JPH0771509B2 - ヒトβ−NGFの発現法 - Google Patents
ヒトβ−NGFの発現法Info
- Publication number
- JPH0771509B2 JPH0771509B2 JP63171863A JP17186388A JPH0771509B2 JP H0771509 B2 JPH0771509 B2 JP H0771509B2 JP 63171863 A JP63171863 A JP 63171863A JP 17186388 A JP17186388 A JP 17186388A JP H0771509 B2 JPH0771509 B2 JP H0771509B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ngf
- human
- gene
- dna
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) ヒトβ−NGFの発現法に関する。詳しくは遺伝子組換え
技術によりヒトβ−NGFを発現させる方法に関するもの
である。
技術によりヒトβ−NGFを発現させる方法に関するもの
である。
(発明が解決しようとする課題) NGF(神経成長因子 nerve growth factor)は交感神経
節や知覚神経節等の末梢神経の分化や成長を促進する作
用をもつポリペプチドとして知られているが、近年NGF
が脳内の中枢神経系にも存在し機能していることが解明
されると共に、アルツハイマー型老人性痴呆症との関連
性が注目されている。また、NGFはα2βγ2の複合体
からなり、これ等サブユニットの中で神経突起を伸長さ
せる活性はβ−NGF(以下便宜上β−NGFと記す)のみに
あって、α−NGF及びγ−NGFには活性が無いことが知ら
れているが、ヒトNGFの生理作用に関する研究は報告さ
れておらず、NGFとアルツハイマー型老人性痴呆症との
関係も今後の研究の進展に委ねられている。
節や知覚神経節等の末梢神経の分化や成長を促進する作
用をもつポリペプチドとして知られているが、近年NGF
が脳内の中枢神経系にも存在し機能していることが解明
されると共に、アルツハイマー型老人性痴呆症との関連
性が注目されている。また、NGFはα2βγ2の複合体
からなり、これ等サブユニットの中で神経突起を伸長さ
せる活性はβ−NGF(以下便宜上β−NGFと記す)のみに
あって、α−NGF及びγ−NGFには活性が無いことが知ら
れているが、ヒトNGFの生理作用に関する研究は報告さ
れておらず、NGFとアルツハイマー型老人性痴呆症との
関係も今後の研究の進展に委ねられている。
ヒトβ−NGFの構造については、1983年に遺伝子配列が
決定され、マウスβ−NGFと極めて高い相同性を有する
ことが報告されているが[NATURE,Vol.303,30 JUNE,821
〜825(1983)]、これを遺伝子組換え技術により発現
させること、特に酵母を宿主として分泌させることにつ
いては全く報告されていない。
決定され、マウスβ−NGFと極めて高い相同性を有する
ことが報告されているが[NATURE,Vol.303,30 JUNE,821
〜825(1983)]、これを遺伝子組換え技術により発現
させること、特に酵母を宿主として分泌させることにつ
いては全く報告されていない。
(課題を解決するための手段) 本発明等は上記の事情に鑑み、NGFの今後の研究の進展
と応用に寄与するため、とくにヒトβ−NGFを遺伝子組
換え技術により有利に取得することを目的として鋭意検
討した結果、酵母のαフェロモン(性フェロモン)遺伝
子のリーダー配列を含み、その直後に合成ヒトβ−NGF
遺伝子を組み込んだプラスミドを使用し、これにより形
質転換した酵母がヒトβ−NGFの分泌能を有することを
確認し本発明を達成した。
と応用に寄与するため、とくにヒトβ−NGFを遺伝子組
換え技術により有利に取得することを目的として鋭意検
討した結果、酵母のαフェロモン(性フェロモン)遺伝
子のリーダー配列を含み、その直後に合成ヒトβ−NGF
遺伝子を組み込んだプラスミドを使用し、これにより形
質転換した酵母がヒトβ−NGFの分泌能を有することを
確認し本発明を達成した。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に使用されるサッカロマイセス セレビシエ(Sa
ccharomyces cerevisiae)のαフェロモン遺伝子MFα1
のリーダー配列の直後に合成ヒトβ−NGF遺伝子を含有
するプラスミドは、例えば以下に述べる方法により構築
される。
ccharomyces cerevisiae)のαフェロモン遺伝子MFα1
のリーダー配列の直後に合成ヒトβ−NGF遺伝子を含有
するプラスミドは、例えば以下に述べる方法により構築
される。
[プラスミドの構築] (1)プラスミドpRE1078(7.5kb)の作製(第1図参
照) 特開昭63−133987号公報及びMolecular and Celluar Bi
ology,7,3185〜3193(1987)に記載されている方法で
作製した、サッカロマイセス セレビシエのαフェロモ
ン遺伝子MFα1のプロモーター配列、リーダー(分泌シ
グナル)配列、ターミネーター配列並びにTRP1、2μm
及びpBR322のoriとアンピシリン耐性遺伝子(Apr)を有
し、かつリーダー配列とターミネーター配列との間にヒ
トβ−エンドルフィン遺伝子が挿入されている公知のプ
ラスミドpRE1059を使用し、そのプロモーター配列をホ
スフォグリセレートキナーゼ(PGK)のプロモーター配
列で置換したプラスミドpRE1078を作製する。
照) 特開昭63−133987号公報及びMolecular and Celluar Bi
ology,7,3185〜3193(1987)に記載されている方法で
作製した、サッカロマイセス セレビシエのαフェロモ
ン遺伝子MFα1のプロモーター配列、リーダー(分泌シ
グナル)配列、ターミネーター配列並びにTRP1、2μm
及びpBR322のoriとアンピシリン耐性遺伝子(Apr)を有
し、かつリーダー配列とターミネーター配列との間にヒ
トβ−エンドルフィン遺伝子が挿入されている公知のプ
ラスミドpRE1059を使用し、そのプロモーター配列をホ
スフォグリセレートキナーゼ(PGK)のプロモーター配
列で置換したプラスミドpRE1078を作製する。
即ち、PGKのプロモーター配列とターミネーター配列を
含む公知のプラスミドpMA91[Gene,24,1〜14(1983)]
をBgl IIで切断し、DNAポリメラーゼIで平滑末端とし
た後、EcoR Iで切断してPGKのプロモーター配列を含む
1.5kbのEcoR I−(Bgl II)断片(I)を単離する。
含む公知のプラスミドpMA91[Gene,24,1〜14(1983)]
をBgl IIで切断し、DNAポリメラーゼIで平滑末端とし
た後、EcoR Iで切断してPGKのプロモーター配列を含む
1.5kbのEcoR I−(Bgl II)断片(I)を単離する。
一方、前記のpRE1059をHinf Iで切断し、末端を充填し
た後、Sal Iで切断してMFα1の5′非翻訳領域とリー
ダー配列を含む337bpの断片(II)を単離する。また、p
PE1059のヒトβ−エンドルフィン遺伝子を含むSal I−A
gt II断片(III)と、TRP1、2μm及びpBR322のori並
びにApr領域を含むEcoR I−Aat II断片(IV)とを夫々
の制限酵素で切断して得る。
た後、Sal Iで切断してMFα1の5′非翻訳領域とリー
ダー配列を含む337bpの断片(II)を単離する。また、p
PE1059のヒトβ−エンドルフィン遺伝子を含むSal I−A
gt II断片(III)と、TRP1、2μm及びpBR322のori並
びにApr領域を含むEcoR I−Aat II断片(IV)とを夫々
の制限酵素で切断して得る。
上記で得られる(I)〜(IV)を同時に結合することに
よりpRE1078(7.5kb)を作製する。
よりpRE1078(7.5kb)を作製する。
(2)プラスミドpSSE2(7.5kb)の作製(第2図参照)
pRE1078中のMFα1のリーダー配列の86番目のグルタミ
ン酸コドンGAGAを部位特異的変異導入(site directed
mutagenesis)によりTCTに変え、ここにBgl II切断部位
が導入されたプラスミドpSSE2(7.5kb)を作製する。
pRE1078中のMFα1のリーダー配列の86番目のグルタミ
ン酸コドンGAGAを部位特異的変異導入(site directed
mutagenesis)によりTCTに変え、ここにBgl II切断部位
が導入されたプラスミドpSSE2(7.5kb)を作製する。
即ち、pRE1078をEcoR I及びBamH Iで切断して、PGKのプ
ロモーター配列とMFα1のリーダー配列とを含むEcoR I
−BamH I断片(1.6kb)を採取し、これを既知のファー
ジベクターM13mp18(東洋紡績社カタログ61頁記載)に
クローンし、一本鎖のファージDNAと変異用DNA(5′AG
C TTC AGC AGA TCT TTT ATC3′)をアニールさせた後、
Amersham社のキット(RPN.2322)を用いてハンドブック
(Oligonucleo−tide directed in vitro mutagenesis
system)記載の方法に従って処理してBgl II切断部位が
導入されたDNAを得る。このように処理して得られたBgl
II切断部位が導入されたEcoR I−BamH I断片を、pRE10
78のEcoR I−BamH I断片(5.7kb)と結合してpSSE2(7.
5kb)を作製する。
ロモーター配列とMFα1のリーダー配列とを含むEcoR I
−BamH I断片(1.6kb)を採取し、これを既知のファー
ジベクターM13mp18(東洋紡績社カタログ61頁記載)に
クローンし、一本鎖のファージDNAと変異用DNA(5′AG
C TTC AGC AGA TCT TTT ATC3′)をアニールさせた後、
Amersham社のキット(RPN.2322)を用いてハンドブック
(Oligonucleo−tide directed in vitro mutagenesis
system)記載の方法に従って処理してBgl II切断部位が
導入されたDNAを得る。このように処理して得られたBgl
II切断部位が導入されたEcoR I−BamH I断片を、pRE10
78のEcoR I−BamH I断片(5.7kb)と結合してpSSE2(7.
5kb)を作製する。
(3)プラスミドpSSE9(7.7kb)の作製(第2図参照)
上記で得られたpSSE2をBgl II及びBamH Iで切断し、こ
の切断部位に下記塩基配列からなる合成ヒトβ−NGF遺
伝子を結合することにより、pRE1078中のMFα1のリー
ダー配列の86番目から90番目のコドンとリンカー配列に
由来する7アミノ酸残基に相当するコドン及びβ−エル
ドルフィン遺伝子の代りに、合成ヒトβ−NGF遺伝子が
挿入されたpSSE9(7.7kb)を作製する。
上記で得られたpSSE2をBgl II及びBamH Iで切断し、こ
の切断部位に下記塩基配列からなる合成ヒトβ−NGF遺
伝子を結合することにより、pRE1078中のMFα1のリー
ダー配列の86番目から90番目のコドンとリンカー配列に
由来する7アミノ酸残基に相当するコドン及びβ−エル
ドルフィン遺伝子の代りに、合成ヒトβ−NGF遺伝子が
挿入されたpSSE9(7.7kb)を作製する。
なお、下記塩基配列の合成ヒトβ−NGF遺伝子は、前記N
ATURE,Vol.303,30 JUNE,821〜825(1983)に記載されて
いるヒトβ−NGF遺伝子配列のアミノ酸配列は変えず
に、酵母で強く発現している蛋白質の遺伝子でよく使わ
れているコドンに変えるため、ヒトβ−NGF遺伝子配列
中の85個の塩基を変えて合成したものである。
ATURE,Vol.303,30 JUNE,821〜825(1983)に記載されて
いるヒトβ−NGF遺伝子配列のアミノ酸配列は変えず
に、酵母で強く発現している蛋白質の遺伝子でよく使わ
れているコドンに変えるため、ヒトβ−NGF遺伝子配列
中の85個の塩基を変えて合成したものである。
上記の方法により作製したプラスミドpSSE9でサッカロ
マイセス セレビシエを通常の方法により形質転換株は
ヒトβ−NGFの分泌能を有し、後記実施例に示すよう
に、形質転換株の培養液上清からヒトβ−NGFが取得さ
れる。そして得られたヒトβ−NGFは、例えばクローン
化されたラット副腎髄質褐色細胞株由来のPC12細胞の神
経突起を伸長する作用を有することが観察された。
マイセス セレビシエを通常の方法により形質転換株は
ヒトβ−NGFの分泌能を有し、後記実施例に示すよう
に、形質転換株の培養液上清からヒトβ−NGFが取得さ
れる。そして得られたヒトβ−NGFは、例えばクローン
化されたラット副腎髄質褐色細胞株由来のPC12細胞の神
経突起を伸長する作用を有することが観察された。
(発明の効果) 本発明によれば、活性ヒトβ−NGFを発現させることが
できるので、今後のNGF研究の進展と応用に寄与すると
ころが大きい。
できるので、今後のNGF研究の進展と応用に寄与すると
ころが大きい。
(実施例) 以下本発明は実施例について更に詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限りこれ等の実施例に限定さ
れるものではない。
発明はその要旨を超えない限りこれ等の実施例に限定さ
れるものではない。
なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次のI〜Vの方法によった。
を除き、次のI〜Vの方法によった。
I[制限酵素によるDNAの切断と回収] 制限酵素による切断用緩衝液は、下記3種類を用い
(1)〜(3)の使い分けは、Advanced Bacterial Gen
tics(1981)(Cold spring Harbor,New York)に従っ
た。また切断条件は2単位/μg DNAの制限酵素を用い3
7℃または65℃で30分間処理する。
(1)〜(3)の使い分けは、Advanced Bacterial Gen
tics(1981)(Cold spring Harbor,New York)に従っ
た。また切断条件は2単位/μg DNAの制限酵素を用い3
7℃または65℃で30分間処理する。
次いでTE緩衝液(10mMのトリス塩酸(pH8.0)及び1mMの
EDATからなる)で飽和したフェノールで1回抽出し、エ
ーテルでフェノールを除き、2倍容のエタノールを加え
て−20℃で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回収
する。
EDATからなる)で飽和したフェノールで1回抽出し、エ
ーテルでフェノールを除き、2倍容のエタノールを加え
て−20℃で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回収
する。
(1)低塩濃度緩衝液 10mMのトリス塩酸(pH7.4)、10mMの硫酸マグネシウム
及び1mMのジチオスレイトールからなる。
及び1mMのジチオスレイトールからなる。
(2)中塩濃度緩衝液 50mMのNaCl、10mMのトリス塩酸(pH7.4)、10mMの硫酸
マグネシウム及び1mMのジチオスチトールからなる。
マグネシウム及び1mMのジチオスチトールからなる。
(3)高塩濃度緩衝液 100mMのNaCl、50mMのトリス塩酸(pH7.4)及び10mMの硫
酸マグネシウムからなる。
酸マグネシウムからなる。
II[大腸菌(E.coli)らのプラスミドDNAの調製] (1)ミニ調製法(mini prep法)Nucleic Acids Res.
7,1513〜1523(1979)] 大腸菌を宿主とし、0.5mlのL−ブロス(10gのペプト
ン、5gのイースン・エキス、1gのグルコース、5gのNaCl
/1からなるpH7.2)を用いて一夜間培養し、遠心分離し
て集菌した菌体を100μlの溶液A(50mMのグルコー
ス、10mMのEDTA、25mMのトリス塩酸(pH8.0)及びリゾ
チーム2mg/mlからなる)に懸濁し室温で30分間放置す
る。
7,1513〜1523(1979)] 大腸菌を宿主とし、0.5mlのL−ブロス(10gのペプト
ン、5gのイースン・エキス、1gのグルコース、5gのNaCl
/1からなるpH7.2)を用いて一夜間培養し、遠心分離し
て集菌した菌体を100μlの溶液A(50mMのグルコー
ス、10mMのEDTA、25mMのトリス塩酸(pH8.0)及びリゾ
チーム2mg/mlからなる)に懸濁し室温で30分間放置す
る。
次いで氷水中で200μlの溶液[1%のSDS(ドデシン硫
酸ナトリウム)を含む0.2NのNaOH]を加えて振盪し同時
にDNAの変性を行う。150μlの3M酢酸ソーダ溶液を加え
氷冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを加え、−20
℃で冷却して遠心分離し沈澱を集める。
酸ナトリウム)を含む0.2NのNaOH]を加えて振盪し同時
にDNAの変性を行う。150μlの3M酢酸ソーダ溶液を加え
氷冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを加え、−20
℃で冷却して遠心分離し沈澱を集める。
沈澱を溶液C(50mMのトリス塩酸及び0.1Mの酢酸ソーダ
からなる)に溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを
加え、沈澱するDNAを洗浄し減圧下乾燥し−20℃で保存
する。
からなる)に溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを
加え、沈澱するDNAを洗浄し減圧下乾燥し−20℃で保存
する。
(2)大量調製法 200mlのL−ブロス(薬剤耐性プラスミド場合は薬剤を
含む)に大腸菌HB101を植菌し、一夜間培養して集菌
後、15mlのSTES緩衝液[TES緩衝液(10mMのトリス塩酸
(pH7.4)、1mMのEDTA及び50mMのNaClからなる)に25%
のサッカロースを添加したもの]に懸濁し、EDTA、リゾ
チーム及びリボヌクレアーゼA(シグマ社製)を夫々30
mM,600μg/ml及び50μg/ml加え、更に氷水中でプロナー
ゼEを500μg/ml添加する。次いでSDSを1%となるよう
に加え37℃で振盪し、氷水中に戻しNaClを終濃度1Mとな
るように添加した後、遠心分離した上清に2倍容の冷エ
タノールを加え−20℃に保持し遠心分離してDNAを沈澱
として回収し減圧下乾燥し−20℃で保存する。
含む)に大腸菌HB101を植菌し、一夜間培養して集菌
後、15mlのSTES緩衝液[TES緩衝液(10mMのトリス塩酸
(pH7.4)、1mMのEDTA及び50mMのNaClからなる)に25%
のサッカロースを添加したもの]に懸濁し、EDTA、リゾ
チーム及びリボヌクレアーゼA(シグマ社製)を夫々30
mM,600μg/ml及び50μg/ml加え、更に氷水中でプロナー
ゼEを500μg/ml添加する。次いでSDSを1%となるよう
に加え37℃で振盪し、氷水中に戻しNaClを終濃度1Mとな
るように添加した後、遠心分離した上清に2倍容の冷エ
タノールを加え−20℃に保持し遠心分離してDNAを沈澱
として回収し減圧下乾燥し−20℃で保存する。
III[T4 DNAリガーゼによる連結] 連結する2個のDNA断片は、1μg/10μlになるように
連結用緩衝液[66mMのトリス塩酸(pH7.5)、6.6mMの塩
化マグネシウム、10mMのジチオスレイトールからなる]
に溶解し65℃で10分間処理した後、4℃で66μMのATP
(アデノシントリフォスフェート)を加え、更にT4リガ
ーゼを粘着末端の場合は0.1単位/μgDNA、または平滑
末端の場合は1単位/μgDNAになるように加えて4℃で
18時間反応させた後、65℃で10分間処理する。
連結用緩衝液[66mMのトリス塩酸(pH7.5)、6.6mMの塩
化マグネシウム、10mMのジチオスレイトールからなる]
に溶解し65℃で10分間処理した後、4℃で66μMのATP
(アデノシントリフォスフェート)を加え、更にT4リガ
ーゼを粘着末端の場合は0.1単位/μgDNA、または平滑
末端の場合は1単位/μgDNAになるように加えて4℃で
18時間反応させた後、65℃で10分間処理する。
IV[大腸菌の形質転換(Advanced Bacterial Genetics
(1981)(Cold Spring Havor,New York)] 5mlのL−ブロスに大腸菌を植菌し、一夜間培養する。
この0.2mlを20mlのL−ブロスに植え37℃でクレットユ
ニットが60に達するまで振盪培養する。菌体を集め氷冷
した50mMの塩化カルシウムと10mMのトリス塩酸(pH8.
0)とからなる緩衝液10mlに懸濁し30分間氷冷する。遠
心分離した菌体を1mlの塩化カルシウム溶液に懸濁し、
その0.1mlを10μlのDNA溶液と混合し0℃で30分間、42
℃で2分間インキュベートした後、1.5mlのL−ブロス
を加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天培地に植
える。
(1981)(Cold Spring Havor,New York)] 5mlのL−ブロスに大腸菌を植菌し、一夜間培養する。
この0.2mlを20mlのL−ブロスに植え37℃でクレットユ
ニットが60に達するまで振盪培養する。菌体を集め氷冷
した50mMの塩化カルシウムと10mMのトリス塩酸(pH8.
0)とからなる緩衝液10mlに懸濁し30分間氷冷する。遠
心分離した菌体を1mlの塩化カルシウム溶液に懸濁し、
その0.1mlを10μlのDNA溶液と混合し0℃で30分間、42
℃で2分間インキュベートした後、1.5mlのL−ブロス
を加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天培地に植
える。
V[粘着末端の充填] 1μgのDNAを30μlの50mMトリス塩酸(pH7.2)、10mM
の硫酸マグネシウム、0.1mMのジチオスレイトール、50
μg/mlの牛血清アルブミン(BSA)及び0.2mMのdNTPに溶
かし、1.25単位のklenow断片(大腸菌のDNAポリメラー
ゼIをトリプシンで処理して得られる大きな断片)を加
え室温で30分間反応させる。次いで1μlの0.5M EDTA
(pH8.0)を加えて反応を停止させ、フェノール及びエ
ーテルで逐次抽出しフェノールを除去し、DNAをエタノ
ール沈澱により回収する。
の硫酸マグネシウム、0.1mMのジチオスレイトール、50
μg/mlの牛血清アルブミン(BSA)及び0.2mMのdNTPに溶
かし、1.25単位のklenow断片(大腸菌のDNAポリメラー
ゼIをトリプシンで処理して得られる大きな断片)を加
え室温で30分間反応させる。次いで1μlの0.5M EDTA
(pH8.0)を加えて反応を停止させ、フェノール及びエ
ーテルで逐次抽出しフェノールを除去し、DNAをエタノ
ール沈澱により回収する。
実施例1 (1)プラスミドpRE1078(7.5kb)の作製(第1図)PG
Kのプロモーター配列とターミネーター配列を含むプラ
スミドpMA91をBgl IIで切断し、DNAポリメラーゼIで平
滑末端した後、EcoR Iで切断してPGKのプロモーター配
列を含む1.5kbのEcoR I−(Bgl II)断片(I)を単離
した。
Kのプロモーター配列とターミネーター配列を含むプラ
スミドpMA91をBgl IIで切断し、DNAポリメラーゼIで平
滑末端した後、EcoR Iで切断してPGKのプロモーター配
列を含む1.5kbのEcoR I−(Bgl II)断片(I)を単離
した。
一方、pRE1059をHinf Iで切断し、末端を充填した後、S
al Iで切断してMFα1の5′非翻訳領域とリーダー配列
を含む337bpの断片(II)を単離した。また、pRE1059の
β−エルドルフィン遺伝子を含むSal I−Aat II断片(I
II)と、TRP1、2μm及びpBR322のori、Aprを含むEcoR
I−Aat II断片(IV)とを、夫々の制限酵素で切断した
後、アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のバン
ドを溶出することにより得た。上記で得た(I)〜(I
V)の断片を同時にT4 DNAリガーゼで結合してpRE1078
(7.5kb)を作製した。
al Iで切断してMFα1の5′非翻訳領域とリーダー配列
を含む337bpの断片(II)を単離した。また、pRE1059の
β−エルドルフィン遺伝子を含むSal I−Aat II断片(I
II)と、TRP1、2μm及びpBR322のori、Aprを含むEcoR
I−Aat II断片(IV)とを、夫々の制限酵素で切断した
後、アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のバン
ドを溶出することにより得た。上記で得た(I)〜(I
V)の断片を同時にT4 DNAリガーゼで結合してpRE1078
(7.5kb)を作製した。
(2)プラスミドpSSE2(7.5kb)の作製(第2図)pRE1
078をEcoR I及びBamH Iで切断し、PGKのプロモーター配
列とMFα1のリーダー配列を含むEcoR I−BamH I断片
(1.6kb)を採取し、これをファージベクターM13mp18に
クローンし一本鎖のファージDNAと変異用DNA(5′AGC
TTC AGC AGA TCT TTT ATC3′)をアニールさせた後、Am
ersham社のキット(RPN.2322)を用いハンドブック(Ol
igonucleotide directed in vitro mutagenesis syste
m)記載の方法に従って処理してBgl II切断部位が導入
されたDNAを得た。得られたBgl II切断部位が導入され
たEcoR I−BamH I断片を、pRE1078のEcoR I−BamH I断
片(5.7kb)と結合してpSSE2(7.5kb)を作製した。
078をEcoR I及びBamH Iで切断し、PGKのプロモーター配
列とMFα1のリーダー配列を含むEcoR I−BamH I断片
(1.6kb)を採取し、これをファージベクターM13mp18に
クローンし一本鎖のファージDNAと変異用DNA(5′AGC
TTC AGC AGA TCT TTT ATC3′)をアニールさせた後、Am
ersham社のキット(RPN.2322)を用いハンドブック(Ol
igonucleotide directed in vitro mutagenesis syste
m)記載の方法に従って処理してBgl II切断部位が導入
されたDNAを得た。得られたBgl II切断部位が導入され
たEcoR I−BamH I断片を、pRE1078のEcoR I−BamH I断
片(5.7kb)と結合してpSSE2(7.5kb)を作製した。
(3)プラスミドpSSE9(7.5kb)の作製(第2図) 上記で得たpSSE2をBgl II及びBamH Iで切断し、この切
断部位に前記塩基配列の合成ヒトβ−NGF遺伝子を結合
して、pRE1078中のβ−エルドルフィン遺伝子の代り
に、βNGF遺伝子が挿入されたpSSE9(7.7kb)を作製し
た。
断部位に前記塩基配列の合成ヒトβ−NGF遺伝子を結合
して、pRE1078中のβ−エルドルフィン遺伝子の代り
に、βNGF遺伝子が挿入されたpSSE9(7.7kb)を作製し
た。
(4)[pSSE9によるサッカロマイセス セレビシエ20B
−12株の形質転換] サッカロマイセス セレビシエ20B−12株をYPD培地(1
%酵母エキス、2%バクトペプトン及び2%グルコース
からなる)で一夜間培養した培養液0.5mlを20mlのYPD培
地に植え、30℃でクレットユニット60まで振盪培養し
た。この10mlを遠心分離し、菌体を10mlのTE緩衝液で洗
浄後1mlのTE緩衝液に懸濁した。この0.5mlに0.5mlの0.2
M酢酸リチウム、10mMのトリス塩酸(pH7.5)及び1mMのE
DTAを加え、30℃で1時間保持した後、氷水中で冷却し
た。
−12株の形質転換] サッカロマイセス セレビシエ20B−12株をYPD培地(1
%酵母エキス、2%バクトペプトン及び2%グルコース
からなる)で一夜間培養した培養液0.5mlを20mlのYPD培
地に植え、30℃でクレットユニット60まで振盪培養し
た。この10mlを遠心分離し、菌体を10mlのTE緩衝液で洗
浄後1mlのTE緩衝液に懸濁した。この0.5mlに0.5mlの0.2
M酢酸リチウム、10mMのトリス塩酸(pH7.5)及び1mMのE
DTAを加え、30℃で1時間保持した後、氷水中で冷却し
た。
得られた菌体懸濁液100μlに、上記(3)で得たpSSE9
の溶液10μlを加え、0℃で30分間保持した後、集菌し
水0.5mlで洗浄後0.3mlの水に懸濁し、プレート1枚に0.
1mlを植えた。
の溶液10μlを加え、0℃で30分間保持した後、集菌し
水0.5mlで洗浄後0.3mlの水に懸濁し、プレート1枚に0.
1mlを植えた。
(5)ヒトβ−NGFの分泌量と活性の測定 上記(4)で得た形質転換菌体をYCD培地(1%酵母エ
キス、2%カザミノ酸及び2%のグルコースからなる)
で30℃で2日間培養し、培養液を遠心分離し、得られた
上清をホローファイバー(アミコン社HIP10−20)で10
〜60倍量に濃縮して、ヒトβ−NGFの同定と活性の測定
に供した。
キス、2%カザミノ酸及び2%のグルコースからなる)
で30℃で2日間培養し、培養液を遠心分離し、得られた
上清をホローファイバー(アミコン社HIP10−20)で10
〜60倍量に濃縮して、ヒトβ−NGFの同定と活性の測定
に供した。
[ヒトβ−NGFの分泌量] 上記の濃縮液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた後、抗NGF抗体を用いたウエスタンブロッティン
グ(Western blotting)により測定した結果、β−NGF
の分泌量は約10μg/lであった。
かけた後、抗NGF抗体を用いたウエスタンブロッティン
グ(Western blotting)により測定した結果、β−NGF
の分泌量は約10μg/lであった。
[ヒトβ−NGFの活性] PC12細胞(1975年、GreeneとTischlerによりクローン化
されたラット副腎髄質褐色細胞腫[Proceedings of the
National Academy of Sciences,of the U.S.A.,73,242
4〜2428(1976)]由来のPC12の細胞神経突起伸長反応
の有無を調べた。
されたラット副腎髄質褐色細胞腫[Proceedings of the
National Academy of Sciences,of the U.S.A.,73,242
4〜2428(1976)]由来のPC12の細胞神経突起伸長反応
の有無を調べた。
次の処方により分化誘導培地を調製した。即ち、DME培
地(Gibco社製)とF12培地(Gibco社製)の1000ml用試
薬を1:1の割合で混合し、これにヘペス(Hepes)7.15
g、亜セレン酸ナトリウム10.36μg、重炭酸ナトリウム
3.7g、ペニシリンG10万単位及び硫酸ストレプトマイシ
ン200mgを加え、水で合計2000mlとする。以下これをDF
培地という。
地(Gibco社製)とF12培地(Gibco社製)の1000ml用試
薬を1:1の割合で混合し、これにヘペス(Hepes)7.15
g、亜セレン酸ナトリウム10.36μg、重炭酸ナトリウム
3.7g、ペニシリンG10万単位及び硫酸ストレプトマイシ
ン200mgを加え、水で合計2000mlとする。以下これをDF
培地という。
準胎児牛血清及び熱非働化馬血清を、夫々5%濃度とな
るようにDF培地に添加し、この培地を用いてPC12細胞を
2×104cell/mlとなるように希釈し、これを予めコラー
ゲンでコートした24穴のウエルに入れる。このウエル
に、ヒトβ−NGFを含む前記の濃縮上清を加え、5%CO2
を含むインキュベター中で3〜5日間培養して顕微鏡で
観察したところ、明らかな神経突起の伸長が認められ
た。
るようにDF培地に添加し、この培地を用いてPC12細胞を
2×104cell/mlとなるように希釈し、これを予めコラー
ゲンでコートした24穴のウエルに入れる。このウエル
に、ヒトβ−NGFを含む前記の濃縮上清を加え、5%CO2
を含むインキュベター中で3〜5日間培養して顕微鏡で
観察したところ、明らかな神経突起の伸長が認められ
た。
第1図及び第2図は夫々プラスミドpRE1078及びpSSE9の
構成ルートを示す模式図である。図中AはAat IIを、B
はBamH Iを、BgはBgl IIを、EはEcoR Iを、HはHind I
IIを、HfはHinf Iを、SはSal Iを夫々示す。
構成ルートを示す模式図である。図中AはAat IIを、B
はBamH Iを、BgはBgl IIを、EはEcoR Iを、HはHind I
IIを、HfはHinf Iを、SはSal Iを夫々示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−84299(JP,A) 特開 昭59−132892(JP,A) 特開 昭62−248488(JP,A)
Claims (1)
- 【請求項1】サッカロマイセス セレビシエのαフェロ
モン遺伝子MFα1のリーダー配列の直後に、下記の塩基
配列 で示される合成ヒトβ−NGF遺伝子を含有するプラスミ
ドでサッカロマイセス セレビシエを形質転換し、得ら
れた形質転換株を培養してヒトβ−NGFを分泌させるこ
とを特徴とする活性型ヒトβ−NGFの発現法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63171863A JPH0771509B2 (ja) | 1988-07-12 | 1988-07-12 | ヒトβ−NGFの発現法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63171863A JPH0771509B2 (ja) | 1988-07-12 | 1988-07-12 | ヒトβ−NGFの発現法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0223883A JPH0223883A (ja) | 1990-01-26 |
JPH0771509B2 true JPH0771509B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=15931184
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63171863A Expired - Lifetime JPH0771509B2 (ja) | 1988-07-12 | 1988-07-12 | ヒトβ−NGFの発現法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0771509B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4139000A1 (de) * | 1991-11-27 | 1993-06-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3382547D1 (de) * | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
DK161152C (da) * | 1983-03-03 | 1991-11-11 | Genentech Inc | Polypeptid med egenskaber som human beta-nervevaekstfaktor og fremgangsmaade til fremstilling deraf, dna-isolat omfattende en sekvens som koder for polypeptidet, replicerbar udtrykkelsesvektor for dna-sekvensen, rekombinant vaertscelle transformeret med vektoren, farmaceutisk praeparat indeholdende polypeptidet og fremg. der omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremst. af et farmaceutisk praeparat |
JPS62248488A (ja) * | 1985-11-28 | 1987-10-29 | Agency Of Ind Science & Technol | 組み換えdna及びそれを含む酵母形質転換体 |
-
1988
- 1988-07-12 JP JP63171863A patent/JPH0771509B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0223883A (ja) | 1990-01-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK175822B1 (da) | Renset DNA-sekvens, som koder for en gæralkoholoxidase II-genregulatorregion | |
KR900005776B1 (ko) | 인터페론의 제조방법 | |
KR900008950B1 (ko) | 야로위아 리포리티카 형질전환체에 의한 이종 단백질의 발현 및 분비 | |
JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているdnaと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているdna | |
US5641650A (en) | Expression of heterologous polypeptides in halobacteria | |
JPH03103188A (ja) | ヒト血清アルブミンの製造方法 | |
US5015574A (en) | DNA sequence involved in gene expression and protein secretion, expression-secretion vector including the DNA sequence and the method of producing proteins by using the expression-secretion vector | |
JPH0771509B2 (ja) | ヒトβ−NGFの発現法 | |
US5334531A (en) | Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone | |
KR950010817B1 (ko) | 사카로미세스 세레비시아에에서 재조합 인간 psti의 제법 | |
NO173452B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter | |
Tarragona-Fiol et al. | Production of mature bovine pancreatic ribonuclease in Escherichia coli | |
RU2465315C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPBS-St9, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СОМАТОТРОПИНА, И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ДЛЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА | |
EP0248227A1 (en) | Yeast production of streptokinase | |
AU653178B2 (en) | Method of improving the yield of heterologous proteins produced by streptomyces lividans | |
JP2516737B2 (ja) | プラスミドベクタ−、その製造法および用法 | |
JPS6398389A (ja) | 酵母における改良遺伝子発現 | |
KR940004543B1 (ko) | 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법 | |
JP2560214B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコードするdna配列 | |
HUT55049A (en) | Process for expressing functional insect specific toxin gene in mammalian cells | |
RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
JP2538200B2 (ja) | ポリペプチド分泌発現ベクタ―及び形質転換微生物 | |
JP2507874B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコ−ドするdna配列 | |
JPH05317037A (ja) | 酵母erd2遺伝子とそのリガンドとしての小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子とを含む共発現系及びそれを利用する有用ポリペプチドの製造法 | |
US4757021A (en) | Recombinant plasmid and microbial strain transformed by said plasmid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |