JPH04211384A - 細菌ベクター - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子操作の分野に関
し、そして多機能性複製開始点および／またはラクトコ
ッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
ｔｉｓ） の培養物の上清中の最も豊富なタンパク質〔
以後そのシグナルペプチドにちなんで主要分泌産物（Ｍ
ＳＰ） と呼称する〕をコードするＤＮＡ配列および／
またはＭＳＰ遺伝子のプロモーターを含んで成る新規Ｄ
ＮＡ分子を提供する。この新規ＤＮＡ分子は、少なくと
もＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびラクトコッカス種（
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｅｃ．） 中でのＤＮＡの
クローニングのための新規シャトルベクター、またはグ
ラム陽性菌、例えばラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） およびバシラス種（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）中での同種もしくは異種遺伝子
の発現および分泌遺伝子産物の生産のための新規ベクタ
ーの作製に使用される。
し、そして多機能性複製開始点および／またはラクトコ
ッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
ｔｉｓ） の培養物の上清中の最も豊富なタンパク質〔
以後そのシグナルペプチドにちなんで主要分泌産物（Ｍ
ＳＰ） と呼称する〕をコードするＤＮＡ配列および／
またはＭＳＰ遺伝子のプロモーターを含んで成る新規Ｄ
ＮＡ分子を提供する。この新規ＤＮＡ分子は、少なくと
もＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびラクトコッカス種（
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｅｃ．） 中でのＤＮＡの
クローニングのための新規シャトルベクター、またはグ
ラム陽性菌、例えばラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） およびバシラス種（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）中での同種もしくは異種遺伝子
の発現および分泌遺伝子産物の生産のための新規ベクタ
ーの作製に使用される。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子操作技術において同種または異種
遺伝子のクローニングのための多数の原核生物ベクター
−宿主系が既に知られているが、既知の系を上回る利点
を有する新規系への要望が引き続き存在している。
遺伝子のクローニングのための多数の原核生物ベクター
−宿主系が既に知られているが、既知の系を上回る利点
を有する新規系への要望が引き続き存在している。
【０００３】ＤＮＡ技術における大部分の組換え操作は
、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）またはバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ） のような細菌を用いて行われてい
る。しかしながら、乳酸菌は産業上より興味のあるもの
である。このため、乳酸菌、特にラクトバシラス種（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．） およびラク
トコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）
中での同種または異種遺伝子のクローニングおよび発
現のためのプラスミドベクターを開発するために、多く
の努力がなされている〔ＰＣＴ ＷＯ ８５／０３９４
５；ＧａｓｓｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９８５）
；ＥＰ−Ａ−０ ３１６ ６７７ ； Ｂａｔｅｓ ら
（１９８９）；Ｊｏｓら（１９８５）； 並びにＣｈａ
ｓｓｙ（１９８７）およびＤｅ Ｖｏｓ（１９８７）の
概説文献を参照のこと〕。
、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）またはバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ） のような細菌を用いて行われてい
る。しかしながら、乳酸菌は産業上より興味のあるもの
である。このため、乳酸菌、特にラクトバシラス種（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．） およびラク
トコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）
中での同種または異種遺伝子のクローニングおよび発
現のためのプラスミドベクターを開発するために、多く
の努力がなされている〔ＰＣＴ ＷＯ ８５／０３９４
５；ＧａｓｓｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９８５）
；ＥＰ−Ａ−０ ３１６ ６７７ ； Ｂａｔｅｓ ら
（１９８９）；Ｊｏｓら（１９８５）； 並びにＣｈａ
ｓｓｙ（１９８７）およびＤｅ Ｖｏｓ（１９８７）の
概説文献を参照のこと〕。
【０００４】これまで研究されたラクトコッカス菌株は
、複数の異なるプラスミドから成る特徴的なプラスミド
補足物を含有する。この性質を用いて、様々なラクトコ
ッカス株間を区別することができる（Ｄａｖｉｅｓ ら
、１９８１） 。遺伝的研究のため、プラスミドの機能
研究の間の繰返し処理によりプラスミド不含の株が作製
された（Ｄｅ Ｖｏｓ，１９８７） 。
、複数の異なるプラスミドから成る特徴的なプラスミド
補足物を含有する。この性質を用いて、様々なラクトコ
ッカス株間を区別することができる（Ｄａｖｉｅｓ ら
、１９８１） 。遺伝的研究のため、プラスミドの機能
研究の間の繰返し処理によりプラスミド不含の株が作製
された（Ｄｅ Ｖｏｓ，１９８７） 。
【０００５】例えば、以後Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ と
も称されるＬ．ラクチス７１２ のプラスミド補足物は
、それぞれｐＳＨ７１， ｐＳＨ７２， ｐＳＨ７３，
ｐＳＨ７４およびｐＬＰ７１２と命名された１．８Ｍ
ｄ， ２．５Ｍｄ，５．２Ｍｄ，９Ｍｄおよび３３Ｍｄ
の分子量を有する５つのプラスミドから成る（Ｇａｓｓ
ｏｎ，１９８３） 。
も称されるＬ．ラクチス７１２ のプラスミド補足物は
、それぞれｐＳＨ７１， ｐＳＨ７２， ｐＳＨ７３，
ｐＳＨ７４およびｐＬＰ７１２と命名された１．８Ｍ
ｄ， ２．５Ｍｄ，５．２Ｍｄ，９Ｍｄおよび３３Ｍｄ
の分子量を有する５つのプラスミドから成る（Ｇａｓｓ
ｏｎ，１９８３） 。
【０００６】Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のプラ
スミドｐＳＨ７１ および関連するＬ．クレモリス（Ｌ
．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）プラスミド ｐＷＶ０１（Ｏｔｔ
ｏ ら、１９８２） を基にして、様々なクローニング
ベクターが作製されている。抗生物質耐性遺伝子のよう
な遺伝マーカーをプラスミド中に挿入するか、または複
製開始点機能、即ち特定のＤＮＡ断片の複製を維持する
能力についてプラスミド断片をスクリーニングすること
により、クローニングベクターが作製されている。後者
の方法に従って作製されたクローニングベクターは、複
製開始点を含んで成るｐＳＨ７１ の１．７ｋｂｐ Ｃ
ｌａ Ｉ 制限断片を含むｐＮＺ１２ である（Ｇａｓ
ｓｏｎ およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９８５）。ｐＳＨ
７１ の複製開始点は、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｅｃ．）のような別のグラム陽性菌およびグラム
陰性菌エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）中でも機能的である。
スミドｐＳＨ７１ および関連するＬ．クレモリス（Ｌ
．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）プラスミド ｐＷＶ０１（Ｏｔｔ
ｏ ら、１９８２） を基にして、様々なクローニング
ベクターが作製されている。抗生物質耐性遺伝子のよう
な遺伝マーカーをプラスミド中に挿入するか、または複
製開始点機能、即ち特定のＤＮＡ断片の複製を維持する
能力についてプラスミド断片をスクリーニングすること
により、クローニングベクターが作製されている。後者
の方法に従って作製されたクローニングベクターは、複
製開始点を含んで成るｐＳＨ７１ の１．７ｋｂｐ Ｃ
ｌａ Ｉ 制限断片を含むｐＮＺ１２ である（Ｇａｓ
ｓｏｎ およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９８５）。ｐＳＨ
７１ の複製開始点は、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｅｃ．）のような別のグラム陽性菌およびグラム
陰性菌エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）中でも機能的である。
【０００７】それらのプラスミドを基にして、乳酸菌中
での同種または異種遺伝子の導入および発現に有用であ
るクローニングベクターが開発されている。クローニン
グベクターの開発は、食品および飼料産業において有用
な改善された性質を有する形質転換ラクトコッカス株、
例えばバクテリオファージ耐性Ｌ．ラクチス株（ＥＰ−
Ａ−０３１６ ６７７） またはウシプロキモシンを生
産するＬ．ラクチス株（ＰＣＴ ＷＯ ８５／０３９４
５） をもたらした。同種または異種遺伝子産物の生産
のためのクローニングベクターの開発は、改良された乳
酸菌細胞の製造のために重要であるばかりでなく、組換
えタンパク質の生産のためにも重要である、微生物発現
系における異種タンパク質の生産の主要な課題の１つは
、生産物の精製である。細胞内タンパク質の精製は時間
がかかり、そしてしばしば乏しい収量に終わる。生産物
が宿主細胞から分泌されれば、精製を著しく容易にする
ことができる。細菌中で発現される生産物の精製の問題
を回避するために、上清中に分泌される組換えタンパク
質の生産のためのベクター−宿主系が有用である。
での同種または異種遺伝子の導入および発現に有用であ
るクローニングベクターが開発されている。クローニン
グベクターの開発は、食品および飼料産業において有用
な改善された性質を有する形質転換ラクトコッカス株、
例えばバクテリオファージ耐性Ｌ．ラクチス株（ＥＰ−
Ａ−０３１６ ６７７） またはウシプロキモシンを生
産するＬ．ラクチス株（ＰＣＴ ＷＯ ８５／０３９４
５） をもたらした。同種または異種遺伝子産物の生産
のためのクローニングベクターの開発は、改良された乳
酸菌細胞の製造のために重要であるばかりでなく、組換
えタンパク質の生産のためにも重要である、微生物発現
系における異種タンパク質の生産の主要な課題の１つは
、生産物の精製である。細胞内タンパク質の精製は時間
がかかり、そしてしばしば乏しい収量に終わる。生産物
が宿主細胞から分泌されれば、精製を著しく容易にする
ことができる。細菌中で発現される生産物の精製の問題
を回避するために、上清中に分泌される組換えタンパク
質の生産のためのベクター−宿主系が有用である。
【０００８】分泌タンパク質のもう１つの利点は、それ
らが全く再生工程を必要としないため、生来の生物学的
に活性なコンホメーションを有することができることで
ある。ポリペプチドが細胞内に堆積される場合は、通常
再生が必要である。
らが全く再生工程を必要としないため、生来の生物学的
に活性なコンホメーションを有することができることで
ある。ポリペプチドが細胞内に堆積される場合は、通常
再生が必要である。
【０００９】タンパク質の分泌は、通常、分泌経路にタ
ンパク質を指し向ける翻訳一次産物のアミノ末端にシグ
ナルペプチドを必要とする。細胞膜を通過する移動中に
シグナルペプチドがタンパク質から酵素的に開裂される
ならば有利である。しかしながら、これは必ずしもそう
いう場合であるとは限らない。
ンパク質を指し向ける翻訳一次産物のアミノ末端にシグ
ナルペプチドを必要とする。細胞膜を通過する移動中に
シグナルペプチドがタンパク質から酵素的に開裂される
ならば有利である。しかしながら、これは必ずしもそう
いう場合であるとは限らない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、グラ
ム陽性およびグラム陰性菌中で複製することができそし
て／または同種もしくは異種タンパク質の発現および上
清中への安定なタンパク質生成物の分泌を可能にする新
規ハイブリッドベクターを提供することである。
ム陽性およびグラム陰性菌中で複製することができそし
て／または同種もしくは異種タンパク質の発現および上
清中への安定なタンパク質生成物の分泌を可能にする新
規ハイブリッドベクターを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】この目的は、特に、プロ
モーター領域；シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列；および上清のＴＣＡ沈澱、沈澱したタンパク質のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシ
ーブリリアントブルーによるゲルの染色後に評価すると
Ｌ．ラクチスの上清中の最も豊富なタンパク質であり以
後主要分泌産物（ＭＳＰ） と呼称されるポリペプチド
をコードする今までに未知の遺伝子のコード領域、を含
んで成る新規ＤＮＡを含む本発明の新規ハイブリッドベ
クターにより達成される。
モーター領域；シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列；および上清のＴＣＡ沈澱、沈澱したタンパク質のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシ
ーブリリアントブルーによるゲルの染色後に評価すると
Ｌ．ラクチスの上清中の最も豊富なタンパク質であり以
後主要分泌産物（ＭＳＰ） と呼称されるポリペプチド
をコードする今までに未知の遺伝子のコード領域、を含
んで成る新規ＤＮＡを含む本発明の新規ハイブリッドベ
クターにより達成される。
【００１２】本発明の目的の更なる解決手段は、グラム
陽性菌中でもグラム陰性菌中でも機能性であるＬ．ラク
チスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプラ
スミド由来の複製開始点またはそれに関連する複製開始
点を含んで成る新規ハイブリッドベクターである。
陽性菌中でもグラム陰性菌中でも機能性であるＬ．ラク
チスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプラ
スミド由来の複製開始点またはそれに関連する複製開始
点を含んで成る新規ハイブリッドベクターである。
【００１３】従って、本発明の目的のための別の解決手
段は、プロモーター領域；シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列および／またはＭＳＰ遺伝子もしくは関連
遺伝子のコード領域；並びにＬ．ラクチスＬＬ７１２
の２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプラスミド由来の複製
開始点またはそれに関連する複製開始点、を含んで成る
新規ハイブリッドベクターを提供することである。
段は、プロモーター領域；シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列および／またはＭＳＰ遺伝子もしくは関連
遺伝子のコード領域；並びにＬ．ラクチスＬＬ７１２
の２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプラスミド由来の複製
開始点またはそれに関連する複製開始点、を含んで成る
新規ハイブリッドベクターを提供することである。
【００１４】本発明は、新規ＤＮＡ挿入断片の機能性断
片または複製開始点それ自体にも関する。それらは、乳
酸菌からの同種または異種タンパク質の分泌のための新
規発現ベクターの作製に有用である。
片または複製開始点それ自体にも関する。それらは、乳
酸菌からの同種または異種タンパク質の分泌のための新
規発現ベクターの作製に有用である。
【００１５】本発明は更に、新規ＤＮＡ分子およびハイ
ブリッドベクターの調製方法、並びに本発明の新規ハイ
ブリッドベクターにより形質転換された宿主を用いた分
泌遺伝子産物の生産方法にも関する。
ブリッドベクターの調製方法、並びに本発明の新規ハイ
ブリッドベクターにより形質転換された宿主を用いた分
泌遺伝子産物の生産方法にも関する。
【００１６】本発明は純粋な形のＭＳＰタンパク質も提
供する。
供する。
【００１７】
ＤＮＡ分子
本発明は、
ａ）プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃ
ｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）挿入断片、もしくはそれの機能性断片；または ｂ）前記挿入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリ
ダイズするか、またはそのようなハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列に天然に作用可能に連結しているプロモーター
領域を含んで成るＤＮＡ配列；または ｃ）ａ）またはｂ）の中に含まれそしてシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の縮重配列；またはｄ）ａ）
，ｂ）またはｃ）の中に含まれるＤＮＡ分子の誘導体；
および／または ｅ）（Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラ
スミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．
２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの複製開始点、を
含んで成るハイブリッドベクターに関する。
ｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）挿入断片、もしくはそれの機能性断片；または ｂ）前記挿入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリ
ダイズするか、またはそのようなハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列に天然に作用可能に連結しているプロモーター
領域を含んで成るＤＮＡ配列；または ｃ）ａ）またはｂ）の中に含まれそしてシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の縮重配列；またはｄ）ａ）
，ｂ）またはｃ）の中に含まれるＤＮＡ分子の誘導体；
および／または ｅ）（Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラ
スミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．
２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの複製開始点、を
含んで成るハイブリッドベクターに関する。
【００１８】プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ
のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片
は、ＭＳＰ遺伝子のプロモーター領域、ＭＳＰシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列およびＭＳＰのコード
領域を含んで成る。シグナルペプチドが付いているＭＳ
Ｐを以後プレ−ＭＳＰと命名する。ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａ
ｌ Ｉ 挿入断片は、塩基位置１がＥｃｏＲＩ部位に近
くなるような方向において配列表に記載の配列番号１を
有する長さ１９２０ｂｐのＤＮＡ配列を含んで成る。
のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片
は、ＭＳＰ遺伝子のプロモーター領域、ＭＳＰシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列およびＭＳＰのコード
領域を含んで成る。シグナルペプチドが付いているＭＳ
Ｐを以後プレ−ＭＳＰと命名する。ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａ
ｌ Ｉ 挿入断片は、塩基位置１がＥｃｏＲＩ部位に近
くなるような方向において配列表に記載の配列番号１を
有する長さ１９２０ｂｐのＤＮＡ配列を含んで成る。
【００１９】ＭＳＰのコード領域は、配列番号１を有す
る配列の塩基位置４９２ から塩基位置１７９３までに
及ぶ。
る配列の塩基位置４９２ から塩基位置１７９３までに
及ぶ。
【００２０】長さ２７アミノ酸のＭＳＰシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列は、下記に定義するプロモー
ター領域の終わりから成熟ＭＳＰをコードするＤＮＡ配
列の初めまで、即ち配列番号１を有する配列の ４１１
位の塩基から ４９１位までに及ぶ。ＭＳＰシグナルペ
プチドまたはそれの機能性断片は、タンパク質のＮ末端
が該シグナルペプチドのＣ末端に共有結合しているなら
ば、宿主細胞、例えば乳酸菌、例えばラクトコッカス・
ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、
またはバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、
例えばＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ） からタンパク質を分泌させる。ＭＳＰシグ
ナルペプチドのＣ末端と宿主細胞から分泌させようとす
るタンパク質のＮ末端との共有結合は、ＭＳＰシグナル
ペプチドをコードする完全なＤＮＡ配列またはＣ末端を
含むＭＳＰシグナルペプチドの機能性断片をコードする
その部分を、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子
の５′末端に正しい読み枠において連結せしめることに
より得ることができる。そのような融合遺伝子は、例え
ば、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
ヒルジン構造遺伝子とを含んで成る配列番号２を有する
ＤＮＡ分子である。
ドをコードするＤＮＡ配列は、下記に定義するプロモー
ター領域の終わりから成熟ＭＳＰをコードするＤＮＡ配
列の初めまで、即ち配列番号１を有する配列の ４１１
位の塩基から ４９１位までに及ぶ。ＭＳＰシグナルペ
プチドまたはそれの機能性断片は、タンパク質のＮ末端
が該シグナルペプチドのＣ末端に共有結合しているなら
ば、宿主細胞、例えば乳酸菌、例えばラクトコッカス・
ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、
またはバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、
例えばＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ） からタンパク質を分泌させる。ＭＳＰシグ
ナルペプチドのＣ末端と宿主細胞から分泌させようとす
るタンパク質のＮ末端との共有結合は、ＭＳＰシグナル
ペプチドをコードする完全なＤＮＡ配列またはＣ末端を
含むＭＳＰシグナルペプチドの機能性断片をコードする
その部分を、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子
の５′末端に正しい読み枠において連結せしめることに
より得ることができる。そのような融合遺伝子は、例え
ば、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
ヒルジン構造遺伝子とを含んで成る配列番号２を有する
ＤＮＡ分子である。
【００２１】ＭＳＰシグナルペプチドとＭＳＰのアミノ
酸配列も、配列番号１を有する配列中に与えられる。
酸配列も、配列番号１を有する配列中に与えられる。
【００２２】ＭＳＰ遺伝子のプロモーター領域は、ＭＳ
ＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に位
置しており、そして約１５００まで、好ましくは約 １
００〜１０００ヌクレオチドまでを含んで成る。プラス
ミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／
Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片において、プロモー
ター領域は、配列番号１を有するＤＮＡ配列の１位に相
当する塩基の上流に置かれた挿入断片のＥｃｏＲＩ切断
末端から４１１ 位の塩基までに及ぶ。プロモーター領
域は、ＲＮＡポリメラーゼおよび調節タンパク質を結合
することができ、それと作用可能に連結した構造遺伝子
の発現を調節することができる。
ＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に位
置しており、そして約１５００まで、好ましくは約 １
００〜１０００ヌクレオチドまでを含んで成る。プラス
ミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／
Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片において、プロモー
ター領域は、配列番号１を有するＤＮＡ配列の１位に相
当する塩基の上流に置かれた挿入断片のＥｃｏＲＩ切断
末端から４１１ 位の塩基までに及ぶ。プロモーター領
域は、ＲＮＡポリメラーゼおよび調節タンパク質を結合
することができ、それと作用可能に連結した構造遺伝子
の発現を調節することができる。
【００２３】機能性断片なる用語には、プロモーター、
シグナルおよび／または構造機能を保持しているそれら
のＤＮＡ断片が含まれる。
シグナルおよび／または構造機能を保持しているそれら
のＤＮＡ断片が含まれる。
【００２４】好ましい機能性断片は、ＭＳＰプロモータ
ー領域、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列、またはプロモーター領域およびＭＳＰシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含むものである。本発明
に係る断片は、ＭＳＰプロモーター活性を保持しそして
／またはシグナルペプチド活性を有するペプチドをコー
ドする小断片から構成される。
ー領域、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列、またはプロモーター領域およびＭＳＰシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含むものである。本発明
に係る断片は、ＭＳＰプロモーター活性を保持しそして
／またはシグナルペプチド活性を有するペプチドをコー
ドする小断片から構成される。
【００２５】プロモーター機能を有する断片は、例えば
、約３．５ｋｂｐのＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラ
クチス挿入断片のＥｃｏＲ Ｉ切断末端の最初の塩基で
始まるもの、または特に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位のところ
で始まりそして配列番号１を有する配列の約４１０ 位
に相当する塩基までに及ぶものである。プロモーター機
能を有する別の断片は、ＥｃｏＲ Ｉ部位とＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位の間の塩基のいずれか１つから出発しそして
配列番号１を有する配列の約４１０ 位の塩基で終わる
断片の群から選択される。プロモーター領域のより短い
断片も、プロモーター活性を保持している。
、約３．５ｋｂｐのＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラ
クチス挿入断片のＥｃｏＲ Ｉ切断末端の最初の塩基で
始まるもの、または特に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位のところ
で始まりそして配列番号１を有する配列の約４１０ 位
に相当する塩基までに及ぶものである。プロモーター機
能を有する別の断片は、ＥｃｏＲ Ｉ部位とＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位の間の塩基のいずれか１つから出発しそして
配列番号１を有する配列の約４１０ 位の塩基で終わる
断片の群から選択される。プロモーター領域のより短い
断片も、プロモーター活性を保持している。
【００２６】シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片
は、例えば、配列番号１を有する配列の約 ４１１位の
塩基から ４９１位の塩基までに及ぶ。それは、プロモ
ーター活性を保持していないプロモーター領域の断片を
使って５′末端を延長することができる。
は、例えば、配列番号１を有する配列の約 ４１１位の
塩基から ４９１位の塩基までに及ぶ。それは、プロモ
ーター活性を保持していないプロモーター領域の断片を
使って５′末端を延長することができる。
【００２７】ＭＳＰプロモーター機能を保持しておりそ
してシグナルペプチドをコードする断片は、配列番号１
を有するＤＮＡ配列の１位に相当する塩基の上流に置か
れた挿入断片のＥｃｏＲ Ｉ切断末端から ４９１位の
塩基までである。ＭＳＰプロモーター機能を保持してお
りそしてシグナルペプチドをコードしている他の断片は
、配列番号１を有するＤＮＡ配列の１位に相当する塩基
の上流に置かれた最初のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位から
４９１ 位に相当する塩基付近までに及ぶ。ＭＳＰプロ
モーター機能を保持しておりそしてシグナルペプチドを
コードする他の断片は、前記ＥｃｏＲ Ｉ部位とＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位との間の塩基のいずれか１つで始まりそ
して配列番号１を有する配列の約 ４９１位の塩基で終
わる断片の群から選択される。
してシグナルペプチドをコードする断片は、配列番号１
を有するＤＮＡ配列の１位に相当する塩基の上流に置か
れた挿入断片のＥｃｏＲ Ｉ切断末端から ４９１位の
塩基までである。ＭＳＰプロモーター機能を保持してお
りそしてシグナルペプチドをコードしている他の断片は
、配列番号１を有するＤＮＡ配列の１位に相当する塩基
の上流に置かれた最初のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位から
４９１ 位に相当する塩基付近までに及ぶ。ＭＳＰプロ
モーター機能を保持しておりそしてシグナルペプチドを
コードする他の断片は、前記ＥｃｏＲ Ｉ部位とＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位との間の塩基のいずれか１つで始まりそ
して配列番号１を有する配列の約 ４９１位の塩基で終
わる断片の群から選択される。
【００２８】断片は、別のＤＮＡ分子への好結果の連結
に備えてリンカーを含むことができる。上記断片に対す
る適切なリンカーは、該断片を連結しようとするＤＮＡ
の制限部位にぴったりはまるＤＮＡ配列を有する。それ
らは、予め決められた制限部位を含むこともできる。
に備えてリンカーを含むことができる。上記断片に対す
る適切なリンカーは、該断片を連結しようとするＤＮＡ
の制限部位にぴったりはまるＤＮＡ配列を有する。それ
らは、予め決められた制限部位を含むこともできる。
【００２９】前記挿入断片とハイブリダイズするＤＮＡ
分子は、常用の条件下でハイブリダイズしている。常用
のハイブリダイゼーション方法は、例えば Ｂｅｎｔｏ
ｎ およびＤａｖｉｓ（１９７７） により記載されて
いる。そのようなハイブリダイズしているＤＮＡ分子は
、例えば、ハイブリダイズしているＤＮＡ配列として、
ＭＳＰをコードする構造遺伝子の変異体を含んで成る。 そのようなハイブリダイズしている変異体を以後、ＭＳ
Ｐ遺伝子に関連する構造遺伝子と呼称する。そのような
関連遺伝子によりコードされるタンパク質をＭＳＰに関
連するタンパク質と呼称する。従って、前記挿入断片と
ハイブリダイズしているＤＮＡ配列に天然に作用可能に
連結しているプロモーター領域は、ＭＳＰ遺伝子に関連
する遺伝子のプロモーター領域である。
分子は、常用の条件下でハイブリダイズしている。常用
のハイブリダイゼーション方法は、例えば Ｂｅｎｔｏ
ｎ およびＤａｖｉｓ（１９７７） により記載されて
いる。そのようなハイブリダイズしているＤＮＡ分子は
、例えば、ハイブリダイズしているＤＮＡ配列として、
ＭＳＰをコードする構造遺伝子の変異体を含んで成る。 そのようなハイブリダイズしている変異体を以後、ＭＳ
Ｐ遺伝子に関連する構造遺伝子と呼称する。そのような
関連遺伝子によりコードされるタンパク質をＭＳＰに関
連するタンパク質と呼称する。従って、前記挿入断片と
ハイブリダイズしているＤＮＡ配列に天然に作用可能に
連結しているプロモーター領域は、ＭＳＰ遺伝子に関連
する遺伝子のプロモーター領域である。
【００３０】ＭＳＰ遺伝子に関連する構造遺伝子は、例
えば、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）以外の細菌、
特に乳酸菌、例えばラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．） またはラクトコッカス種
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、例えばＬ
．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）またはＬ．サー
モフィルス（Ｌ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の天
然に存在する変異体である。また、Ｌ．ラクチスの染色
体上またはＬ．ラクチス中に天然に存在するプラスミド
上のイソ遺伝子によりコードされる天然の変異体である
。
えば、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）以外の細菌、
特に乳酸菌、例えばラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．） またはラクトコッカス種
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、例えばＬ
．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）またはＬ．サー
モフィルス（Ｌ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の天
然に存在する変異体である。また、Ｌ．ラクチスの染色
体上またはＬ．ラクチス中に天然に存在するプラスミド
上のイソ遺伝子によりコードされる天然の変異体である
。
【００３１】ＭＳＰ遺伝子に関連する遺伝子を含んで成
るＤＮＡ分子は、常法に従って単離することができる。
るＤＮＡ分子は、常法に従って単離することができる。
【００３２】本発明のＤＮＡ分子は、縮重したＤＮＡ配
列を有するものも包含する。それらは、それらをコード
するアミノ酸配列を変えることなく不定数のヌクレオチ
ドが別のヌクレオチドにより置き換えられるという遺伝
暗号の意味の範囲内で縮重している。そのような縮重Ｄ
ＮＡ配列を有する分子は、それらの異なる制限部位のた
め、または特定の宿主における好ましいコドン使用のた
め、有用となり得る。好ましいのは、ＭＳＰシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列またはそれの変異体の縮
重配列である。
列を有するものも包含する。それらは、それらをコード
するアミノ酸配列を変えることなく不定数のヌクレオチ
ドが別のヌクレオチドにより置き換えられるという遺伝
暗号の意味の範囲内で縮重している。そのような縮重Ｄ
ＮＡ配列を有する分子は、それらの異なる制限部位のた
め、または特定の宿主における好ましいコドン使用のた
め、有用となり得る。好ましいのは、ＭＳＰシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列またはそれの変異体の縮
重配列である。
【００３３】ａ），ｂ）またはｃ）に含まれるＤＮＡ分
子と関係して用いられる誘導体なる用語には、そのよう
なＤＮＡ分子の断片、変異体またはより大きい誘導体が
含まれる。誘導体なる用語には、そのようなＤＮＡ分子
の断片または変異体のより大きい誘導体が含まれる。好
ましいのは、プロモーター、シグナルまたは構造機能を
保持している断片である。そのような断片の例は上記に
与えられている。
子と関係して用いられる誘導体なる用語には、そのよう
なＤＮＡ分子の断片、変異体またはより大きい誘導体が
含まれる。誘導体なる用語には、そのようなＤＮＡ分子
の断片または変異体のより大きい誘導体が含まれる。好
ましいのは、プロモーター、シグナルまたは構造機能を
保持している断片である。そのような断片の例は上記に
与えられている。
【００３４】ａ），ｂ）またはｃ）に記載のＤＮＡ分子
の変異体は、例えば、天然に存在するかまたは常法に従
って生体内もしくは試験管内でＤＮＡ分子中に人為的に
導入することができる欠失、挿入、逆位もしくは点変異
体である。変異体は変更された制限パターンを示し得る
。
の変異体は、例えば、天然に存在するかまたは常法に従
って生体内もしくは試験管内でＤＮＡ分子中に人為的に
導入することができる欠失、挿入、逆位もしくは点変異
体である。変異体は変更された制限パターンを示し得る
。
【００３５】ａ），ｂ）またはｃ）に含まれるＤＮＡ分
子のより大きな誘導体は、例えば、Ｌ．ラクチスのゲノ
ムから切り出すことができる。それらは、核酸の断片化
、適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩ， ＥｃｏＲ
ＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩによる断片の処理、適当なベ
クター、例えばラムダファージλＥＭＢＬ３またはプラ
スミドｐＢＲ３２２中への連結、例えばＥ．コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中でのクローニング、および同じまたは別の
適当な制限酵素を用いた再度の切り出し、により得られ
たＬ．ラクチスＬＭ０２３０のゲノムライブラリー中に
見つけることができる。
子のより大きな誘導体は、例えば、Ｌ．ラクチスのゲノ
ムから切り出すことができる。それらは、核酸の断片化
、適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩ， ＥｃｏＲ
ＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩによる断片の処理、適当なベ
クター、例えばラムダファージλＥＭＢＬ３またはプラ
スミドｐＢＲ３２２中への連結、例えばＥ．コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中でのクローニング、および同じまたは別の
適当な制限酵素を用いた再度の切り出し、により得られ
たＬ．ラクチスＬＭ０２３０のゲノムライブラリー中に
見つけることができる。
【００３６】ａ），ｂ）またはｃ）に含まれるＤＮＡ分
子の大きな誘導体としては、フランキング配列を有する
組換えＤＮＡ分子、例えば適当な制限部位を提供するか
、またはプロモーター、シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ配列もしくはターミネーターのような調節配列お
よび構造遺伝子を正しい距離もしくは読み枠中に配置す
るリンカーを含んで成るもの；またはベクター、例えば
ハイブリッドベクターの作製において使用されるファー
ジもしくはプラスミド由来の配列を含んで成るものが挙
げられる。そのようなより大きな誘導体中に含まれるフ
ランキング配列は、融合遺伝子を生成することができる
。
子の大きな誘導体としては、フランキング配列を有する
組換えＤＮＡ分子、例えば適当な制限部位を提供するか
、またはプロモーター、シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ配列もしくはターミネーターのような調節配列お
よび構造遺伝子を正しい距離もしくは読み枠中に配置す
るリンカーを含んで成るもの；またはベクター、例えば
ハイブリッドベクターの作製において使用されるファー
ジもしくはプラスミド由来の配列を含んで成るものが挙
げられる。そのようなより大きな誘導体中に含まれるフ
ランキング配列は、融合遺伝子を生成することができる
。
【００３７】Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄも
しくは５．２Ｍｄプラスミドまたは２．５Ｍｄプラスミ
ドもしくは５．２Ｍｄプラスミドと同じ不和合性群のプ
ラスミド由来の複製開始点は、プラスミドを酸菌、例え
ばラクトコッカス、例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ）、Ｌ．ラクチスジアセチラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）もしくはＬ．クレ
モリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、およびＥ．コリ（Ｅ
．ｃｏｌｉ）またはＥ．コリ以外のグラム陰性菌または
乳酸菌以外のグラム陽性菌、例えばバシラス種（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、例えばＢ．スリンジェンシ
ス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） 中で複製させ
ることができる。
しくは５．２Ｍｄプラスミドまたは２．５Ｍｄプラスミ
ドもしくは５．２Ｍｄプラスミドと同じ不和合性群のプ
ラスミド由来の複製開始点は、プラスミドを酸菌、例え
ばラクトコッカス、例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ）、Ｌ．ラクチスジアセチラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）もしくはＬ．クレ
モリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、およびＥ．コリ（Ｅ
．ｃｏｌｉ）またはＥ．コリ以外のグラム陰性菌または
乳酸菌以外のグラム陽性菌、例えばバシラス種（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、例えばＢ．スリンジェンシ
ス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） 中で複製させ
ることができる。
【００３８】Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄも
しくは５．２Ｍｄプラスミドまたは２．５Ｍｄプラスミ
ドもしくは５．２Ｍｄプラスミドと同じ不和合性群のプ
ラスミド由来である複製開始点は、例えば、適当な制限
エンドヌクレアーゼでの処理後に得ることができる各々
の全体の線状プラスミド中に含まれる。従って、本発明
のハイブリッドベクターは、２．５Ｍｄもしくは５．２
Ｍｄプラスミドまたは２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプ
ラスミドと同じ不和合性群のプラスミドの全ＤＮＡ配列
を含んで成るものでもある。２つのプラスミドは、例え
ば、ＤＳＭ ５８０４としてＤＳＭに寄託されているＬ
．ラクチスＬＬ７１２ 株から単離することができる。
しくは５．２Ｍｄプラスミドまたは２．５Ｍｄプラスミ
ドもしくは５．２Ｍｄプラスミドと同じ不和合性群のプ
ラスミド由来である複製開始点は、例えば、適当な制限
エンドヌクレアーゼでの処理後に得ることができる各々
の全体の線状プラスミド中に含まれる。従って、本発明
のハイブリッドベクターは、２．５Ｍｄもしくは５．２
Ｍｄプラスミドまたは２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプ
ラスミドと同じ不和合性群のプラスミドの全ＤＮＡ配列
を含んで成るものでもある。２つのプラスミドは、例え
ば、ＤＳＭ ５８０４としてＤＳＭに寄託されているＬ
．ラクチスＬＬ７１２ 株から単離することができる。
【００３９】複製開始点として機能するＤＮＡ配列は、
複製開始点機能を保持している前記プラスミドのいずれ
かの断片であることもできる。そのようなＤＮＡ断片は
、例えば、物理的力、例えば剪断力、または化学的開裂
反応、またはＤＮＡを開裂する酵素、例えばヌクレアー
ゼ、例えばエキソヌクレアーゼＢａｌ ３１， Ｓ１も
しくはエキソヌクレアーゼＩＩＩ 、またはエンドヌク
レアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いた各プ
ラスミドまたはそれの断片の断片化の後にそれを単離す
ることにより、得ることができる。特に、そのようなＤ
ＮＡ配列は、各プラスミドまたはそれの断片を１種また
は２種の異なる制限エンドヌクレアーゼ（２．５Ｍｄプ
ラスミドの場合は、例えばＮｄｅ Ｉ，Ｓｐｈ Ｉ お
よび／またはＥｃｏＲ Ｖであり、そして５．２Ｍｄプ
ラスミドの場合には、例えばＳａｕ３Ａ， Ｎｄｅ Ｉ
， Ｈｉｎｄ ＩＩＩ， Ａｃｃ Ｉ および／または
ＥｃｏＲ Ｉである）で処理した後に得られた制限断片
である。
複製開始点機能を保持している前記プラスミドのいずれ
かの断片であることもできる。そのようなＤＮＡ断片は
、例えば、物理的力、例えば剪断力、または化学的開裂
反応、またはＤＮＡを開裂する酵素、例えばヌクレアー
ゼ、例えばエキソヌクレアーゼＢａｌ ３１， Ｓ１も
しくはエキソヌクレアーゼＩＩＩ 、またはエンドヌク
レアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いた各プ
ラスミドまたはそれの断片の断片化の後にそれを単離す
ることにより、得ることができる。特に、そのようなＤ
ＮＡ配列は、各プラスミドまたはそれの断片を１種また
は２種の異なる制限エンドヌクレアーゼ（２．５Ｍｄプ
ラスミドの場合は、例えばＮｄｅ Ｉ，Ｓｐｈ Ｉ お
よび／またはＥｃｏＲ Ｖであり、そして５．２Ｍｄプ
ラスミドの場合には、例えばＳａｕ３Ａ， Ｎｄｅ Ｉ
， Ｈｉｎｄ ＩＩＩ， Ａｃｃ Ｉ および／または
ＥｃｏＲ Ｉである）で処理した後に得られた制限断片
である。
【００４０】２．５Ｍｄプラスミドの複製開始点は、例
えば、約１．８ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ
断片；約３．５ｋｂｐ のＳｐｈ Ｉ 断片の部分的Ｅ
ｃｏＲ Ｖ消化後に得られる約３．１ｋｂｐ のＥｃｏ
Ｒ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ 断片；約３．５ｋｂｐ のＳｐｈ
Ｉ 断片；約１．２ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｅｃｏ
Ｒ Ｖ断片；約２．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｖ断片；ま
たは約３．５ｋｂｐ のＳｐｈ Ｉ 断片の部分的Ｅｃ
ｏＲ Ｖ消化後に得られる約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ
Ｖ／Ｓｐｈ Ｉ 断片上に置かれる。約３．５ｋｂｐ
のＳｐｈ Ｉ 断片および上述の他の断片は、ｐＳＣ
１２ 中に含まれる。ｐＳＣ１２ の作製は実施例１．
２ において記載する。制限地図を図２に示す。
えば、約１．８ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ
断片；約３．５ｋｂｐ のＳｐｈ Ｉ 断片の部分的Ｅ
ｃｏＲ Ｖ消化後に得られる約３．１ｋｂｐ のＥｃｏ
Ｒ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ 断片；約３．５ｋｂｐ のＳｐｈ
Ｉ 断片；約１．２ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｅｃｏ
Ｒ Ｖ断片；約２．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｖ断片；ま
たは約３．５ｋｂｐ のＳｐｈ Ｉ 断片の部分的Ｅｃ
ｏＲ Ｖ消化後に得られる約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ
Ｖ／Ｓｐｈ Ｉ 断片上に置かれる。約３．５ｋｂｐ
のＳｐｈ Ｉ 断片および上述の他の断片は、ｐＳＣ
１２ 中に含まれる。ｐＳＣ１２ の作製は実施例１．
２ において記載する。制限地図を図２に示す。
【００４１】５．２Ｍｄプラスミドの複製開始点は、例
えば、約１．０ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ断片；約２．２ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ａｃｃ
Ｉ 断片；約２．７ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片；約３．１ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｕ
３Ａ断片；約２．０ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片；約３．２ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ／Ａｃ
ｃ Ｉ 断片；約３．７ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ／Ｅｃ
ｏＲ Ｉ断片；または約４．１ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ
断片上に置かれる。Ｓａｕ ３Ａ切断末端を有する断片
は、５．２Ｍｄプラスミド、ｐＳＣ１８ プラスミドま
たはそれらのプラスミドの適当な制限断片の部分的Ｓａ
ｕ ３Ａ消化後に得ることができる。ｐＳＣ１８ の作
製を実施例１．３ において記載する。制限地図を図３
に示す。
えば、約１．０ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ断片；約２．２ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ａｃｃ
Ｉ 断片；約２．７ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片；約３．１ｋｂｐ の Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｕ
３Ａ断片；約２．０ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片；約３．２ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ／Ａｃ
ｃ Ｉ 断片；約３．７ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ／Ｅｃ
ｏＲ Ｉ断片；または約４．１ｋｂｐ のＳａｕ ３Ａ
断片上に置かれる。Ｓａｕ ３Ａ切断末端を有する断片
は、５．２Ｍｄプラスミド、ｐＳＣ１８ プラスミドま
たはそれらのプラスミドの適当な制限断片の部分的Ｓａ
ｕ ３Ａ消化後に得ることができる。ｐＳＣ１８ の作
製を実施例１．３ において記載する。制限地図を図３
に示す。
【００４２】同じ不和合性群のプラスミドは、同一細胞
中に安定して共存することができない。それらは関連す
る複製開始点を担持している。
中に安定して共存することができない。それらは関連す
る複製開始点を担持している。
【００４３】組換えＤＮＡ分子は、例えば、リンカーお
よび／またはファージもしくはプラスミドのようなベク
ター由来の配列を含有し、そして所望により、マーカー
遺伝子、例えば耐性マーカー遺伝子、例えばエリスロマ
イシン、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝
子等を含有する。本発明の複製開始点を含んで成る組換
えＤＮＡ分子は、例えば、乳酸菌のためのベクタープラ
スミド、好ましくは少なくとも乳酸菌と大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）中で複製することができ、且つ本発明のラクト
コッカス由来の複製開始点が唯一の複製開始点であるシ
ャトルベクターである。好ましいシャトルベクターは、
ｐＳＣ１２， ｐＳＣ１２ΔＰ， ｐＳＣ１２ΔＮ，
ｐＳＣ１２ΔＮＰ， ｐＳＣ１８，ｐＳＣ１８ΔＰ ま
たは ｐＳＣ１８ΔＮ である。乳酸菌中での外来遺伝
子の発現に好ましいシャトルベクターは、ｐＳＣ１２Ｈ
ＩＲ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１またはｐＳＣ１２ＨＩＲ
Ｔｅｒｍである。好ましいシャトルベクターを実施例に
おいて記載する。
よび／またはファージもしくはプラスミドのようなベク
ター由来の配列を含有し、そして所望により、マーカー
遺伝子、例えば耐性マーカー遺伝子、例えばエリスロマ
イシン、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝
子等を含有する。本発明の複製開始点を含んで成る組換
えＤＮＡ分子は、例えば、乳酸菌のためのベクタープラ
スミド、好ましくは少なくとも乳酸菌と大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）中で複製することができ、且つ本発明のラクト
コッカス由来の複製開始点が唯一の複製開始点であるシ
ャトルベクターである。好ましいシャトルベクターは、
ｐＳＣ１２， ｐＳＣ１２ΔＰ， ｐＳＣ１２ΔＮ，
ｐＳＣ１２ΔＮＰ， ｐＳＣ１８，ｐＳＣ１８ΔＰ ま
たは ｐＳＣ１８ΔＮ である。乳酸菌中での外来遺伝
子の発現に好ましいシャトルベクターは、ｐＳＣ１２Ｈ
ＩＲ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１またはｐＳＣ１２ＨＩＲ
Ｔｅｒｍである。好ましいシャトルベクターを実施例に
おいて記載する。
【００４４】上記のｅ）のもとに包含するつもりである
少なくとも乳酸菌と大腸菌中で複製開始点として機能す
るＤＮＡ配列は、複製開始点の機能を保持している上記
で定義したＤＮＡ配列の逆位、挿入、欠失または点変異
体である。そのような変異体は、真の複製開始点に隣接
しているＤＮＡ配列中に変更されたヌクレオチド配列を
有し、例えば変更された制限部位のパターンをもたらす
かまたは欠失変異体、例えばプラスミド ｐＳＣ１２Δ
Ｐ， ｐＳＣ１２ΔＮ，ｐＳＣ１２ΔＮＰもしくは ｐ
ＳＣ１８ΔＮ（表１参照）のＬ．ラクチス挿入断片をも
たらす点変異を有する。上述の真の複製開始点は、複製
開始点として機能する最小のＤＮＡ断片であると解釈さ
れる。
少なくとも乳酸菌と大腸菌中で複製開始点として機能す
るＤＮＡ配列は、複製開始点の機能を保持している上記
で定義したＤＮＡ配列の逆位、挿入、欠失または点変異
体である。そのような変異体は、真の複製開始点に隣接
しているＤＮＡ配列中に変更されたヌクレオチド配列を
有し、例えば変更された制限部位のパターンをもたらす
かまたは欠失変異体、例えばプラスミド ｐＳＣ１２Δ
Ｐ， ｐＳＣ１２ΔＮ，ｐＳＣ１２ΔＮＰもしくは ｐ
ＳＣ１８ΔＮ（表１参照）のＬ．ラクチス挿入断片をも
たらす点変異を有する。上述の真の複製開始点は、複製
開始点として機能する最小のＤＮＡ断片であると解釈さ
れる。
【００４５】本発明のハイブリッドベクターは、真菌ま
たは特に細菌のような宿主中でのクローニングに用いる
ことができる。それらは、遺伝子操作の技術において有
用な任意のベクター、例えばファージ、コスミドまたは
プラスミドから誘導することができる。それらは、例え
ば、λファージ、例えばＮＭ９８９ もしくはＥＭＢＬ
３；Ｍ１３ ファージ、例えばＭ１３ｍｐ１８ もしく
はＭ１３ｍｐ１９；細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２
２， ｐＵＣ１８ もしくはｐＵＣ１９ または乳酸菌
のプラスミド；または酵母プラスミド、例えば酵母２μ
プラスミド；更には欠陥ファージもしくは欠陥プラスミ
ドの複製を可能にするヘルパーファージもしくはヘルパ
ープラスミドの存在下における欠陥ファージもしくは欠
陥プラスミドの誘導体である。
たは特に細菌のような宿主中でのクローニングに用いる
ことができる。それらは、遺伝子操作の技術において有
用な任意のベクター、例えばファージ、コスミドまたは
プラスミドから誘導することができる。それらは、例え
ば、λファージ、例えばＮＭ９８９ もしくはＥＭＢＬ
３；Ｍ１３ ファージ、例えばＭ１３ｍｐ１８ もしく
はＭ１３ｍｐ１９；細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２
２， ｐＵＣ１８ もしくはｐＵＣ１９ または乳酸菌
のプラスミド；または酵母プラスミド、例えば酵母２μ
プラスミド；更には欠陥ファージもしくは欠陥プラスミ
ドの複製を可能にするヘルパーファージもしくはヘルパ
ープラスミドの存在下における欠陥ファージもしくは欠
陥プラスミドの誘導体である。
【００４６】本発明のハイブリッドベクターは、ａ），
ｂ），ｃ）またはｄ）に含まれるＤＮＡ分子のヌクレオ
チド配列を含んで成る。それは特に、約３．５ｋｂｐ
のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片、
ＭＳＰシグナルペプチドをコードするそれの断片および
／またはＭＳＰ遺伝子のプロモーターを含んで成る。ハ
イブリッドベクター中に挿入される本発明のＤＮＡ分子
のタイプに依存して、該ベクターはハイブリッド発現調
節配列を含んで成ることができる。そのようなハイブリ
ッド発現調節配列は、一部分はａ），ｂ）またはｃ）に
含まれるＤＮＡ分子から成り、そして一部分はａ），ｂ
）またはｃ）に含まれるＤＮＡ分子とは異なるＤＮＡ分
子から成る。例えば、ハイブリッドベクターは、非−Ｍ
ＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と組合せ
たＭＳＰプロモーター、ＭＳＰプロモーター以外の別の
ものと組合せたＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片を含んで成ることができる。その上、本発明の
ハイブリッドベクターは、所望により、転写ターミネー
ター領域、例えばＥ．コリの ｔｒｐ Ａ転写ターミネ
ーターを含んで成ることがある。
ｂ），ｃ）またはｄ）に含まれるＤＮＡ分子のヌクレオ
チド配列を含んで成る。それは特に、約３．５ｋｂｐ
のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片、
ＭＳＰシグナルペプチドをコードするそれの断片および
／またはＭＳＰ遺伝子のプロモーターを含んで成る。ハ
イブリッドベクター中に挿入される本発明のＤＮＡ分子
のタイプに依存して、該ベクターはハイブリッド発現調
節配列を含んで成ることができる。そのようなハイブリ
ッド発現調節配列は、一部分はａ），ｂ）またはｃ）に
含まれるＤＮＡ分子から成り、そして一部分はａ），ｂ
）またはｃ）に含まれるＤＮＡ分子とは異なるＤＮＡ分
子から成る。例えば、ハイブリッドベクターは、非−Ｍ
ＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と組合せ
たＭＳＰプロモーター、ＭＳＰプロモーター以外の別の
ものと組合せたＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片を含んで成ることができる。その上、本発明の
ハイブリッドベクターは、所望により、転写ターミネー
ター領域、例えばＥ．コリの ｔｒｐ Ａ転写ターミネ
ーターを含んで成ることがある。
【００４７】本発明のシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列、即ちプレ−ＭＳＰまたは関連遺伝子に由来す
るＤＮＡ配列を含んで成るハイブリッドベクターは、乳
酸菌、特にラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐｅｃ．） 、特にＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）もしくはＬ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
、または別の細菌、例えばバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｐｅｃ．）、例えばＢ．スリンジェンシス（Ｂ．
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） における分泌遺伝子産
物の生産に有用である。そのようなハイブリッドベクタ
ーは、所望の細菌中で機能するプロモーター、例えば乳
酸菌中での発現のためのＭＳＰプロモーター、および所
望により所望の細菌中で機能する転写ターミネーター領
域を含んで成る。ターミネーターの使用は、ターミネー
ターをそれぞれの同種または異種構造遺伝子に作用可能
に連結させると、組換え遺伝子産物の収量を増加させる
ことができる。例えば、Ｅ．コリの ｔｒｐ Ａターミ
ネーターを、乳酸菌中でＭＳＰプロモーターとＭＳＰシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ分子の調節下で発現
されるヒルジン遺伝子に作用可能に連結させると、デス
ルフェートヒルジンの生産が著しく増加する。
ＮＡ配列、即ちプレ−ＭＳＰまたは関連遺伝子に由来す
るＤＮＡ配列を含んで成るハイブリッドベクターは、乳
酸菌、特にラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐｅｃ．） 、特にＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）もしくはＬ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
、または別の細菌、例えばバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｐｅｃ．）、例えばＢ．スリンジェンシス（Ｂ．
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） における分泌遺伝子産
物の生産に有用である。そのようなハイブリッドベクタ
ーは、所望の細菌中で機能するプロモーター、例えば乳
酸菌中での発現のためのＭＳＰプロモーター、および所
望により所望の細菌中で機能する転写ターミネーター領
域を含んで成る。ターミネーターの使用は、ターミネー
ターをそれぞれの同種または異種構造遺伝子に作用可能
に連結させると、組換え遺伝子産物の収量を増加させる
ことができる。例えば、Ｅ．コリの ｔｒｐ Ａターミ
ネーターを、乳酸菌中でＭＳＰプロモーターとＭＳＰシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ分子の調節下で発現
されるヒルジン遺伝子に作用可能に連結させると、デス
ルフェートヒルジンの生産が著しく増加する。
【００４８】本発明のハイブリッドベクターは、所望の
宿主、例えば乳酸菌および／またはバシラス菌種（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）および／または大腸菌（Ｅ
．ｃｏｌｉ）中で機能する複製開始点も含んで成る。
宿主、例えば乳酸菌および／またはバシラス菌種（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）および／または大腸菌（Ｅ
．ｃｏｌｉ）中で機能する複製開始点も含んで成る。
【００４９】少なくとも乳酸菌中で機能する複製開始点
を有するＤＮＡ配列、例えばラクトコッカスのプラスミ
ドｐＳＨ７１（ＧａｓｓｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，
１９８５）の１．７ｋｂｐ Ｃｌａ Ｉ 断片またはＬ
．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしく
は５．２Ｍｄプラスミドの複製開始点を含んで成る、上
記に定義したＤＮＡ断片のうちの１つである。
を有するＤＮＡ配列、例えばラクトコッカスのプラスミ
ドｐＳＨ７１（ＧａｓｓｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，
１９８５）の１．７ｋｂｐ Ｃｌａ Ｉ 断片またはＬ
．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしく
は５．２Ｍｄプラスミドの複製開始点を含んで成る、上
記に定義したＤＮＡ断片のうちの１つである。
【００５０】本発明のハイブリッドベクターは、選択可
能なマーカーを含んでもよい。マーカーの選択は、形質
転換、選択およびクローニングしようとする宿主に依存
する。マーカーの表現型の発現によって形質転換体の選
択を促進するようないずれのマーカー遺伝子でも使用す
ることができる。適当なマーカーは、特に、抗生物質、
例えばエリスロマイシン、テトラサイクリンもしくはア
ンピシリンに対する耐性を発現するもの、または栄養素
要求性変異体の場合には、宿主の障害を補完する遺伝子
、例えばラクトース代謝経路の遺伝子である。
能なマーカーを含んでもよい。マーカーの選択は、形質
転換、選択およびクローニングしようとする宿主に依存
する。マーカーの表現型の発現によって形質転換体の選
択を促進するようないずれのマーカー遺伝子でも使用す
ることができる。適当なマーカーは、特に、抗生物質、
例えばエリスロマイシン、テトラサイクリンもしくはア
ンピシリンに対する耐性を発現するもの、または栄養素
要求性変異体の場合には、宿主の障害を補完する遺伝子
、例えばラクトース代謝経路の遺伝子である。
【００５１】本発明の好ましい態様は、ＭＳＰシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しい読み枠におい
て作用可能に連結されておりそしてＭＳＰプロモーター
または異種プロモーターの調節下で発現され得る、同種
または異種構造遺伝子、例えばＭＳＰまたは特に下記に
定義する異種構造遺伝子、を含んで成る。
ペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しい読み枠におい
て作用可能に連結されておりそしてＭＳＰプロモーター
または異種プロモーターの調節下で発現され得る、同種
または異種構造遺伝子、例えばＭＳＰまたは特に下記に
定義する異種構造遺伝子、を含んで成る。
【００５２】構造遺伝子は、ウイルス、原核生物細胞ま
たは真核生物細胞由来であることができ、そしてゲノム
ＤＮＡまたはｍＲＮＡ経路を経て調製されたｃＤＮＡに
由来することができ、または化学的に合成することもで
きる。それらは、グリコシル化されたポリペプチドを含
む種々様々な有用なポリペプチド、特に高等真核生物、
特に哺乳類、例えば動物または特にヒト起源のポリペプ
チド、例えば栄養素の生産および化学における酵素反応
に用いることができる酵素、あるいはヒトもしくは動物
の病気の治療または予防に有用で且つ貴重であるポリペ
プチド、例えばホルモン、免疫調節活性、抗ウイルス性
および抗腫瘍性を有するポリペプチド、抗体、ウイルス
抗原、ワクチン、凝固因子、食料品等をコードしてもよ
い。
たは真核生物細胞由来であることができ、そしてゲノム
ＤＮＡまたはｍＲＮＡ経路を経て調製されたｃＤＮＡに
由来することができ、または化学的に合成することもで
きる。それらは、グリコシル化されたポリペプチドを含
む種々様々な有用なポリペプチド、特に高等真核生物、
特に哺乳類、例えば動物または特にヒト起源のポリペプ
チド、例えば栄養素の生産および化学における酵素反応
に用いることができる酵素、あるいはヒトもしくは動物
の病気の治療または予防に有用で且つ貴重であるポリペ
プチド、例えばホルモン、免疫調節活性、抗ウイルス性
および抗腫瘍性を有するポリペプチド、抗体、ウイルス
抗原、ワクチン、凝固因子、食料品等をコードしてもよ
い。
【００５３】そのような異種構造遺伝子の例は、例えば
、ホルモン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン
、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン
、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、
β−リポトロピン、ウロガストロンまたはインスリン；
増殖因子、例えば表皮増殖因子、インスリン様増殖因子
（ＩＧＦ） 、例えばＩＧＦ−Ｉ およびＩＧＦ−ＩＩ
、マスト細胞増殖因子、神経成長因子、グリア由来神経
細胞増殖因子または形質転換増殖因子（ＴＧＦ） 、例
えば ＴＧＦβ；成長ホルモン、例えばヒトまたはウシ
成長ホルモン；インターロイキン、例えばインターロイ
キン−１または−２；ヒトマクロファージ遊走阻止因子
（ＭＩＦ）；インターフェロン、例えばヒトα−インタ
ーフェロン、例えばインターフェロン−αＡ，αＢ，α
ＤもしくはαＦ、β−インターフェロン、γ−インター
フェロンまたはハイブリッドインターフェロン、例えば
αＡ−αＤ−もしくはαＢ−αＤ−ハイブリッドインタ
ーフェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢ
Ｂ；プロテイナーゼ阻害剤、例えばα−抗トリプシン、
ＳＬＰＩ等；肝炎ウイルス抗原、例えばＢ型肝炎ウイル
ス表面もしくはコア抗原、またはＡ型肝炎ウイルス抗原
または非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原；プラスミノーゲン
活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子ま
たはウロキナーゼ；腫瘍壊死因子；ソマトスタチン；レ
ニン；β−エンドルフィン；免疫グロブリン、例えば免
疫グロブリンＤ，ＥもしくはＧの軽鎖および／または重
鎖、またはヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリン；
免疫グロブリン結合因子、例えばｓＣＤ２３；カルシト
ニン、ヒトカルシトニン関連ペプチド；血液凝固因子、
例えば第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩｃ 因子；エリトロ
ポイエチン；エグリン、例えばエグリンＣ；ヒルジン、
デスルフェートヒルジン、例えばデスルフェートヒルジ
ン変種 ＨＶ１， ＨＶ２， ＨＶ３， Ｌｅｕ１，Ｔ
ｈｒ２ −ＨＶ１， Ｌｙｓ４７ −ＨＶ２またはＰＡ
；ヒトスーパーオキシドジスムターゼ；ウイルスチミジ
ンキナーゼ；β−ラクタマーゼ；グルコースイソメラー
ゼをコードするものである。好ましい遺伝子は、デスル
フェートヒルジン、例えば変種ＨＶ１ をコードする遺
伝子である。本発明のハイブリッドベクターにおいて、
本発明のプロモーターおよび／またはＭＳＰシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ分子は、ポリペプチドの効率
的な発現を確保するためにポリペプチドコード領域に作
用可能に連結されている。
、ホルモン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン
、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン
、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、
β−リポトロピン、ウロガストロンまたはインスリン；
増殖因子、例えば表皮増殖因子、インスリン様増殖因子
（ＩＧＦ） 、例えばＩＧＦ−Ｉ およびＩＧＦ−ＩＩ
、マスト細胞増殖因子、神経成長因子、グリア由来神経
細胞増殖因子または形質転換増殖因子（ＴＧＦ） 、例
えば ＴＧＦβ；成長ホルモン、例えばヒトまたはウシ
成長ホルモン；インターロイキン、例えばインターロイ
キン−１または−２；ヒトマクロファージ遊走阻止因子
（ＭＩＦ）；インターフェロン、例えばヒトα−インタ
ーフェロン、例えばインターフェロン−αＡ，αＢ，α
ＤもしくはαＦ、β−インターフェロン、γ−インター
フェロンまたはハイブリッドインターフェロン、例えば
αＡ−αＤ−もしくはαＢ−αＤ−ハイブリッドインタ
ーフェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢ
Ｂ；プロテイナーゼ阻害剤、例えばα−抗トリプシン、
ＳＬＰＩ等；肝炎ウイルス抗原、例えばＢ型肝炎ウイル
ス表面もしくはコア抗原、またはＡ型肝炎ウイルス抗原
または非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原；プラスミノーゲン
活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子ま
たはウロキナーゼ；腫瘍壊死因子；ソマトスタチン；レ
ニン；β−エンドルフィン；免疫グロブリン、例えば免
疫グロブリンＤ，ＥもしくはＧの軽鎖および／または重
鎖、またはヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリン；
免疫グロブリン結合因子、例えばｓＣＤ２３；カルシト
ニン、ヒトカルシトニン関連ペプチド；血液凝固因子、
例えば第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩｃ 因子；エリトロ
ポイエチン；エグリン、例えばエグリンＣ；ヒルジン、
デスルフェートヒルジン、例えばデスルフェートヒルジ
ン変種 ＨＶ１， ＨＶ２， ＨＶ３， Ｌｅｕ１，Ｔ
ｈｒ２ −ＨＶ１， Ｌｙｓ４７ −ＨＶ２またはＰＡ
；ヒトスーパーオキシドジスムターゼ；ウイルスチミジ
ンキナーゼ；β−ラクタマーゼ；グルコースイソメラー
ゼをコードするものである。好ましい遺伝子は、デスル
フェートヒルジン、例えば変種ＨＶ１ をコードする遺
伝子である。本発明のハイブリッドベクターにおいて、
本発明のプロモーターおよび／またはＭＳＰシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ分子は、ポリペプチドの効率
的な発現を確保するためにポリペプチドコード領域に作
用可能に連結されている。
【００５４】好ましいハイブリッドベクターは、ｐＵＣ
ＲＳ， Ｍ１３ｍｐ１８ＲＳ， Ｍ１３ｍｐ１９Ｈ，
ｐＶＡＨＩＲ， ｐＶＡＨＩＲ−１， ｐＳＣ１２ＨＩ
Ｒ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１および特にｐＳＣ１２ＨＩ
ＲＴｅｒｍである。それらのハイブリッドベクターは実
施例において後述する。
ＲＳ， Ｍ１３ｍｐ１８ＲＳ， Ｍ１３ｍｐ１９Ｈ，
ｐＶＡＨＩＲ， ｐＶＡＨＩＲ−１， ｐＳＣ１２ＨＩ
Ｒ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１および特にｐＳＣ１２ＨＩ
ＲＴｅｒｍである。それらのハイブリッドベクターは実
施例において後述する。
【００５５】本発明はまた、
ａ）プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃ
ｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）挿入断片、もしくはそれの機能性断片であり；また
は ｂ）前記挿入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリ
ダイズするか、またはそのようなハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列に天然に作用可能に連結しているプロモーター
領域を含んで成り；または ｃ）ａ）またはｂ）の中に含まれそしてシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の縮重配列であり；またはｄ
）ａ），ｂ）またはｃ）の中に含まれるＤＮＡ分子の誘
導体であり；そして／または ｅ）（Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラ
スミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．
２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの複製開始点を含
んで成る、ＤＮＡ分子それ自体に関する。それらのＤＮ
Ａ分子は、本発明のハイブリッドベクターの調製または
更なる類似のＤＮＡもしくはｍＲＮＡのためのＤＮＡ遺
伝子ライブラリーもしくはｍＲＮＡのスクリーニングに
有用である。 ＤＮＡ分子およびＭＳＰの調製方法
ｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）挿入断片、もしくはそれの機能性断片であり；また
は ｂ）前記挿入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリ
ダイズするか、またはそのようなハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列に天然に作用可能に連結しているプロモーター
領域を含んで成り；または ｃ）ａ）またはｂ）の中に含まれそしてシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の縮重配列であり；またはｄ
）ａ），ｂ）またはｃ）の中に含まれるＤＮＡ分子の誘
導体であり；そして／または ｅ）（Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラ
スミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．
２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの複製開始点を含
んで成る、ＤＮＡ分子それ自体に関する。それらのＤＮ
Ａ分子は、本発明のハイブリッドベクターの調製または
更なる類似のＤＮＡもしくはｍＲＮＡのためのＤＮＡ遺
伝子ライブラリーもしくはｍＲＮＡのスクリーニングに
有用である。 ＤＮＡ分子およびＭＳＰの調製方法
【００５６】本発明の更なる目的は、本発明のＤＮＡ分
子、即ちハイブリッドベクターまたは上記に定義したＤ
ＮＡ分子の調製方法であって、 Ａ）そのようなハイブリッドベクターもしくはＤＮＡ分
子を含んで成る宿主を培養し、そして前記培養された宿
主からそのようなハイブリッドベクターもしくはＤＮＡ
分子を単離し、または Ｂ）試験管内合成によりそのようなハイブリッドベクタ
ーもしくはＤＮＡ分子を調製する、ことを含んで成る方
法を提供することである。
子、即ちハイブリッドベクターまたは上記に定義したＤ
ＮＡ分子の調製方法であって、 Ａ）そのようなハイブリッドベクターもしくはＤＮＡ分
子を含んで成る宿主を培養し、そして前記培養された宿
主からそのようなハイブリッドベクターもしくはＤＮＡ
分子を単離し、または Ｂ）試験管内合成によりそのようなハイブリッドベクタ
ーもしくはＤＮＡ分子を調製する、ことを含んで成る方
法を提供することである。
【００５７】宿主の培養は常用の栄養培地中で行われる
。該培地は、形質転換体（即ち選択マーカーと一緒に所
望のＤＮＡ分子を含むような宿主）の非形質転換体（即
ち所望のＤＮＡ分子を欠いているような宿主）からの陰
性または陽性の選択を可能にする化学的化合物が補足さ
れているかまたは欠いている。
。該培地は、形質転換体（即ち選択マーカーと一緒に所
望のＤＮＡ分子を含むような宿主）の非形質転換体（即
ち所望のＤＮＡ分子を欠いているような宿主）からの陰
性または陽性の選択を可能にする化学的化合物が補足さ
れているかまたは欠いている。
【００５８】当業界で有用な任意の適当な形質転換可能
な宿主、例えば適当な細菌、例えばグラム陰性菌、例え
ばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、あるいはグラム陽性菌、
例えばバシラス菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）
または乳酸菌、例えばラクトバシラス菌種（Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃ．） または特にラクトコッ
カス菌種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、
例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．ラクチ
スジアセチラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｄｉａｃｅｔ
ｙｌａｃｔｉｓ）もしくはＬ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅ
ｍｏｒｉｓ）を用いることができる。
な宿主、例えば適当な細菌、例えばグラム陰性菌、例え
ばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、あるいはグラム陽性菌、
例えばバシラス菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）
または乳酸菌、例えばラクトバシラス菌種（Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃ．） または特にラクトコッ
カス菌種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、
例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．ラクチ
スジアセチラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｄｉａｃｅｔ
ｙｌａｃｔｉｓ）もしくはＬ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅ
ｍｏｒｉｓ）を用いることができる。
【００５９】細菌は常法により形質転換され、そして形
質転換体は常法、例えばテトラサイクリンに対するそれ
らの耐性により同定される。
質転換体は常法、例えばテトラサイクリンに対するそれ
らの耐性により同定される。
【００６０】特に記載されるハイブリッドベクターは、
適当なＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株、例えばＴＧ１
， ＨＢ１０１， ＪＭ１０９， ＭＨ１株等、または
適当なバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、または適当
な乳酸菌、例えばラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ） 菌株、例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ
）０２３０、Ｌ．ラクチスジアセチラクチス（Ｌ．ｌａ
ｃｔｉｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．クレモ
リス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等において増殖される。 当業界における常法により宿主が形質転換されそして単
離される。 増殖したプラスミドは、常法、例えばＢｉｒｎｂｏｉｍ
＆Ｄｏｌｙ（１９７９） により記載されたようにし
て、細菌から単離される。
適当なＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株、例えばＴＧ１
， ＨＢ１０１， ＪＭ１０９， ＭＨ１株等、または
適当なバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、または適当
な乳酸菌、例えばラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ） 菌株、例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ
）０２３０、Ｌ．ラクチスジアセチラクチス（Ｌ．ｌａ
ｃｔｉｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．クレモ
リス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等において増殖される。 当業界における常法により宿主が形質転換されそして単
離される。 増殖したプラスミドは、常法、例えばＢｉｒｎｂｏｉｍ
＆Ｄｏｌｙ（１９７９） により記載されたようにし
て、細菌から単離される。
【００６１】本発明のＤＮＡ分子は、常法に従って試験
管内合成により調製することもできる。試験管内合成は
、特に小さい断片、例えばＭＳＰ遺伝子またはプロモー
ターもしくは特にシグナルペプチドをコードする関連遺
伝子のＤＮＡ配列の調製に適用できる。
管内合成により調製することもできる。試験管内合成は
、特に小さい断片、例えばＭＳＰ遺伝子またはプロモー
ターもしくは特にシグナルペプチドをコードする関連遺
伝子のＤＮＡ配列の調製に適用できる。
【００６２】本発明のＤＮＡ分子は、そのようなＤＮＡ
分子を含む乳酸菌から、特にそれのゲノムライブラリー
からまたはｍＲＮＡを経て得ることができる。
分子を含む乳酸菌から、特にそれのゲノムライブラリー
からまたはｍＲＮＡを経て得ることができる。
【００６３】プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ
のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片
であるＤＮＡ分子の調製を下記に詳細に記載する。
のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片
であるＤＮＡ分子の調製を下記に詳細に記載する。
【００６４】出発物質として、常法に従って、例えばＬ
．ラクチス株、例えばＬＭ０２３０，Ｃ２ またはＬＬ
７１２ のゲノムＤＮＡを制限酵素、例えばＳａｕ ３
ＡまたはＭｂｏ Ｉ で部分消化し、そして高分子量Ｄ
ＮＡ断片を適当なベクター、例えばＥ．コリのプラスミ
ドｐＵＮ１２１またはラムダファージ、例えばλＥＭＢ
Ｌ３中でクローニングすることにより調製された、ラク
トコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）
、例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）０２３０
のゲノムライブラリーを用いることができる。
．ラクチス株、例えばＬＭ０２３０，Ｃ２ またはＬＬ
７１２ のゲノムＤＮＡを制限酵素、例えばＳａｕ ３
ＡまたはＭｂｏ Ｉ で部分消化し、そして高分子量Ｄ
ＮＡ断片を適当なベクター、例えばＥ．コリのプラスミ
ドｐＵＮ１２１またはラムダファージ、例えばλＥＭＢ
Ｌ３中でクローニングすることにより調製された、ラク
トコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）
、例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）０２３０
のゲノムライブラリーを用いることができる。
【００６５】ＭＳＰを生産する乳酸菌の他のいずれの株
もゲノムライブラリー源として用いることができ、同様
に他の適当なベクターも断片の受容体として用いること
ができる。
もゲノムライブラリー源として用いることができ、同様
に他の適当なベクターも断片の受容体として用いること
ができる。
【００６６】ゲノムライブラリーを本発明のＤＮＡ配列
について好結果にスクリーニングするために、そのよう
なＤＮＡ配列、例えばＭＳＰ構造遺伝子、とハイブリダ
イズするＤＮＡプローブが必要である。これは、例えば
ＭＳＰ遺伝子またはその部分の配列が本発明より以前に
既知であるならば、合成ＤＮＡプローブであることがで
きる。ＭＳＰタンパク質もＭＳＰ遺伝子配列またはその
部分も本発明より以前に知られていなかったので、ＭＳ
Ｐの精製、ＭＳＰのＮ末端配列の決定およびハイブリダ
イズ用ＤＮＡプローブの調製の課題を最初に解決した。
について好結果にスクリーニングするために、そのよう
なＤＮＡ配列、例えばＭＳＰ構造遺伝子、とハイブリダ
イズするＤＮＡプローブが必要である。これは、例えば
ＭＳＰ遺伝子またはその部分の配列が本発明より以前に
既知であるならば、合成ＤＮＡプローブであることがで
きる。ＭＳＰタンパク質もＭＳＰ遺伝子配列またはその
部分も本発明より以前に知られていなかったので、ＭＳ
Ｐの精製、ＭＳＰのＮ末端配列の決定およびハイブリダ
イズ用ＤＮＡプローブの調製の課題を最初に解決した。
【００６７】ＭＳＰは、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、例えばＬ．ラクチス（
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の培養物の上清のＴＣＡ沈澱、沈澱
したタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびクーマシーブリリアントブルーでのゲルの染
色後に評価すると、前記上清において最も豊富な遺伝子
産物である。
ｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、例えばＬ．ラクチス（
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の培養物の上清のＴＣＡ沈澱、沈澱
したタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびクーマシーブリリアントブルーでのゲルの染
色後に評価すると、前記上清において最も豊富な遺伝子
産物である。
【００６８】ＭＳＰの精製のために、それを含有する任
意の源、例えば乳酸菌、例えばラクトコッカス種（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、例えばＬ．ラク
チス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の培養物の上清を用いること
ができる。ＭＳＰは、主要タンパク質バンドを含むゲル
片を切り取りそしてＭＳＰを溶出させることにより、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから精製することができ
る。
意の源、例えば乳酸菌、例えばラクトコッカス種（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 、例えばＬ．ラク
チス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の培養物の上清を用いること
ができる。ＭＳＰは、主要タンパク質バンドを含むゲル
片を切り取りそしてＭＳＰを溶出させることにより、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから精製することができ
る。
【００６９】純粋なＭＳＰを得るために更なる精製方法
、例えばトリクロロ酢酸を用いた酸沈澱、塩析、異なる
塩の形における再沈澱、透析、クロマトグラフィー、例
えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、電気
泳動、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動、等電点電気泳動、電気溶出等、またはそれら
の任意の組合せを適用することができる。
、例えばトリクロロ酢酸を用いた酸沈澱、塩析、異なる
塩の形における再沈澱、透析、クロマトグラフィー、例
えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、電気
泳動、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた
電気泳動、等電点電気泳動、電気溶出等、またはそれら
の任意の組合せを適用することができる。
【００７０】本発明においては、トリクロロ酢酸を用い
てＬ．ラクチスＬＭ０２３０の上清を沈澱させ、沈澱し
たタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動し、主要タンパク質バンドを有する領域を切り出
し、そしてＭＳＰをゲルから電気溶出させることにより
、約５６ｋＤの見かけ分子量を有するＭＳＰを純粋な形
で単離した。この方法は、別の見かけ分子量を有するＭ
ＳＰ関連タンパク質の単離にも適する。ＭＳＰのアミノ
酸配列は、配列決定により部分的に決定し、そしてＤＮ
Ａ配列から部分的に推定した。それは配列表の配列番号
１のもとに示されており、記載されたアミノ酸配列の２
８位から４６６ 位までに相当する。
てＬ．ラクチスＬＭ０２３０の上清を沈澱させ、沈澱し
たタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動し、主要タンパク質バンドを有する領域を切り出
し、そしてＭＳＰをゲルから電気溶出させることにより
、約５６ｋＤの見かけ分子量を有するＭＳＰを純粋な形
で単離した。この方法は、別の見かけ分子量を有するＭ
ＳＰ関連タンパク質の単離にも適する。ＭＳＰのアミノ
酸配列は、配列決定により部分的に決定し、そしてＤＮ
Ａ配列から部分的に推定した。それは配列表の配列番号
１のもとに示されており、記載されたアミノ酸配列の２
８位から４６６ 位までに相当する。
【００７１】純粋なＭＳＰタンパク質もまた本発明の主
題である。
題である。
【００７２】ＭＳＰのＮ末端の配列決定を常法により実
施し、そして次のアミノ酸配列が判明した：Ｘ−Ｘ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
。 ”Ｘ” で示されている最初の２つのアミノ酸と１５位
のアミノ酸は決定されなかった。
施し、そして次のアミノ酸配列が判明した：Ｘ−Ｘ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
。 ”Ｘ” で示されている最初の２つのアミノ酸と１５位
のアミノ酸は決定されなかった。
【００７３】５位〜１３位のアミノ酸の配列に基づいて
、次のようなオリゴヌクレオチド混合物を合成した：Ｇ
ＡＮ１ＡＴＮ２ＧＣＩＡＡＮ３ＣＡＮ３ＧＡＮ１ＧＣＩ
ＡＣ。このヌクレオチド配列中、Ｎ１はＴまたはＣであ
り；Ｎ２ はＴ，ＣまたはＡであり；Ｎ３ はＡまたは
Ｇである。Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシチジン、
ＧはグアノシンそしてＩはイノシン塩基を有するヌクレ
オチドを表わす。このオリゴヌクレオチド混合物を常法
により放射能標識し、そしてラクトコッカス種（Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 特にＬ．ラクチス（
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＬＭ０２３０のゲノムライブラリー
をスクリーニングするのに使用した。
、次のようなオリゴヌクレオチド混合物を合成した：Ｇ
ＡＮ１ＡＴＮ２ＧＣＩＡＡＮ３ＣＡＮ３ＧＡＮ１ＧＣＩ
ＡＣ。このヌクレオチド配列中、Ｎ１はＴまたはＣであ
り；Ｎ２ はＴ，ＣまたはＡであり；Ｎ３ はＡまたは
Ｇである。Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシチジン、
ＧはグアノシンそしてＩはイノシン塩基を有するヌクレ
オチドを表わす。このオリゴヌクレオチド混合物を常法
により放射能標識し、そしてラクトコッカス種（Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） 特にＬ．ラクチス（
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＬＭ０２３０のゲノムライブラリー
をスクリーニングするのに使用した。
【００７４】ＭＳＰアミノ酸配列をコードする配列を含
みそして少なくとも約１４ｂｐを有するＤＮＡプローブ
は、関連ＭＳＰ遺伝子またはその部分を含んで成る核酸
についてのスクリーニング（プレ−ＭＳＰ をコードす
るｍＲＮＡについてのスクリーニングも含む）に用いる
ことができる。
みそして少なくとも約１４ｂｐを有するＤＮＡプローブ
は、関連ＭＳＰ遺伝子またはその部分を含んで成る核酸
についてのスクリーニング（プレ−ＭＳＰ をコードす
るｍＲＮＡについてのスクリーニングも含む）に用いる
ことができる。
【００７５】スクリーニングのために、γ３２Ｐ−ＡＴ
Ｐ とＴ４キナーゼを使って当業界で既知の方法により
、ＤＮＡプローブはそれらの５′末端において放射能標
識される。この標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより、遺伝子ライブラリーのフィルター複製
品上で、挿入物として本発明の核酸を所有している宿主
微生物またはファージが同定される。
Ｐ とＴ４キナーゼを使って当業界で既知の方法により
、ＤＮＡプローブはそれらの５′末端において放射能標
識される。この標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより、遺伝子ライブラリーのフィルター複製
品上で、挿入物として本発明の核酸を所有している宿主
微生物またはファージが同定される。
【００７６】使用するハイブリダイゼーション条件は常
用のものであり、例えば単純に異なる温度を採用するこ
とにより、より大きなまたはより小さな緊縮条件であっ
てもよい。
用のものであり、例えば単純に異なる温度を採用するこ
とにより、より大きなまたはより小さな緊縮条件であっ
てもよい。
【００７７】オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイ
ズするライブラリーのＤＮＡクローンのハイブリダイズ
している部分を常法に従って部分的に配列決定した。決
定された配列は、ほとんど完全な機能性ＭＳＰ遺伝子を
含む。この配列は配列表の配列番号１のもとに記載され
る。
ズするライブラリーのＤＮＡクローンのハイブリダイズ
している部分を常法に従って部分的に配列決定した。決
定された配列は、ほとんど完全な機能性ＭＳＰ遺伝子を
含む。この配列は配列表の配列番号１のもとに記載され
る。
【００７８】３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ
Ｌ．ラクチス挿入断片は、ＥｃｏＲ ＩとＳａｌ Ｉ
での消化、および常法に従った、例えばアガロースゲ
ル電気泳動を使った挿入断片の精製により、ゲノムライ
ブラリーの陽性クローンから単離することができる。常
法に従って断片を調製し、そして適当なベクター、例え
ばＭ１３ｍｐ１８ 中に連結してＭ１３ｍｐ１８ＲＳ
を生じさせるかまたはｐＵＣ１８ 中に連結してｐＵＣ
ＲＳ を生じさせることができる。
Ｌ．ラクチス挿入断片は、ＥｃｏＲ ＩとＳａｌ Ｉ
での消化、および常法に従った、例えばアガロースゲ
ル電気泳動を使った挿入断片の精製により、ゲノムライ
ブラリーの陽性クローンから単離することができる。常
法に従って断片を調製し、そして適当なベクター、例え
ばＭ１３ｍｐ１８ 中に連結してＭ１３ｍｐ１８ＲＳ
を生じさせるかまたはｐＵＣ１８ 中に連結してｐＵＣ
ＲＳ を生じさせることができる。
【００７９】同様に、ＭＳＰ配列を含んで成る別のＬ．
ラクチス挿入断片、例えば３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ
／Ｓａｌ Ｉ 挿入断片のより大きな誘導体、変異体も
しくは断片；または３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａ
ｌ Ｉ 挿入断片とハイブリダイズするかまたはそのよ
うなハイブリダイズするＤＮＡ分子に天然に連結してい
るプロモーター領域を含んで成るＤＮＡ分子、を乳酸菌
のゲノムライブラリーから単離することができる。
ラクチス挿入断片、例えば３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ
／Ｓａｌ Ｉ 挿入断片のより大きな誘導体、変異体も
しくは断片；または３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａ
ｌ Ｉ 挿入断片とハイブリダイズするかまたはそのよ
うなハイブリダイズするＤＮＡ分子に天然に連結してい
るプロモーター領域を含んで成るＤＮＡ分子、を乳酸菌
のゲノムライブラリーから単離することができる。
【００８０】ａ）〜ｃ）に記載のＤＮＡ分子の断片は、
常法、例えば該挿入断片を適当なエキソ−またはエンド
ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ， Ｂ
ａｌ３１もしくはＳ１または制限エンドヌクレアーゼ、
例えばＳａｕ ３Ａ， Ｈｉｎｄ ＩＩＩ等により消化
した後の断片の単離により、得ることができる。
常法、例えば該挿入断片を適当なエキソ−またはエンド
ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ， Ｂ
ａｌ３１もしくはＳ１または制限エンドヌクレアーゼ、
例えばＳａｕ ３Ａ， Ｈｉｎｄ ＩＩＩ等により消化
した後の断片の単離により、得ることができる。
【００８１】上記ａ）〜ｃ）のいずれかに含まれるＤＮ
Ａ分子の変異体、例えば逆位、欠失、挿入または点変異
体は、常法、例えば、変異原性オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使った部位特異的突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ
およびＳｍｉｔｈ，１９８３；Ｂｏｔｓｔｅｉｎおよ
びＳｈｏｒｔｌｅ，１９８５；またはＮｏｒｒｉｓら、
１９８３の概説文献を参照のこと） により、または適
当な制限酵素で切断することにより２つの制限部位間の
ＤＮＡ断片を除去し、そして所望により希釈溶液中で該
ＤＮＡを再連結せしめることにより、生体内または試験
管内で調製することができる。
Ａ分子の変異体、例えば逆位、欠失、挿入または点変異
体は、常法、例えば、変異原性オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使った部位特異的突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ
およびＳｍｉｔｈ，１９８３；Ｂｏｔｓｔｅｉｎおよ
びＳｈｏｒｔｌｅ，１９８５；またはＮｏｒｒｉｓら、
１９８３の概説文献を参照のこと） により、または適
当な制限酵素で切断することにより２つの制限部位間の
ＤＮＡ断片を除去し、そして所望により希釈溶液中で該
ＤＮＡを再連結せしめることにより、生体内または試験
管内で調製することができる。
【００８２】次に、複製開始点として機能するＤＮＡ配
列を含んで成る本発明の組換えＤＮＡ分子の調製を下記
に詳細に記載する。
列を含んで成る本発明の組換えＤＮＡ分子の調製を下記
に詳細に記載する。
【００８３】常法に従って、例えばＢｉｒｎｂｏｉｍお
よびＤｏｌｙ（１９７９）により記載された方法（実施
例において記載された変形を伴う）により、Ｌ．ラクチ
スＬＬ７１２ からプラスミドを単離し、そして常法、
例えばクロマトグラフィー技術、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２）により記載されたようなアガロースゲ
ルクロマトグラフィーを使ってプラスミドを分離する。 ２．５Ｍｄプラスミドと５．２Ｍｄプラスミドを単離し
、常法に従って断片化する。
よびＤｏｌｙ（１９７９）により記載された方法（実施
例において記載された変形を伴う）により、Ｌ．ラクチ
スＬＬ７１２ からプラスミドを単離し、そして常法、
例えばクロマトグラフィー技術、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２）により記載されたようなアガロースゲ
ルクロマトグラフィーを使ってプラスミドを分離する。 ２．５Ｍｄプラスミドと５．２Ｍｄプラスミドを単離し
、常法に従って断片化する。
【００８４】こして得られた断片混合物を、常法に従っ
て、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載のよ
うにして、適当なベクターと連結せしめ、そしてそれら
の連結混合物を用いて常法に従って適当な中間宿主株を
形質転換せしめる。
て、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載のよ
うにして、適当なベクターと連結せしめ、そしてそれら
の連結混合物を用いて常法に従って適当な中間宿主株を
形質転換せしめる。
【００８５】適当なベクターは、乳酸菌中での選択のた
めのマーカー遺伝子、例えば耐性マーカー遺伝子、例え
ばエリスロマイシン耐性遺伝子；および乳酸菌中では機
能しないがＬ．ラクチスプラスミドの断片のクローニン
グ用の中間宿主株として適当な細菌中では機能する複製
開始点を有する。適当なベクターは、乳酸菌中で機能す
るマーカー遺伝子と同一であってもよい中間宿主中での
選択のためのマーカー遺伝子も含んで成る。適当な中間
宿主は、例えば、Ｅ．コリ株、例えばＥ．コリＴＧ１で
あり、そして適当なクローニングベクターはＥ．コリベ
クター、例えばエリスロマイシン耐性遺伝子を担持して
いるｐＵＣ１８ 誘導体、例えばｐＵＣ３８３であり、
それの作製は実施例において後述する。
めのマーカー遺伝子、例えば耐性マーカー遺伝子、例え
ばエリスロマイシン耐性遺伝子；および乳酸菌中では機
能しないがＬ．ラクチスプラスミドの断片のクローニン
グ用の中間宿主株として適当な細菌中では機能する複製
開始点を有する。適当なベクターは、乳酸菌中で機能す
るマーカー遺伝子と同一であってもよい中間宿主中での
選択のためのマーカー遺伝子も含んで成る。適当な中間
宿主は、例えば、Ｅ．コリ株、例えばＥ．コリＴＧ１で
あり、そして適当なクローニングベクターはＥ．コリベ
クター、例えばエリスロマイシン耐性遺伝子を担持して
いるｐＵＣ１８ 誘導体、例えばｐＵＣ３８３であり、
それの作製は実施例において後述する。
【００８６】Ｌ．ラクチスの２．５Ｍｄまたは５．２Ｍ
ｄプラスミドの断片を含んで成るベクターにより形質転
換された中間宿主細胞は、所望により、使用する中間宿
主細胞およびベクターのタイプに依存する常法に従って
選択することができる。選択マーカーは、例えば、耐性
マーカー遺伝子またはスクリーニング可能なマーカー酵
素をコードする遺伝子、例えばＥ．コリｌａｃＺ遺伝子
の産物、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子であ
ることができる。 ただし、この場合は宿主がゲノムｌａｃＺ遺伝子に欠損
のあるＥ．コリ株であることを前提とする。選択マーカ
ー遺伝子は、ＤＮＡ断片の挿入により妨害され得る。マ
ーカーがｌａｃＺであるならば、ｌａｃＺ遺伝子中に挿
入された断片を有するベクターを含有する宿主細胞は、
Ｘ−Ｇａｌ を青色色素に変換することがもはや不可能
であり、そして結果として、ＩＰＴＧによるｌａｃＺ遺
伝子の発現の誘導後のＸ−Ｇａｌ 含有寒天プレート上
の陽性クローンは白色のままである。
ｄプラスミドの断片を含んで成るベクターにより形質転
換された中間宿主細胞は、所望により、使用する中間宿
主細胞およびベクターのタイプに依存する常法に従って
選択することができる。選択マーカーは、例えば、耐性
マーカー遺伝子またはスクリーニング可能なマーカー酵
素をコードする遺伝子、例えばＥ．コリｌａｃＺ遺伝子
の産物、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子であ
ることができる。 ただし、この場合は宿主がゲノムｌａｃＺ遺伝子に欠損
のあるＥ．コリ株であることを前提とする。選択マーカ
ー遺伝子は、ＤＮＡ断片の挿入により妨害され得る。マ
ーカーがｌａｃＺであるならば、ｌａｃＺ遺伝子中に挿
入された断片を有するベクターを含有する宿主細胞は、
Ｘ−Ｇａｌ を青色色素に変換することがもはや不可能
であり、そして結果として、ＩＰＴＧによるｌａｃＺ遺
伝子の発現の誘導後のＸ−Ｇａｌ 含有寒天プレート上
の陽性クローンは白色のままである。
【００８７】Ｌ．ラクチスの２．５Ｍｄまたは５．２Ｍ
ｄプラスミド由来の挿入断片を担持しているベクターを
、プラスミド不含のＬ．ラクチス株、例えばＬ．ラクチ
ス０２３０中で複製する能力についてテストする。この
ために、前記中間宿主からプラスミドを単離し、そして
常法に従って、例えばＰｏｗｅｌｌら（１９８８）によ
り記載されたようにして、Ｌ．ラクチス０２３０細胞中
に形質転換せしめる。複製しているベクターは、複製開
始点として機能するＬ．ラクチス５．２Ｍｄまたは２．
５Ｍｄプラスミド由来のＤＮＡ挿入断片を含んで成る。 この機能を有するＤＮＡ分子を、複製しているベクター
から単離し、断片化し、変異せしめることができ、そし
てこれを用いて本発明の組換えＤＮＡ分子、例えば乳酸
菌中で複製するクローニングまたは発現ベクターを作製
することができる。Ｌ．ラクチス５．２Ｍｄまたは２．
５Ｍｄプラスミド由来の複製開始点は、乳酸菌以外の細
菌、例えばバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．
）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でも機能性である
。従って、そのようなＤＮＡ断片を含んで成るベクター
は、シャトルベクターとして使用することができる。
ｄプラスミド由来の挿入断片を担持しているベクターを
、プラスミド不含のＬ．ラクチス株、例えばＬ．ラクチ
ス０２３０中で複製する能力についてテストする。この
ために、前記中間宿主からプラスミドを単離し、そして
常法に従って、例えばＰｏｗｅｌｌら（１９８８）によ
り記載されたようにして、Ｌ．ラクチス０２３０細胞中
に形質転換せしめる。複製しているベクターは、複製開
始点として機能するＬ．ラクチス５．２Ｍｄまたは２．
５Ｍｄプラスミド由来のＤＮＡ挿入断片を含んで成る。 この機能を有するＤＮＡ分子を、複製しているベクター
から単離し、断片化し、変異せしめることができ、そし
てこれを用いて本発明の組換えＤＮＡ分子、例えば乳酸
菌中で複製するクローニングまたは発現ベクターを作製
することができる。Ｌ．ラクチス５．２Ｍｄまたは２．
５Ｍｄプラスミド由来の複製開始点は、乳酸菌以外の細
菌、例えばバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．
）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でも機能性である
。従って、そのようなＤＮＡ断片を含んで成るベクター
は、シャトルベクターとして使用することができる。
【００８８】複製開始点を担持している２．５Ｍｄまた
は５．２Ｍｄプラスミドの断片は、Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の全プラスミドプールの断片化により得られた断
片混合物から、上述の方法に従って同定および単離する
こともできる。複製開始点を有するクローン化された断
片のいずれが２．５Ｍｄまたは５．２Ｍｄプラスミドに
由来するものであるかは、クローン化された断片を、ア
ガロースゲル上で分離されたＬ．ラクチスＬＬ７１２
由来のプラスミドプールのプラスミドとハイブリダイズ
させることにより、またはクローン化された断片の制限
パターンと前記プールのプラスミドの制限パターンとの
比較により、決定することができる。
は５．２Ｍｄプラスミドの断片は、Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の全プラスミドプールの断片化により得られた断
片混合物から、上述の方法に従って同定および単離する
こともできる。複製開始点を有するクローン化された断
片のいずれが２．５Ｍｄまたは５．２Ｍｄプラスミドに
由来するものであるかは、クローン化された断片を、ア
ガロースゲル上で分離されたＬ．ラクチスＬＬ７１２
由来のプラスミドプールのプラスミドとハイブリダイズ
させることにより、またはクローン化された断片の制限
パターンと前記プールのプラスミドの制限パターンとの
比較により、決定することができる。
【００８９】Ｌ．ラクチス２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍ
ｄプラスミドまたは２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの全ＤＮＡ配列を
含んで成る本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えば、各プ
ラスミドを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、そ
してそれを例えば同種もしくは異種構造子、プロモータ
ー領域またはベクター配列を含んで成るＤＮＡ断片とま
たはリンカー断片等と連結せしめることにより、得るこ
とができる。適当な制限エンドヌクレアーゼは、各プラ
スミド中に唯一の認識および開裂部位を有するものであ
る。
ｄプラスミドまたは２．５Ｍｄもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの全ＤＮＡ配列を
含んで成る本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えば、各プ
ラスミドを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、そ
してそれを例えば同種もしくは異種構造子、プロモータ
ー領域またはベクター配列を含んで成るＤＮＡ断片とま
たはリンカー断片等と連結せしめることにより、得るこ
とができる。適当な制限エンドヌクレアーゼは、各プラ
スミド中に唯一の認識および開裂部位を有するものであ
る。
【００９０】２．５Ｍｄまたは５．２Ｍｄプラスミド由
来の複製開始点機能を有する配列を含んで成る組換えＤ
ＮＡ分子は、例えば、常法に従ったＬ．ラクチスＬＬ７
１２ のプラスミドプールの調製；例えばアガロースゲ
ル電気泳動において分子量を評価することによる２．５
Ｍｄまたは５．２Ｍｄプラスミドの同定；例えば適当な
制限酵素を用いた各プラスミドの断片化；複製開始点機
能を含んで成る断片、例えば上述した断片のうちの１つ
の調製；そのような断片またはそのような断片を含む混
合物と、複製開始点を含まないＤＮＡ分子、例えば複製
開始点を欠くクローニングベクターとの連結；および少
なくともＬ．ラクチスとＥ．コリ中で複製するＤＮＡ分
子についての選択、を含んで成る方法により得ることが
できる。
来の複製開始点機能を有する配列を含んで成る組換えＤ
ＮＡ分子は、例えば、常法に従ったＬ．ラクチスＬＬ７
１２ のプラスミドプールの調製；例えばアガロースゲ
ル電気泳動において分子量を評価することによる２．５
Ｍｄまたは５．２Ｍｄプラスミドの同定；例えば適当な
制限酵素を用いた各プラスミドの断片化；複製開始点機
能を含んで成る断片、例えば上述した断片のうちの１つ
の調製；そのような断片またはそのような断片を含む混
合物と、複製開始点を含まないＤＮＡ分子、例えば複製
開始点を欠くクローニングベクターとの連結；および少
なくともＬ．ラクチスとＥ．コリ中で複製するＤＮＡ分
子についての選択、を含んで成る方法により得ることが
できる。
【００９１】２．５Ｍｄまたは５．２Ｍｄプラスミドと
同じ不和合性群の複製開始点含有プラスミドは、それら
は同一細胞内においてそれぞれ２．５Ｍｄまたは５．２
Ｍｄプラスミドと一緒に維持できないため、同定するこ
とができる。
同じ不和合性群の複製開始点含有プラスミドは、それら
は同一細胞内においてそれぞれ２．５Ｍｄまたは５．２
Ｍｄプラスミドと一緒に維持できないため、同定するこ
とができる。
【００９２】本発明は、構造遺伝子の発現用のハイブリ
ッドベクターの調製のための本発明のＤＮＡ分子または
組換えＤＮＡ分子の使用にも関する。そのような構造遺
伝子の例は上記に与えられている。ハイブリッドベクタ
ーは、常法に従って、酵素、例えば制限酵素、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ等を使って調製することが
できる。
ッドベクターの調製のための本発明のＤＮＡ分子または
組換えＤＮＡ分子の使用にも関する。そのような構造遺
伝子の例は上記に与えられている。ハイブリッドベクタ
ーは、常法に従って、酵素、例えば制限酵素、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ等を使って調製することが
できる。
【００９３】実施例４と５は、乳酸菌、特にＬ．ラクチ
ス、またはバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．
）、特にＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ） 中での構造遺伝子の発現用のハイブリッ
ドベクターの調製を詳細に記載する。 形質転換宿主またはその調製方法
ス、またはバシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．
）、特にＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ） 中での構造遺伝子の発現用のハイブリッ
ドベクターの調製を詳細に記載する。 形質転換宿主またはその調製方法
【００９４】本発明は更に、本発明のハイブリッドベク
ターにより形質転換された細菌宿主にも関する。
ターにより形質転換された細菌宿主にも関する。
【００９５】本発明の形質転換された細菌宿主は、ａ）
〜ｅ）において定義されたＤＮＡ分子を含んで成るハイ
ブリッドベクターのクローニング、増幅および／または
調製に適当である。それらのハイブリッドベクターは、
そのような宿主中で複製することができ、且つ増殖中の
細胞集団において選択的圧力下で失われない。使用でき
る宿主は、ハイブリッドベクター中に含まれる複製開始
点に依存する。ハイブリッドベクターがｅ）に記載の複
製開始点機能を有するＤＮＡ配列を含んで成る場合には
、適当な宿主は、例えば、同じ不和合性群の複製開始点
を有するプラスミドを含まないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ
）、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）また
はラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅ
ｃ．） のいずれかの菌株である。
〜ｅ）において定義されたＤＮＡ分子を含んで成るハイ
ブリッドベクターのクローニング、増幅および／または
調製に適当である。それらのハイブリッドベクターは、
そのような宿主中で複製することができ、且つ増殖中の
細胞集団において選択的圧力下で失われない。使用でき
る宿主は、ハイブリッドベクター中に含まれる複製開始
点に依存する。ハイブリッドベクターがｅ）に記載の複
製開始点機能を有するＤＮＡ配列を含んで成る場合には
、適当な宿主は、例えば、同じ不和合性群の複製開始点
を有するプラスミドを含まないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ
）、バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）また
はラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅ
ｃ．） のいずれかの菌株である。
【００９６】ハイブリッドベクターが適切な読み枠にお
いてＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
融合された同種または異種構造遺伝子を含んで成る場合
、本発明の形質転換宿主は、分泌される同種または異種
タンパク質の生産に適当であるもの、例えばＬ．ラクチ
スの菌株である。
いてＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
融合された同種または異種構造遺伝子を含んで成る場合
、本発明の形質転換宿主は、分泌される同種または異種
タンパク質の生産に適当であるもの、例えばＬ．ラクチ
スの菌株である。
【００９７】本発明の形質転換宿主の例は、 ｐＵＣＲ
Ｓ， ｐＳＣ１２， ｐＳＣ１２ΔＰ， ｐＳＣ１２Δ
Ｎ， ｐＳＣ１２ΔＮＰ，ｐＳＣ１８，ｐＳＣ１８ΔＮ
， ｐＳＣ１８ΔＰ， ｐＶＡＨＩＲ， ｐＶＡＨＩＲ
−１， ｐＳＣ１２ＨＩＲ，ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１もし
くはｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転換されたＥ
．コリ株、例えばＴＧ１， Ｃ６００ もしくはＨＢ１
０１ 、前記プラスミドのいずれかにより形質転換され
た、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）もしくは
プラスミド不含Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、例
えばＬ．ラクチスＬＭ０２３０、またはバシラス株、例
えばＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ） である。好ましいのは、ｐＵＣＲＳ により
形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１ 、
ｐＵＣＲＳ， ｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍ， ｐＳＣ１
２ またはｐＳＣ１８ により形質転換されたＬ．ラク
チス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、および ｐＶＡＨＩＲ ま
たは ｐＶＡＨＩＲ−１ により形質転換されたＢ．ス
リンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
である。
Ｓ， ｐＳＣ１２， ｐＳＣ１２ΔＰ， ｐＳＣ１２Δ
Ｎ， ｐＳＣ１２ΔＮＰ，ｐＳＣ１８，ｐＳＣ１８ΔＮ
， ｐＳＣ１８ΔＰ， ｐＶＡＨＩＲ， ｐＶＡＨＩＲ
−１， ｐＳＣ１２ＨＩＲ，ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１もし
くはｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転換されたＥ
．コリ株、例えばＴＧ１， Ｃ６００ もしくはＨＢ１
０１ 、前記プラスミドのいずれかにより形質転換され
た、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）もしくは
プラスミド不含Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、例
えばＬ．ラクチスＬＭ０２３０、またはバシラス株、例
えばＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ） である。好ましいのは、ｐＵＣＲＳ により
形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１ 、
ｐＵＣＲＳ， ｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍ， ｐＳＣ１
２ またはｐＳＣ１８ により形質転換されたＬ．ラク
チス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、および ｐＶＡＨＩＲ ま
たは ｐＶＡＨＩＲ−１ により形質転換されたＢ．ス
リンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
である。
【００９８】本発明は、そのような形質転換体の調製方
法であって、所望により選択マーカー遺伝子と一緒に、
本発明の組換えＤＮＡ分子、特に本発明のハイブリッド
ベクターを用いて形質転換条件下で宿主を処理し、そし
て形質添転換体を選択することを含んで成る方法にも関
する。 ポリペプチドの調製方法
法であって、所望により選択マーカー遺伝子と一緒に、
本発明の組換えＤＮＡ分子、特に本発明のハイブリッド
ベクターを用いて形質転換条件下で宿主を処理し、そし
て形質添転換体を選択することを含んで成る方法にも関
する。 ポリペプチドの調製方法
【００９９】本発明は更に、ポリペプチドの調製方法で
あって、同種または異種構造遺伝子を正しい読み枠にお
いてＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
融合せしめ、そのような融合遺伝子を含んで成るハイブ
リッドベクターを用いて適当な宿主、例えばグラム陽性
菌宿主、例えばラクトコッカス宿主、例えばＬ．ラクチ
ス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＬＭ０２３０、またはバシラス
種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、例えばＢ．スリ
ンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を形
質転換せしめ、そして前記遺伝子によりコードされるポ
リペプチドを宿主細胞から分泌させることを特徴とする
方法にも関する。必要ならば、常法に従って上清からポ
リペプチドを単離する。本発明の好ましい態様によれば
、発現されるタンパク質を分解するようなプロテアーゼ
を培地中に分泌しない細菌宿主が使用される。
あって、同種または異種構造遺伝子を正しい読み枠にお
いてＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
融合せしめ、そのような融合遺伝子を含んで成るハイブ
リッドベクターを用いて適当な宿主、例えばグラム陽性
菌宿主、例えばラクトコッカス宿主、例えばＬ．ラクチ
ス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＬＭ０２３０、またはバシラス
種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、例えばＢ．スリ
ンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を形
質転換せしめ、そして前記遺伝子によりコードされるポ
リペプチドを宿主細胞から分泌させることを特徴とする
方法にも関する。必要ならば、常法に従って上清からポ
リペプチドを単離する。本発明の好ましい態様によれば
、発現されるタンパク質を分解するようなプロテアーゼ
を培地中に分泌しない細菌宿主が使用される。
【０１００】そのような本発明の好ましい態様は、例え
ばそのようなタンパク質をコードする遺伝子を含んで成
る本発明のハイブリッドベクター、例えばｐＳＣ１２Ｈ
ＩＲ，ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１または特にｐＳＣ１２ＨＩ
ＲＴｅｒｍにより形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２
３０細胞から分泌されるタンパク質、例えばデスルフェ
ートヒルジンの生産である。活性デスルフェートヒルジ
ンの濃縮物は、ｐＳＣ１２ＨＩＲまたはｐＳＣ１２ＨＩ
Ｒ−１により形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０
細胞の安定期培養物の上清から得ることができる。ｐＳ
Ｃ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転換されたＬ．ラクチ
スＬＭ０２３０細胞の上清において、デスルフェートヒ
ルジンの収量が増加する。驚くべきことに、異種遺伝子
産物、例えばデスルフェートヒルジンのレベルは、安定
期培養物の長期インキュベーション、例えば一晩のイン
キュベーション後にも減少しない。このことは、上清に
おける異種遺伝子産物のタンパク質分解がないことを示
す。
ばそのようなタンパク質をコードする遺伝子を含んで成
る本発明のハイブリッドベクター、例えばｐＳＣ１２Ｈ
ＩＲ，ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１または特にｐＳＣ１２ＨＩ
ＲＴｅｒｍにより形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２
３０細胞から分泌されるタンパク質、例えばデスルフェ
ートヒルジンの生産である。活性デスルフェートヒルジ
ンの濃縮物は、ｐＳＣ１２ＨＩＲまたはｐＳＣ１２ＨＩ
Ｒ−１により形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０
細胞の安定期培養物の上清から得ることができる。ｐＳ
Ｃ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転換されたＬ．ラクチ
スＬＭ０２３０細胞の上清において、デスルフェートヒ
ルジンの収量が増加する。驚くべきことに、異種遺伝子
産物、例えばデスルフェートヒルジンのレベルは、安定
期培養物の長期インキュベーション、例えば一晩のイン
キュベーション後にも減少しない。このことは、上清に
おける異種遺伝子産物のタンパク質分解がないことを示
す。
【０１０１】本発明の別の態様によれば、例えば遠心ま
たは濾過により、対数期または安定期のいずれかにおい
て栄養培地から細胞を収得し、そして少量、例えばもと
の培養物容量の約１％〜２０％の新鮮な栄養培地または
適当な緩衝液中に再懸濁する。再懸濁した細胞のインキ
ュベーションは、上清中に分泌される異種遺伝子産物の
収量の増加をもたらす。例えば、ｐＳＣ１２ＨＩＲによ
り形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０の培養物に
おいては、安定期培養物の細胞を遠心により収得し、約
１／１０容の新鮮な栄養培地中に再懸濁し、そして約３
０℃において約３０分間インキュベートすると、上清中
のデスルフェートヒルジンの収量の増加を獲得すること
ができる。
たは濾過により、対数期または安定期のいずれかにおい
て栄養培地から細胞を収得し、そして少量、例えばもと
の培養物容量の約１％〜２０％の新鮮な栄養培地または
適当な緩衝液中に再懸濁する。再懸濁した細胞のインキ
ュベーションは、上清中に分泌される異種遺伝子産物の
収量の増加をもたらす。例えば、ｐＳＣ１２ＨＩＲによ
り形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０の培養物に
おいては、安定期培養物の細胞を遠心により収得し、約
１／１０容の新鮮な栄養培地中に再懸濁し、そして約３
０℃において約３０分間インキュベートすると、上清中
のデスルフェートヒルジンの収量の増加を獲得すること
ができる。
【０１０２】本発明の別の態様は、上記に記載の方法に
従って本発明のハイブリッドベクター、例えばｐＵＣＲ
Ｓ により形質転換されたグラム陽性宿主細胞から分泌
されるＭＳＰの生産である。本発明の更なる態様は、
ｐＶＡＨＩＲ または ｐＶＡＨＩＲ−１ により形質
転換されたＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ） 、好ましくはＨＤ１ｃｒｙＢ（ＤＳＭ
４５７４）株中でのデスルフェートヒルジンの生産で
ある。
従って本発明のハイブリッドベクター、例えばｐＵＣＲ
Ｓ により形質転換されたグラム陽性宿主細胞から分泌
されるＭＳＰの生産である。本発明の更なる態様は、
ｐＶＡＨＩＲ または ｐＶＡＨＩＲ−１ により形質
転換されたＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ） 、好ましくはＨＤ１ｃｒｙＢ（ＤＳＭ
４５７４）株中でのデスルフェートヒルジンの生産で
ある。
【０１０３】
略語
ｄＮＴＰ デオキシヌクレオチド三リン酸Ｈ
ＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィーＩＰ
ＴＧ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド ｋｂｐ キロ塩基対 ｋＤ キロダルトン ＬＢ Ｌｕｒｉａ ブロス栄養培地（Ｇ
ｉｂｃｏ／ＢＲＬ） Ｍｄ メガダルト
ン ｓＣＤ２３ 可溶性ＣＤ２３、即ち２５ｋ Ｉ
ｇＥ−結合因子ＳＬＰＩ 分泌ロイコプロテ
イナーゼ阻害剤
ＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィーＩＰ
ＴＧ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド ｋｂｐ キロ塩基対 ｋＤ キロダルトン ＬＢ Ｌｕｒｉａ ブロス栄養培地（Ｇ
ｉｂｃｏ／ＢＲＬ） Ｍｄ メガダルト
ン ｓＣＤ２３ 可溶性ＣＤ２３、即ち２５ｋ Ｉ
ｇＥ−結合因子ＳＬＰＩ 分泌ロイコプロテ
イナーゼ阻害剤
【０１０４】
【実施例】次の実施例は本発明を説明するためのもので
あるが、本発明の限定として解釈してはならない。 材料および方法 菌株
あるが、本発明の限定として解釈してはならない。 材料および方法 菌株
【０１０５】Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０は、Ｌ．ラクチ
スＣ２（Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｊ．Ｄ．およびＭｃＫ
ａｙ，Ｌ，Ｌ．，１９７７）のプラスミド不含誘導体で
ある。これは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚ
ｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている（後述）。
スＣ２（Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｊ．Ｄ．およびＭｃＫ
ａｙ，Ｌ，Ｌ．，１９７７）のプラスミド不含誘導体で
ある。これは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚ
ｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている（後述）。
【０１０６】Ｌ．ラクチスＣ２（ＮＣＤＯ ２０３１）
および後に２．５Ｍｄと５．２Ｍｄプラスミドの入手
源として働くＬ．ラクチスＬＬ７１２ は、密接に関連
しているかまたは同一である（Ｆ．Ｌ．Ｄａｖｉｓら、
１９８１） 。前者は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｒｙ Ｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ，ＵＫ（ＮＣＤＯ２０３１）から得ることができ、
後者はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋ
ｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている（後述）。
および後に２．５Ｍｄと５．２Ｍｄプラスミドの入手
源として働くＬ．ラクチスＬＬ７１２ は、密接に関連
しているかまたは同一である（Ｆ．Ｌ．Ｄａｖｉｓら、
１９８１） 。前者は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｒｙ Ｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ，ＵＫ（ＮＣＤＯ２０３１）から得ることができ、
後者はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋ
ｕｌｔｕｒｅｎに寄託されている（後述）。
【０１０７】Ｅ．コリＴＧ１は遺伝子型 Ｋ１２， Δ
（ｌａｃ−ｐｒｏ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｈｓｄＤ５／
Ｆ’ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ＋ Ｂ ＋ ，ｌａｃＩ
ｑ ，ｌａｃＺ ΔＭ１５ を有し、Ａｍｅｒｓｈａｍ
から得ることができる。それはＡｍｅｒｓｈａｍの「オ
リゴヌクレオチド指向試験管内突然変異誘発システム」
手引書に記載されている。 一般的方法 形質転換
（ｌａｃ−ｐｒｏ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｈｓｄＤ５／
Ｆ’ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ＋ Ｂ ＋ ，ｌａｃＩ
ｑ ，ｌａｃＺ ΔＭ１５ を有し、Ａｍｅｒｓｈａｍ
から得ることができる。それはＡｍｅｒｓｈａｍの「オ
リゴヌクレオチド指向試験管内突然変異誘発システム」
手引書に記載されている。 一般的方法 形質転換
【０１０８】Ｅ．コリは、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８
２）により記載された塩化カルシウム法に従って形質転
換される。ラクトコッカス株の形質転換は、ＢｉｏＲａ
ｄ社のＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標） 装置を使って
、そしてＬ．ラクチスＬＭ０２３０についてのプロトコ
ルに従って、エレクトロポレーションにより行われる。 プラスミドの調製
２）により記載された塩化カルシウム法に従って形質転
換される。ラクトコッカス株の形質転換は、ＢｉｏＲａ
ｄ社のＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標） 装置を使って
、そしてＬ．ラクチスＬＭ０２３０についてのプロトコ
ルに従って、エレクトロポレーションにより行われる。 プラスミドの調製
【０１０９】ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ（１９７
９）の方法に従ってＥ．コリからプラスミドＤＮＡを調
製する。
９）の方法に従ってＥ．コリからプラスミドＤＮＡを調
製する。
【０１１０】次のような変更を伴ってラクトコッカスか
らのプラスミドの単離にも同じ方法が使われる。 ａ）一晩培養物をＭ１７−Ｇ 培地（Ｔｅｒｚａｇｈｉ
およびＳａｄｉｎｅ，１９７５）中で３０℃にて増殖
させ、新鮮な培地中に１：１０希釈し、そして更に２時
間増殖させる。 ｂ）リゾチームとのインキュベーションをムタノリシン
（５０ｍｇ／ｌ）の存在下で３７℃にて１０〜２０分間
行う。
らのプラスミドの単離にも同じ方法が使われる。 ａ）一晩培養物をＭ１７−Ｇ 培地（Ｔｅｒｚａｇｈｉ
およびＳａｄｉｎｅ，１９７５）中で３０℃にて増殖
させ、新鮮な培地中に１：１０希釈し、そして更に２時
間増殖させる。 ｂ）リゾチームとのインキュベーションをムタノリシン
（５０ｍｇ／ｌ）の存在下で３７℃にて１０〜２０分間
行う。
【０１１１】Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ からのプラスミ
ドプールを同じ方法で調製し、そしてプラスミド画分を
ＣｓＣｌ−臭化エチジウム平衡遠心分離（Ｃｌｅｗｅｌ
ｌ およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，１９６９）により更に精
製する。精製したプラスミド画分は３つの小さいプラス
ミド（１．８Ｍｄ，２．５Ｍｄ，５．２Ｍｄ；Ｇａｓｓ
ｏｎ，１９８３）に富み、一方２つの大きいプラスミド
（９Ｍｄと３３Ｍｄ；Ｇａｓｓｏｎ，１９８３）はより
少量存在する。 １． 乳酸菌と大腸菌のためのシャトルベクターの作
製１．１ ｐＵＣ８３８の作製
ドプールを同じ方法で調製し、そしてプラスミド画分を
ＣｓＣｌ−臭化エチジウム平衡遠心分離（Ｃｌｅｗｅｌ
ｌ およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，１９６９）により更に精
製する。精製したプラスミド画分は３つの小さいプラス
ミド（１．８Ｍｄ，２．５Ｍｄ，５．２Ｍｄ；Ｇａｓｓ
ｏｎ，１９８３）に富み、一方２つの大きいプラスミド
（９Ｍｄと３３Ｍｄ；Ｇａｓｓｏｎ，１９８３）はより
少量存在する。 １． 乳酸菌と大腸菌のためのシャトルベクターの作
製１．１ ｐＵＣ８３８の作製
【０１１２】ｐＶＡ８３８（ＡＴＣＣ ３７１６０；Ｍ
ａｃｒｉｎａら、１９８２） は、１．７ｋｂｐ のＡ
ｖａＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限断片上に構成的に発現さ
れるエリスロマイシン耐性遺伝子を担持しているラクト
コッカスプラスミドである。約１０μｇの ｐＶＡ８３
８ ＤＮＡ をＡｖａ Ｉ とＨｉｎｄ ＩＩＩで消化
する。このＤＮＡ断片の末端を４種のｄＮＴＰの存在下
でクレノウ酵素により平滑末端にする。アガロースゲル
上で断片を分離し、そして電気溶出により１．７ｋｂｐ
の Ａｖａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をゲルから回
収する。
ａｃｒｉｎａら、１９８２） は、１．７ｋｂｐ のＡ
ｖａＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限断片上に構成的に発現さ
れるエリスロマイシン耐性遺伝子を担持しているラクト
コッカスプラスミドである。約１０μｇの ｐＶＡ８３
８ ＤＮＡ をＡｖａ Ｉ とＨｉｎｄ ＩＩＩで消化
する。このＤＮＡ断片の末端を４種のｄＮＴＰの存在下
でクレノウ酵素により平滑末端にする。アガロースゲル
上で断片を分離し、そして電気溶出により１．７ｋｂｐ
の Ａｖａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をゲルから回
収する。
【０１１３】Ｒｕｓｃｈｅらにより提唱されたようにし
て、約 ２００ｎｇの前記断片と １００ｎｇのＳｍａ
Ｉ 切断ｐＵＣ１８（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ら） を
Ｔ４リガーゼの存在下で連結せしめ、そしてこの連結混
合物を用いてＥ．コリＴＧ１を形質転換せしめる。 Ｘ−Ｇａｌ，ＩＰＴＧおよび １００ｍｇ／ｌのアンピ
シリンを含むＬＢ寒天プレートから白色コロニーを取り
出す。それらのプラスミドＤＮＡを単離・分析し、そし
てエリスロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天
プレート上で増殖する能力により正しいクローンを同定
する。得られたプラスミドをｐＵＣ８３８と命名する。 ｐＵＣ８３８の制限部位と特徴を図１に示す。 １．２ ｐＳＣ１２の作製
て、約 ２００ｎｇの前記断片と １００ｎｇのＳｍａ
Ｉ 切断ｐＵＣ１８（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ら） を
Ｔ４リガーゼの存在下で連結せしめ、そしてこの連結混
合物を用いてＥ．コリＴＧ１を形質転換せしめる。 Ｘ−Ｇａｌ，ＩＰＴＧおよび １００ｍｇ／ｌのアンピ
シリンを含むＬＢ寒天プレートから白色コロニーを取り
出す。それらのプラスミドＤＮＡを単離・分析し、そし
てエリスロマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ寒天
プレート上で増殖する能力により正しいクローンを同定
する。得られたプラスミドをｐＵＣ８３８と命名する。 ｐＵＣ８３８の制限部位と特徴を図１に示す。 １．２ ｐＳＣ１２の作製
【０１１４】Ｌ．ラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）ＬＬ
７１２から単離したプール中のプラスミドを調製用アガ
ロースゲル上で分離する。下から二番目のＤＮＡバンド
は、２．５Ｍｄプラスミドのｃｃｃ型に相当する。その
バンドを切り出し、プラスミドを電気溶出させる。この
プラスミドをＳｐｈ Ｉ で消化し、そしてアガロース
ゲル電気泳動すると、２．５Ｍｄプラスミド中に単一の
またはごく近位の数個のＳｐｈ Ｉ 開裂部位があるこ
とを示す一本の３．５ｋｂｐ 断片が現われる。
７１２から単離したプール中のプラスミドを調製用アガ
ロースゲル上で分離する。下から二番目のＤＮＡバンド
は、２．５Ｍｄプラスミドのｃｃｃ型に相当する。その
バンドを切り出し、プラスミドを電気溶出させる。この
プラスミドをＳｐｈ Ｉ で消化し、そしてアガロース
ゲル電気泳動すると、２．５Ｍｄプラスミド中に単一の
またはごく近位の数個のＳｐｈ Ｉ 開裂部位があるこ
とを示す一本の３．５ｋｂｐ 断片が現われる。
【０１１５】ｐＵＣ８３８をユニークＳｐｈ Ｉ 部位
で切断し、子ウシ腸ホスファターゼで処理する。ホスフ
ァターゼ処理したベクター約５０ｎｇと２．５Ｍｄプラ
スミドの３．５ｋｂｐ Ｓｐｈ Ｉ 断片１５０ｎｇ
とをＴ４リガーゼにより連結せしめ、この連結混合物を
用いてコンピテントなＥ．コリＴＧ１細胞を形質転換せ
しめる。形質転換混合物を１ｍｌのＬＢ中で３７℃にて
９０分間増殖させ、次いで １００ｍｇ／ｌのエリスロ
マイシンを含む ２００ｍｌのＬＢに移し、３７℃で一
晩増殖させる。この培養物の細胞からプラスミドＤＮＡ
を調製し、約２μｇを用いてＬ．ラクチスＬＭ０２３０
を形質転換せしめる。形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ
０２３０細胞を、５ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含む
Ｍ−１７Ｇ 寒天プレート上で３０℃にて選択する。
で切断し、子ウシ腸ホスファターゼで処理する。ホスフ
ァターゼ処理したベクター約５０ｎｇと２．５Ｍｄプラ
スミドの３．５ｋｂｐ Ｓｐｈ Ｉ 断片１５０ｎｇ
とをＴ４リガーゼにより連結せしめ、この連結混合物を
用いてコンピテントなＥ．コリＴＧ１細胞を形質転換せ
しめる。形質転換混合物を１ｍｌのＬＢ中で３７℃にて
９０分間増殖させ、次いで １００ｍｇ／ｌのエリスロ
マイシンを含む ２００ｍｌのＬＢに移し、３７℃で一
晩増殖させる。この培養物の細胞からプラスミドＤＮＡ
を調製し、約２μｇを用いてＬ．ラクチスＬＭ０２３０
を形質転換せしめる。形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ
０２３０細胞を、５ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含む
Ｍ−１７Ｇ 寒天プレート上で３０℃にて選択する。
【０１１６】形質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０
細胞の幾つかのクローンからプラスミドＤＮＡを単離し
、そして制限酵素分析にかける。調べた全ての形質転換
体が８．０ｋｂｐ のプラスミドｐＳＣ１２ を含んで
おり、それから３．５ｋｂｐ のＳｐｈ Ｉ 挿入断片
を回収することができる。ｐＳＣ１２ の物理的地図を
図２に示す。
細胞の幾つかのクローンからプラスミドＤＮＡを単離し
、そして制限酵素分析にかける。調べた全ての形質転換
体が８．０ｋｂｐ のプラスミドｐＳＣ１２ を含んで
おり、それから３．５ｋｂｐ のＳｐｈ Ｉ 挿入断片
を回収することができる。ｐＳＣ１２ の物理的地図を
図２に示す。
【０１１７】ｐＳＣ１２ は、制限パターンに顕著な変
化を全く与えることなくＬ．ラクチスとＥ．コリとの間
で数回シャトルされる。 １．３ ｐＳＣ１８の作製
化を全く与えることなくＬ．ラクチスとＥ．コリとの間
で数回シャトルされる。 １．３ ｐＳＣ１８の作製
【０１１８】５００ｎｇアリコートのＤＮＡを様々な量
の制限酵素と共にインキュベートすることにより、Ｌ．
ラクチスＬＬ７１２ からのプラスミドプールＤＮＡを
Ｓａｕ３ＡＩで部分的に制限消化する。部分的に切断さ
れたＤＮＡを含む試料をアガロースゲル上で同定する。 このＤＮＡを、ユニークＢａｍＨ Ｉ部位で予め切断さ
れそして子ウシ腸ホスファターゼで処理されたｐＵＣ８
３８ベクターに連結せしめる。
の制限酵素と共にインキュベートすることにより、Ｌ．
ラクチスＬＬ７１２ からのプラスミドプールＤＮＡを
Ｓａｕ３ＡＩで部分的に制限消化する。部分的に切断さ
れたＤＮＡを含む試料をアガロースゲル上で同定する。 このＤＮＡを、ユニークＢａｍＨ Ｉ部位で予め切断さ
れそして子ウシ腸ホスファターゼで処理されたｐＵＣ８
３８ベクターに連結せしめる。
【０１１９】ｐＳＣ１２ について記載したのと同様に
して、Ｅ．コリＴＧ１の形質転換、プラスミドの単離お
よび次なるＬ．ラクチスＬＭ０２３０の形質転換を行う
。また、Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０形質転換体の幾つか
のクローンから単離されたプラスミドＤＮＡにおいて制
限消化を行う。それらは８．８ｋｂｐ のプラスミドｐ
ＳＣ１８ を有する。Ｌ．ラクチスとＥ．コリとの間で
プラスミドを数回シャトリングしても制限パターンに全
く変化を与えず、このことは２つの細胞タイプにおける
該構成物の安定性を示している。ｐＳＣ１８ の物理的
地図を図３に示す。 ２． ラクトコッカスの複製開始点の同定２．１ ｐ
ＳＣ１２とｐＳＣ１８ の欠失分析
して、Ｅ．コリＴＧ１の形質転換、プラスミドの単離お
よび次なるＬ．ラクチスＬＭ０２３０の形質転換を行う
。また、Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０形質転換体の幾つか
のクローンから単離されたプラスミドＤＮＡにおいて制
限消化を行う。それらは８．８ｋｂｐ のプラスミドｐ
ＳＣ１８ を有する。Ｌ．ラクチスとＥ．コリとの間で
プラスミドを数回シャトリングしても制限パターンに全
く変化を与えず、このことは２つの細胞タイプにおける
該構成物の安定性を示している。ｐＳＣ１８ の物理的
地図を図３に示す。 ２． ラクトコッカスの複製開始点の同定２．１ ｐ
ＳＣ１２とｐＳＣ１８ の欠失分析
【０１２０】ラクト
コッカス由来の複製開始点を担持しているプラスミドｐ
ＳＣ１２ とｐＳＣ１８ 上の領域を、次のような欠失
分析により限定する。
コッカス由来の複製開始点を担持しているプラスミドｐ
ＳＣ１２ とｐＳＣ１８ 上の領域を、次のような欠失
分析により限定する。
【０１２１】プラスミドを対応する制限酵素で切断し、
そしてＴ４リガーゼにより再環化せしめることにより、
適当な制限部位の間のＤＮＡを除去する。ｐＳＣ１２
およびｐＳＣ１８ における適当な制限酵素開裂部位の
位置をそれぞれ図２と図３および表１に示す。
そしてＴ４リガーゼにより再環化せしめることにより、
適当な制限部位の間のＤＮＡを除去する。ｐＳＣ１２
およびｐＳＣ１８ における適当な制限酵素開裂部位の
位置をそれぞれ図２と図３および表１に示す。
【０１２２】それぞれプラスミド ｐＳＣ１２および
ｐＳＣ１８のｐＵＣ１８ 部分の２つの ＰｖｕＩＩ部
位の間のＤＮＡを除去し、こうしてｃｏｌ Ｅ１由来の
複製開始点を除去することにより、 ｐＳＣ１２ΔＰ
および ｐＳＣ１８ΔＰ を作製する。
ｐＳＣ１８のｐＵＣ１８ 部分の２つの ＰｖｕＩＩ部
位の間のＤＮＡを除去し、こうしてｃｏｌ Ｅ１由来の
複製開始点を除去することにより、 ｐＳＣ１２ΔＰ
および ｐＳＣ１８ΔＰ を作製する。
【０１２３】ｐＳＣ１２ΔＮ と ｐＳＣ１８ΔＮ で
は、ｐＳＣ１２ または ｐＳＣ１８の小さい方のＮｄ
ｅ Ｉ 断片がそれぞれ除去されている。ｐＳＣ１２Δ
Ｒ は、 ｐＳＣ１２のラクトコッカスＤＮＡ中のＥｃ
ｏＲＶ 断片を欠く。ｐＳＣ１２ΔＮＰでは、ｐＵＣ
中の Ｐｖｕ ＩＩ 部位と ｐＳＣ１２のラクトコッ
カス部分のＮｄｅ Ｉ 部位との間のＤＮＡが除去され
ている。この場合、再連結前にベクターＤＮＡをクレノ
ウ酵素で平滑にする。ｐＳＣ１８の更なる誘導体 ｐＳ
Ｃ１８ΔＨ は、プラスミド中のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位
間のＤＮＡを欠く。
は、ｐＳＣ１２ または ｐＳＣ１８の小さい方のＮｄ
ｅ Ｉ 断片がそれぞれ除去されている。ｐＳＣ１２Δ
Ｒ は、 ｐＳＣ１２のラクトコッカスＤＮＡ中のＥｃ
ｏＲＶ 断片を欠く。ｐＳＣ１２ΔＮＰでは、ｐＵＣ
中の Ｐｖｕ ＩＩ 部位と ｐＳＣ１２のラクトコッ
カス部分のＮｄｅ Ｉ 部位との間のＤＮＡが除去され
ている。この場合、再連結前にベクターＤＮＡをクレノ
ウ酵素で平滑にする。ｐＳＣ１８の更なる誘導体 ｐＳ
Ｃ１８ΔＨ は、プラスミド中のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位
間のＤＮＡを欠く。
【０１２４】まず、エリスロマイシンに耐性であるＥ．
コリＴＧ１形質転換体から変異プラスミドＤＮＡを単離
する。次に、それらを用いてＬ．ラクチスＬＭ０２３０
をエリスロマイシン耐性に形質転換させることができる
かどうかをテストする。そうすることができないという
ことは、ラクトコッカスの複製開始点が欠失により除去
されたかまたは破壊されたことを示すと推測される。エ
リスロマイシン耐性形質転換体が得られた時、プラスミ
ドを再び単離し、制限分析によりその構造的無傷を再確
認する。
コリＴＧ１形質転換体から変異プラスミドＤＮＡを単離
する。次に、それらを用いてＬ．ラクチスＬＭ０２３０
をエリスロマイシン耐性に形質転換させることができる
かどうかをテストする。そうすることができないという
ことは、ラクトコッカスの複製開始点が欠失により除去
されたかまたは破壊されたことを示すと推測される。エ
リスロマイシン耐性形質転換体が得られた時、プラスミ
ドを再び単離し、制限分析によりその構造的無傷を再確
認する。
【０１２５】２．５Ｍｄと５．２Ｍｄのプラスミドの両
方について、ストレプトコッカス中での複製に必要とさ
れる領域を同定する。ΔＰ−誘導体がＥ．コリ中で複製
できるという事実から、クローン化されたラクトコッカ
ス複製開始点がグラム陰性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
中でも機能できるということは明らかである。それらの
実験結果を表１に示す。
方について、ストレプトコッカス中での複製に必要とさ
れる領域を同定する。ΔＰ−誘導体がＥ．コリ中で複製
できるという事実から、クローン化されたラクトコッカ
ス複製開始点がグラム陰性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
中でも機能できるということは明らかである。それらの
実験結果を表１に示す。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】１． 欠失は２つの制限部位間に及ぶ。
ｐＳＣ１２または ｐＳＣ１８における制限部位のお
よその位置は、位置（０）として定義されるプラスミド
のｐＵＣ８３８由来部分中のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位から
の距離としてカッコ内に示されている。それらは、それ
ぞれ図２および図３に示される塩基位置に関係する。２
． 欠失断片のｋｂｐ におけるおよその長さ。 ３． 測定せず。 ２．２ ラクトコッカス複製開始点の起源
よその位置は、位置（０）として定義されるプラスミド
のｐＵＣ８３８由来部分中のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位から
の距離としてカッコ内に示されている。それらは、それ
ぞれ図２および図３に示される塩基位置に関係する。２
． 欠失断片のｋｂｐ におけるおよその長さ。 ３． 測定せず。 ２．２ ラクトコッカス複製開始点の起源
【０１２８
】複製開始点を担持しているＤＮＡ断片についての単離
プロトコルから明らかなように、 ｐＳＣ１２中の複製
開始点はＬ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラス
ミドに由来する。制限酵素開裂パターンは、 ｐＳＣ１
８中の複製開始点が５．２Ｍｄプラスミドに由来するこ
とを示す。 ２．３ 別の乳酸菌ラクトコッカス中での ｐＳＣ１
２および ｐＳＣ１８の複製
】複製開始点を担持しているＤＮＡ断片についての単離
プロトコルから明らかなように、 ｐＳＣ１２中の複製
開始点はＬ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラス
ミドに由来する。制限酵素開裂パターンは、 ｐＳＣ１
８中の複製開始点が５．２Ｍｄプラスミドに由来するこ
とを示す。 ２．３ 別の乳酸菌ラクトコッカス中での ｐＳＣ１
２および ｐＳＣ１８の複製
【０１２９】Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．
ラクチスジアセチラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｄｉａ
ｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）およびＬ．クレモリス（Ｌ．ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）は、上記２つのプラスミドで好結果に
形質転換される。このプラスミドは、選択的圧力下で安
定して細胞集団と会合したままである。 ３． Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０の主要分泌産物（Ｍ
ＳＰ） をコードする遺伝子のクローニング ３．１ Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０の主要分泌タンパ
ク質（ＭＳＰ） の単離
ラクチスジアセチラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｄｉａ
ｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）およびＬ．クレモリス（Ｌ．ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）は、上記２つのプラスミドで好結果に
形質転換される。このプラスミドは、選択的圧力下で安
定して細胞集団と会合したままである。 ３． Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０の主要分泌産物（Ｍ
ＳＰ） をコードする遺伝子のクローニング ３．１ Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０の主要分泌タンパ
ク質（ＭＳＰ） の単離
【０１３０】Ｍ−１７Ｇ 中で３０℃にて増殖させたＬ
．ラクチスＬＭ０２３０の一晩培養物１．５リットルを
、Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローター中で４℃にて７０
００ｒｐｍ で２０分間遠心する。上清を収集し、同容
量の氷冷１０％トリクロロ酢酸を添加しそして室温で３
０分間インキュベートすることにより、タンパク質を沈
澱させる。Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローター中で４℃
にて８０００ｒｐｍ で３０分間遠心することにより沈
澱を収得する。タンパク質ペレットを流し出し、３ｍｌ
のＳＤＳ−試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）中
に再溶解させる。少量の４ＮＮａＯＨ を添加すること
により試料を中和し、次いで４リットルの２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．０２％ＳＤＳに対
して４時間透析する。回収した試料は約４ｍｌの容量を
有する。容量を６ｍｌに増やすために試料に３×濃ＳＤ
Ｓ−試料緩衝液を添加する。
．ラクチスＬＭ０２３０の一晩培養物１．５リットルを
、Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローター中で４℃にて７０
００ｒｐｍ で２０分間遠心する。上清を収集し、同容
量の氷冷１０％トリクロロ酢酸を添加しそして室温で３
０分間インキュベートすることにより、タンパク質を沈
澱させる。Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローター中で４℃
にて８０００ｒｐｍ で３０分間遠心することにより沈
澱を収得する。タンパク質ペレットを流し出し、３ｍｌ
のＳＤＳ−試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）中
に再溶解させる。少量の４ＮＮａＯＨ を添加すること
により試料を中和し、次いで４リットルの２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．０２％ＳＤＳに対
して４時間透析する。回収した試料は約４ｍｌの容量を
有する。容量を６ｍｌに増やすために試料に３×濃ＳＤ
Ｓ−試料緩衝液を添加する。
【０１３１】ＢｉｏＲａｄからのＰｒｏｔｅａｎ セル
を使って調製用８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（
Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）上で２ｍｌアリコートを泳
動することにより、タンパク質を分離する。ゲルから小
さいストリップを切りとり、クーマシーブリリアントブ
ルーで染色し、そして１０％メタノールと１０％酢酸を
含む水溶液中で脱色する。それらは、約５６ｋＤの見か
け分子量を有する主要タンパク質バンドを同定しそして
切り出すためのマーカーとして働く。このタンパク質を
ゲルから切り出す。
を使って調製用８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（
Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）上で２ｍｌアリコートを泳
動することにより、タンパク質を分離する。ゲルから小
さいストリップを切りとり、クーマシーブリリアントブ
ルーで染色し、そして１０％メタノールと１０％酢酸を
含む水溶液中で脱色する。それらは、約５６ｋＤの見か
け分子量を有する主要タンパク質バンドを同定しそして
切り出すためのマーカーとして働く。このタンパク質を
ゲルから切り出す。
【０１３２】Ｂｉｏｔｒａｐ 装置および２０ｍＭ酢酸
アンモニウムと０．０１％ＳＤＳを含む緩衝液を使って
１５０Ｖで２時間電気溶出させることにより、ＭＳＰ
タンパク質をゲルから回収する。２回交換する２０ｍＭ
酢酸アンモニウム、０．００５ ％ＳＤＳに対して４８
時間試料を透析する。透析したタンパク質の試料を８％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させると、約５６ｋＤの見か
け分子量を有する一本の鋭いタンパク質バンドが観察さ
れる。 ３．２ ＭＳＰのアミノ末端配列分析
アンモニウムと０．０１％ＳＤＳを含む緩衝液を使って
１５０Ｖで２時間電気溶出させることにより、ＭＳＰ
タンパク質をゲルから回収する。２回交換する２０ｍＭ
酢酸アンモニウム、０．００５ ％ＳＤＳに対して４８
時間試料を透析する。透析したタンパク質の試料を８％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させると、約５６ｋＤの見か
け分子量を有する一本の鋭いタンパク質バンドが観察さ
れる。 ３．２ ＭＳＰのアミノ末端配列分析
【０１３３】Ｍ
ＳＰタンパク質のアミノ末端配列分析は、気相シークエ
ネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ
ｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４７０Ａ）と共に、開裂されたア
ミノ酸残基のフェニルチオヒダントイン誘導体のＨＰＬ
Ｃ定量を使って、常法に従って実施する。
ＳＰタンパク質のアミノ末端配列分析は、気相シークエ
ネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ
ｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４７０Ａ）と共に、開裂されたア
ミノ酸残基のフェニルチオヒダントイン誘導体のＨＰＬ
Ｃ定量を使って、常法に従って実施する。
【０１３４】得られた長さ２８アミノ酸の配列は、Ｘ−
Ｘ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−
Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ である。”Ｘ” で表わされている最初の２つ
のアミノ酸と１５番目のアミノ酸は決定されなかった。 ３．３ 混合オリゴヌクレオチドプローブの合成
Ｘ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−
Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ である。”Ｘ” で表わされている最初の２つ
のアミノ酸と１５番目のアミノ酸は決定されなかった。 ３．３ 混合オリゴヌクレオチドプローブの合成
【０
１３５】ＭＳＰのＮ末端配列中の５〜１３位のアミノ酸
に相当するアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ を基に
して、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング用に混合オ
リゴヌクレオチドプローブを設計・作製する。プローブ
の複雑さを減らすために、遺伝暗号の縮重が４つの全て
のＮＴＰを要求するであろう２３−マー中の２つの位置
にイノシンを挿入する。オリゴヌクレオチド混合物のヌ
クレオチド配列はＧＡＮ１ＡＴＮ２ＧＣＩＡＡＮ３ＣＡ
Ｎ３ＧＡＮ１ＧＣＩＡＣである。Ｎ１ はＴまたはＣで
あり；Ｎ２ はＴ，ＣまたはＡであり；Ｎ３ はＡまた
はＧである。Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシチジン
、ＧはグアノシンそしてＩはイノシン塩基を有するヌク
レオチドを表わす。 ３．４ Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０のゲノムライブラ
リーの作製
１３５】ＭＳＰのＮ末端配列中の５〜１３位のアミノ酸
に相当するアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ を基に
して、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング用に混合オ
リゴヌクレオチドプローブを設計・作製する。プローブ
の複雑さを減らすために、遺伝暗号の縮重が４つの全て
のＮＴＰを要求するであろう２３−マー中の２つの位置
にイノシンを挿入する。オリゴヌクレオチド混合物のヌ
クレオチド配列はＧＡＮ１ＡＴＮ２ＧＣＩＡＡＮ３ＣＡ
Ｎ３ＧＡＮ１ＧＣＩＡＣである。Ｎ１ はＴまたはＣで
あり；Ｎ２ はＴ，ＣまたはＡであり；Ｎ３ はＡまた
はＧである。Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシチジン
、ＧはグアノシンそしてＩはイノシン塩基を有するヌク
レオチドを表わす。 ３．４ Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０のゲノムライブラ
リーの作製
【０１３６】プラスミドの単離に用いたプロ
トコルの変形により、Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０から染
色体ＤＮＡを単離する。即ち、リゾチームとムタノリシ
ンでの処理後、細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （
ｐＨ８） 、２０ｍＭ ＥＤＴＡ 、０．５％ＳＤＳ中
でプロテイナーゼＫ（１００ｍｇ／ｌ）と共に５６℃に
て２時間インキュベートする。フェノール／クロロホル
ム（１容：１容）を用いてＤＮＡを一回抽出し、次いで
ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離により精製する。
トコルの変形により、Ｌ．ラクチスＬＭ０２３０から染
色体ＤＮＡを単離する。即ち、リゾチームとムタノリシ
ンでの処理後、細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （
ｐＨ８） 、２０ｍＭ ＥＤＴＡ 、０．５％ＳＤＳ中
でプロテイナーゼＫ（１００ｍｇ／ｌ）と共に５６℃に
て２時間インキュベートする。フェノール／クロロホル
ム（１容：１容）を用いてＤＮＡを一回抽出し、次いで
ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離により精製する。
【０１３７】染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し
、そしてＭａｎｉａｔｉｓにより記載されたようにして
ショ糖勾配上でサイズ分別する。約１０−２０ｋｂｐ
の断片を集める。
、そしてＭａｎｉａｔｉｓにより記載されたようにして
ショ糖勾配上でサイズ分別する。約１０−２０ｋｂｐ
の断片を集める。
【０１３８】λＥＭＢＬ３ ＤＮＡをＢａｍＨ ＩとＥ
ｃｏＲ Ｉで開裂せしめ、フェノール抽出とエタノール
沈澱により精製する。 次いでそれを塩化ヘキサミンコバルト（ＩＩＩ） の存
在下で前記の１０−２０ｋｂｐ 断片と連結せしめ、コ
ンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の形成を助ける（
Ｒｕｓｃｈｅ Ｊ．Ｒ．ら、１９８５） 。Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅからのＧｉｇａｐａｃｋ Ｐｌｕｓ（商標）
システムを使って、連結混合物を試験管内パッケージ
ングする。
ｃｏＲ Ｉで開裂せしめ、フェノール抽出とエタノール
沈澱により精製する。 次いでそれを塩化ヘキサミンコバルト（ＩＩＩ） の存
在下で前記の１０−２０ｋｂｐ 断片と連結せしめ、コ
ンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の形成を助ける（
Ｒｕｓｃｈｅ Ｊ．Ｒ．ら、１９８５） 。Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅからのＧｉｇａｐａｃｋ Ｐｌｕｓ（商標）
システムを使って、連結混合物を試験管内パッケージ
ングする。
【０１３９】Ｅ．コリＱ３５９（Ｋａｈｎ Ｊ．ら、１
９８０） 上にライブラリーを塗布することにより組換
え体を選択する。全部で約６００，０００ の組換えフ
ァージが得られる。 ３．５ ＭＳＰをコードするＤＮＡ配列についてのラ
イブラリーのスクリーニング
９８０） 上にライブラリーを塗布することにより組換
え体を選択する。全部で約６００，０００ の組換えフ
ァージが得られる。 ３．５ ＭＳＰをコードするＤＮＡ配列についてのラ
イブラリーのスクリーニング
【０１４０】約１５，０００の組換えλＥＭＢＬ３ プ
ラークをペトリ皿（直径１５ｃｍ）一枚あたりに塗布し
、そしてＰｌａｑｕｅＳｃｒｅｅｎ（商標）膜（ＮＥＮ
）に移行させる。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記
載の標準手順に従って、Ｔ４キナーゼを使って ｒ３２
Ｐ ＡＴＰ で標識された実施例３．３に記載の混合オ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
により、フィルターをスクリーニングする。
ラークをペトリ皿（直径１５ｃｍ）一枚あたりに塗布し
、そしてＰｌａｑｕｅＳｃｒｅｅｎ（商標）膜（ＮＥＮ
）に移行させる。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記
載の標準手順に従って、Ｔ４キナーゼを使って ｒ３２
Ｐ ＡＴＰ で標識された実施例３．３に記載の混合オ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
により、フィルターをスクリーニングする。
【０１４１】陽性クローンを同定し、そして低いプラー
ク密度での２回目のスクリーニングにかける。
ク密度での２回目のスクリーニングにかける。
【０１４２】陽性ファージからＤＮＡを調製し、制限酵
素で消化し、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載のサザン分析にか
ける。サザンブロットを混合オリゴヌクレオチドにより
探索する。それは、陽性ファージのＬ．ラクチス挿入断
片中の３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片
にハイブリダイズする。更なる探索は、３．５ｋｂｐ
ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片中の２．１ｋｂｐ Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ断片がオリゴヌクレオチド混合物とハイ
ブリダイズすることを示した。
素で消化し、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載のサザン分析にか
ける。サザンブロットを混合オリゴヌクレオチドにより
探索する。それは、陽性ファージのＬ．ラクチス挿入断
片中の３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片
にハイブリダイズする。更なる探索は、３．５ｋｂｐ
ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片中の２．１ｋｂｐ Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ断片がオリゴヌクレオチド混合物とハイ
ブリダイズすることを示した。
【０１４３】３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ
断片のＥｃｏＲ Ｉ切断末端からの様々な制限部位の
およその距離を、各々の酵素および適当な酵素混合物で
の断片の消化後のアガロースゲル電気泳動により決定す
る。ＥｃｏＲ Ｉ切断末端は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位か
ら約０．５ｋｂｐ 離れて位置し、第二のＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ部位からは約２．６ｋｂｐ 、そして第三のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位からは約３．１５ｋｂｐ 離れて位置す
る。 ３．６ ｐＵＣＲＳの作製
断片のＥｃｏＲ Ｉ切断末端からの様々な制限部位の
およその距離を、各々の酵素および適当な酵素混合物で
の断片の消化後のアガロースゲル電気泳動により決定す
る。ＥｃｏＲ Ｉ切断末端は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位か
ら約０．５ｋｂｐ 離れて位置し、第二のＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ部位からは約２．６ｋｂｐ 、そして第三のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位からは約３．１５ｋｂｐ 離れて位置す
る。 ３．６ ｐＵＣＲＳの作製
【０１４４】陽性ファージからのＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉ
とＳａｌ Ｉで消化する。０．６％アガロースゲル上で
断片を分離し、３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ
Ｉ 断片を切り出し、そして電気溶出により単離する
。３倍モル過剰のこの断片を、ＥｃｏＲ ＩとＳａｌ
Ｉ で切断されそしてアルカリホスファターゼ処理され
たｐＵＣ１９ に連結せしめる。
とＳａｌ Ｉで消化する。０．６％アガロースゲル上で
断片を分離し、３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ
Ｉ 断片を切り出し、そして電気溶出により単離する
。３倍モル過剰のこの断片を、ＥｃｏＲ ＩとＳａｌ
Ｉ で切断されそしてアルカリホスファターゼ処理され
たｐＵＣ１９ に連結せしめる。
【０１４５】この連結混合物を用いてＥ．コリＴＧ１を
形質転換せしめ、 １００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含
むプレート上で形質転換体を選択する。形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製し、制限分析を行って正しい構
成物を同定し、これをｐＵＣＲＳ と命名する。
形質転換せしめ、 １００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含
むプレート上で形質転換体を選択する。形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製し、制限分析を行って正しい構
成物を同定し、これをｐＵＣＲＳ と命名する。
【０１４６】ｐＵＣＲＳ で形質転換されたＥ．コリＴ
Ｇ１は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ
ｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ） に寄託されている。 ３．７ 主要分泌産物（ＭＳＰ） 遺伝子の配列決定
Ｇ１は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ
ｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ） に寄託されている。 ３．７ 主要分泌産物（ＭＳＰ） 遺伝子の配列決定
【０１４７】配列決定は、ＵＳＢＣからのＳｅｑｕｅｎ
ａｓｅ（商標） を使ってチェーンターミネーション法
（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、１９７７） により行う。
ａｓｅ（商標） を使ってチェーンターミネーション法
（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、１９７７） により行う。
【０１４８】実施例３．６に記載のようにして調製した
３．５ｋｂｐＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片をＭ１３
ｍｐ１８ 中にサブクローニングする。生じたプラスミ
ドをＭ１３ｍｐ１８ＲＳ と命名する。 ３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片の２．
１ｋｂｐ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をＭ１３ｍｐ１９ 中
にサブクローニングし、生じたプラスミドをＭ１３ｍｐ
１９Ｈと命名する。ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ
とＳ１（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８４；Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ら、１９８５） で消化することに
より、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＳ 中の挿入断片のＳａｌ Ｉ
末端から１組の単一方向の欠失を生じさせる。欠失は
挿入断片中の約２ｋｂｐ に及ぶ。万能ｍｐ１８プライ
マーからのそれらの欠失の配列決定は、一本の鎖につい
ての配列情報を提供した。この配列に基づいて一組の合
成オリゴヌクレオチドを合成し、そしてもう一本の鎖を
配列決定するためのプライマーとして用いる。同じ方法
を用いてＭ１３ｍｐ１９Ｈから作られたｅｘｏ ＩＩＩ
−Ｓ１欠失体を配列決定することにより、追加の配列情
報を得る。３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ
断片の１９２０ｂｐ断片のＤＮＡ配列を配列表の配列番
号１のもとに記載する。それはＭＳＰプロモーター領域
の一部分、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列および成熟ＭＳＰの構造遺伝子を含んで成る。
３．５ｋｂｐＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片をＭ１３
ｍｐ１８ 中にサブクローニングする。生じたプラスミ
ドをＭ１３ｍｐ１８ＲＳ と命名する。 ３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ 断片の２．
１ｋｂｐ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をＭ１３ｍｐ１９ 中
にサブクローニングし、生じたプラスミドをＭ１３ｍｐ
１９Ｈと命名する。ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ
とＳ１（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８４；Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ら、１９８５） で消化することに
より、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＳ 中の挿入断片のＳａｌ Ｉ
末端から１組の単一方向の欠失を生じさせる。欠失は
挿入断片中の約２ｋｂｐ に及ぶ。万能ｍｐ１８プライ
マーからのそれらの欠失の配列決定は、一本の鎖につい
ての配列情報を提供した。この配列に基づいて一組の合
成オリゴヌクレオチドを合成し、そしてもう一本の鎖を
配列決定するためのプライマーとして用いる。同じ方法
を用いてＭ１３ｍｐ１９Ｈから作られたｅｘｏ ＩＩＩ
−Ｓ１欠失体を配列決定することにより、追加の配列情
報を得る。３．５ｋｂｐ ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ
断片の１９２０ｂｐ断片のＤＮＡ配列を配列表の配列番
号１のもとに記載する。それはＭＳＰプロモーター領域
の一部分、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列および成熟ＭＳＰの構造遺伝子を含んで成る。
【０１４９】長さ約２ｋｂｐ のＤＮＡ配列の分析は、
４６１ 個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコード
する単一の転写解読枠（ＯＲＦ） の存在を示した。推
定アミノ酸配列と単離されたＭＳＰのＮ末端の配列決定
から得られたデータとの比較は、２７アミノ酸により先
導される４３４ アミノ酸を有する成熟形のタンパク質
を同定した。先導アミノ酸により形成されるペプチドは
、典型的なシグナルペプチドの構造を有する。荷電アミ
ノ酸はＮ末端に見つかり、配列の残部は主に疎水性アミ
ノ酸から成る。開裂部位周辺のアミノ酸組成は、他のシ
グナルペプチドから推論される規則（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊ
ｎｅ，１９８３） に従う。 ４． ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）中での組換えデスルフェートヒ
ルジンの生産４．１ デスルフェートヒルジン分泌プ
ラスミドの作製
４６１ 個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコード
する単一の転写解読枠（ＯＲＦ） の存在を示した。推
定アミノ酸配列と単離されたＭＳＰのＮ末端の配列決定
から得られたデータとの比較は、２７アミノ酸により先
導される４３４ アミノ酸を有する成熟形のタンパク質
を同定した。先導アミノ酸により形成されるペプチドは
、典型的なシグナルペプチドの構造を有する。荷電アミ
ノ酸はＮ末端に見つかり、配列の残部は主に疎水性アミ
ノ酸から成る。開裂部位周辺のアミノ酸組成は、他のシ
グナルペプチドから推論される規則（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊ
ｎｅ，１９８３） に従う。 ４． ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）中での組換えデスルフェートヒ
ルジンの生産４．１ デスルフェートヒルジン分泌プ
ラスミドの作製
【０１５０】プラスミドＭ１３ｍｐ１９
Ｈは、シグナルペプチドを含むＭＳＰのＮ末端半分をコ
ードする２．１ｋｂｐ のＨｉｎｄ ＩＩＩ断片と約１
．５ｋｂｐ の上流ＤＮＡを含有する。このプラスミド
を、シグナルペプチドのＣＯＯＨ末端の１２９ｂｐ 下
流のユニークＳｃａＩ 部位で開裂せしめる。プラスミ
ドｐＭＬ３１０（ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−１６８
３４２に発表されている） からデスルフェートヒル
ジンの遺伝情報をコードしている平滑末端化された２１
１ｂｐ のＤＮＡ断片を単離し、そしてＭ１３ｍｐ１９
Ｈの開裂Ｓｃａ Ｉ 部位に挿入する。シグナルペプチ
ドの最後のアミノ酸（Ａｌａ） のコドンとデスルフェ
ートヒルジンの最初のアミノ酸（Ｖａｌ） のコドンと
を分離している過剰のＤＮＡを除去することにより、Ｍ
ＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とデスル
フェートヒルジン構造遺伝子との間のフレーム融合を造
成する。 これは、Ａｍｅｒｓｈａｍからの系を使ったオリゴヌク
レオチド指向試験管内突然変異誘発により達成される。 ２９ｂｐオリゴヌクレオチドは、シグナルペプチドの最
後の１４ｂｐとヒルジン遺伝子の最初の１５ｂｐを含ん
で成る。生じた融合配列を配列表の配列番号２のもとに
記載する。
Ｈは、シグナルペプチドを含むＭＳＰのＮ末端半分をコ
ードする２．１ｋｂｐ のＨｉｎｄ ＩＩＩ断片と約１
．５ｋｂｐ の上流ＤＮＡを含有する。このプラスミド
を、シグナルペプチドのＣＯＯＨ末端の１２９ｂｐ 下
流のユニークＳｃａＩ 部位で開裂せしめる。プラスミ
ドｐＭＬ３１０（ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−１６８
３４２に発表されている） からデスルフェートヒル
ジンの遺伝情報をコードしている平滑末端化された２１
１ｂｐ のＤＮＡ断片を単離し、そしてＭ１３ｍｐ１９
Ｈの開裂Ｓｃａ Ｉ 部位に挿入する。シグナルペプチ
ドの最後のアミノ酸（Ａｌａ） のコドンとデスルフェ
ートヒルジンの最初のアミノ酸（Ｖａｌ） のコドンと
を分離している過剰のＤＮＡを除去することにより、Ｍ
ＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とデスル
フェートヒルジン構造遺伝子との間のフレーム融合を造
成する。 これは、Ａｍｅｒｓｈａｍからの系を使ったオリゴヌク
レオチド指向試験管内突然変異誘発により達成される。 ２９ｂｐオリゴヌクレオチドは、シグナルペプチドの最
後の１４ｂｐとヒルジン遺伝子の最初の１５ｂｐを含ん
で成る。生じた融合配列を配列表の配列番号２のもとに
記載する。
【０１５１】融合部を有するＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を切
り出し、 ｐＳＣ１２のユニークＨｉｎｄ ＩＩＩ中に
挿入する。両方の配向の挿入断片を回収する。得られた
プラスミドをそれぞれｐＳＣ１２ＨＩＲおよびｐＳＣ１
２ＨＩＲ−１と命名する。
り出し、 ｐＳＣ１２のユニークＨｉｎｄ ＩＩＩ中に
挿入する。両方の配向の挿入断片を回収する。得られた
プラスミドをそれぞれｐＳＣ１２ＨＩＲおよびｐＳＣ１
２ＨＩＲ−１と命名する。
【０１５２】Ｅ．コリ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） の ｔ
ｒｐ Ａ転写ターミネーターをデスルフェートヒルジン
遺伝子の約１２５ｂｐ 下流にあるｐＳＣ１２ＨＩＲの
ユニークＨｐａ Ｉ 部位に挿入することにより、別の
プラスミド（ｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍ）を作製する。 ４．２ Ｌ．ラクチスによるデスルフェートヒルジン
の分泌
ｒｐ Ａ転写ターミネーターをデスルフェートヒルジン
遺伝子の約１２５ｂｐ 下流にあるｐＳＣ１２ＨＩＲの
ユニークＨｐａ Ｉ 部位に挿入することにより、別の
プラスミド（ｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍ）を作製する。 ４．２ Ｌ．ラクチスによるデスルフェートヒルジン
の分泌
【０１５３】デスルフェートヒルジン融合プラス
ミドをＬ．ラクチスＬＭ０２３０中に形質転換せしめる
。２％のグルコースが補足されたＭ−１７Ｇ培地中でエ
リスロマイシン（５ｍｇ／ｌ）の存在下において３０℃
にて形質転換体を増殖させる。培養物が安定期に達した
時、１．５ｍｌの試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）試
験管中で遠心分離する。培養上清を取り出し、−７０℃
にて凍結させる。次いで更に一晩培養物を増殖させた後
、第二の試料を取り、遠心し、上清を取り、同様に凍結
させる。バイオアッセイを用いて分泌されたデスルフェ
ートヒルジンの生産を測定する。
ミドをＬ．ラクチスＬＭ０２３０中に形質転換せしめる
。２％のグルコースが補足されたＭ−１７Ｇ培地中でエ
リスロマイシン（５ｍｇ／ｌ）の存在下において３０℃
にて形質転換体を増殖させる。培養物が安定期に達した
時、１．５ｍｌの試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）試
験管中で遠心分離する。培養上清を取り出し、−７０℃
にて凍結させる。次いで更に一晩培養物を増殖させた後
、第二の試料を取り、遠心し、上清を取り、同様に凍結
させる。バイオアッセイを用いて分泌されたデスルフェ
ートヒルジンの生産を測定する。
【０１５４】バイオアッセイは、収集した上清中のデス
ルフェートヒルジンのトロンビン阻害活性を測定する。 トロンビン阻害アッセイであるバイオアッセイの詳細な
プロトコルを下記に示す。
ルフェートヒルジンのトロンビン阻害活性を測定する。 トロンビン阻害アッセイであるバイオアッセイの詳細な
プロトコルを下記に示す。
【０１５５】あらゆる試料および試薬の希釈液を作製す
るのに使う緩衝液は、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．０
１％ウシ血清アルブミンを含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５である。トロンビンはヒト血漿からの
ものであり（Ｐｒｏｔｏｇｅｎ ＡＧ， Ｌａｕｆｅｌ
ｆｉｎｇｅｎ、商品番号 ８０−１３−１１０２）、色
素産生トロンビン基質はＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ ＴＨ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、商品番号
２０６８４９） である。 Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ Ｔ
Ｈから放出されるｐ−ニトロアニリンをＤｙｎａｔｅｃ
ｈ ＭＲ６００マイクロプレートリーダーで測定する。 全てのアッセイはマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ
，ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ ｐｌａｔｅ）中で行う。各ウエ
ルに、５０μｌの緩衝液、未知の濃度のトロンビン阻害
活性、即ちデスルフェートヒルジンを有する５０μｌの
上清、および２５μｌのトロンビン溶液を入れる。１５
０ μｌの基質溶液（３３０μｇ／ｍｌ）を添加するこ
とにより反応を開始し、そして３７℃にて２時間プレー
トをインキュベートする。未阻害の対照ウエルにおいて
は、Ａ４０５ｎｍ ＝０．８±０．２を与えるようにト
ロンビン濃度を調整する。基質とトロンビン溶液は共に
−２０℃で凍結保存し、使用直前に解凍する。既知の濃
度のｒ Ｔｙｒ６３ デスルフェートヒルジン（４０，
２０， １０，５， ２．５ および１．２５ｎｇ／
ｍｌ）を用いた標準曲線を使って、ＯＤ−測定値を活性
デスルフェートヒルジンの濃度に変換する。
るのに使う緩衝液は、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．０
１％ウシ血清アルブミンを含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５である。トロンビンはヒト血漿からの
ものであり（Ｐｒｏｔｏｇｅｎ ＡＧ， Ｌａｕｆｅｌ
ｆｉｎｇｅｎ、商品番号 ８０−１３−１１０２）、色
素産生トロンビン基質はＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ ＴＨ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、商品番号
２０６８４９） である。 Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ Ｔ
Ｈから放出されるｐ−ニトロアニリンをＤｙｎａｔｅｃ
ｈ ＭＲ６００マイクロプレートリーダーで測定する。 全てのアッセイはマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ
，ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ ｐｌａｔｅ）中で行う。各ウエ
ルに、５０μｌの緩衝液、未知の濃度のトロンビン阻害
活性、即ちデスルフェートヒルジンを有する５０μｌの
上清、および２５μｌのトロンビン溶液を入れる。１５
０ μｌの基質溶液（３３０μｇ／ｍｌ）を添加するこ
とにより反応を開始し、そして３７℃にて２時間プレー
トをインキュベートする。未阻害の対照ウエルにおいて
は、Ａ４０５ｎｍ ＝０．８±０．２を与えるようにト
ロンビン濃度を調整する。基質とトロンビン溶液は共に
−２０℃で凍結保存し、使用直前に解凍する。既知の濃
度のｒ Ｔｙｒ６３ デスルフェートヒルジン（４０，
２０， １０，５， ２．５ および１．２５ｎｇ／
ｍｌ）を用いた標準曲線を使って、ＯＤ−測定値を活性
デスルフェートヒルジンの濃度に変換する。
【０１５６】ｐＳＣ１２ＨＩＲ またはｐＳＣ１２ＨＩ
Ｒ−１のいずれかにより形質転換されたＬ．ラクチスＬ
Ｍ０２３０の細胞の安定期培養物の上清において、同じ
レベルのデスルフェートヒルジン活性が測定される。ｐ
ＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転換されたＬ．ラク
チスＬＭ０２３０細胞の安定期培養物の上清においては
、デスルフェートヒルジン活性のレベルが約５０％増加
する。対照として ｐＳＣ１２により形質転換された細
胞の上清は、全くデスルフェートヒルジン活性を有さな
い。
Ｒ−１のいずれかにより形質転換されたＬ．ラクチスＬ
Ｍ０２３０の細胞の安定期培養物の上清において、同じ
レベルのデスルフェートヒルジン活性が測定される。ｐ
ＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転換されたＬ．ラク
チスＬＭ０２３０細胞の安定期培養物の上清においては
、デスルフェートヒルジン活性のレベルが約５０％増加
する。対照として ｐＳＣ１２により形質転換された細
胞の上清は、全くデスルフェートヒルジン活性を有さな
い。
【０１５７】安定期培養物の約１６時間の長いインキュ
ベーション後でもデスルフェートヒルジンのレベルは増
加しなかった。それらの結果は、Ｌ．ラクチスＬＭ０２
３０の上清中のタンパク質分解がないことを示す。
ベーション後でもデスルフェートヒルジンのレベルは増
加しなかった。それらの結果は、Ｌ．ラクチスＬＭ０２
３０の上清中のタンパク質分解がないことを示す。
【０１５８】１つの実験において、まず遠心により細胞
を収得し、次いで１／１０容の新鮮培地中に再懸濁し、
そして３０分の発現期間の間３０℃にてインキュベート
する。 バイオアッセイは、上述の実験におけるよりも約６倍高
いレベルのデスルフェートヒルジン活性を測定する。よ
り精巧な形態では、発現期間の間の細胞の濃度が上清中
の分泌産物の濃度を増加させる方法である。 ５． バシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）中での組換えデスル
フェートヒルジンの生産５．１ プラスミド ｐＶＡ
ＨＩＲ の作製
を収得し、次いで１／１０容の新鮮培地中に再懸濁し、
そして３０分の発現期間の間３０℃にてインキュベート
する。 バイオアッセイは、上述の実験におけるよりも約６倍高
いレベルのデスルフェートヒルジン活性を測定する。よ
り精巧な形態では、発現期間の間の細胞の濃度が上清中
の分泌産物の濃度を増加させる方法である。 ５． バシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）中での組換えデスル
フェートヒルジンの生産５．１ プラスミド ｐＶＡ
ＨＩＲ の作製
【０１５９】プラスミド ｐＶＡ８３８
（Ｍａｃｒｉｎａ ら、１９８２） をＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで消化し、エリスロマイシン耐性遺伝子を有する５．
０ｋｂｐ 断片およびグラム陽性複製開始点を０．５％
アガロースゲルから電気溶出により単離する。同じ方法
でｐＳＣ１２ＨＩＲからデスルフェートヒルジン遺伝子
を含むＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を単離する。
（Ｍａｃｒｉｎａ ら、１９８２） をＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで消化し、エリスロマイシン耐性遺伝子を有する５．
０ｋｂｐ 断片およびグラム陽性複製開始点を０．５％
アガロースゲルから電気溶出により単離する。同じ方法
でｐＳＣ１２ＨＩＲからデスルフェートヒルジン遺伝子
を含むＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を単離する。
【０１６０】２つの断片をＴ４−リガーゼの存在下で連
結せしめ、その連結混合物を直接用いてエレクトロポレ
ーションによりＬ．ラクチスＬＭ０２３０を形質転換せ
しめる。 エリスロマイシン耐性形質転換体を選択し、それらから
プラスミドＤＮＡを調製する。
結せしめ、その連結混合物を直接用いてエレクトロポレ
ーションによりＬ．ラクチスＬＭ０２３０を形質転換せ
しめる。 エリスロマイシン耐性形質転換体を選択し、それらから
プラスミドＤＮＡを調製する。
【０１６１】それらのプラスミドの制限分析を行い、正
しい構成物を同定する。両方の配向のＨｉｎｄ ＩＩＩ
デスルフェート発現カセットが得られ、バシラス・スリ
ンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ）中でのデスルフェートヒルジンの生産に用い
ることができる。それらのプラスミドを ｐＶＡＨＩＲ
および ｐＶＡＨＩＲ−１ と命名する。 ５．２ Ｂ．スリンジェンシスによるデスルフェート
ヒルジンの分泌
しい構成物を同定する。両方の配向のＨｉｎｄ ＩＩＩ
デスルフェート発現カセットが得られ、バシラス・スリ
ンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ）中でのデスルフェートヒルジンの生産に用い
ることができる。それらのプラスミドを ｐＶＡＨＩＲ
および ｐＶＡＨＩＲ−１ と命名する。 ５．２ Ｂ．スリンジェンシスによるデスルフェート
ヒルジンの分泌
【０１６２】エレクトロポレーション（Ｗ．Ｓｃｈｕｒ
ｔｅｒ ら、１９８９） を使って ｐＶＡＨＩＲ に
よりＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ） 株ＨＤ１ ｃｒｙＢ（ＤＳＭ ４５７４）を
形質転換せしめる。
ｔｅｒ ら、１９８９） を使って ｐＶＡＨＩＲ に
よりＢ．スリンジェンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ） 株ＨＤ１ ｃｒｙＢ（ＤＳＭ ４５７４）を
形質転換せしめる。
【０１６３】２７℃または３０℃において２０μｇ／ｍ
ｌのエリスロマイシンを含むＬＢプレート上で形質転換
体を選択する。Ｌ．ラクチスに使用したものと同じ方法
により、個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
する。制限分析は、単離したプラスミドの構造が ｐＶ
ＡＨＩＲ と同一であることを再確認する。
ｌのエリスロマイシンを含むＬＢプレート上で形質転換
体を選択する。Ｌ．ラクチスに使用したものと同じ方法
により、個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
する。制限分析は、単離したプラスミドの構造が ｐＶ
ＡＨＩＲ と同一であることを再確認する。
【０１６４】ｐＶＡＨＩＲ または ｐＶＡ８３８（対
照として） を含有する形質転換体を、２０ｍｇ／ｌの
エリスロマイシンを含むＬＢ中で２７℃にて一晩増殖さ
せる。培養物を新鮮な培地中に希釈し、３０℃にて更に
増殖させる。培養物を遠心し、そして希釈の７時間後デ
スルフェートヒルジン活性について上清をアッセイする
。
照として） を含有する形質転換体を、２０ｍｇ／ｌの
エリスロマイシンを含むＬＢ中で２７℃にて一晩増殖さ
せる。培養物を新鮮な培地中に希釈し、３０℃にて更に
増殖させる。培養物を遠心し、そして希釈の７時間後デ
スルフェートヒルジン活性について上清をアッセイする
。
【０１６５】ｐＶＡＨＩＲ で形質転換された細胞の上
清中にはデスルフェートヒルジンが検出され、一方 ｐ
ＶＡ８３８ で形質転換された対照では全く測定されな
い。 寄託した微生物
清中にはデスルフェートヒルジンが検出され、一方 ｐ
ＶＡ８３８ で形質転換された対照では全く測定されな
い。 寄託した微生物
【０１６６】ブタペスト条約に従って、下記の微生物を
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔ
ｕｒｅｎ（ＤＳＭ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ
１ｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄
託した。
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔ
ｕｒｅｎ（ＤＳＭ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ
１ｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄
託した。
【０１６７】
微生物
寄託番号 寄託日Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＴＧ１／ｐＵＣＲＳ
ＤＳＭ５８０３ １９９０年２
月１６日Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＬＬ
７１２ ＤＳＭ５８０４
１９９０年２月１６日Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ ＬＭ０２３０ ＤＳＭ５８０４
１９９０年２月１６日
寄託番号 寄託日Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＴＧ１／ｐＵＣＲＳ
ＤＳＭ５８０３ １９９０年２
月１６日Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＬＬ
７１２ ＤＳＭ５８０４
１９９０年２月１６日Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ ＬＭ０２３０ ＤＳＭ５８０４
１９９０年２月１６日
【０１６８
】 参考文献 Ｂａｔｅｓ，Ｅ．Ｅ．Ｍ ら（１９８９）Ａｐｐｌｉｅ
ｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ５５，２０９５ 。Ｂｅｒｎｔｏｎ
，Ｗ．Ｄ．， およびＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．（１９７７
），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６ １８０。Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ，Ｈ．Ｃ． およびＤｏｌｙ，Ｊ．（１９７９）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３ 。 Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ． およびＳｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．
（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１１９３。Ｃｈ
ａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６，２９７。Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ
．およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．（１９６９）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２，１
１５９ 。Ｄａｖｉｅｓ，Ｆ．Ｌ．，Ｕｎｄｅｒｗｏｏ
ｄ，Ｈ．Ｍ．およびＧａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９８１
）Ｊ．ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ， ５１，３２５。Ｄｅ Ｖｏｓ，Ｗ．Ｍ．（１９８
７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６，２
８１。Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｊ．Ｄ． およびＭｃＫ
ａｙ，Ｌ．Ｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
， １３０，２５７ 。Ｇａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９
８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４，１ 。Ｇａ
ｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍ． およびＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｈ
．（１９８５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．，３０，１９３。 Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（１９８４）Ｇｅｎｅ，２８，
３５１。Ｊｏｓ，Ｍ．（１９８５）Ａｐｐｌｉｅｄ ａ
ｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ５０，５４０。Ｋａｒｎ，Ｊ．，Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ，Ｓ．，Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｌ．，およびＣｅｓａ
ｒｅｎｉ，Ｇ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５１７２ 。Ｌａｅｍｍ
ｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ， ２２７，
６８０ 。Ｍａｃｒｉｎａ，Ｆ．Ｌ．ら，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８２）
。Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．
およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 。Ｎｏ
ｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．ら（１９８３）Ｇｅｎｅ， ２６
，１０１。Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ． ら（１９８３）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１，５１０３ 。Ｐｏｗ
ｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖ
ｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
５４，６。Ｏｔｏ，Ｒ．ら（１９８２）Ａｐｐｌｉｅｄ
ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ４３，１２７２ 。Ｒｕｓｃｈｅ，Ｊ
．Ｒ． およびＨｏｗａｒｄｓ−Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ｐ
．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
， １３，１９９７ 。Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｍｉｌｋｅ
ｎ，Ｓ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．（１９７７）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５
４６３ 。Ｓｃｈｕｒｔｅｒ，Ｗ．，Ｇｅｉｓｅｒ，Ｍ
． およびＭａｔｈｅ，Ｄ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２１８，１７７。Ｔｅｒｚａｇｈｉ
，Ｂ．Ｋ． およびＳａｄｉｎｅ，Ｎ．Ｅ．（１９７５
）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２９，
８０７。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９８３）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３３，１７ 。Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．
およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ，
３３，１０３。Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ． およびＳｍｉ
ｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１００，４６８ 。
】 参考文献 Ｂａｔｅｓ，Ｅ．Ｅ．Ｍ ら（１９８９）Ａｐｐｌｉｅ
ｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ５５，２０９５ 。Ｂｅｒｎｔｏｎ
，Ｗ．Ｄ．， およびＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．（１９７７
），Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６ １８０。Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ，Ｈ．Ｃ． およびＤｏｌｙ，Ｊ．（１９７９）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３ 。 Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ． およびＳｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．
（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１１９３。Ｃｈ
ａｓｓｙ，Ｂ．Ｍ．（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６，２９７。Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ
．およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．（１９６９）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２，１
１５９ 。Ｄａｖｉｅｓ，Ｆ．Ｌ．，Ｕｎｄｅｒｗｏｏ
ｄ，Ｈ．Ｍ．およびＧａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９８１
）Ｊ．ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ， ５１，３２５。Ｄｅ Ｖｏｓ，Ｗ．Ｍ．（１９８
７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６，２
８１。Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｊ．Ｄ． およびＭｃＫ
ａｙ，Ｌ．Ｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
， １３０，２５７ 。Ｇａｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９
８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４，１ 。Ｇａ
ｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍ． およびＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｈ
．（１９８５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．，３０，１９３。 Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（１９８４）Ｇｅｎｅ，２８，
３５１。Ｊｏｓ，Ｍ．（１９８５）Ａｐｐｌｉｅｄ ａ
ｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ５０，５４０。Ｋａｒｎ，Ｊ．，Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ，Ｓ．，Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｌ．，およびＣｅｓａ
ｒｅｎｉ，Ｇ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５１７２ 。Ｌａｅｍｍ
ｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ， ２２７，
６８０ 。Ｍａｃｒｉｎａ，Ｆ．Ｌ．ら，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８２）
。Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．
およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 。Ｎｏ
ｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．ら（１９８３）Ｇｅｎｅ， ２６
，１０１。Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ． ら（１９８３）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１，５１０３ 。Ｐｏｗ
ｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖ
ｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
５４，６。Ｏｔｏ，Ｒ．ら（１９８２）Ａｐｐｌｉｅｄ
ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ４３，１２７２ 。Ｒｕｓｃｈｅ，Ｊ
．Ｒ． およびＨｏｗａｒｄｓ−Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ｐ
．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
， １３，１９９７ 。Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｍｉｌｋｅ
ｎ，Ｓ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．（１９７７）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５
４６３ 。Ｓｃｈｕｒｔｅｒ，Ｗ．，Ｇｅｉｓｅｒ，Ｍ
． およびＭａｔｈｅ，Ｄ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２１８，１７７。Ｔｅｒｚａｇｈｉ
，Ｂ．Ｋ． およびＳａｄｉｎｅ，Ｎ．Ｅ．（１９７５
）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２９，
８０７。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９８３）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３３，１７ 。Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．
およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ，
３３，１０３。Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ． およびＳｍｉ
ｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１００，４６８ 。
配列番号：１
配列の長さ：１９２０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起 源
生物名：ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） 株 名：ＬＭ０２３０ 直接の起源 クローン名：プラスミドｐＵＣＲＳ（ＤＳＭ ５８０５
） 配列の特徴 特徴を表す記号： ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置： １
．．４１０ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号： ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：
４１１．．４９１ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号： ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：
４９２．．１７９３ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ｌ．ラクチスの主要分泌産物（ＭＳＰ）遺伝
子配 列 ＴＴＴＡＧＧＴＡＴＴ ＴＡＣＧＧＡＡＴＴＧ Ｃ
ＧＡＣＣＴＴＡＴＴ ＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴ
４０ ＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴ ＴＴＧＴ
ＡＴＡＴＡＡ ＴＡＴＡＣＡＡＡＴＡ ＡＣＴＡＴＡＴ
ＴＴＡ ８０ ＣＴＡＡＴＣＧ
ＣＴＧ ＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴ ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡ
ＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴ １２０
ＧＡＣＣＧＣＴＴＴＴ ＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡ ＧＴ
ＧＣＡＡＴＣＡＴ ＴＡＴＧＡＣＡＧＣＴ
１６０ ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧ ＣＣＣＡＡ
ＣＴＴＣＡ ＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡ ＴＴＴＧＴＴＧＴ
ＴＴ ２００ ＡＣＣＡＧＴＴＡ
ＧＣ ＧＣＣＴＡＣＡＣＴＴ ＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡ
ＴＴＡＴＣＴＴＡＧＣ ２４０
ＴＧＴＡＧＣＣＴＴＡ ＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴ ＴＡＧ
ＡＡＡＴＣＴＴ ＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡ
２８０ ＡＡＧＡＡＡＡＧＴＣ ＡＴＧＴＡＡ
ＧＡＴＡ ＣＡＡＴＴＡＧＡＡＡ ＧＴＧＴＴＴＴＧＴ
Ａ ３２０ ＡＴＣＡＴＡＡＡＧ
Ａ ＡＡＴＡＴＴＡＡＧＧ ＴＧＧＧＧＴＡＧＧＡ Ａ
ＴＡＧＴＡＴＡＡＴ ３６０ Ａ
ＴＧＴＴＴＡＴＴＣ ＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴ ＡＡＴＧ
ＧＧＡＧＧＡ ＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡ
４００ ＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴ ＡＴＧ ＡＡＡ
ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＣＴ
４３４
Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ １
５ ＡＴＴ ＴＴＡ Ａ
ＴＧ ＴＣＴ ＡＣＡ ＧＴＧ ＡＴＡ ＣＴＴ ＴＣ
Ｔ ＧＣＴ ＧＣＡ ４６７ Ｉ
ｌｅ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ
１０ １５
ＧＣＣ ＣＣＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＴＴ Ｔ
ＡＣ ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＡＣ
５００ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓ
ｎ ２０
２５ ３０
ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＣＡＡ Ｇ
ＡＴ ＧＣＧ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＣＡ
５３３ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ ３５
４０ ＡＧＣ
ＧＣＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＣＡ Ｃ
ＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ５
６６ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌ
ｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ
４５
５０ ＣＡＡ ＧＴＴ ＧＡＴ
ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＴＴ Ｇ
ＡＣ ＡＧＣ ５９９ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ
５５ ６０
ＴＴＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＣＡ
ＡＧＴ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ
６３２ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇ
ｌｎ ６５
７０ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＴＣ
ＧＡＡ ＡＧＣ ＧＡＡ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＣＴＴ ６６５ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ ７５
８０
８５ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＴＴ
ＧＣＴ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＧＴ
ＡＴＣ ６９８ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
９０
１００ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＧＴ ＡＣＡ ＡＡＧ
ＡＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ
７３１ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ａｌａ １０５
１１０ ＣＧ
Ｔ ＡＧＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＧＣ
ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＡＴ
７６４ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ
１１５
１２０ ＴＡＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣ
Ｔ ＧＴＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＡＡ ＴＣＴ
ＴＴＧ ７９７ Ｔｙｒ Ｍｅ
ｔ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １２５
１３０
ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ
ＧＴＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＣＴ
８３０ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ａｌａ
１３５ １４０
１４５
ＡＣＴ ＧＴＴ ＴＣＴ
ＡＧＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＧ Ｔ
ＴＧ ＧＡＡ ８６３
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
１５０ １５
５ Ｃ
ＡＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＡ
Ａ ＧＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＣＡＡ
８９６ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
１６０
１６５
ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＴＴ
ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＡＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ
９２９ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ
１７０
１７５
ＴＴＣ ＧＴＴ
ＴＣＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＡＧＴ ＴＴＧ Ｇ
ＡＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ９６２
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
１８０
１８５
ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＣ
Ａ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣ
９９５ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ
１９０ １９５
２００
ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＣＧ
ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＣＡ
ＡＣＡ ＡＴＴ １０２８
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ
２０５ ２
１０
ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＡＴ ＡＡＡ Ａ
ＡＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＴＴＡ
１０６１ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ
２１５
２１０
ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＣ
Ａ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＣＴ
ＣＡＡ １０９４ Ａｓ
ｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ
２２５
２３０
ＧＡＡ
ＧＣＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＧＣＧ
ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＣＴ １
１２７ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ
２３５ ２４０
ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＡＡ Ｇ
ＣＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣ
Ｔ １１６０ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌ
ａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ
２４５
２５０ ２５５
ＴＣＡ ＡＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＣＴ
ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＣＡ １１９３
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ
２６０
２６５ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＣ
Ａ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ
ＡＧＴ ＣＡＡ １２２６
Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
２７０
２７５
ＧＣＴ Ｃ
ＣＡ ＣＡＡ ＧＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＧＣ ＡＣ
Ｔ ＧＡＴ ＡＡＴ ＡＣＡ １２５
９ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ
２８
０ ２８５
ＡＣＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＧＣＴ ＡＧＴ ＧＣＣ Ｔ
ＣＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＡＴ
１２９２ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ａｓｎ ２
９０ ２９５
ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＣＡ
ＡＧＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＧＣ ＡＧＴ
１３２５ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ
３００ ３０５
３１０
ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ
ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＧＴ ＡＡＴ
ＴＣＴ １３５８ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
３１５
３２０
ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＧ
Ｔ ＧＧＧ ＡＡＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ
ＡＣＴ ＡＧＴ １３９１
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
３２５
３３０
ＡＣＴ Ｇ
ＧＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＡＣ
Ｔ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ １４２
４ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
３３
５ ３４０
ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＴＡ ＡＡＴ ＡＧＴ ＴＣＡ Ｃ
ＣＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＡＡＴ ＣＣＴ
１４５７ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｐｒｏ ３
４５ ３５０
ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＧＡ
ＴＧＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＧＧ
１４９０ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖ
ａｌ Ｔｒｐ ３５
５ ３６０
３６５
ＣＡＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＣＴ Ｇ
ＣＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＧ
Ａ １５２３ Ｇｌｎ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ
３７０
３７５
ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＧ
ＣＣＴ ＧＧＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＡＡ Ｔ
ＧＧ ＧＣＴ １５５６ Ａｓ
ｎ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ
３８０
３８５
ＴＣＴ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＣＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＴＧ
ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＴＴ １５８９
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ
３９０
３９５
ＧＴ
Ａ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＴＴ
ＡＴＣ ＧＣＡ ＴＣＡ ＡＧＣ
１６２２ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ ４００
４０５
ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＴ
Ｔ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＣＡ ＡＡＣ ＴＣＡ
１６５５ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ ４１
０ ４１５
４２０
ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ Ｇ
ＴＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＴ
Ｔ １６８８ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ
４２５
４３０
ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ Ｇ
ＡＡ ＧＧＣ １７２１ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
４３５
４４０
ＧＧＡ ＴＡＴ
ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＧＡ
ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＧＴ １７５４
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｒ
ｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ
４４５
４５０
ＡＣ
Ｔ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＴＴ
ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ＡＴＧ
１７８７ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
４５５
４６０
ＣＣＡ ＡＡＣ ＴＡＧ ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＴ Ｔ
ＡＡＴＡＡＡＴＡＡ ＡＡＡＡＴＡＧＴＧＧ
１８２６ Ｐｒｏ Ａｓｎ
４６５
ＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧ ＧＧＧＡＡＴＡＡ
ＴＴ ＴＴＣＣＴＴＣＴＧＴ ＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴ
１８６６ ＴＴＴＡＴＴＡＴＴ
Ｇ ＴＧＧＴＡＴＡＡＴＡ ＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡ Ａ
ＴＧＡＴＡＡＧＧＧ １９０６
ＧＡＴＡＧＡＴＡＣＡ ＡＡＴＧ
１９２０ 配列番号：２ 配列の長さ：２７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：他の核酸 組換えＤＮＡ起 源 生物名：ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） 株 名：ＬＭ０２３０ 生物名：ヒルド・メディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌｉｓ） 直接の起源 クローン名：プラスミドｐＵＣＲＳ（ ＤＳＭ ５８０
５）、プラスミドｐＭＬ３１０ （ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−１６８ ３４２参照）
配列の特徴 特徴を表す記号： ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：
１．．８１ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置： ８２．．２７９ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：細菌中での分泌ヒルジンの生産のためのＭＳ
ＰシグナルペプチドをコードするＬ．ラクチスＬＭ０２
３０ＤＮＡ とヒルジン構造遺伝子との融合 配列
ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ
ＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＴＴ
Ａ ＡＴＧ ＴＣＴ ３６ Ｍｅｔ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
−２５
−２０
ＡＣＡ ＧＴＧ
ＡＴＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ Ｃ
ＣＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ７２
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
−１５
−１０ −５
ＧＴＴ
ＴＡＣ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＣＣ
ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＧＡＡ ＴＣＴ
１０８ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａ
ｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ
１ ５
ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＴＧ
ＴＧＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＡＣ ＧＴＴ
１４４ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ａｓｎ Ｖａｌ １０
１５
２０
ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ
Ｃ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＣＴ
ＧＡＣ １８０ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ
２５
３０
ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ Ａ
ＡＣ ＣＡＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＣＣ ＧＧＣ ＧＡ
Ａ ＧＧＴ ＡＣＣ ２１６ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
３５
４０
４５ ＣＣＧ ＡＡＡ
ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＡＣ ＧＡＣ Ｇ
ＧＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ２５２
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
５０ ５５
ＧＡＡ Ａ
ＴＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡ
Ｇ ＴＡＧ ２７
９ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
６
０ ６５
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） 株 名：ＬＭ０２３０ 直接の起源 クローン名：プラスミドｐＵＣＲＳ（ＤＳＭ ５８０５
） 配列の特徴 特徴を表す記号： ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置： １
．．４１０ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号： ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：
４１１．．４９１ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号： ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：
４９２．．１７９３ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ｌ．ラクチスの主要分泌産物（ＭＳＰ）遺伝
子配 列 ＴＴＴＡＧＧＴＡＴＴ ＴＡＣＧＧＡＡＴＴＧ Ｃ
ＧＡＣＣＴＴＡＴＴ ＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴ
４０ ＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴ ＴＴＧＴ
ＡＴＡＴＡＡ ＴＡＴＡＣＡＡＡＴＡ ＡＣＴＡＴＡＴ
ＴＴＡ ８０ ＣＴＡＡＴＣＧ
ＣＴＧ ＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴ ＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡ
ＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴ １２０
ＧＡＣＣＧＣＴＴＴＴ ＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡ ＧＴ
ＧＣＡＡＴＣＡＴ ＴＡＴＧＡＣＡＧＣＴ
１６０ ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧ ＣＣＣＡＡ
ＣＴＴＣＡ ＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡ ＴＴＴＧＴＴＧＴ
ＴＴ ２００ ＡＣＣＡＧＴＴＡ
ＧＣ ＧＣＣＴＡＣＡＣＴＴ ＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡ
ＴＴＡＴＣＴＴＡＧＣ ２４０
ＴＧＴＡＧＣＣＴＴＡ ＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴ ＴＡＧ
ＡＡＡＴＣＴＴ ＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡ
２８０ ＡＡＧＡＡＡＡＧＴＣ ＡＴＧＴＡＡ
ＧＡＴＡ ＣＡＡＴＴＡＧＡＡＡ ＧＴＧＴＴＴＴＧＴ
Ａ ３２０ ＡＴＣＡＴＡＡＡＧ
Ａ ＡＡＴＡＴＴＡＡＧＧ ＴＧＧＧＧＴＡＧＧＡ Ａ
ＴＡＧＴＡＴＡＡＴ ３６０ Ａ
ＴＧＴＴＴＡＴＴＣ ＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴ ＡＡＴＧ
ＧＧＡＧＧＡ ＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡ
４００ ＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴ ＡＴＧ ＡＡＡ
ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＣＴ
４３４
Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ １
５ ＡＴＴ ＴＴＡ Ａ
ＴＧ ＴＣＴ ＡＣＡ ＧＴＧ ＡＴＡ ＣＴＴ ＴＣ
Ｔ ＧＣＴ ＧＣＡ ４６７ Ｉ
ｌｅ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ
１０ １５
ＧＣＣ ＣＣＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＴＴ Ｔ
ＡＣ ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＡＣ
５００ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓ
ｎ ２０
２５ ３０
ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＣＡＡ Ｇ
ＡＴ ＧＣＧ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＣＡ
５３３ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ ３５
４０ ＡＧＣ
ＧＣＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＣＡ Ｃ
ＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ５
６６ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌ
ｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ
４５
５０ ＣＡＡ ＧＴＴ ＧＡＴ
ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＴＴ Ｇ
ＡＣ ＡＧＣ ５９９ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ
５５ ６０
ＴＴＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＣＡ
ＡＧＴ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ
６３２ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇ
ｌｎ ６５
７０ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＴＣ
ＧＡＡ ＡＧＣ ＧＡＡ ＣＧＴ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＣＴＴ ６６５ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ ７５
８０
８５ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＴＴ
ＧＣＴ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＧＴ
ＡＴＣ ６９８ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ
９０
１００ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＧＴ ＡＣＡ ＡＡＧ
ＡＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ
７３１ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ａｌａ １０５
１１０ ＣＧ
Ｔ ＡＧＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＧＣ
ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＡＴ
７６４ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ
１１５
１２０ ＴＡＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣ
Ｔ ＧＴＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＡＡ ＴＣＴ
ＴＴＧ ７９７ Ｔｙｒ Ｍｅ
ｔ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １２５
１３０
ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ
ＧＴＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＣＴ
８３０ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ａｌａ
１３５ １４０
１４５
ＡＣＴ ＧＴＴ ＴＣＴ
ＡＧＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＧ Ｔ
ＴＧ ＧＡＡ ８６３
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
１５０ １５
５ Ｃ
ＡＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＡ
Ａ ＧＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＣＡＡ
８９６ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
１６０
１６５
ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＴＴ
ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＡＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ
９２９ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ
１７０
１７５
ＴＴＣ ＧＴＴ
ＴＣＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＡＧＴ ＴＴＧ Ｇ
ＡＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ９６２
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
１８０
１８５
ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＣ
Ａ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣ
９９５ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ
１９０ １９５
２００
ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＣＧ
ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＣＡ
ＡＣＡ ＡＴＴ １０２８
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ
２０５ ２
１０
ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＡＴ ＡＡＡ Ａ
ＡＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＴＴＡ
１０６１ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ
２１５
２１０
ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＣ
Ａ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＣＴ
ＣＡＡ １０９４ Ａｓ
ｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ
２２５
２３０
ＧＡＡ
ＧＣＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＧＣＧ
ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＡＡ ＧＣＴ １
１２７ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ
２３５ ２４０
ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＡＡ Ｇ
ＣＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣ
Ｔ １１６０ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌ
ａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ
２４５
２５０ ２５５
ＴＣＡ ＡＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＣＴ
ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＣＡ １１９３
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ
２６０
２６５ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＣ
Ａ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ
ＡＧＴ ＣＡＡ １２２６
Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
２７０
２７５
ＧＣＴ Ｃ
ＣＡ ＣＡＡ ＧＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＧＣ ＡＣ
Ｔ ＧＡＴ ＡＡＴ ＡＣＡ １２５
９ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ
２８
０ ２８５
ＡＣＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＧＣＴ ＡＧＴ ＧＣＣ Ｔ
ＣＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＡＴ
１２９２ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ａｓｎ ２
９０ ２９５
ＡＧＴ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＣＡ
ＡＧＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＧＣ ＡＧＴ
１３２５ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ
３００ ３０５
３１０
ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ
ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＧＴ ＡＡＴ
ＴＣＴ １３５８ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ
３１５
３２０
ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＧ
Ｔ ＧＧＧ ＡＡＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ
ＡＣＴ ＡＧＴ １３９１
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
３２５
３３０
ＡＣＴ Ｇ
ＧＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＡＣ
Ｔ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ １４２
４ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
３３
５ ３４０
ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＴＡ ＡＡＴ ＡＧＴ ＴＣＡ Ｃ
ＣＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＡＡＴ ＣＣＴ
１４５７ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｐｒｏ ３
４５ ３５０
ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＧＡ
ＴＧＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＧＧ
１４９０ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｖ
ａｌ Ｔｒｐ ３５
５ ３６０
３６５
ＣＡＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＣＴ Ｇ
ＣＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＧ
Ａ １５２３ Ｇｌｎ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｒｇ
３７０
３７５
ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＴＧ
ＣＣＴ ＧＧＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＣＡＡ Ｔ
ＧＧ ＧＣＴ １５５６ Ａｓ
ｎ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ
３８０
３８５
ＴＣＴ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＣＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＴＧ
ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＴＴ １５８９
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ
３９０
３９５
ＧＴ
Ａ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＴＴ
ＡＴＣ ＧＣＡ ＴＣＡ ＡＧＣ
１６２２ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ ４００
４０５
ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＴ
Ｔ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＣＡ ＡＡＣ ＴＣＡ
１６５５ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ ４１
０ ４１５
４２０
ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ Ｇ
ＴＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＴ
Ｔ １６８８ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ
４２５
４３０
ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ Ｇ
ＡＡ ＧＧＣ １７２１ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
４３５
４４０
ＧＧＡ ＴＡＴ
ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＧＡ
ＣＡＴ ＧＡＡ ＣＧＴ １７５４
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｒ
ｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ
４４５
４５０
ＡＣ
Ｔ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＴＴ
ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ＡＴＧ
１７８７ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｈｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
４５５
４６０
ＣＣＡ ＡＡＣ ＴＡＧ ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＴ Ｔ
ＡＡＴＡＡＡＴＡＡ ＡＡＡＡＴＡＧＴＧＧ
１８２６ Ｐｒｏ Ａｓｎ
４６５
ＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧ ＧＧＧＡＡＴＡＡ
ＴＴ ＴＴＣＣＴＴＣＴＧＴ ＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴ
１８６６ ＴＴＴＡＴＴＡＴＴ
Ｇ ＴＧＧＴＡＴＡＡＴＡ ＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡ Ａ
ＴＧＡＴＡＡＧＧＧ １９０６
ＧＡＴＡＧＡＴＡＣＡ ＡＡＴＧ
１９２０ 配列番号：２ 配列の長さ：２７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：他の核酸 組換えＤＮＡ起 源 生物名：ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） 株 名：ＬＭ０２３０ 生物名：ヒルド・メディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌｉｓ） 直接の起源 クローン名：プラスミドｐＵＣＲＳ（ ＤＳＭ ５８０
５）、プラスミドｐＭＬ３１０ （ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−１６８ ３４２参照）
配列の特徴 特徴を表す記号： ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：
１．．８１ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置： ８２．．２７９ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：細菌中での分泌ヒルジンの生産のためのＭＳ
ＰシグナルペプチドをコードするＬ．ラクチスＬＭ０２
３０ＤＮＡ とヒルジン構造遺伝子との融合 配列
ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ
ＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＡＴＴ ＴＴ
Ａ ＡＴＧ ＴＣＴ ３６ Ｍｅｔ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
−２５
−２０
ＡＣＡ ＧＴＧ
ＡＴＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ Ｃ
ＣＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ７２
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
−１５
−１０ −５
ＧＴＴ
ＴＡＣ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＣＣ
ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＧＡＡ ＴＣＴ
１０８ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａ
ｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ
１ ５
ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＴＧ
ＴＧＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＡＣ ＧＴＴ
１４４ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ａｓｎ Ｖａｌ １０
１５
２０
ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ
Ｃ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＣＴ
ＧＡＣ １８０ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ
２５
３０
ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ Ａ
ＡＣ ＣＡＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＣＣ ＧＧＣ ＧＡ
Ａ ＧＧＴ ＡＣＣ ２１６ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
３５
４０
４５ ＣＣＧ ＡＡＡ
ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＡＣ ＧＡＣ Ｇ
ＧＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ２５２
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
５０ ５５
ＧＡＡ Ａ
ＴＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡ
Ｇ ＴＡＧ ２７
９ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
６
０ ６５
【図１】プラスミドｐＵＣ８３８の物理的地図を示した
図である。地図位置はおよそであり、ｋｂｐ で与えら
れている。 ｐＵＣ１８ 部分は地図位置０から２．７までに及び、
そしてエリスロマイシン耐性遺伝子を担持している ｐ
ＶＡ８３８ 部分は地図位置２．７から４．４までであ
る。丸括弧内に示された制限部位は、組換え分子の調製
中に破壊された。略語の意味は次の通りである： ａｍ
ｐｒ ＝アンピシリン耐性遺伝子； ｅｒｙｒ ＝エリ
スロマイシン耐性遺伝子； ｏｒｉｐｕｃ ＝ｐＵＣ１
８ 由来の複製開始点。
図である。地図位置はおよそであり、ｋｂｐ で与えら
れている。 ｐＵＣ１８ 部分は地図位置０から２．７までに及び、
そしてエリスロマイシン耐性遺伝子を担持している ｐ
ＶＡ８３８ 部分は地図位置２．７から４．４までであ
る。丸括弧内に示された制限部位は、組換え分子の調製
中に破壊された。略語の意味は次の通りである： ａｍ
ｐｒ ＝アンピシリン耐性遺伝子； ｅｒｙｒ ＝エリ
スロマイシン耐性遺伝子； ｏｒｉｐｕｃ ＝ｐＵＣ１
８ 由来の複製開始点。
【図２】プラスミド ｐＳＣ１２の物理的地図を示した
図である。地図位置はおよそであり、ｋｂｐ で与えら
れている。 ｐＵＣ１８ ＤＮＡは地図位置０から２．７までであ
る。 ｐＶＡ８３８ の１．７ｋｂｐ エリスロマイシ
ン耐性担持断片は、位置２．７から４．４までに及ぶ。 Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）２．５Ｍｄプラスミ
ド由来の挿入断片は、位置４．４から８．０／０までに
及ぶ。丸括弧内に示された制限部位は、組換え分子の調
製中に破壊された。略語の意味は次の通りである：ＰＬ
１＝ＥｃｏＲ Ｉから（Ｓｍａ Ｉ） 部位までのｐ
ＵＣ ポリリンカー領域；ＰＬ ２＝（Ｓｍａ Ｉ）
からＳｐｈ Ｉ 部位までのｐＵＣ ポリリンカー領域
；ａｍｐ ｒ ＝アンピシリン耐性遺伝子； ｅｒｙｒ
＝エリスロマイシン耐性遺伝子； ｏｒｉｐｕｃ ＝
ｐＵＣ 由来の複製開始点；ｏｒｉ１１ ＝欠失分析か
ら導かれたラクトコッカス２．５Ｍｄプラスミド由来の
複製開始点。
図である。地図位置はおよそであり、ｋｂｐ で与えら
れている。 ｐＵＣ１８ ＤＮＡは地図位置０から２．７までであ
る。 ｐＶＡ８３８ の１．７ｋｂｐ エリスロマイシ
ン耐性担持断片は、位置２．７から４．４までに及ぶ。 Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）２．５Ｍｄプラスミ
ド由来の挿入断片は、位置４．４から８．０／０までに
及ぶ。丸括弧内に示された制限部位は、組換え分子の調
製中に破壊された。略語の意味は次の通りである：ＰＬ
１＝ＥｃｏＲ Ｉから（Ｓｍａ Ｉ） 部位までのｐ
ＵＣ ポリリンカー領域；ＰＬ ２＝（Ｓｍａ Ｉ）
からＳｐｈ Ｉ 部位までのｐＵＣ ポリリンカー領域
；ａｍｐ ｒ ＝アンピシリン耐性遺伝子； ｅｒｙｒ
＝エリスロマイシン耐性遺伝子； ｏｒｉｐｕｃ ＝
ｐＵＣ 由来の複製開始点；ｏｒｉ１１ ＝欠失分析か
ら導かれたラクトコッカス２．５Ｍｄプラスミド由来の
複製開始点。
【図３】プラスミド ｐＳＣ１８の物理的地図を示した
図である。地図位置はおよそであり、ｋｂｐ で与えら
れている。 ｐＵＣ１８ ＤＮＡは地図位置０から２．７までであ
る。 ｐＶＡ８３８ の１．７ｋｂｐ エリスロマイシ
ン耐性担持断片は、位置２．７から４．４までに及ぶ。 Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）５．２Ｍｄプラスミ
ド由来の挿入断片は、位置４．４から８．５／０までに
及ぶ。丸括弧内に示された制限部位は、組換え分子の調
製中に破壊された。略語の意味は次の通りである：ＰＬ
１＝ＥｃｏＲ Ｉから（Ｓｍａ Ｉ） 部位までのｐ
ＵＣ ポリリンカー領域；ＰＬ ２＝（ＢａｍＨＩ）
からＨｉｎｄ ＩＩＩ部位までのｐＵＣ ポリリンカー
領域；ａｍｐｒ ＝アンピシリン耐性遺伝子； ｅｒｙ
ｒ ＝エリスロマイシン耐性遺伝子； ｏｒｉｐｕｃ
＝ｐＵＣ 由来の複製開始点；ｏｒｉ１２ ＝欠失分析
から導かれたラクトコッカス５．２Ｍｄプラスミド由来
の複製開始点。
図である。地図位置はおよそであり、ｋｂｐ で与えら
れている。 ｐＵＣ１８ ＤＮＡは地図位置０から２．７までであ
る。 ｐＶＡ８３８ の１．７ｋｂｐ エリスロマイシ
ン耐性担持断片は、位置２．７から４．４までに及ぶ。 Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）５．２Ｍｄプラスミ
ド由来の挿入断片は、位置４．４から８．５／０までに
及ぶ。丸括弧内に示された制限部位は、組換え分子の調
製中に破壊された。略語の意味は次の通りである：ＰＬ
１＝ＥｃｏＲ Ｉから（Ｓｍａ Ｉ） 部位までのｐ
ＵＣ ポリリンカー領域；ＰＬ ２＝（ＢａｍＨＩ）
からＨｉｎｄ ＩＩＩ部位までのｐＵＣ ポリリンカー
領域；ａｍｐｒ ＝アンピシリン耐性遺伝子； ｅｒｙ
ｒ ＝エリスロマイシン耐性遺伝子； ｏｒｉｐｕｃ
＝ｐＵＣ 由来の複製開始点；ｏｒｉ１２ ＝欠失分析
から導かれたラクトコッカス５．２Ｍｄプラスミド由来
の複製開始点。
Claims (42)
- 【請求項１】 ハイブリッドベクターであって、ａ）
プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ
Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）
挿入断片、もしくはそれの機能性断片；または ｂ）前記挿入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリ
ダイズするか、またはそのようなハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列に天然に作用可能に連結しているプロモーター
領域を含んで成るＤＮＡ配列；または ｃ）ａ）またはｂ）の中に含まれそしてシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の縮重配列；またはｄ）ａ）
，ｂ）またはｃ）の中に含まれるＤＮＡ分子の誘導体；
および／または ｅ）（Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラ
スミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．
２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの複製開始点、を
含んで成るハイブリッドベクター。 - 【請求項２】 プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋ
ｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入
断片またはそれの機能性断片を含んで成る、請求項１に
記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項３】 前記機能性断片がプロモーター、シグ
ナルおよび／または構造機能を保持している、請求項１
に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項４】 前記機能性断片がＭＳＰプロモーター
機能を保持している、請求項３に記載のハイブリッドベ
クター。 - 【請求項５】 プロモーター機能を保持している機能
性断片が、プレ−ＭＳＰ配列の出発コドンからＭＳＰ遺
伝子の約−１５００位の塩基までに及ぶ、請求項４に記
載のハイブリッドベクター。 - 【請求項６】 プロモーター機能を保持している機能
性断片が、プレ−ＭＳＰ配列の出発コドンからＭＳＰ遺
伝子の約−１００ 〜−１０００位の塩基までに及ぶ、
請求項５に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項７】 前記機能性断片がＭＳＰシグナル配列
の機能を保持している、請求項３に記載のハイブリッド
ベクター。 - 【請求項８】 ＭＳＰシグナル機能を保持している機
能性断片が長さ２７アミノ酸のＭＳＰシグナル配列をコ
ードする、請求項７に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項９】 ＭＳＰシグナル機能を保持している機
能性断片が、配列番号１を有するＤＮＡ配列の約 ４１
１位の塩基から約 ４９１位の塩基までに及ぶ、請求項
７に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項１０】 前記機能性断片がＭＳＰプロモータ
ー機能とＭＳＰシグナル配列の機能を保持している、請
求項３に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項１１】 ＭＳＰプロモーター機能とＭＳＰシ
グナル配列の機能の両方を保持している機能性断片が、
プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ
Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿入断片のＥｃｏＲ
Ｉ切断末端と配列番号１を有するＤＮＡ配列の１位に相
当する塩基の上流の前記挿入断片中に存在する最初のＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ制限部位との間の任意の塩基から配列番
号１を有するＤＮＡ配列の ４９１位に相当する塩基付
近までに及ぶ断片の群から選択される、請求項１０に記
載のハイブリッドベクター。 - 【請求項１２】 前記機能性断片がＭＳＰ構造遺伝子
の機能を保持している、請求項３に記載のハイブリッド
ベクター。 - 【請求項１３】 ＭＳＰ構造遺伝子の機能を保持して
いる機能性断片が、配列番号１を有するＤＮＡ配列の約
４９２位の塩基から約１７９３位の塩基までに及ぶ、
請求項１２に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項１４】 プラスミドｐＵＣＲＳ の約３．５
ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス挿
入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリダイズする
か、またはそのようなハイブリダイズするＤＮＡ配列に
天然に作用可能に連結しているプロモーター領域を含む
ＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１に記載のハイブリッ
ドベクター。 - 【請求項１５】 ＭＳＰ遺伝子に関連する遺伝子もし
くはそれの機能性断片またはＭＳＰ遺伝子に関連する遺
伝子のプロモーター領域をコードするＤＮＡ配列を含ん
で成る、請求項１４に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項１６】 ＭＳＰのシグナルペプチドまたは関
連するペプチドをコードし且つ請求項１ａ）または１ｂ
）に記載のＤＮＡ配列に対する遺伝暗号の意味に関して
縮重しているＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１に記載
のハイブリッドベクター。 - 【請求項１７】 請求項１ａ），１ｂ）または１ｃ）
に記載のＤＮＡ分子の誘導体を含んで成る、請求項１に
記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項１８】 （Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の
２．５Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ
７１２ の５．２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．
ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは
５．２Ｍｄプラスミドと同じ不和合性群のプラスミドの
複製開始点を含んで成る、請求項１に記載のハイブリッ
ドベクター。 - 【請求項１９】 Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５
Ｍｄプラスミドの約１．８ｋｂｐ のＮｄｅ Ｉ ／Ｓ
ｐｈ Ｉ 断片上に置かれた複製開始点を含んで成る、
請求項１８に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項２０】 Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．２
Ｍｄプラスミドの約１．０ｋｂｐ のＮｄｅ Ｉ ／Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ断片上に置かれた複製開始点を含んで成
る、請求項１８に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項２１】 ｐＳＣ１２， ｐＳＣ１２ΔＰ，
ｐＳＣ１２ΔＮ， ｐＳＣ１２ΔＮＰ， ｐＳＣ１８，
ｐＳＣ１８ΔＰ または ｐＳＣ１８ΔＮ， ｐＳＣ
１２ＨＩＲ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１， ｐＳＣ１２Ｈ
ＩＲＴｅｒｍ， ｐＵＣＲＳ， Ｍ１３ｍｐ１８ＲＳ，
Ｍ１３ｍｐ１９Ｈ， ｐＶＡＨＩＲ−１ およびｐＶ
ＡＨＩＲから成るベクターの群から選択される、請求項
１に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項２２】 ｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍである、
請求項１に記載のハイブリッドベクター。 - 【請求項２３】 ＭＳＰシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列とＭＳＰプロモーターまたは異種プロモー
ターとに正しい読み枠において作用可能に連結している
同種または異種構造遺伝子を含んで成る、請求項１に記
載のハイブリッドベクター。 - 【請求項２４】 ＤＮＡ分子であって、ａ）プラスミ
ドｐＵＣＲＳ の約３．５ｋｂｐ のＥｃｏＲ Ｉ／Ｓ
ａｌ Ｉ Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）挿入断片
、もしくはそれの機能性断片であり；または ｂ）前記挿入断片もしくはそれの機能性断片とハイブリ
ダイズするか、またはそのようなハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列に天然に作用可能に連結しているプロモーター
領域を含んで成り；または ｃ）ａ）またはｂ）の中に含まれそしてシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列の縮重配列であり；またはｄ
）ａ），ｂ）またはｃ）の中に含まれるＤＮＡ分子の誘
導体であり；そして／または ｅ）（Ｉ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の２．５Ｍｄプラ
スミドまたは（ＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７１２ の５．
２Ｍｄプラスミドまたは（ＩＩＩ）Ｌ．ラクチスＬＬ７
１２ の２．５Ｍｄプラスミドもしくは５．２Ｍｄプラ
スミドと同じ不和合性群のプラスミドの複製開始点を含
んで成る、ＤＮＡ分子。 - 【請求項２５】 請求項１に記載のハイブリッドベク
ターまたは請求項２４に記載のＤＮＡ分子の調製方法で
あって、Ａ）そのようなハイブリッドベクターもしくは
ＤＮＡ分子を含んで成る宿主を培養し、そして前記培養
された宿主からそのようなハイブリッドベクターもしく
はＤＮＡ分子を単離し、またはＢ）試験管内合成により
そのようなハイブリッドベクターもしくはＤＮＡ分子を
調製する、ことを含んで成る方法。 - 【請求項２６】 請求項１に記載のハイブリッドベク
ターにより形質転換された宿主。 - 【請求項２７】 プラスミド ｐＵＣＲＳ， ｐＳＣ
１２， ｐＳＣ１２ΔＰ， ｐＳＣ１２ΔＮ， ｐＳＣ
１２ΔＮＰ， ｐＳＣ１８， ｐＳＣ１８ΔＮ， ｐＳ
Ｃ１８ΔＰ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ
−１ またはｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍのいずれかによ
り形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１，
Ｃ６００ および ＨＢ１０１株、並びにｐＵＣＲＳ，
ｐＳＣ１２，ｐＳＣ１２ΔＰ， ｐＳＣ１２ΔＮ，
ｐＳＣ１２ΔＮＰ， ｐＳＣ１８， ｐＳＣ１８ΔＮ，
ｐＳＣ１８ΔＰ， ｐＶＡＨＩＲ， ｐＶＡＨＩＲ−
１， ｐＳＣ１２ＨＩＲ， ｐＳＣ１２ＨＩＲ−１，ま
たはｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍのいずれかにより形質転
換されたＬ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、プ
ラスミド不含Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）および
バシラス菌株から成る形質転換宿主の群から選択される
、請求項２６に記載の形質転換された宿主。 - 【請求項２８】 ｐＵＣＲＳ により形質転換された
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１ 、ｐＵＣＲＳ， ｐ
ＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍ， ｐＳＣ１２またはｐＳＣ１
８ により形質転換されたＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ）、および ｐＶＡＨＩＲ−１ または ｐＶＡＨ
ＩＲ により形質転換されたＢ．スリンジェンシス（Ｂ
．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） から成る形質転換宿
主の群から選択される、請求項２６に記載の形質転換さ
れた宿主。 - 【請求項２９】 請求項２６に記載の形質転換された
宿主の調製方法であって、（ａ）形質転換条件下におい
て所望により選択マーカー遺伝子と一緒に請求項１のハ
イブリッドベクターで宿主を処理し、そして（ｂ）形質
転換体を選択する段階を含んで成る方法。 - 【請求項３０】 ポリペプチドの調製方法であって、
（ａ）正しい読み枠において同種または異種構造遺伝子
を、ＭＳＰシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と
融合せしめ、（ｂ）（ａ）において調製した融合遺伝子
を含んで成るハイブリッドベクターを用いて適当な宿主
を形質転換せしめ、（ｃ）前記融合遺伝子によりコード
されるポリペプチドを宿主細胞から分泌せしめ、そして
必要な時には（ｄ）常法に従って上清からポリペプチド
を単離する段階を含んで成る方法。 - 【請求項３１】 ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．） およびバシラス種（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）から成る宿主の群から選択され
た宿主が使用される、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 発現されるタンパク質を分解するプ
ロテアーゼを培地中に分泌しない細菌宿主が使用される
、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３３】 デスルフェートヒルジンが生産され
る、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３４】 ｐＳＣ１２ＨＩＲ， ｐＳＣ１２Ｈ
ＩＲ−１またはｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形質転
換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０細胞が使用される、
請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 ｐＳＣ１２ＨＩＲＴｅｒｍにより形
質転換されたＬ．ラクチスＬＭ０２３０細胞が使用され
る、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３６】 ｐＶＡＨＩＲ または ｐＶＡＨ
ＩＲ−１ により形質転換されたＢ．スリンジェンシス
（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） 細胞が使用され
る、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３７】 （ａ）培養の対数期または安定期の
いずれかにおいて栄養培地から形質転換された細胞を収
得し、（ｂ）それらを少量の新鮮な栄養培地または適当
な緩衝液中に再懸濁し、そして（ｃ）上清から所望の生
産物を単離する前にそれらを更にインキュベートするこ
とを特徴とする、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３８】 形質転換された細胞をもとの培養物
容量の約１％〜２０％において再懸濁することを特徴と
する、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 ｐＳＣ１２ＨＩＲにより形質転換さ
れたＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＬＭ０２３０細
胞を約１／１０容の新鮮な栄養培地中に再懸濁し、そし
て約３０℃において約３０分間インキュベートすること
を特徴とする、請求項３８に記載の方法。 - 【請求項４０】 ＭＳＰが生産される、請求項３０に
記載の方法。 - 【請求項４１】 純粋な形態のＭＳＰ。
- 【請求項４２】 純粋なＭＳＰの生産方法であって、
（ａ）Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＬＭ０２３０
の上清からトリクロロ酢酸によりタンパク質を沈澱させ
、（ｂ）沈澱したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動し、（ｃ）主要なタンパク質バン
ドを有する領域を切り出し、そして（ｄ）ゲルからＭＳ
Ｐを電気溶出させる段階を含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB90064007 | 1990-03-22 | ||
| GB909006400A GB9006400D0 (en) | 1990-03-22 | 1990-03-22 | Bacterial vectors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211384A true JPH04211384A (ja) | 1992-08-03 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3056889A Pending JPH04211384A (ja) | 1990-03-22 | 1991-03-20 | 細菌ベクター |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0449770B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04211384A (ja) |
| KR (1) | KR910016930A (ja) |
| AR (1) | AR245504A1 (ja) |
| AT (1) | ATE174055T1 (ja) |
| AU (1) | AU643511B2 (ja) |
| BR (1) | BR9101137A (ja) |
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| GB (1) | GB9006400D0 (ja) |
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| IE (1) | IE910948A1 (ja) |
| MX (1) | MX25027A (ja) |
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| NZ (1) | NZ237506A (ja) |
| PT (1) | PT97081B (ja) |
| TW (1) | TW213488B (ja) |
| ZA (1) | ZA912114B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008067708A (ja) * | 1995-10-20 | 2008-03-27 | Actogenix Nv | 生物学的に活性のあるポリペプチドのデリバリー |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5286361A (en) * | 1992-10-19 | 1994-02-15 | Regents Of The University Of California | Magnetically attached sputter targets |
| AU2149495A (en) * | 1995-04-11 | 1996-10-30 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast- Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Method for the construction of vectors for lactic acid bacte ria like lactobacillus such that the bacteria can efficientl y express, secrete and display proteins at the surface |
| NZ334521A (en) * | 1996-09-06 | 2000-03-27 | Bioteknologisk Inst | A lactic acid bacterial regulatable expression system |
| EP1239032A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-11 | Société des Produits Nestlé S.A. | Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy |
| US7780961B2 (en) | 2001-05-03 | 2010-08-24 | Actogenix N.V. | Self-containing Lactococcus strain |
| WO2004001020A2 (en) | 2002-06-19 | 2003-12-31 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Methods and means to promote gut absorption |
| CA2506031A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Vib Vzw | Self-containing lactobacillus strain comprising a thya mutation and therapeutic applications thereof |
| JP5410759B2 (ja) | 2005-11-29 | 2014-02-05 | アクトジェニックス・エヌブイ | 抗原に対する粘膜寛容の誘導 |
| KR101557509B1 (ko) | 2007-01-12 | 2015-10-06 | 액토제닉스 엔.브이. | 락토코커스 프로모터 및 그것의 용도 |
| EP2774621B1 (en) | 2007-01-25 | 2018-01-24 | Intrexon Actobiotics NV | Treatment of immune disease by mucosal delivery of antigens |
| JP5126879B2 (ja) * | 2007-07-13 | 2013-01-23 | 独立行政法人海洋研究開発機構 | 新規ｄｎａ断片およびそれを含む組換えベクター、それらによって形質転換された形質転換体、ならびにそれらの利用 |
| EP2344626B1 (en) | 2008-09-29 | 2017-03-29 | Intrexon Actobiotics NV | Reduced colonization of microbes at the mucosa |
| CN102414310B (zh) | 2009-04-30 | 2015-05-06 | 阿克图杰尼斯公司 | 用于冷冻干燥乳酸菌的冷冻保护剂 |
| EP2275527A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-19 | ActoGeniX NV | Animal component-free culture medium for bacterial fermentation |
| EP3192873A1 (en) | 2009-09-29 | 2017-07-19 | Intrexon Actobiotics NV | Lactobacillus and streptococcus promoters and uses thereof |
| AU2011268146A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-01-10 | Actogenix Nv | Compositions and methods for treating inflammatory conditions |
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| ATE64956T1 (de) | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
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Cited By (1)
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