ ＮaＣl、６mＭ ＥＤＴ
Ａ、１ＸＤenhardt's溶液、１００μＭ rＡＴＰ、１mＭ
ＮaＨ2ＰＯ4−Ｎaピロホスフェート、０．５％Ｎonidet
Ｐ−４０、０．１mg／ml酵母ＲＮＡ(ＳigmaＲ−６７５
０))中、〜１×１０8cpmの32Ｐ−標識プローブと、室温
で１８時間ハイブリッド形成させた。フィルターを、４
２℃で６×ssc中で３０分間(３回)洗浄し、強化スクリ
ーン(Ｄupont)を用いて−７０℃で１６時間、Ｘ線フイ
ルムに感光させた。約０．７−０．９％(上３７０、下
４６０)のコロニーを選択し、もとのプライミング部位
に対して５'である２つの追加の合成プライマーによる
２回目のスクリーニングにかけた。アミノ酸７４−７７
のための全ての潜在的mＲＮＡ配列に相補的な１２量体
を各４プライマーの２プールに合成した。各々８個の１
４量体２プール(アミノ酸５２−５８および５６の一部
のための潜在的mＲＮＡ配列に相補的)を同様にして合成
した。第１回のスクリーニングで選択した「上」および
「下」のコロニーから、３セットの同一のフィルターを作
成した。４つの合成オリゴヌクレオチドから、既述した
様にして32Ｐ−標識プローブを作成した。プライマー・
ハイブリダイゼーション・ミックス中、フィルターを
０．５×１０8cpmとハイブリッド形成させ、洗浄し、Ｘ
線フイルムに感光させた。５'オリゴヌクレオチド全て
とハイブリッド形成を行なった９つの陽性群(下から３
つ、上から６つ)がみつかった。ミニスクリーン手法で
プラスミドＤＮＡを分離し、最も大きい挿入体を持った
クローンを制限分析により決定した。pmβＮ−９Ｇ１と
名付けたプラスミドの塩基配列を、Ｍaxam−Ｇilbert法
によって完全に決定した。このcＤＮＡ挿入体は、１４
塩基のプライマー配列(図１〜図３、プール１)および全
量７１６bpを含んでいた。 【００５４】Ｃ．７． βＮＧＦメッセージに富むmＲ
ＮＡから調製されたオリゴdＴ−プライム化cＤＮＡクロ
ーン ０．０２５Ｍのクエン酸ナトリウム(pＨ３．８)中の２
％アガロースおよび６Ｍ尿素からなる変性アガロースゲ
ルにより、電気泳動によって２００μgのポリ(Ａ+)ＲＮ
Ａを分画した。リボソームバンド(帯)は、垂直のスライ
スをエチジウムブロマイドで染色することにより肉眼観
察し得る様にした。ゲルを０．５cmのスライスに切断
し、７０℃で融解し、フェノールで２回、クロロホルム
で１回、強力に抽出した。２回のエタノール沈澱の後、
そのペレットをddＨ2Ｏ ３０μlに溶解した。各フラク
ション(４Ｍ酢酸アンモニウム５μl(pＨ７．０)中)１μ
lを乾燥ニトロセルロースフィルターにスポットし、厳
重な条件下でドット・ハイブリダイゼーションによりス
クリーニングした。Ｋlenow Ｐol１反応系中、プライ
マーとして牛胸腺ＤＮＡフラグメントを用いて既知の方
法により、32Ｐ−標識プローブをpmβＮ−９Ｇ１挿入体
から調製した。このフィルターを、５０mＭ ＮaＰＯ4(p
Ｈ７．０)、５×Ｄenhardt's溶液、５×ＳＳＣ、５０μ
g／mlの超音波処理したニシン精子ＤＮＡ、１００μＭ
のrＡＴＰ、１mＭ ＮaＨ2ＰＯ4−ナトリウムピロホスフ
ェート、および５０％ホルムアミド中、４２℃で１８時
間、〜１０7cpmのハイブリッド形成させた。このフィル
ターを０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中、４２℃で２
０分間洗浄し(３回)、フイルムに感光させた。ハイブリ
ダイゼーションの結果、ＮＧＦメッセージはフラクショ
ン１１および１２にあることがわかった。フラクション
１１および１２のそれぞれ１０μlを用い、標準的な方
法でオリゴdＴ−プライム化cＤＮＡを調製した。５％ポ
リアクリルアミドゲル上の電気泳動の後、ゲルスライス
から６００bpより長いcＤＮＡを溶離した。フラクショ
ン１１から約４０ngmのcＤＮＡ、およびフラクション１
２からの２０ngmをd(Ｃ)−尾部形成し、d(Ｇ)−尾部形
成したpＢＲ３２２とアニーリングした。フラクション
１１から約３３００クローン、フラクション１２からの
１５００クローンを、pmβＮ−９Ｇ１からの32Ｐ−標識
内部ＨpaIIフラグメント(２１６bp)を使って、厳重な条
件下のフィルターハイブリダイゼーションにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フィルターを４２℃で
１８時間、５０×１０6cpmとハイブリッド形成させ、洗
浄し、既述した様にＸ線フイルムに感光させた。フラク
ション１２からの５つのクローンがこのプローブについ
て陽性であった。制限分析により、それらは同胞である
ことがわかった。pmβＮ−１２Ｅ４を、Ｍaxam−Ｇilbe
rt法により完全に塩基配列決定した。フラクション１１
からの２つのクローンが陽性であった。最大のpmβＮ−
８Ｂ３の塩基配列をＭaxam−Ｇilbert法により完全に決
定した。 【００５５】Ｃ．８． 医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−ＮＧＦは、このβ−ＮＧＦを適
当な担体と混合して、既知の方法で、有用な医薬組成物
に製剤化することができる。好適な担体、および他のヒ
トの蛋白質、例えばヒトの血清アルブミンを含んでいて
もよい製剤の調製法は、例えばＲemingtonのＰharmacen
tical Ｓciences(Ｅ．Ｗ．Ｍartinによる)に記載され
ている。この様な医薬組成物は、本発明の蛋白質の有効
量を適当な量の担体と共に含んでおり、患者に非経口投
与することができる。 【００５６】このヒトβ−ＮＧＦは、神経障害またはそ
の他の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかかっ
ている患者に非経口投与することができる。投与量およ
び投与割合は、例えばマウスの唾液腺から得られる同様
の製剤の臨床実験に現在使用されているものと同じであ
る。 【００５７】以上の記載は本発明の好ましい態様を述べ
たものであり、本発明がこれに限定されると解釈しては
ならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸配
列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝
子の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図である(そ
の１)。 【図２】 マウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸配
列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝
子の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図で，ある
(その２)。 【図３】 マウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸配
列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝
子の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図である(そ
の３)。 【図４】 β−ＮＧＦmＲＮＡ断片を含んでいるクロー
ンのノーザン・ブロット分析の結果を示すグラフであ
る。 【図５】 マウスＮＧＦ遺伝子の部分的制限地図、およ
び本発明のプラスミドのヌクレオチド配列とマウスＮＧ
Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列との対比を示す模式図であ
る。 【図６】 組換えファージλhＮ８の物理的地図である
(その１)。 【図７】 組換えファージλhＮ８の物理的地図である
(その２)。 【図８】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド配
列を示す模式図である(その１)。 【図９】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド配
列を示す模式図である(その２)。 【図１０】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド
配列を示す模式図である(その３)。 【図１１】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド
配列を示す模式図である(その４)。 【図１２】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド
配列を示す模式図である(その５)。 【図１３】 ヒトおよびマウスのプレプロ−βＮＧＦ遺
伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示
す模式図である(その１)。 【図１４】 ヒトおよびマウスのプレプロ−βＮＧＦ遺
伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示
す模式図である(その２)。 【図１５】 ヒトβＮＧＦの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示す模式図である(その１)。 【図１６】 ヒトβＮＧＦの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示す模式図である(その２)。 【図１７】 ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli
を形質転換するためのプラスミドphＮＧＦtrp１の組み
立て工程の１部を示す工程図である(その１)。 【図１８】 ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli
を形質転換するためのプラスミドphＮＧＦtrp１の組み
立て工程の１部を示す工程図である(その２)。 【図１９】 ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli
を形質転換するためのプラスミドphＮＧＦtrp１の組み
立て工程の１部を示す工程図である(その３)。
列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝
子の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図である(そ
の１)。 【図２】 マウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸配
列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝
子の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図で，ある
(その２)。 【図３】 マウスＮＧＦのβサブユニットのアミノ酸配
列、それを暗号化している遺伝子配列、およびその遺伝
子の特定の断片の相補ＤＮＡ鎖を示す模式図である(そ
の３)。 【図４】 β−ＮＧＦmＲＮＡ断片を含んでいるクロー
ンのノーザン・ブロット分析の結果を示すグラフであ
る。 【図５】 マウスＮＧＦ遺伝子の部分的制限地図、およ
び本発明のプラスミドのヌクレオチド配列とマウスＮＧ
Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列との対比を示す模式図であ
る。 【図６】 組換えファージλhＮ８の物理的地図である
(その１)。 【図７】 組換えファージλhＮ８の物理的地図である
(その２)。 【図８】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド配
列を示す模式図である(その１)。 【図９】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド配
列を示す模式図である(その２)。 【図１０】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド
配列を示す模式図である(その３)。 【図１１】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド
配列を示す模式図である(その４)。 【図１２】 ヒトβＮＧＦ染色体遺伝子のヌクレオチド
配列を示す模式図である(その５)。 【図１３】 ヒトおよびマウスのプレプロ−βＮＧＦ遺
伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示
す模式図である(その１)。 【図１４】 ヒトおよびマウスのプレプロ−βＮＧＦ遺
伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較を示
す模式図である(その２)。 【図１５】 ヒトβＮＧＦの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示す模式図である(その１)。 【図１６】 ヒトβＮＧＦの発現のために組み立てられ
た遺伝子を示す模式図である(その２)。 【図１７】 ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli
を形質転換するためのプラスミドphＮＧＦtrp１の組み
立て工程の１部を示す工程図である(その１)。 【図１８】 ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli
を形質転換するためのプラスミドphＮＧＦtrp１の組み
立て工程の１部を示す工程図である(その２)。 【図１９】 ヒトβＮＧＦを発現するための、Ｅ．coli
を形質転換するためのプラスミドphＮＧＦtrp１の組み
立て工程の１部を示す工程図である(その３)。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ.
26，ＮＯ．３，（1980），Ｐ．195−200
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下のアミノ酸配列： 【化１】 ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg を有する、ヒト起源の夾雑蛋白質を実質的に含まないヒ
トβＮＧＦ。 ２．組換え宿主細胞によって生産される請求項１に記載
のヒトβＮＧＦ。 ３．微生物細胞によって生産される請求項２に記載のヒ
トβＮＧＦ。 ４．Ｅ．coli細胞によって生産される請求項３に記載の
ヒトβＮＧＦ。 ５．グリコシル化されていない請求項１に記載のヒトβ
ＮＧＦ。 ６．アミノ末端にmetをさらに含み、そして／またはカ
ルボキシ末端にarg alaをさらに含むアミノ酸配列を有
する請求項１に記載のヒトβＮＧＦ。 ７．以下のアミノ酸配列： 【化２】 ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg arg ala を有する請求項６に記載のヒトβＮＧＦ。 ８．以下のアミノ酸配列： 【化３】met ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg を有する請求項６に記載のヒトβＮＧＦ。 ９．以下のアミノ酸配列： 【化４】met ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg arg ala を有する請求項６に記載のヒトβＮＧＦ。 １０．以下のアミノ酸配列： 【化６】 ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg を有するヒトβＮＧＦを暗号化しているＤＮＡ配列を含
有し、該配列を発現することができる複製可能な発現ベ
クターで組換え宿主細胞を形質転換し、この細胞を培養
し、発現されたヒトβＮＧＦを分離することからなる、
ヒト起源の夾雑蛋白質を実質的に含まないヒトβＮＧＦ
の調製法。 １１．ヒトβＮＧＦがグリコシル化されていない請求項
１０に記載の調製法。 １２．宿主細胞が微生物細胞である請求項１０に記載の
調製法。 １３．宿主細胞がＥ．coli細胞である請求項１２に記載
の調製法。 １４．ＤＮＡが、アミノ末端にmetをさらに含み、そし
て／またはカルボキシ末端にarg alaをさらに含むアミ
ノ酸配列を暗号化している請求項１０に記載の調製法。 １５．ＤＮＡが、以下のアミノ酸配列： 【化７】 ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg arg ala を暗号化している請求項１４に記載の調製法。 １６．ＤＮＡが、以下のアミノ酸配列： 【化８】met ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg を暗号化している請求項１４に記載の調製法。 １７．ＤＮＡが、以下のアミノ酸配列： 【化９】met ser ser ser his pro ile phe his arg gly glu phe ser val cys asp ser val ser val trp val gly asp lys thr thr ala thr asp ile lys gly lys glu val met val leu gly glu val asn ile asn asn ser val phe lys gln tyr phe phe glu thr lys cys arg asp pro asn pro val asp ser gly cys arg gly ile asp ser lys his trp asn ser tyr cys thr thr thr his thr phe val lys ala leu thr met asp gly lys gln ala ala trp arg phe ile arg ile asp thr ala cys val cys val leu ser arg lys ala val arg arg ala を暗号化している請求項１４に記載の調製法。
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