DK172458B1 - Signalpeptid, DNA-sekvens, som koder for dette peptid, genstruktur indeholdende DNA-sekvensen, plasmid indeholdende DNA-sek - Google Patents

Description

i DK PR 172458 B1

Den foreliggende opfindelse angår et signalpeptid, som er en bestanddel af et propeptid, som i en strep-tomycetcelle, der indeholder en signalpeptidase, spaltes i signalpeptidet og et polypeptid, hvorved sidstnævnte 5 fjernes fra cellen og udskilles i dyrkningsmediet. Opfindelsen angår endvidere en DNA-sekvens, som koder for dette signalpeptid, genstrukturer, som indeholder denne DNA-sekvens i læseramme med et strukturgen, et plasmid, som indeholder en sådan DNA-sekvens eller genstruktur, samt en 10 værtsorganisme indeholdende et sådant plasmid. Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, hvorved der anvendes en sådan værtsorganisme.

I tysk patentansøgning nr. P 33 31 860.3 foreslås en fremgangsmåde til fremstilling af tendamistat 15 ved hjælp af fermentering af streptomyces tendae, hvilken fremgangsmåde er karakteriseret ved, at der anvendes tendamistat-producerende S. tendae-stammer, som behandles med subletale doser acriflavin, \Jd fra de herved opnåede stammer isoleres et DNA-fragment med genet for 20 tendamistat, nemlig et 2,3-kb-Pst X-fragment. Ved indbygning af dette fragment i en med Pst I snittet pBR 322 kunne dette DNA formeres i E.coli og igen isoleres.

Det har nu vist sig, at på dette 2,3-kb-store fragment er umiddelbart foran strukturgenet for tendami-25 stat indkodet et signalpeptid (præpeptid) med formlen

Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala I

hvori S er et hydrofobt område, som omfatter 17-20 30 aminosyrer.

Opfindelsen angår således et peptid, som er ejendommeligt, at det har formlen

Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala 35 2 DK PR 172458 B1 hvor X er et hydrofobt område, som omfatter 10-25, fortrinsvis 17-20 aminosyrer.

Opfindelsen angår også den tilsvarende DNA-sekvens 5 B, som kan fås ud fra tendamistat-producerende Streptomyces tendae-stammer, som fortrinsvis er behandlet med subletale doser acriflavin, ved isolering af total-DNA'et, fordøjelse med Pst I, Southern-hybridisering med DNA-sekvensen A

10 5'-(32P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3' (A) isolering af det 2,3 kb store Pst I-fragment, snitning med BamHI, Southern-hybridisering med sekvensen A, isolering af det 0,94 kb store Pstl-BamHI-subfragment, snitning med Sau 15 3a, Southern-hybridisering med sekvensen A, isolering af det 0,525 kb store BamHI-Sau 3a-subfragment og sekventering af DNA'et, hvilken DNA-sekvens er ejendommelig ved karakteristikaene: 20 (a) den ligger umiddelbart før tendamistat-struktur genet, (b) den koder ved amino-endestillingen for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, 25 (c) den koder ved carboxy-endesti11ingen for Ala-Ser-Ala, og (d) den koder i midten for et hydrofobt område, der 30 omfatter 10-25, fortrinsvis 17-20 aminosyrer.

De ved sammenligning med standardmarkører opnåede kb-talværdier har den gængse nøjagtighed.

I stedet for sekvensen A kan der til Southern» 35 3 DK PR 172458 B1 -hybridisering vælges en hvilken som helst sekvens, der er komplementær med tendamistatgenet eller modstrengen.

Til de forskellige trin til karakterisering af 5 DNA-sekvensen B indføres i praksis DNA'et i en egnet vektor, denne transformeres i en værtscelle, formeres der, transformanterne fås ved kolonihybridisering med sekvensen A, og DNA isoleres igen. Disse trin er i og for sig kendt.

10 DNA-Sekvensen C, hvis indkodende streng er anført nedenfor i tillægget til beskrivelsen, har nucleotidræk-kefølgen i tendamistat-strukturgenet hidrørende fra S. ten-dae.

Opfindelsen angår også en genstruktur, som er ejen-15 dommelig ved, at den indeholder DNA-sekvensen B, fortrinsvis umiddelbart i læseramme med et strukturgen, især strukturgenet for tendamistat, navnlig DNA-sekvensen C.

Opfindelsen angår desuden et plasmid, som er ejendommeligt ved den ovennævnte DNA-sekvens B eller genstruk-20 tur, fortrinvis med et i streptomyceter virksomt replicon og/eller et i E. coli virksomt replicon.

Hvis plasmidet indeholder et i E. coli virksomt replicon, er det i stand til at formepe DNA'et i E. coli og eventuelt også udtrykke det. Hvis pladmidet indeholder et i 25 streptomyceter virksom replicon, bliver en streptomycet transformeret med et sådant plasmid i stand til at udtrykke det ved strukturgenet bestemte peptid i form af propeptidet med formlen II, som så inden for rammen af oparbejdningen spaltes med en signalpeptidase og udskiller det ønskede 30 peptid i dyrkningsmediet.

Fordelagtige er de såkaldte "shuttle"-plasmider, som indeholder et replicon, der er virksomt både i E. coli og i streptomycter. Disse "shuttle"-vektorer kan formeres i E. coli og efter omisolering transformeres i streptomyceter, 35 hvor så produktionen af det ønskede polypeptid finder sted.

4 DK PR 172458 B1

Opfindelsen angår også en værtsorganisme af slægten Streptomyces, især arten S. tendae eller S. lividans, som er ejendommelig ved, at den indeholder et plasmid ifølge 5 opfindelsen.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en værtsorganisme ifølge opfindelsen, som indeholder en signalpeptidase, som fra- 10 skiller præpeptidet, der svarer til DNA-sekvensen B.

Medens der til gram-negative bakterier findes en mængde vektorer, er der kun beskrevet få vektorer til gram-positive bakterier. Vektorer til bakterier af arten S. tendae har hidtil ikke været kendt. Opfindelsen åbner 15 således mulighed for adgang til udnyttelse af S. tendae som værtsorganismer.

En særlig fordel ved opfindelsen består i, at transformerede streptomyces-stammer, især S. lividans, har optimal sporedannelse, dvs, indholdet af det rekom- 2 0 binante plasmid generer ikke denne stamme i dens generative fase. De transformerede organismer er derfor også egnede til yderligere stanuneforbedringer, f.eks. til fremstilling og udvælgelse af metaboliske mutanter, ved hvis fremstilling der arbejdes med sporer.

25 I modsætning til de kendte stammer af S. tendae danner de transformerede stammer, især S. lividans, intet melanin. Derfor bortfalder fraskillelsen heraf, hvilket letter isoleringen af det ønskede peptid, f.eks. tenda- mistat, væsentligt og forhindrer tab af udbytte.

30

Et yderligere fortrin ved opfindelsen består i, at fremmedgener også eksprimeres i S. lividans og de tilsvarende polypeptider udsondres, hvilket ligeledes giver 35

O

5 DK PR 172458 B1 mange muligheder for stammeforbedring og ligeledes for modificering af det således fremstillede polypeptid.

Ifølge opfindelsen kan dog også andre Strepto-mycesarter transformeres, f.eks. S. ghanaensis eller 5 aureofaciens, Dersom plasmidfrie stammer, der er i stand til at syntetisere en specifik signalpeptidase, transformeres med hybridplasmiderne ifølge opfindelsen, fås stabile transformanter, som udtrykker og udsondrer det indkodede peptid, 10 Særlig foretrukne udførelsesformer for opfindel sen vil blive nærmere forklaret i de følgende eksempler. Procentangivelserne er her efter vægt, medmindre andet er anført. Tegningens figurer, der fremstiller hybridplas-mider, viser snitstederne i de rigtige målestoksforhold.

15 I eksemplerne anvendes følgende fra litteraturen kendte vektorer; enkeltstrengsfagerne M 13 mp 8 og M 13 mp 9; Messing m.fl., Gene 19, 269 (1982), pUC 8: Vierra m,fl,, Gene 19, 259 (1982), pAC 177 og 184: Chang m.fl., J. Bacteriology 134, 1141 (1978) , pIJ 102 og 350: Kieser 20 m.fl., Mol, Gen. Genet. 185, 223 (1982),

Hvorledes stammen S, tendae fås, er. beskrevet i USA patentskrift nr, 4,226,764, Isoleringen af tenda-mistagenet kan principielt ske ud fra enhver tendamistat-producerende stamme. Særlig fordelagtig er dog frem-25 gangsmåden ifølge tysk patentansøgning nr. P 33 31 860.3, i hvis eksempel 3 isoleringen af DNA er beskrevet. Dette isolerede total-DNA er udgangsmaterialet for nedenstående eksempel 1.

30 Eksempel 1 5^ug DNA fordøjes fuldstændig med restriktionsenzymet Pst I og overføres efter adskillelse til en 0,8%'s agarose-gel på nitrocellulosefilter (Southern-transfer).

Filteret med det. bundne denaturerede DNA forhybridiseres 35 i 6 timer i 5 ml forhybridiseringsmedium (0,6 molær NaCl, 0,06 molær Na-EDTA, 0,1%'s natriumdodcecylsulfatopløsning,

O

6 DK PR 172458 B1 lOO^ug/ml ultralydbehandlet kalvebrissel-DNA og 4 gange koncentreret Denhardt-opløsning. Derpå behandles igen med 5 ml forhybridiseringsmedium, hvortil der dog er tilsat 500.000 cpm/ml radioaktivt mærket DNA. Denne radio- 5 aktivt markerede prøve fås på følgende måde: DNA-Sekvensen A syntetiseres kemisk ved hjælp af phosphit-fremgangsmåden. Den indeholder 20 nucleo-tider (molekylevægt ca, 13.000) og er komplementær med den putative DNA-sekvens for tendamistat, afledt af ami-10 npsyresekvensen ,fra tendamistat fra tendamistats aminosyre 37 ved hjælp af de af E.coli foretrukne tripletter.

PNA-Sekvensen A mærkes radioaktivt ved 5'-enden ved hjælp 32 af γ- P-ATP og nucleotid-kinase.

For at hybridisere denne radioaktive prøve til 15 den komplementære DNA-sekvens i total-DNA'et henstår blandingen i 24 timer ved 37°C. Derefter fjernes det ikke-bundne radioaktive DNA, og filteret vaskes ved 37°C 5 x 30 minuuter, hver gang med 200 ml hybridiseringsme-dium og autoradiocjraferes derpå. Efter 24 timers ekspo-20 nering viser hybridiseringssignalerne, at genet ligger på et 2,3 kb langt Pst I-fragment. Dette fragment udvindes ved feiektroeluering på præparativ agarose-gel af en snitdel, der svarer til denne fragmentstørrelse, til opdeling af det med Pstl-fordøjede totale DNA. Det 25 eluerede DNA klones i Pst I-snitstedet i plasmidet pUC 8.

Disse hybridplasmider transformeres til E.coli JM 103 og formeres. Påvisningen af sådanne kloner, som bærer det søgte indsatte stykke med tendamistat-genet, sker ved hjælp af kolonihybridisering ved anvendelse af 30 den radioaktive DNA-prøve A. De således opnåede hybridplasmider pKAI la og lb er fremstillet i tegningens fig.

1 a og b.

Ved hjælp af yderligere Southern-hybridseringer mod det isolerede 2,3 kb lange Pst I-fragment og dettes 35 subfragmenter kan genet lokaliseres nøjagtigt (fig. 2a til 2c), DK PR 172458 B1 o 7

Eksempel 2 I de særlige snitsteder i plasmidet pIJ 102 for Pst I klones 2,3 kb Pst I-fragmentet fra S. tendae. De således opnåede hybridplasmider pAX la og lb, som er for-5 skellige med hensyn til det indsattes orientering, sætter efter transformering i S, lividans-stammer dette i stand til at producere tendamistat. På fig. 3 ses plas-midet pAX la.

10 Eksempel 3

Den på markedet værende stamme S. lividans TK

24 (John Innes Institute, Norwich, England) overføres på kendt måde til protoplaater og der tilsættes l,ug hybrid- 8 ' plasmid pAX la med 10 protoplaster under tilsætning af 15 20%fs polyethylenglycol 6000. De transformerede proto plaster dyrkes på regenerationsmedium R2YE [Thompson m. fl., Nature 286, 525 (1980)] ved 30°C i 5 dage.

Påvisningen af, at der er dannet en ekstracel-lulær amylase-inaktivator, kan ske ved hjælp af en pla-20 deprøve:

De regenererede kolonier overhældes med 5 ml af en 0,4-1 mg/ml pankreatin-holdig vandig opløsning og inkuberes i en time ved 37°C. Opløsningen fjernes derpå og der tilsættes 5 ml af en 2%'s stivelsesagar. Efter 2 25 timers inkubation ved 37°C overhældes pladerne med 5 ml af en jod-kaliumiodid-opløsning til fremkaldelse. Kolonierne med blå ring viser, . at klonerne syntetiserer og udsondrer tendamistat.

Som kontrol kan man ud fra tendamistat-produce-30 rende godt sporedannende stammer Isolere plasmid-DNA’et og kortlægge dette. Alle tendamistat-producerende stammer frembyder det indsatte plasmid-DNA.

Eksempel 4 35 Fremgangsmåden i eksempel 2 benyttes, idet der dog anvendes plasmidet pIJ 350, der som selektionsmarkør

O

8 DK PR 172458 B1 i streptomyceter bærer et thiostrepton-resistensgen.

Herved fås hybridplasmiderne pAX 350 a og b (forskellige med hensyn til det indsattes orientering).

Fig. 4 viser plasmidet pAX 350 a.

5 Efter transformation ifølge eksempel 3 udvælges på minimalmedium [Hopwood, Bacteriological Reviews 31, 373-403 (1967)] i nærvær af 50^ug/ml thiostrepton resistente kloner, og disse afprøves enten direkte på minimalmedium eller efter omstrygning på ikke-selektiv R2YE-10 -agar med hensyn til tendamistat-produktion.

Eksempel 5

Hybridplasmider, som indeholder Pst X-fragmen-tet på 2,3 kb og foruden streptomycet-repliconet også 15 indeholder et E.coli-replicon, har som shuttle-vekto-rer en række fordele: på grund af E. coli-repliconet og de i E.coli virksomme resistensmarkører kan de formeres godt i disse organismer. Efter isolering og transformation i streptomyceter, især S. lividans, udviser 20 de høj stabilitet. Som følge af deres selektionsmarkører, der er virksomme i streptomyceter, og streptomycet-repliconet kan de også formeres godt i disse organismer og eksprimerer og udskiller tendamistat.

Plasmidet pAC 184 fordøjes helt med restrik-25 tionsenzymet Sal I, og enzymet fjernes ved hjælp af phenol/chloroform-ekstraktion, De udragende 5'-ender fyldes i nærvær af ATP, CTP, GTP og TTP ved hjælp af enzymet DNA-polymerase (Klenow-fragment). Til de stumpe ender (blunt ends) ligateres ved en ligase-reaktion 30 ved 16°C et Pst-I-meliemstykke med strukturen 5’TCG AGC TGC AGC TCG A 3' 3' AGC TCG ACG TCG AGC T 5' 35 (2^ug mellemstykke bil Q,4^,ug DNA) , DNA’et ekstraheres med phenol/chloroform, og efter fældning fordøjes det med

O

9 DK PR 172458 B1 enzymet Pst I til udvinding af de ligaterbare Pst I-ender.

DNA'et dephopshoryleres derpå, ekstraheres igen med phen-ol/chloroform og ligateres med det med Pst I delvis fordøjede plasmid pAX la. Ligationsblandingen transforme-5 res i E. coli (HB 101 eller MC 1061). Mod chloramphenicol resistente kloner renses fra pladen, og DNA'et isole res. S. lividans TK 24 transformeres med l-2^,ug DNA og arprøves med hensyn til tendamistat-produktion,

Kloner, der reagerer positivt ved tendamistat-10 -prøven, isoleres, plasmid-DNA’et isoleres ved alkalisk hurtiglyse og tilbagetransformeres i E. coli HB 101 eller MC 1061, De efter formering atter isolerede plasmi-der adskiller sig ikke fra de ud fra S. lividans-stammer isolerede plasmider. Alt efter orienteringen af det ind-15 satte, som barer tendamistat-genet, betegnes de rekombi-nante plasmider som pSA 2 a eller b (fig. 5 a og b).

Eksempel 6

Fremgangsmåden ifølge eksempel 5 anvendes, idet 20 der dog startes med plasmid pAX 350 a, der udvælges i E. coli med hensyn til chloramphenicol-resistens og i S. lividans med hensyn til thiostrepton-resistens og tendamistat-produktion, og herved fås plasmiderne pSA 351 a og b (fig. 6 a/b).

25

Eksempel 7

Fremgangsmåden ifølge eksempel 5 anvendes, idet der dog startes med plasmidet pAC 177 i stedet for pAC 184, og herved fås plasmiderne pSA 3 a og b (fig. 7 a/b).

30 Hertil snittes plasmidet pAX 1 a partielt med

Pst I, og enzymet varmeinaktiveres ved 15 minutters opvarmning til 68°C. DNA’et ligateres i det med Pst I snittede dephosphorylerede og deproteinerede plasmid pAC 177. Efter transformation af E. coli HB 101 eller 35 MC 1061 renses de over for kanamycin resistente kloner fra pladen, plasmid-DNA'et isoleres, og S, lividans TK

DK PR 172458 B1 o 24 transformeres med l-2^ug af dette DNA. Tendamistat- producerende kloner udvælges og plasmiderne karakterise res .

ίο 5 Eksempel 8

Der gås frem ifølge eksempel 7, men i stedet for plasmidet pAX 1 anvendes plasmidet pAX 350 a, og der selektioneres i S. lividans med hensyn til thiostrepton--resistens, hvorved der fås plasmiderne pSA 352 a og b 10 (fig. 8 a/b).

Eksempel 9

Som det fremgår af fig. 2, er det gen, der koder for tendamistat og signalsekvensen ca. 0,3 kb stort.

15 Det i de ovenstående beskrevne eksempler anvendte fragment på 2,3 kb kan altså anvendes i forkortet form til konstruktion af hybridplasmider, som bevirker produktion af tendamistat;

Plasmidet pKAI 1 a fordøjes med Sal I og religa-20 teres. Der fås således det med ca. 750 basepar forkortede plasmid pKAI 2, Dette klones, isoleres og snittes med Pst I, DNA’et dephosphoryleres med alkalisk phosphatase fra kalvetarm og deproteiniseres med phenol/chlo-roform, 25 Plasmidet pIJ 102 snittes helt med Pst I, og fragmenterne ligateres i Pst I-snitstedet i pKAI 2 efter varmeinaktivering af enzymet. Ligationsblandingen transformeres i E. coli HB 101 eller MC 1061. Plasmid-DNA'et isoleres ud fra kloner, der er resistente mod ampicillin, 30 ved hjælp af alkalisk hurtig-lyse;og S, lividans TK 24 transformeres med l-2^ug af dette DNA, Der selektioneres ud fra tendamistat-produktion, og plasmid-DNAfet i disse kloner isoleres ved hjælp af alkalisk hurtig-lyse.

Efter tilbagetransformation i E.coli HB 101 eller MC 1061 35 og efter isolering af plasmid-DNA'et fra de transformerede E.coli-stammer bestemmes plasmid pSA 1 ved hjælp

II

DK PR 172458 B1 o af restriktionsanalyse (fig. 9). Plasmidet viser ingen forskelle fra de ud fra S. lividans-stairaner isolerede plasmlder, men DNA-oparbejdningen ud fra E.coli er rigeligere og sker på kortere tid.

5

Eksempel 10

Fremgangsmåden i eksempel 9 benyttes, men der anvendes i stedet for plasmidet pIJ 102 plasmidet pIJ 350, hvorved der i S.lividans så yderligere kan selek-10 tioneres efter thiostrepton-resistens, så at der fås plas-miderne pSA 350 a eller b. Fig. 10 viser plasmidet pSA 350 a. Dette plasmid fører i rystekultur til højere udbytter af tendamistat end plasmidet pSA 350 b, som indeholder det indsatte med tendamistat-genet i omvendt ori-15 entering. Derimod har formindskelsen af det indsatte til 1,5 kb ingen signifikant indflydende på produktdannelsen.

Eksempel 11

Til konstatering af tendamistat-genets struktur og nu-20 cleotidsekvens klones det 0,94 kb stor Pst Ι-Bam HI-sub-fragment (fig. 2 a og b) samt det 295 kb store Sau 3a--Bam HI-subfragment (fig. 2c) ind i enkeltstréngsfagerne M 13 mp 8 og M 13 mp 9. Som igangsætter til di-deoxy-sekvenseringsreaktionen anvendes DNA-sekvensen A, som 25 omfatter 20 nucleotider samt en på markedet værende 15 kb-stor igangsætter (Bethesda Research Laboratories GmbH, Neu-I.senburg) . Der fås DNA-sekvensen C.

Eksempel 12 30 Foran tendamistats strukturgen findes der på DNA'et en åben aflæsningsramme indtil startcodonet ATG (met) for et protein, som er lejret sømløst foran tendamistats aminoendestilling. Til dette signalpeptid svarer DNA-sekvensen B.

35

O

12 DK PR 172458 B1

Tillæg: DNA-Sekvens C (kodende strsncri 5 10 5'-GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG 5 Nl^-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Prc Ser Cys Val 15 20

ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC

Thr Leu Tyr Gin Ser Trp Arg Tyr Ser Gin Ala Asp 25 30 35 10 AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC Asn Gly Cys Ala Glu Thr Val Thr Val Lys Val Val ««o 5

TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC

Tyr Glu Asp Asp Thr Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Val 15 50 55 εο

GCA CCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC

Ala Pro Gly Gin Ile Thr Thr Val Gly Asp Gly Tyr 65 70

ATC GGC TCG CAC GGC CAC GCG CGC TAC CTG GCT CGC

20

Ile Gly Ser His Gly His Ala Arg Tyr Leu Ala Arg TGC CTT TAG-3'

Cys Leu Stp 25

Eksempler 1 og 3 i tvsk patentansøgning P 33 31 860.3 Eksempel 1 2

Mutationsmetode: Ca. 0,25 cm sporedannet mycelium 30 af stammen DSM 2727, der dyrkes på havregrynsagar (EP-A 49 847), podes i 100 ml Erlenmeyer-kolber, der er fyldt med følgende dyrkningsmedium:

Sojamel 2 % Ammoniumcitrat 0,1%

Glucose 3 % Maltekstrakt 0,5% 35 Majsstivelse 0,2% KH2P04 0,2%

Urinstof 0,1% DK PR 172458 B1 o 13

Mediet autoklaveres i 30 minutter ved 121°C og 1 bar, pH værdien er 7,0. Podekolberne inkuberes i 2 dage ved 30°C på en rystemaskine. Derpå podes 2 ml af den dyrkede forkultur over i 20 ml af hovedkulturmed-5 diet, som findes i 100 ml-Erlenmeyer-kolberne (EP-A 49847).

Opløselig stivelse 2-4% Skummetmælkspulver 0,7%

Sojamehl 0,4% Glucose 1,0%

Fl. majsstøbevæske 0,4% (NH4)2HP04 1,2% 10

Mediets pH-værdi er efter autoklavering 7,6.

Til dette medieum tilsættes acriflavin i en koncentration på 10-25^ug/ml som mutagent middel. Kulturen rystes i 5 dage ved 28°C og 220 o/min. Derpå cen-15 trifugeres kulturopløsningen (1300 G, 5 minutter), og cellepellet?en i hovedkulturmediet vaskes. De vaskede celler fragmenteres med en glashomogenisator og udstry-ges på agarplader med følgende medium: Rørsukker 0,3 % Tryptonsojanæringssuppe 0,5% 20 Dejcstrin 1,5 % (Fa. Oxoid)

NaCl 0,05 % Kødekstrakt 0,1% K2HP04 0,05 % (Fa. Difco)

FeS04 x 7 H20 0,001% Gærekstrakt 0,2%

Agar (Fa. 1,5 % (Fa, Difco) 25 Merck)

Opløsningen pH-værdi er 7,1 (autoklaveringsbetingelser som ovenfor).

Pladerne dyrkes i 5 dage ved 28°C, og enkeltkolonier podes over i skråtstillede glas med 30 havregrynsagar. Disse dyrkes som beskrevet, indtil myceliet har dannet sporer. Det sporedannede mycelium formeres som beskrevet ovenfor i for- og hovedkulturen, og kulturfiltratet prøves efter 5-dages hoveddyrkning for indhold af tendamistat (jfr. EP-A 49 847) . På denne må-35 de kan stammerne 1-9353, 1-9362, 1-9417 og 1-9418 selektioneres, som i deres vækstperiode under de beskrevne DK PR 172458 B1 o 14 betingelser producerer ca. 90.000-100.000 I.E, tendami-stat/liter dyrkningsopløsning svarende til 1,5-1,8 g inaktivator/liter.

5 Eksempel 3

Isolering af desoxyribonucleinsyre ud fra 5. tendae og dennes molekylærbiologlske karakteristik._

Dyrkningen af celler sker ifølge eksempel 1.

Efter 3 dages vækst i hoveddyrkningsmediet høstes celler-io i en Erlenmeyer-kolbe ved hjælp af centrifugering i 5 minutter ved 3000 G og 4°C og vaskes to gange med 50 ml af en opløsning af 50 mmolær Tris/HCl-puffer, 100 mmolær NaCl og 25 mmolæf EDTA.

Ved en typisk fremstilling dybfryses chokag-15 tigt 3 g fast-centrifugerede celler i flydende nitrogen ved -198°C og homogeniseres derpå med en hakkeknivhomo-genisator (Warring Commercial Blender) i nærvær af N2 til et fint pulver. Dette pulver tages op i 10 ml af den nævnte puffer, opløses på is og inkuberes med 0,8 20 ml lysozymopløsning (30 mg/ml) i 20 minutter ved 28°C under let rystning. Til suspensionen tilsættes så 0,8 ml af en proteinase-K-opløsning (15 mg/ml) og 0,8 ml af en 20%'s opløsning af natriumsaltet af N-lauroylsarcosin.

Efter forsigtig blanding inkuberes blandingen i 30 mi-25 nutter på is og yderligere i 15 minutter ved stuetemperatur, Efter tilsætning og opløsning af 22 g fast cae-siumchlorid justeres voluminet med ovennævnte puffer til 22 ml, og suspensionen centrifugeres ved 12,000 G og 4°c i 25 minutter, Til det klare centrifugat tilsættes ethi-30 diumbromid, og brydningsindekset justeres refraktometrisk med CsCl til n - 1,3920. Efter præprativ ultracentrifu-gering (120,000 G, 36 timer, 15°C) fjernes båndene af chromosomalt DNA fra centrifugeglassene og centrifugeres under de samme betingelser. De isolerede bånd befries 35 ved udrystning med n-butanol for ethidiumbromid og dialyseres til fuldstændig fjernelse af CsCl. Det således o 15 DK PR 172458 B1 udvundne DNA kan snittes f.eks. med enzymerne Pst I,

BamHI, Sau 3A, Cla I, Bgl II og Xho I og kan ikke snit-tes med f.eks. endonucleaserne Eco RI og Hind III.

Det f.eks. ud fra mutanterne 1-9353 og 1-9362 5 udvundne DNA karakteriseres i forhold til DNA fra ATCC 31210 og DSM 2727 ved hjælp af et forstærket genetisk element, hvis enkeltfragmenter fremtræder klart synligt efter farvning med fluorescensfarvestoffet ethidiumbro-mid på baggrund af ikke selektivt formerede fragmenter.

10 Størrelsen af de forstærkede element samt de karakteristiske enkeltfragmenter efter fordøjelse med restrik-tionsendonucleaser gengives nedenfor:

Fragment Fragmentstørrelse (kbp)

Nr.__Pst I_Xho I_Bam Η I

15 1 9,0 13,5 7,2 2 7,0 11,5 6,1 3 6,8 9,3 5,3 4 4,6 2,8 2,9 5 3,¾ 0,7 2,6 20 6 3,1 2,5 7 2,3 2,15 8 1,1 2,1 9 1,5 10 1,2 25 11 1,1 12 1,0 13 0,8 1¾ 0,5 15__0,H8 30 ialt 37T3 37^8 37, i 3 35

Claims (8)

1. Peptid, kendetegnet ved, at det har formlen

2. DNA-Sekvens B, som KAP fås ud fra tendamistat-producerende Streptomyces tendae-stammer, som fortrinsvis er behandlet med subletale doser acriflavin, ved isolering af total-DNA'et, fordøjelse med Pst I, southern-hybridisering med DNA-sekven-15 sen A 5'-(32P-)CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA-3' A * isolering af det 2,3 kb store Pst I-fragment, snitning med BamHI, southern-hybridisering med sekvensen A, iso- 2 0 lering af det 0,94 kb store PstI-BamHI-subfragment, snitning med Sau 3a, southern-hybridisering med sekvensen A, isolering af det 0,525 kb store BamHI-Sau 3a-subfragment og sekventering af DNA'et, kendetegnet ved karakteristikaene: 25 (a) den ligger umiddelbart før tendamistat-struktur-genet, (b) den koder ved amino-endestillingen for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, (c) den koder ved carboxyendestillingen for 30 Ala-Ser-Ala, og (d) den koder i midten for et hydrofobt område, som omfatter 10-25, fortrinsvis 17-20 aminosyrer. 35 DK PR 172458 B1

3. Genstruktur, kendetegnet ved, at den indeholder DNA-sekvensen B, fortrinsvis umiddelbart i læseramme med et strukturgen, især strukturgenet for tendamistat, navnlig DNA-sekvensen c.

4. Plasmid, kendetegnet ved en DNA-sek- vens ifølge krav 2 eller 3, fortrinsvis med et i streptomy-ceter virksomt replicon og/eller et i E. coli virksomt repli-con.

5. Værtsorganisme af slægten Streptomyces, især 10 arten S. tendae eller S. lividans, kendetegnet ved, at den indeholder et plasmid ifølge krav 4.

5 Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg-X-Ala-Ser-Ala hvor X er et hydrofobt område, som omfatter 10-25, fortrinsvis 17-20 aminosyrer.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, kendetegnet ved, at der anvendes en værtsorganisme ifølge krav 5, som indeholder en signalpeptidase, som fra- 15 skiller præpeptidet, der svarer til DNA-sekvensen B.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidet efter fraskillelse af præpeptidet fjernes fra cellen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, k e n - 20 detegnet ved, at der anvendes en værtsorganisme med et plasmid, som indeholder en genstruktur ifølge krav 3. 25 30 35