CN103917639B - 经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有提高的胁迫抗性和/或改善的贮藏特征的革兰氏阳性细菌。特别地，本发明涉及积累细胞内海藻糖的革兰氏阳性细菌。根据本发明的革兰氏阳性细菌缺乏纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性。所述革兰氏阳性细菌还可以缺乏海藻糖6‑磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。所述革兰氏阳性细菌还可以过表达海藻糖转运蛋白。本发明还涉及包含所述革兰氏阳性细菌的组合物及其方法和用途。

Description

经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途
技术领域
本发明涉及具有改善的胁迫抗性和改善的制造、加工和贮藏特征的微生物(例如革兰氏阳性细菌)。本发明特别地涉及积累细胞内海藻糖的经遗传修饰的微生物。本发明还涉及这些微生物在食品技术和医疗应用中的用途。
背景技术
革兰氏阳性细菌共同地因具有单脂质双层质膜而分类。革兰氏阳性细菌包括多种杆状(bacilliform)和球状(cocciform)细菌属，其中双歧杆菌(Bifidobacteria)和一群属统称为乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)。LAB包括革兰氏阳性、低GC、酸抗性、通常无孢子形成、非呼吸的杆或球的分支，其通过其共同的代谢和生理特征而相关联。这些细菌通常见于(分解的)植物和乳制品，产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。在历史上，该特征将LAB与食物发酵相联系，因为酸化抑制腐败因子(spoilage agent)的生长。一个原型LAB乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是嗜温且微需氧发酵的乳酸菌。尽管该细菌广泛的应用在食品发酵中(尤其地在乳品工业中)，对于其在药物和保健品中的用途(作为药物来治疗体腔中的感染如阴道感染，或者作为递送生物活性分子的载体)有越来越高的兴趣。在所有这些案例中，对具有高度活力的起子培养物或者包含高比例有活力细菌的药物或营养物制剂有需要。然而，乳酸乳球菌(L.lactis)倾向于在贮藏期间或加工(对于干粉配方、片剂形成等的生产......)期间失去活力。当细菌在冷冻干燥后经受额外的胁迫(例如高酸度或存在胆汁盐)时，活力的下降甚至更为明显。
已经提出了数种方法来克服该问题。海藻糖的使用是特别有感兴趣的。海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-1，1-a-D-吡喃葡萄糖苷)是在多种生物(从细菌到无脊椎动物)中存在的非还原性二糖。海藻糖(有时与葡聚糖组合)经常用作外部添加的深低温保藏剂。外部添加的海藻糖具有糖类基质的功能(Conrad等，2000，)，并且发挥其保护作用(尤其在冷冻干燥期间)，其中它充当玻璃成形剂(glass former)。此外，海藻糖被公认为胁迫代谢物，并且其已经在真菌中尤其是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中被广泛的研究。高浓度的内部海藻糖的确改善贮藏能力并导致深低温保藏后的较高活力。此外，重要的是注意到外部添加的海藻糖几乎不导致微生物中内部海藻糖积累，无论是因为其未被摄取还是其在摄取后被迅速地代谢。
Termont等(Appl Environ Microbiol72：7694；2006)报道通过质粒驱动的otsA(海藻糖-6-磷酸合酶)和otsB(海藻糖-6-磷酸磷酸酶)之过表达在乳酸乳球菌中细胞内积累来从头合成的海藻糖。细胞内的海藻糖积累而非外部添加的海藻糖保护乳酸乳球菌免受胆汁裂解以及通过冷冻干燥的细胞死亡。由于乳酸乳球菌极度敏感，对胆汁裂解的保护可被用作细胞内海藻糖积累的重要功能性测定。
Andersson等(J Biol Chem276：42707；2001)已经描述了用于在乳酸乳球菌中的海藻糖利用的新途径。该途径使用海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trePP)的活性将海藻糖-6-磷酸转换为β-葡萄糖1-磷酸和葡萄糖6-磷酸。他们描述了在乳酸乳球菌中trePP的插入失活导致失去在海藻糖上生长的能力。
对于海藻糖的细胞内积累，Carvalho等(Appl Environ Microbiol77：4189；2011)描述了利用质粒驱动的乳酸乳球菌trePP和β-葡糖磷酸变位酶(pgmB)过表达的方法。如由这些作者表明的，考虑到细菌缺乏海藻糖6-磷酸磷酸酶，来自食品级生物费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)的对应基因otsB用于提供所需的活性。所产生的细胞表现出改善了对冷休克、热休克和酸性的抗性。然而作者指出所产生的海藻糖的至少67％见于生长培养基中。因此，所产生的海藻糖看来没有在细胞内高效地保留或积累。
尽管这些方法的确导致贮藏的改善，还需要有可以导致革兰氏阳性细菌(例如LAB或双歧杆菌)之贮藏改善的方法，不仅在细菌用于在医学应用中递送生物活性化合物的那些情况中，而且在当细菌用于食品工业(例如乳品工业)时也是如此。
Lowes等2006(Oral Microbiol Immunol.21(1)：21-7)公开了变异链球菌(Streptococcus mutans)细菌的一些突变体，被他命名为PTS系统IIC组分(PtcC)突变体。被Lowes研究的变异链球菌(S.mutans)是导致龋齿的病原体，并且Lowes首要关注研究变异链球菌在其致病的情况下的基因组变异。β-葡糖苷碳水化合物源的利用可以在变异链球菌的致病性和存活中发挥作用，并且从这个角度研究PtcC。Lowes没有提出PtcC在海藻糖内部积累或在改善细菌的胁迫抗性中的任何作用。值得注意的是，Lowes等2006研究了β-葡糖苷的代谢，而海藻糖是α-葡糖苷。Lowes不关心非致病性细菌的PtcC突变体或者此类突变体的任何效用。
发明概述
细胞内海藻糖可保护微生物(例如乳酸菌(LAB))，如乳酸乳球菌细胞免受有害的试剂或条件。实例是胆酸裂解(活LAB在肠转移期间所经历的)，或者用于LAB之保存的冷冻、干燥、喷雾干燥、冷冻干燥期间的冷冻和/或干燥胁迫。
仅有限数量的方法可用来允许海藻糖在细胞内的积累。这些方法利用质粒驱动同源性或异源性基因的过表达。然而这并不是用于药物或食物产品的期望构造。
本文中我们报道了允许海藻糖细胞内积累的新方法，仅基于在革兰氏阳性细菌中不存在纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性，优选地通过导致编码内源性PtcC的基因部分地或完全地缺失、破坏或失活(例如不能产生功能性ptcC基因产物)。本发明人出乎意料地观察到随着时间的推移而积累的海藻糖在一定程度上通过目前未曾预料的并且未被鉴别的海藻糖出口(exit port)泄漏到细胞外，由此，可以在上清液中检测海藻糖。令人惊讶的是，他们发现ptcC的失活阻止了海藻糖的释放。这些发现更是未曾料到的，因为PtcC到目前为止从未与海藻糖转运相关，并且未曾被提出作为负责海藻糖泄漏并释放至周围环境的海藻糖出口。还让人惊讶的是，已知的和已描述的海藻糖转运蛋白(trehalosetransporter)似乎并不负责这一海藻糖泄漏的机制。
在一方面中，本发明涉及革兰氏阳性细菌，例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选缺乏纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性的乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。
另一方面提供了缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌，其用作药物，所述革兰氏阳性细菌例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。这样的药物可以例如涵盖药物制剂、营养品(nutraceutical)、医疗食品(medical food)或功能性食品(functional food)或益生菌剂(probiotics)。
在另一方面中，本发明提供药物、起子培养物(starter culture)、益生菌组合物或食品添加剂，更特别的是非药用益生菌组合物或食品添加剂，其包含缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌，例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。非限制性地，这样的食品添加剂可以是起子培养物，优选地用于制备食品产品的起子培养物。因此，相关的方面提供起子培养物，优选用于制备食品产品的起子培养物，其包含缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。
在另一方面中，本发明提供缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌作为药物、起子培养物、益生菌和/或食品添加剂，更特别地作为非药用起子培养物、益生菌或食品添加剂)的用途。非限制性地，这样的食品添加剂可以是起子培养物，优选用于制备食品产品的起子培养物。因此，相关方面提供使用缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌作为起子培养物，优选用于制备食品产品的起子培养物，更特别地其中所述食品产品是非药用食品产品)的用途。
还通过本发明的一方面提供了用于制备食品产品的方法，其包括将缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)、或者所述食品添加剂或者所述起子培养物与能够被革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵的底物物质混合。在一些实施方案中，这样的方法还可以包括将所述底物物质发酵的步骤。以及提供可通过任意这样的方法获得的这样的食品产品。食品产品可以非限制性地涵盖益生菌剂。
另一方面提供了用于制备药物例如药物制剂、营养品、医疗食品或功能性食品或益生菌，或者用于制备益生菌组合物或食品添加剂(更特别地非药用益生菌组合物或食品添加剂)，或者用于制备起子培养物(优选地用于制备食品产品的起子培养物)的方法，所述方法包括以下步骤：i)在培养基中繁殖缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌，例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌，所述培养基包含能够被所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵的底物物质，以及ii)将如此繁殖的革兰氏阳性细菌例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌分别配制到药物或益生菌组合物或食品添加剂或起子培养物中。因此，还涵盖了缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)用于制备药物(例如药物制剂或营养品、医疗食品或功能性食品或益生菌)，或者用于制备益生菌组合物或食品添加剂(更特别地非药用益生菌组合物或食品添加剂)，或者用于制备起子培养物(优选地用于制备食品产品的起子培养物)的用途。
本发明人发现革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，例如本文中所述的LAB或双歧杆菌)不仅能够细胞内海藻糖积累(甚至不依赖碳源)，而且所述革兰氏阳性细菌显示出极大增强的对多种胁迫或贮藏相关条件的抗性。例如，所述革兰氏阳性细菌更加耐受贮藏相关的操作，例如干燥、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥(冻干)。该革兰氏阳性细菌还展示出在肠胃系统中增强的存活(不依赖进食或禁食状态)，表明改善了对酸性和胆汁裂解的抗性。本文中所述的革兰氏阳性细菌的表现，无论在药用装置(medicinalsetting)或在食品工业中，比之前已知的更加可繁殖。因此体现了本发明原理的革兰氏阳性细菌提供了更加稳健的环境以及生物抗性。
在一方面中，本发明因此还涉及用于在革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中内部积累海藻糖的方法，其包括繁殖缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，优选地其中在包含能够被所述革兰氏阳性细菌发酵的底物物质的培养基中，编码内源性PtcC的基因已被部分地或完全地被缺失、破坏或失活，例如不能产生功能性ptcC基因产物。
在另一方面中，本发明涉及用于改善革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选LAB或双歧杆菌)的胁迫抗性或制造、加工和/或贮藏特征的方法，其包括对革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选LAB或双歧杆菌)进行修饰，例如使其缺乏PtcC活性。优选地，所述胁迫抗性或制造、加工和/或贮藏特征可以是选自以下的一种或更多种：对酸条件的抗性，对胆汁盐的抗性，对热的抗性，对盐的抗性，对干燥、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥的抗性，以及渗透抗性。
优选地，在之前提到的缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选LAB或双歧杆菌)中，编码内源性PtcC的基因已被部分地或全部地缺失、破坏或失活(例如不能产生功能性ptcC基因产物)。应当理解的是，这样的缺失、破坏或失活可以靶向例如ptcC基因的编码序列和/或启动子(ptcC从通过所述启动子表达)。
在一些优选的实施方案中，本文中公开的或使用的缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。优选地，在这样的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选缺乏PtcC活性的乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中还缺乏TrePP活性，编码内源性TrePP的基因已被部分地或全部地缺失、破坏或失活(例如不能产生功能性TrePP基因产物)。应当理解的是，这样的缺失、破坏或失活可以靶向例如trePP基因的编码序列和/或启动子(trePP通过所述启动子表达)。本发明人出人意料地发现缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)还细胞内积累海藻糖。与本方法相反，现有工作(WO2006/018446)教导编码异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶(例如otsB)以实现海藻糖积累。Carvalho等2011(同上)甚至教导过表达TrePP以获得细胞内海藻糖积累。此外，尽管LAB(例如乳酸乳球菌)或许能利用海藻糖，直到目前为止还没有描述过合成海藻糖的乳酸乳球菌菌株。尚未鉴定内源性海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因，其被认为是从葡萄糖-6-磷酸(乳酸乳球菌中存在的代谢物)起始海藻糖产生的先决条件。
在一些优选的实施方案中，本文中公开的或使用的缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以过表达一种或更多种海藻糖转运蛋白，优选的内源性海藻糖转运蛋白，例如包含在海藻糖操纵子中的一种或更多种磷酸转移酶系统基因。本发明人出人意料地发现这样的过表达(与天然海藻糖诱导的表达相反)还增强革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)积累和/或保留细胞内海藻糖的能力。
在一些优选的实施方案中，本文中使用的缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)包含功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。本发明人认识到异源性表达海藻糖6-磷酸磷酸酶还提高海藻糖积累。在一些优选的实施方案中，所述海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB，优选来自大肠杆菌(E.coli)的otsB。
概括来讲，在一些实施方案中，本文中公开的或使用的缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)还可以表现出以下特征中的任意一个、任意两个或所有三个：(a)革兰氏阳性细菌包含功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶；(b)革兰氏阳性细菌缺乏TrePP活性；(c)革兰氏阳性细菌过表达一种或更多种海藻糖转运蛋白。在一些优选的实施方案中，缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌还可以显示特征(b)，或者更优选还可以显示特征(a)和(b)，或者甚至还更优选显示特征(b)和(c)，或者还可以非常优选显示特征(a)和(b)和(c)。
在一些优选的实施方案中，本文中公开的或使用的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)还可以含有一种或更多种异源性基因产物。在一些优选的实施方案中，特别是其中革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)旨在用于药用用途，这样的基因产物可以是预防性和/或治疗性基因产物或抗原。
在某些实施方案中，本文中公开的或使用的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，或药物或食品添加剂或起子培养物或益生菌组合物可以被干燥、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥(冻干)。因此，在一些实施方案中，用于制备药物，或用于制备食品添加剂，或用于制备起子培养物，或用于制备益生菌组合物，或用于在革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中内部积累海藻糖，或者用于改善革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的胁迫抗性或制造、加工和/或贮藏特征的任何前述方法还可以包含干燥、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥(冻干)革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)、药物、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物。
在用于制备药物，或用于制备食品添加剂，或用于制备起子培养物的前述方法的某些实施方案中，或者在用于在革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中内部积累海藻糖的前述方法的某些实施方案中，培养基还可以包含麦芽糖或葡萄糖或者麦芽糖与葡萄糖的组合，作为碳源，优选地作为主要或甚至唯一碳源。在某些实施方案中，培养基基本上不包含外部(外源性)添加的海藻糖。本发明人出人意料地发现本文中公开的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)已经获得了利用碳源(例如麦芽糖或葡萄糖)在细胞内积累海藻糖的能力。因此，根据本发明的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌，并且优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以有利地在例如作为唯一碳源的麦芽糖(其比海藻糖便宜)上生长，还将积累细胞内海藻糖。然而，应当理解的是，在某些实施方案中，培养物培养基可以含有外部(外源性)添加的海藻糖。
在某些优选的实施方案中，在本发明书中意指的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌)可以是乳酸菌(LAB)，更优选乳球菌属(Lactococcus sp.)或乳杆菌属(Lactobacillus sp.)细菌。
在另一些优选实施方案中，在本发明书中意指的革兰氏阳性细菌(例如特别是非致病性革兰氏阳性细菌)可以是双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)细菌。
本发明的以上和另一些方面以及优选的一些实施方案将在以下部分和在所附的权利要求中描述。所附加权利要求的主题在此具体地并入本说明书。
附图简述
图1：在trePP失活之后、otsB表达之后或其组合，细胞内海藻糖积累是可能的。
图2：外源性海藻糖在乳酸乳球菌细胞中的积累提供了针对胆汁裂解的保护。(A)存活；和(B)海藻糖含量。
图3：细胞内海藻糖的积累和稳定性。(A)海藻糖随时间的释放；和(B)海藻糖在上清液中提高。
图4：在表2中描述了海藻糖在多种菌株中的积累和释放。菌株补充了100mM(A)或500mM(B)海藻糖。
图5：ptcC的失活阻止(在M9盐中，图A)或延迟(在0.5％牛胆汁(oxgal)，图B)细胞内海藻糖的释放。
图6：外源性海藻糖在乳酸乳球菌细胞中的积累提供了针对胆汁裂解的保护。(A)细胞内海藻糖随时间的释放；和(B)在0.5％牛胆汁中随时间的存活。
图7：trePP KO菌株(ptcC wt以及ptcC KO二者)能够将葡萄糖或麦芽糖转变为细胞内海藻糖。
图8：当猪被禁食24小时(A)以及在随意可获得食物期间(B)时，都提高了在经猪肠肠内通过期间的存活。
图9：产生生物质后海藻糖的积累。
图10：通过麦芽糖刺激细胞内海藻糖的积累。
图11：生物质产生期间或之后将麦芽糖转变为细胞内海藻糖。
发明详述
除非上下文另有清楚规定，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
本文中使用的术语“包含”与“包括”或“含有”是同义，并且是包括性或开放式的，并且不排除另外的未记载的成员、要素或方法步骤。应当理解的是，本文中使用的术语“包含”包括术语“由......组成”以及术语“基本由......组成”。
通过端点记载的数值范围包括归入在各个范围内的所有数字和部分，以及所记载的端点。
本文中使用的术语“约”或“大约”当涉及可测量值(例如参数、量、时距(temporalduration)等)时意指涵盖给定值的+/-20％或更小、优选+/-10％或更小、更优选+/-5％或更小以及又更优选+/-1％或更小的变化，其程度为这些变化适用于在所公开的本发明中执行。应理解修饰词“约”或“大约”涉及的值自身也是具体的并优选地公开的。
尽管术语“一个/种或更多个/中”或“至少一个/种”，例如一组成员的一个或更多个或者至少一个成员自身通过进一步举例本身清楚，但是术语尤其涵盖其中涉及所述成员的任意一个或者所述成员的任意两个或更多个，例如，所述成员的任意≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，并且多至所有的所述成员。
本说明书引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。特别地，本文所具体引用的所有参考文献的教导通过引用并入本文。
除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
在下文中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指明有矛盾，否则如此定义的每个方面可与任意其他方面组合。特别地，指示为优选的或有利的任意特性可与指示为优选的或有利的任意其他任意特性组合。
在整个本说明书中，提及“一个实施方案”意指关于所述实施方案所描述的具体特性、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在不同地方短语“在一个实施方案中”的出现不一定都指的是相同的实施方案，而是可以。此外，如本领域技术人员从本公开内容显而易见的，在一个或更多个实施方案中，可以以任意合适方式组合具体特性、结构或特征。此外，如本领域技术人员所理解的，虽然本文中所述的一些实施方案包括包括在另一些实施方案中的一些特性而不包括其另一些特征，但是不同实施方案之特性的组合旨在包括在本发明的范围内，并且构成不同的实施方案。例如，在所附权利要求中，可以以任意组合使用所要求保护的实施方案中的任意一个。
在以下的本发明详述中，参照了构成其一部分的附图，并且其中仅通过阐明本发明可实施的一些具体实施方案的方式示出。应理解，可利用另一些实施方案并且可作出结构或逻辑改变而不偏离本发明的范围。因此，以下的详细描述不应视为限制含义，并且本发明的范围由所附权利要求书限定。
列出重组DNA技术一般原理的标准参考书包括Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，第1-3卷，Sambrook等编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(″Ausubel等.1992″)；Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，AcademicPress：San Diego，1990。例如在Davis，B.D.等，Microbiology，第3版，Harper&Row，出版商，Philadelphia，Pa.(1980)中列出了微生物学的一般原则。
本发明人发现海藻糖在一定程度上通过目前未被鉴别的或未曾预料的海藻糖出口从细胞泄漏，并且可以在上清液中回收。出人意料的是，本发明人发现ptcC的破坏避免了海藻糖的释放。
本文中所公开的是缺乏纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性的革兰氏阳性细菌，优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。
在一个方面中，革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以用作药物，即用在治疗中。另一方面提供包含缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的药物。还公开了缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)用于制备药物的用途。例如，可以提供这样的药物作为药物制剂、营养品、益生菌、医疗或功能食物。
另一方面提供了缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)作为益生菌或食品添加剂，更特别地作为非药用益生菌或食品添加剂的用途。相关的方面提供了缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)作为起子培养物的用途，优选用于制备食品产品的起子培养物，更特别地其中所述食品产品是非药用食物产品。
因此，另一方面提供了包含缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的益生菌或食品添加剂，更具体地非药用益生菌或食品添加剂。相关的方面提供了起子培养物，优选用于制备食品产品的起子培养物，更特别地其中所述食品产品是非药用食品产品，所述起子培养物包含缺乏PtcC活性的革兰氏阳性细菌，优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。
本文中使用的术语“革兰氏阳性细菌”具有其在本领域中已知的通常含义。通过进一步的指导，革兰氏阳性细菌可通过保留结晶紫染色的革兰氏染色来鉴别。
在一个优选实施方案中，根据本发明的革兰氏阳性细菌是非致病性的，即其在施用于目的对象时不造成伤害或不引起有害作用。
本文中使用的术语“LAB”的“乳酸菌”涉及革兰氏阳性细菌，所述革兰氏阳性细菌是非致病性的，即其在施用于目的对象时不造成伤害或不引起有害作用，并且其优选属于以下细菌属：乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。更优选地，LAB可以是乳球菌属物种例如但不限于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、鱼乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)和棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)及其任意亚种和菌株。最优选地，乳球菌属物种可以是乳酸乳球菌及其任意亚种和菌株，例如但不限于乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactisssp.cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亚种(Lactococcus lactis ssp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis ssp.lactis)、乳酸乳球菌亚种双乙酰乳酸变种(Lactococcus lactis ssp.bv.diacetylactis)。进一步优选地，乳酸乳球菌可以是乳酸乳球菌乳脂亚种或乳酸乳球菌乳酸亚种，更优选是乳酸乳球菌乳脂亚种，并且涵盖其任意菌株，例如，乳酸乳球菌乳脂亚种SK11、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363或乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403。还优选地，LAB可以是肠球菌属优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)及其任意亚种和菌株，例如但不限于屎肠球菌菌株LMG15709。
双歧杆菌是革兰氏阳性的、非运动性的、通常分支的厌氧细菌的属。本文中使用的双歧杆菌可包括青春双歧杆菌(B.adolescentis)、有角双歧杆菌(B.angulatum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、星形双歧杆菌(B.asteroides)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、波恩双歧杆菌(B.bourn)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、小猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、兔双歧杆菌(B.cuniculi)、寓齿双歧杆菌(B.denticolens)、齿双歧杆菌(B.dentium)、嘉利肯双歧杆菌(B.gallicum)、鸡双歧杆菌(B.gallinarum)、印度双歧杆菌(B.indicum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、殊形双歧杆菌(B.inopinatum)、乳双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、巨大双歧杆菌(B.magnum)、瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、微小双岐杆菌(B.minimum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、反刍双岐杆菌(B.ruminantium)、沙库来双岐杆菌(B.saeculare)、沙布提双岐杆菌(B.subtile)、猪双歧杆菌(B.suis)、热嗜酸性双岐杆菌(B.thermacidophilum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)。优选地，双歧杆菌是青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌。应理解，还包括双歧杆菌的所有亚种和菌株。
本文所使用的“纤维二糖特异性PTS系统IIC组分”或“ptcC”或“PtcC”是指磷酸转移酶系统组分。磷酸转移酶系统参与催化磷酰基从磷酸烯醇式丙酮酸转移到伴随着其跨细胞膜转运进入的糖底物。PtcC是纤维二糖特异性PTS系统的跨膜组分。PtcC到目前为止还没有牵涉到海藻糖转运中，更不用说参与海藻糖从革兰氏阳性细菌(乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)泄漏。例如，乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363的核酸和蛋白质序列分别如SEQ ID NO：7和8(分别对应于Genbank登录号NC_009004.1(区域430271-431608)和YP_001031790.1)所示。在一个实施方案中，本文所使用的ptcC涉及分别具有SEQ ID NO：7和8的核酸或氨基酸序列的基因或蛋白质，或者具有编码SEQ ID NO：8的核酸。
在另一个实施方案中，本文所使用的ptcC涉及具有分别与SEQ ID NO：7和8有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白质。在另一个实施方案中，本文所使用的PtcC编码与SEQ ID NO：8有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)的蛋白质。在另一个实施方案中，本文所使用的ptcC涉及具有与SEQ ID NO：7至少55％同一性(例如至少60％、65％、70％或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因。在另一个实施方案中，本文所使用的ptcC涉及具有与SEQ ID NO：8有至少45％同一性(例如至少50％、55％、60％、65％、70％或更高％同一性)之氨基酸序列的蛋白质。在另一个实施方案中，本文所使用的PtcC编码与SEQ ID NO：8有至少45％同一性(例如至少50％、55％、60％、65％、70％或更高％同一性)的蛋白质。优选地，以上描述的序列涉及或编码功能性PtcC蛋白质。在另一个实施方案中，本文所使用的ptcC是SEQ ID NO：7和8的LAB直系同源物(orthologue)。优选地，但不限于此，当革兰氏阳性细菌是乳酸菌(LAB)更优选乳球菌属，甚至更优选乳酸乳球菌时，可以特别地应用在本段中个体化的序列同一性。
例如，两歧双歧杆菌PRL2010的ptcC的核酸和蛋白质序列分别如Genbank登录号NC_014638.1(区域2033198..2034538，互补)和YP_003971775.1所示；长双歧杆菌长亚属(Bifidobacterium longum subsp.longum)KACC91563的核酸和蛋白质序列分别如Genbank登录号NC_017221.1(区域2316679..2317218)和YP_005588251.1所示；以及短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)UCC2003的核酸和蛋白质序列分别如Genbank登录号CP000303.1(区域2379064..2380443，互补)和ABE96554.1所示。
在另一个实施方案中，本文中所用的ptcC涉及具有与两歧双歧杆菌PRL2010或长双歧杆菌长亚属KACC91563或短双歧杆菌UCC2003之ptcC的核酸或蛋白质序列(分别如以上陈述的Genbank登录号所定义)有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更多％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白质。优选地，以上描述的序列涉及或编码功能性PtcC蛋白。在另一个实施方案中，本文中使用的ptcC是所述双歧杆菌物种(species)的ptcC的双歧杆菌直系同源物。优选地，但不受限制，当革兰氏阳性细菌是双歧杆菌时，可以特别地应用在本段中个体化的序列同一性。
如对技术人员来说显而易见的，许多其他革兰氏阳性细菌的PTS系统IIC组分的序列可以容易地从Genbank核苷酸数据库检索，例如通过用搜索字符串“PTS系统IIC组分”或任选地与所期望的革兰氏阳性细菌的属(例如“乳球菌属”、“乳杆菌属”、“明串珠菌属”、“肠球菌属”、“双歧杆菌属”等)或种(例如“乳酸乳球菌”、“格氏乳球菌”“鱼乳球菌”、“植物乳球菌”、“棉子糖乳球菌”、“粪肠球菌”、“屎肠球菌”、“青春双歧杆菌”、“两歧双歧杆菌”、“短双歧杆菌”、“乳双歧杆菌”等)的名称组合的类似字符串查询数据库，或者通过用字符串“PTS系统IIC组分”或类似字符串来查询此类细菌的经注释的完整基因组序列。(还)未包括在公共数据库时，此种序列可以通过基于序列同源性的分子生物学常规技术容易地鉴别。
用于比较序列和确定序列同一性的方法是本领域中已知的。例如，序列同一性百分比是指比对这些序列之后在两个序列之间相同核酸或氨基酸的百分比。可以用本领域已知的各种不同的程序和算法进行并计算比对和同一性的百分比。优选的比对算法包括BLAST(Altschul，1990；例如在NCBI网站可获得)和CLustal(在Chenna，2003；中综述；例如在EBI网站可获得)。优选地，BALST用于计算两个序列之间同一性的百分比，例如由Tatusova和Madden1999(FEMS Microbiol Lett174：247-250)描述的“Blast2序列”算法，例如使用以发表的默认设置或其他合适的设置(例如，对于BLASTN算法：打开空位的代价＝5，延长空位的代价＝2，错配罚分＝-2，匹配的奖励＝1，空位×_跌落(gap×_dropoff)＝50，期望值＝10.0，字大小＝28；或者对于BLASTP算法：矩阵＝Blosum62，打开空位的代价＝11；延长空位的代价＝1，期望值＝10.0，字大小＝3)。
PtcC的活性可以例如以基因测序的方法直接确定。在该方法中，可以容易地鉴别部分或完整的缺失、破坏或失活突变。
本文中使用的术语“缺乏PtcC活性”意指没有或基本上没有PtcC活性存在。通过进一步的指导，PtcC活性低于野生型革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之PtcC活性的20％。例如，PtcC活性低于野生型PtcC活性的15％，优选低于10％，更优选低于5％，甚至更优选低于1％。之前表明的，最优选PtcC活性是无法检测的或者基本上或完全缺乏。
本文中使用的术语“药物”还涵盖了术语“药品”、“治疗剂”以及用于医药领域以表明具有治疗或预防效果之制剂的其他术语。
本文中使用的术语“治疗”指治疗处理和预防或防范措施，其中对象被预防或减缓(减少)不期望的生理学改变或障碍。本文中使用的术语“治疗”等还包括改善或消除已发生的疾病或病症(一旦其已经建立)或者缓和此类疾病或病症的特征性症状。本文中使用的术语还涵盖根据患者的病症，预防疾病或病症或者与疾病或病症相关之症状的发病，包括在遭受所述疾病或病症之前减缓疾病或病症或与此相关的症状的严重程度。这样的先于遭受的预防或降低是指向在施用时未遭受到疾病或病症的患者施用本发明的化合物或组合物。“预防”还涵盖预防病或病症或与其相关之症状的复发或复发预防，例如在改善一段时间之后。
本文中使用的“营养品”通常涵盖提供健康和医疗益处的食品和食品产品。营养品是可食用的并且可以被人直接吃掉，但优选以添加剂或营养补充剂的形式提供，例如以在健康食品商店出售的那类片剂的形式，或者作为可食用固体中的成分，更优选经加工的食品产品例如谷类、面包、豆腐、饼干、冰淇淋、蛋糕、马铃薯片，脆饼干(pretzel)，奶酪等，以及可饮用液体的形式如饮料，例如乳、苏打水、运动饮料和果汁中。尤其优选的用于产生营养品的过程仅涉及天然来源的溶剂。营养品可以优选含有相对高水平的健康增强物质。营养品也可以混合使用，彼此增强其健康增强作用。
与营养品相反，所谓的“医疗食品”不意味着被普通公众使用并且在商店和超市不可获得。医疗食品不是那些包括在健康食物中以降低疾病之风险的食品，例如降低脂肪的食品(reduced-fat food)或低钠食品，它们也不是减肥产品。当患者具有特别的营养需要以控制疾病或健康状况时，医生开出医疗食品，并且患者受到医生的持续关注。标签声明该产品旨在用于控制特别的医疗疾病或病症。医疗食品的实例是营养上多样的医疗食品，其被设计为用于给具有慢性肠炎病症的患者提供针对性的营养支持。该产品的活性化合物是例如本文中所述化合物的一种或更多种。功能性食品可以涵盖那些包括在健康食物中以降低疾病之风险的食品，例如降低脂肪的食品或低钠食品或减肥产品。
本文中使用的术语“益生菌”是指在肠腔(intestines camera)中帮助维持微生物(微生物群落)之天然平衡的细菌。另外，正常人体消化道含有降低有害细菌生长并促进消化系统健康的益生菌。肠道中最大的益生菌群是LAB。本文中使用的术语“益生菌组合物”是包含益生菌的组合物，优选可食用组合物。本文中使用的术语“益生菌组合物”可以与“饮食补充剂”互换使用。发现本文中所限定的益生菌组合物可用作食物和饮料的补充剂，以及用作用于经肠或肠胃外应用的药物制剂，其可以是固体制剂(例如胶囊或片剂)，或液体制剂(例如溶液剂或悬浮剂)。这样的制剂可以包括但不限制于：饮料(例如...)、酸奶饮料、酸奶、新鲜干酪、奶油、酸奶油等。因此，应当理解益生菌或益生菌组合物可以是药用或非药用的应用。
术语“起子培养物”是指实际上进行发酵的微生物培养物。这些起子通常由培养基(例如已经被用于发酵的微生物良好定植的谷类、种子或营养液)组成。本文中使用的术语起子培养物优选地指高密度起子培养物。因此，起子培养物可以指包含活微生物的组合物，所述活微生物能够起始或影响有机物质的发酵，任选地在单独的起子培养基中培养之后以获得高密度培养物。或者，起子培养物可以是干燥的、喷雾干燥的、冷冻的或冷冻干燥的。
如以上指出的，本发明人出人意料的发现在革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中trePP的缺乏增强细胞内海藻糖积累。与此相反，先前认为异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶和/或异源性海藻糖6-磷酸合酶(分别例如otsB和otsA)对细胞内海藻糖积累是必须的。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及如本文中所述的缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶活性的革兰氏阳性细菌，优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。
本文中使用的术语“海藻糖6-磷酸磷酸化酶”、“trePP”或“TrePP”涉及磷酸化海藻糖6-磷酸的酶，优选催化α，α-海藻糖-6-磷酸与磷酸产生葡萄糖-6-磷酸和β-D-葡萄糖-1-磷酸的反应(或反之亦然)(优选可逆反应)的酶。trePP的同义词例如海藻糖-6-磷酸：磷酸β-D-糖基转移酶和α，α-海藻糖-6-磷酸：磷酸β-D-糖基转移酶。例如，乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363的trePP之核酸和蛋白质序列分别如SEQ ID NO：1和2(分别对应于Genbank登录号NC_009004.1(区域449195-451504)和YP_001031805.1)所示。在一个实施方案中，本文所使用的trePP涉及基因或蛋白质，其分别具有SEQ ID NO：1和2的核酸或氨基酸序列，或者具有编码SEQ ID NO：2的核酸。在另一个实施方案中，本文所使用trePP涉及具有分别与SEQ IDNO：1和2有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白质。在另一个实施方案中，本文所使用trePP编码与SEQ ID NO：2有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)的蛋白质。优选地，上述序列涉及或编码功能性trePP蛋白。在另一个实施方案中，本文所使用的trePP是SEQ ID NO：1和2的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)直系同源物。
可以直接或间接测量trePP的活性。间接确定活性的一种方法是借助基因测序。在这个方法中，可容易地鉴别部分或完全缺失、破坏或失活突变。确定活性的直接方法可例如基于用细胞提取物的测定，其中测量底物消耗或反应产物形成(例如，底物海藻糖6-磷酸或反应产物葡萄糖-6-磷酸和β-D-葡萄糖-1-磷酸)，可能先前的代谢标签组合。还可通过例如高效阴离子交换色谱法(HPAEC)容易地确定底物和产物，例如Andersson等2001(见上)的描述。本文中使用的术语“缺乏TrePP活性”意味着不存在或基本上不存在TrePP活性。通过进一步的指导，TrePP活性低于野生型革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之PtcC活性的20％。例如，TrePP活性低于野生型TrePP活性的15％，优选低于10％，更优选低于5％，甚至更优选低于1％。如之前指出的，最优选TrePP活性是无法检测的或者基本上或完全不存在。
本发明人已经发现异源性海藻糖6-磷酸合酶和/或异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶的存在还可以增强细胞内海藻糖积累。因此，在一个实施方案中，本发明涉及如本发明所述的含有功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶的革兰氏阳性细菌，优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌。在另一个实施方案中，本文中所述的革兰氏阳性细菌，优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌含有功能性异源性海藻糖6-磷酸合酶。还在另一个实施方案中，本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)含有功能性异源性海藻糖6-磷酸合酶并含有功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。在一些优选的实施方案中，海藻糖6-磷酸合酶是otsA，优选来自大肠杆菌的otsA。在另一个优选的实施方案中，海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB，优选来自大肠杆菌的otsB。
特别优选的是海藻糖6-磷酸磷酸酶和/或合酶的基因组整合，其中所述整合优选如具有申请号为11168495.7和11173588.2的欧洲专利申请所公开。这些申请涉及涉及双顺反子表达系统并且通过参考以其整体并入本文。如本文中使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶(优选otsB)和/或海藻糖6-磷酸合酶(优选otsA)的优选位置为作为在内源性usp45基因之后的第二顺反子。
本文中使用的术语“含有”优选涉及表达特定基因产物的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，即在所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中产生功能性或活性蛋白质。
本文所使用的术语“海藻糖6-磷酸磷酸酶”涉及使海藻糖6-磷酸去磷酸的酶，优选催化海藻糖-6-磷酸产生磷酸和海藻糖之反应的酶。海藻糖6-磷酸磷酸酶属于磷酸单酯水解酶家族。海藻糖6-磷酸磷酸酶的同义词例如α，α海藻糖-6-磷酸磷酸水解酶、海藻糖-6-磷酸磷酸水解酶和海藻糖6-磷酸酶。例如，大肠杆菌的海藻糖6-磷酸磷酸酶(即otsB)的核酸和蛋白质序列分别如SEQ ID NO：3和4所示(分别对应于Genbank登录号X69160.1(核苷酸位置675-1475)和P31678.2)。在一个实施方案中，本文中使用的术语海藻糖6-磷酸磷酸酶涉及基因或蛋白质，其分别具有SEQ ID NO：3和4的核酸或氨基酸序列，或者具有编码SEQ IDNO：4的核酸。在另一个实施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶涉及具有分别与SEQ ID NO：3和4有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白质。在另一个实施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶编码与SEQ ID NO：4有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)的蛋白质。优选地，上述序列涉及或编码功能性海藻糖6-磷酸磷酸酶蛋白。在另一个实施方案中，本文所使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶是SEQ ID NO：3和4的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)直系同源物。
本文中使用的术语“海藻糖6-磷酸合酶”涉及使海藻糖6-磷酸去磷酸化的酶，优选催化葡萄糖6-磷酸与UDP-葡萄糖反应产生海藻糖6-磷酸之反应的酶。海藻糖6-磷酸合酶属于糖基转移酶家族。海藻糖6-磷酸合酶的同义词例如海藻糖磷酸-尿苷二磷酸糖基转移酶、磷酸海藻糖-尿苷二磷酸转葡糖基酶、尿苷二磷酸葡萄糖磷酸糖基转移酶，和α，α-海藻糖-6-磷酸合酶。例如，大肠杆菌的海藻糖6-磷酸合酶(即otsA)的核酸和蛋白质序列分别如SEQID NO：5和6所示(分别对应于Genbank登录号X69160.1(核苷酸位置1450-2874)和P31677.3)。在一个实施方案中，本文中使用的术语海藻糖6-磷酸合酶涉及基因或蛋白质，其分别具有SEQ ID NO：5和6的核酸或氨基酸序列，或者具有编码SEQ ID NO：6的核酸。在另一个实施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸合酶涉及具有分别与SEQ ID NO：5和6有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白质。在另一个实施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸合酶编码与SEQID NO：6有至少75％同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)的蛋白质。优选地，上述序列涉及或编码功能性海藻糖6-磷酸合酶蛋白。在另一个实施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸合酶是SEQ ID NO：5和6的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)直系同源物。
可使用本领域已知的任意方法获得缺乏PtcC和/或TrePP活性并且任选含有根据本发明的异源性基因或基因产物(例如海藻糖6-磷酸合酶或磷酸酶或预防性和/或治疗性异源性基因或基因产物)的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，使用分子生物学方法实现，或通过天然变体或从随机化学或放射诱变获得的变体的高通量筛选获得。(可通过使用在海藻糖上不生长的trePP缺陷菌株的方法或者通过trePP直系同源物的高通量测序和生物学分析或其他方法进行trePP KO的高通量筛选)。(对于涉及LAB之重组技术和遗传操作的背景参见例如″Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria″，Gasson&de Vos编辑，Blackie Academic&Professional，1994和″Genetics of LacticAcid Bacteria″，Wood&Warner编辑，Springer，2003”)在实施方案中，在根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中，编码内源性PtcC和/或TrePP和/或启动子(trePP和/或ptcC通过所述启动子表达)的基因已经被部分地或完全地缺失、破坏或失活，例如变得不能产生功能性ptcC和/或trePP基因产物。用于基因破坏的技术是本领域中公知的。例如，可通过完全或部分移除编码区(敲除)或作为替代地完全或部分移除或诱变启动子区来失活内源性ptcC和/或trePP基因。或者，可以插入失活(敲入)ptcC和/或trePP基因，从而破坏内源性编码序列。例如，可以引入早熟终止密码子(premature stop codon)或框移突变。还可以通过引入一个或更多个错义或无义突变来诱变ptcC和/或trePP基因，只要功能性PtcC和/或TrePP可不再或基本不再产生(即PtcC和/或trePP活性(基本上)不存在)即可。应当理解，还涵盖自发的突变。
本发明人还发现，过表达一种或更多种海藻糖转运蛋白还增强革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中细胞内海藻糖积累和/或保持。因此，在一个实施方案中，本发明涉及过表达(优选组成型过表达)一种或更多种编码海藻糖转运蛋白之基因的革兰氏阳性细菌，优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌(如本文中所述的)。在一个优选的实施方案中，海藻糖转运蛋白是革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的内源性海藻糖转运蛋白。在另一个优选的实施方案中，海藻糖转运蛋白是位于革兰氏阳性细菌优(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之海藻糖操纵子中的内源性海藻糖转运蛋白。在另一实施方案中，海藻糖转运蛋白是位于革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之海藻糖操纵子内的磷酸转移酶系统(PTS)的内源性海藻糖转运蛋白。在一个优选的实施方案中，通过向一种或更多种转运蛋白的5′插入启动子使得启动子与转运蛋白序列可操作地连接来完成一种或更多种本文中所述的海藻糖转运蛋白的过表达。可操作地连接是指毗邻(juxtaposition)，其中这样描述的组件处于允许他们以其预期的方式发挥功能的关系中。启动子序列与编码序列“可操作地连接”至是以这样的方式连接，使得在与启动子序列相容的条件下实现编码序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子是强启动子。在另一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子。还在另一个实施方案中，所述启动子是内源性革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)启动子。合适的启动子可见于例如WO2008/084115，其以其整体并入本文。特别地，2008/084115的表12中所列的启动子特别适合过表达本文中所述的转运蛋白。最优选地，启动子是PhIIA(即HU-样DNA结合蛋白的启动子)。因此，在一个优选的实施方案中，PhIIA启动子被插入到位于革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之海藻糖操纵子中的内源性海藻糖转运蛋白之编码区的上游。在一个实施方案中，PhIIA启动子具有SEQ ID NO：13的序列，对应于乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363的PhIIA启动子。在另一个实施方案中，PhIIA启动子具有与SEQ ID NO：13有至少75％同一性，例如与SEQ ID NO：13有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的序列。在另一个实施方案中，PhIIA是SEQ IDNO：13的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)直系同源物。
例如，本文所指的海藻糖转运蛋白分别由SEQ ID NO：9和10(分别对应于Genbank登录号NC_009004.1(区域446937-447422)和YP_001031803.1)，和/或SEQ ID NO：11和12(分别对应于Genbank登录号NC_009004.1(区域447563-449128)和YP_001031804.1)的乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363核酸和氨基酸序列代表。在一个实施方案中，本文中所使用的过表达的转运蛋白涉及基因或蛋白质，其分别具有SEQ ID NO：9和10和/或分别具有SEQ ID NO：11和12的核酸或蛋白质序列，，或者具有编码SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：12的核酸序列。在另一个实施方案中，本文中所使用的过表达的转运蛋白涉及基因或蛋白质，其具有分别与SEQ ID NO：9和10，和/或分别与SEQ ID NO：11和12有至少75％同一性(例如75％、80％、85％、90％、95％或更高％同一性)的核酸或氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文中所使用的过表达的转运蛋白编码蛋白质，其具有与SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：12至少75％的同一性(例如75％、80％、85％、90％、95％或更高％的同一性)。优选地，上述序列涉及编码(a)功能性过表达的(优选组成型过表达的)转运蛋白蛋白质。在另一个实施方案中，本文所使用的(组成型)过表达的转运蛋白是SEQ ID NO：9和10和/或SEQ ID NO：11和12的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)直系同源物。
本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)示出针对多种与环境和贮藏相关的损害和胁迫的提高的耐受，例如提高的干燥、喷雾干燥、冷冻、或冷冻干燥抗性，并且针对在胃肠道中的苛刻条件(例如酸和胆汁盐)的提高的抗性。因此，根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)特别适合于被施用至对象同时在肠道中示出提高的存活率。因此，这些革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)还可应用于将蛋白质递送至对象。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的含有一种或更多种异源性基因产物(优选一种或更多种预防性和/或治疗性基因产物和/或抗原)的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)。生物活性多肽的递送已经例如描述于WO97/14806、WO00/23471、WO0I/02570、WO02/090551、WO2005/111194、WO2007/025977、WO2007/063075、WO2007/128757、WO2008/071751、WO2008/090223、WO2004/046346和WO2010/034844。优选地，本文中所述的异源性基因并入到细菌基因组。特别优选的并入策略公开于专利号为11168495.7和11173588.2的欧洲专利申请，其通过引用以其整体并入本文。特别地，异源性基因可以多顺反子地(例如双-、三-或多-顺贩子地)作为在天然(内源性)基因座(优选操纵子)中的第二(或另外的)基因来插入。以这种方式，异源性基因在天然(内源性)启动子的控制下表达。
本文中使用的术语“抗原”一般是指引起免疫应答(包括体液免疫和/或细胞免疫应答)的物质，并且其能够与免疫应答的产物(例如抗体或T细胞)结合。本文中所预期内的抗原可以作为替代地例如是为了诱导免疫耐受，例如可以是自身抗原(包括自身抗原和同种异体抗原)或可以是变应原。因此，在一个优选的实例中，抗原需要其所施用对象的功能性免疫系统以从这样的对象中引起生理应答。本文中所预期的“抗原”还涵盖“自身抗原”，其不会在一个健康的个体中引起免疫应答，但会在患有自身免疫疾病的人中引起免疫应答，即器官无法识别其自己的组成部分(下至亚分子水平)为“自身”，其导致针对其自身细胞和组织的免疫应答。由这样的异常免疫应答导致的任何疾病被称为自身免疫疾病。因此，本文中所预期的“抗原”还涵盖(生理活性)蛋白质，其不会在健康个体中引起免疫应答但会在所述蛋白质遗传缺陷的个体中引起免疫应答。此外，本文中所预期的“抗原”还涵盖变应原，其在健康个体中不引起免疫应答但将在患有过敏性疾病的患者中引起免疫应答。
本文中所预期的抗原可以源自任意多肽，在人或动物对象中的免疫应答对其将会是治疗上有用的，例如来自病原体，例如来自病毒、原核(如细菌)或真核病原体，来自非生理蛋白质(例如癌组织来源的蛋白质)，来自变应原(例如，用于引发免疫耐受)等。抗原还可以是蛋白质的代谢物。例如，抗原可以是多糖、脂质等。本文中所述的强启动子可以驱动表达必须的酶来合成或组装所述多糖、脂质等。
术语“预防性和/或治疗性基因产物”，多肽或蛋白一般是指肽、多肽或蛋白质，其所施用的人或动物对象中不引发针对其自身的免疫应答(即非疫苗发生性(non-vaccinogenic))并且能实现治疗和/或治疗效果。因此，将期望这样的肽、多肽或蛋白质的预防性和/或治疗性效果直接与其天然的生物学功能相关，从而它可在对象的身体中实现特定的效果，而不是通过在对象中充当免疫原性和/或免疫保护性抗原来产生预防性和/或治疗性效果。因此，非疫苗发生性的预防性或治疗性活性肽、多肽或蛋白质在其表达形式中将会是生物活性的或至少一旦从表达宿主细胞释放必须转变成生物活性形式。优选地，所述肽、多肽或蛋白质的这种生物学活性形式可以显示二级并且还优选三级构象，这与其天然构造相同或密切相似。
优选地，预防性和/或治疗性基因产物、多肽或蛋白质还是无毒的并且非致病性的。在一个优选的实施方案中，预防性和/或治疗性基因产物、多肽或蛋白质可以源自人或动物，并且可以优选对应于与所施用的人或动物对象相同的分类单位(taxon)。
合适的预防性和/或治疗性基因产物、多肽或蛋白质包括能够局部地或全身性地发挥功能的那些，例如能够发挥影响局部或整个身体代谢的内分泌活性，和/或能够调节属于免疫造血系统之细胞的活性，和/或能够影响身体中多种正常或肿瘤细胞的活力、生长和分化或影响免疫调节或对损伤或感染之急性期炎性应答的诱导，和/或能够增强或诱导对由趋化因子作用于其靶细胞受体所介导之细胞和组织感染的抗性或表皮细胞的增殖或对伤口愈合的促进，和/或能够调节体内细胞表达或产生物质。这样的肽、多肽或蛋白质的特定实例包括但不限于胰岛素、生长激素、催乳激素、降钙素、黄体生成素、甲状旁腺激素、生长抑素、促甲状腺激素、血管活性肠多肽、细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-I1、IL-12、IL-13、IL-14至IL-32的任一种，特别是IL-27、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、细胞因子的TNF家族(例如，TNFα、TNFα、CD40、CD27或FAS配体)、细胞因子的IL-1家族、成纤维细胞生长因子家族、血小板衍生生长因子、转化生长因子和神经生长因子、细胞因子的表皮生长因子家族、胰岛素相关的细胞因子等。或者，预防性和/或治疗性活性多肽可以是用于以上限定的预防性和/或治疗性活性多肽的受体或拮抗剂。或者，预防性和/或治疗性活性多肽可以是抗体，例如中和抗体，或其类似物。这样的合适的多肽的另外的特定实例列在例如WO96/11277第14页第1-30行，其通过参考并入本文；WO97/14806第12页第1行直到第13页第27行，其通过参考并入本文；或US5,559,007，第8栏第31行直至第9栏第9行，其通过参考并入本文。在一个实例中，所述非疫苗发生性预防性和/或治疗性活性肽、多肽或蛋白质可以是IL-10，更优选hIL-10、胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)、更优选hGLP-1、胰高血糖素样肽2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)、更优选hGLP-2、三叶因子(trefoil factor，TFF，例如TFF1、2和/或3)或PYY，更优选hPYY。
如提到的，在一些实施方案中，预防性和/或治疗性活性多肽可以是抗体，例如中和抗体或其类似物。本文中所述的抗体可以是完整大小抗体或其功能性片段，例如Fab、融合蛋白或多聚体蛋白。在一个优选的实施方案中，一种或更多种异源性基因编码抗体或功能性抗体片段。本文所使用的术语“功能性”是指抗体片段，其仍可以发挥其预期的功能，即抗原结合。本文中所使用的术语抗体可以包括但不限于常规抗体、嵌合抗体、dAb、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、二价抗体、三价抗体、多价抗体、VHH、纳米抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、FV、dAb、Fd、双抗体(diabody)，三抗体(triabody)、单链抗体、单结构域抗体(single domain antibody)、单个抗体可变结构域。
在本发明的上下文中，术语“抗体”用于描述免疫球蛋白(无论是天然的或者部分地或整体地经改造的)。可用多种方式修饰抗体，术语抗体应当解释为涵盖任意特异性结合分子或物质，其具有用于针对分子对之另一成员(即如上所限定的靶分子)的特异性结合所需的结合结构域。因此，该术语涵盖抗体片段、衍生物、功能等价物和抗体的同源物，以及单链抗体、双功能抗体、二价抗体、VHH、纳米抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、FV、dAb、Fd、双抗体，三抗体和骆驼科(camelid)抗体，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任意多肽(无论是天然的或者整体地或部分地经改造的)。因此，包括了包含融合至另一多肽的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子。该术语还涵盖了具有是抗体结合结构域或与其同源之结合结构域的任意多肽或蛋白质，例如抗体模拟物。抗体的实例是免疫球蛋白同种型以及其同种型亚家族，包括IgG(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgM和IgE。因此，本领域技术人员将理解本发明还涉及包含抗原结合结构域的抗体片段，例如VHH、纳米抗体、Fab、scFv、Fv、dAb、Fd、双抗体和三抗体。在一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌或重组核酸，其中一个外源基因编码抗体之轻链(VL)或其功能性片段，并且另一个外源基因编码抗体之重链(VH)或其功能性片段，更优选其中所述功能性片段是Fab。在一个实施方案中，编码VL或其功能性片段的外源基因与编码VH或其功能性片段之外源基因的3′端在转录上相偶联(transcriptionally coupled)。
在一个实施方案中，本文中所述的(中和)抗体至少部分地或完全地阻断、抑制或中和目的分子(例如细胞因子或趋化因子或毒素)的生物学活性。本文中使用的表述“中和”意味着在体内或体外通过本领域已知的(例如实施例中详述的)方法测量的细胞因子或毒素之生物学活性的抑制或降低。特别地，可以通过在组织或血液样品中确定结肠炎评分(colitic score)或通过确定靶分子来测量所述抑制或降低。本文中使用的表述“中和”意指在体内或体外测量的细胞因子或毒素的生物学活性被抑制或降低至少10％或更多，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％以及甚至更优选100％。
优选地，所述抗体或其功能性片段抑制选自以下名单的细胞因子的生物学作用：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12(或其亚基IL-12p35和IL12p40)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23(或其亚基IL-23p19)、IL-27、IL-32(及其剪切变体)、IFN(α、β、γ)和TNFα。或者，这些细胞因子可以被不是抗体的结合分子抑制。优选地，所述结合分子是可溶性细胞因子受体(例如gp130)或与所述细胞因子的受体结合而不触发炎性信号，所述受体例如IL-2R(CD25、CD122、CD132)、IL-12R(β1、β2)、IL15R、IL-17R、IL-23R或IL-6R。优选地，所述结合分子中和选自以下名单的趋化因子：MIF、MIP-1α、MCP-1、RANTES和嗜酸性粒细胞活化趋化因子(Eotaxin)。优选地，所述结合分子经结合选自以下名单的共刺激分子解决对免疫激活的阻断：CD3/CD28、HVEM、B7.1/B7.2、CD40/CD40L(CD154)、ICOS/ICOSL、OX40/X40L、CD27/CD27L(CD70)、CD30/CD30L(CD153)和41BB/41BBL。优选地所述结合分子经结合选自以下名单的黏附分子解决对炎症的阻断：I-CAM1、α4整合素和α4β7整合素。优选地，所述结合分子对CD3、CTLA4和/或PD1具有共刺激或激动作用。优选地所述结合分子通过靶向CD25、CD20、CD52、CD95、BAFF、APRIL和/或IgE来中和T细胞或B细胞活性。优选地，所述结合分子经与来自MMP家族的酶结合来解决对炎症的阻断。优选地，所述结合分子发挥抗血管发生作用，例如中和αvβ3/α5β1和IL-8活性。在另一个优选的实施方案中，所述结合分子或抗体(或功能性片段)能够中和TNFα、IL-12、IFNγ、IL-23或IL-17的生物学作用。
在本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中可用作异源性基因的抗体或结合分子的非限制性实例包括：
-抗TNFα抗体、抗TNFα抗体片段、抗TNFα单个抗体可变结构域、可溶性TNF受体或TNFα的显性失活变体；
-抗IL-12抗体、抗IL-12抗体片段、抗IL-12单个抗体可变结构域、可溶性IL-12受体、IL-12或IL-12dAb的显性失活变体；
-抗IL-12p35抗体、抗IL-12p35抗体片段、抗IL-12p35单个抗体可变结构域、可溶性IL-12p35受体、IL-12p35或IL-12p35dAb的显性失活变体；
-抗IL-12p40抗体、抗IL-12p40抗体片段、抗IL-12p40单个抗体可变结构域、可溶性IL-12p40受体、IL-12p40或IL-12p40dAb的显性失活变体；
-抗IL-23抗体、抗IL-23抗体片段、抗IL-23单个抗体可变结构域、可溶性IL-23受体、IL-23或IL-23dAb的显性失活变体；
-抗IL-23p19抗体、抗IL-23p19抗体片段、抗IL-23p19单个抗体可变结构域、可溶性IL-23p19受体、IL-23p19或IL-23p19dAb的显性失活变体；
-抗IFNγ抗体、抗IFNγ抗体片段、抗IFNγ单个抗体可变结构域、可溶性IFNγ受体或IFNγ的显性失活变体；
-抗IL-17抗体、抗IL-17抗体片段、抗IL-17单个抗体可变结构域、可溶性IL-17受体、IL-17或IL-17dAb的显性失活变体；以及
-抗MCP-1抗体、抗MCP-1抗体片段、抗MCP-1单个抗体可变结构域、可溶性IL-17受体、MCP-1或MCP-1dAb的显性失活变体。
在一个优选的实施方案中，所述抗体是Fab片段(结合抗原的片段)Fab是本领域中公知的。通过进一步的指导，Fab片段是与抗原结合之抗体上的区域。它由每个重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域组成。
在一个实施方案中，该Fab是cA2抗TNF Fab(其重链和轻链的可变结构域的多核苷酸和多肽序列在US6,790,444中分别作为SEQ ID NO：4和5(重链)和SEQ ID NO：2和3(轻链)公开)或CDP870抗TNF Fab(其重链和轻链的多核苷酸和多肽序列在WO01/94585中分别作为SEQ ID NO：114和115(重链)和SEQ ID NO：112和113(轻链))公开。
技术人员将会理解，作为功能性抗体片段以及特别是Fab片段的抗体是由通过二硫键共价连接的不同个体多肽构成。特别地，通过独立的个体编码序列来编码重链和轻链。
因此，在一个实施方案中，本文中公开的异源性基因编码抗原和/或(中和)抗体或功能性片段或其变体和/或预防性和/或治疗性活性肽、多肽或蛋白质，其中所述抗原能够在人或动物对象中引发免疫应答，优选保护性免疫应答或免疫耐受应答，和/或所述预防性和/或治疗性基因产物、多肽或蛋白质能够在人或动物对象中产生预防性和/或治疗性效果。
在一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)或用于本文中所述用途的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，其被配制用于贮存。特别地，在一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，其是冷冻的、干燥的、冷冻干燥的、喷雾干燥的或贮存在介质中。
如先前解释的，本发明还涉及包含本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)或者包含用于本文中所述用途之革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的组合物。这样的组合物可以是药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及组合物或药物组合物，其用于治疗或用作药物、营养品、医疗食品、功能性食品、益生菌组合物、食品添加剂或起子培养物。在另一个实施方案中，本发明涉及这样的组合物或药物组合物作为药物、营养品、医疗食品、功能性食品、益生菌、食品添加剂、起子培养物的用途，或者用于制备药物、营养品、医疗食品、功能性食品、益生菌组合物、食品添加剂、起子培养物的用途。
如本文中所使用的，本文中所述的药物组合物(例如药物制剂、营养品、医疗或功能性食品或益生菌)优选地包含治疗有效量的本发明之革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)以及可药用载体(即一种或更多种可药用载剂物质和/或添加剂)，例如缓冲剂、载剂、赋形剂、稳定剂等。本文所使用的术语“可药用”与本领域一致并且意指与药物组合物中的其他成分相容，并且对其接受者无害。
在一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)。术语“治疗有效量”是指在对象(例如人或动物)中有效地治疗疾病或病症的治疗物质或组合物的量，即获得期望的局部或全身作用和性能。例如，细菌的治疗有效量可以例如在单一或重复剂量中包含至少1个细菌、或至少10个细菌、或至少102个细菌、或至少103个细菌、或至少104个细菌、或至少105个细菌、或至少106个细菌、或至少107个细菌、或至少108个细菌、或至少109、或至少1010、或至少1011、或至少1012、或至少1013、或至少1014、或至少1015或更多宿主细胞，例如细菌。本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以单独施用或与一种或更多种活性化合物组合施用。后者可以在施用根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之前、之后或与其同时施用。
优选地，本文中所述的兰氏阳性菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)或包含这些兰氏阳性菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的组合物以单位剂量形式提供，例如片剂、胶囊、灌肠剂或定量气雾剂(metered aerosol dose)，使得向对象(例如人或动物患者)施用单一剂量。
活性成分可以一天施用1至6次，充分地展示出期望的活性。这些每日剂量可以作为单一剂量每日一次给予，或在一天中的相同或不同的时间给予两个或更多个更小的剂量，其总计给予指定的日剂量。优选地，所述活性成分一天施用一次或两次。例如，可以在早晨接受一个剂量并且当天晚些时候接受一个剂量。
在本发明的所有方面中，可以给予患者每日维持剂量持续临床上需要的周期，例如1天至几年(例如哺乳动物整个剩余的生命)，例如从约(2或3或5天、1或2周或1个月)以上和/或例如长达约(5年、1年、6个月、1个月、1周或3或5天)。每日维持剂量的施用持续约3至约5天或持续约1周至约1年是典型的。流体制剂的其他组分可以包括防腐剂、无机盐、酸、碱、缓冲剂、营养物质、维生素或其他药物。
本文中所教导的人和动物对象可以指需要治疗或处理的人或动物，所述治疗或处理包括向所述人或动物施用治疗有效量的本文中所教导的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)。动物可以优选为温血动物，更优选脊椎动物，甚至更优选哺乳动物，例如家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物和实验动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，例如猿、猴、猩猩、黑猩猩；犬科动物，例如狗和狼；猫科动物，例如猫、狮和虎；马科动物，例如马、驴和斑马；肉用动物如牛、猪、绵羊；有蹄类动物，例如鹿和长颈鹿；啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等。一般而言，术语“对象”或“患者”可以互换使用并且特别地指动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，甚至更优选哺乳动物，仍然更优选灵长类动物，并且特别地包括人患者和非人动物、哺乳动物和灵长类动物。优选的患者可以是人对象。
在人或动物中通过递送本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)(任选的表达预防性和/或治疗性肽、多肽、或蛋白质)的可治疗疾病之类型的非限制性实例还包括但不限于：例如炎性肠病，包括克罗恩氏病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎(可用例如IL-1ra或IL-10或IL-27或三叶肽治疗)；自身免疫性疾病，包括但不限于1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(可用例如IL-1ra或IL-10或IL-27或相关的自身抗原治疗)；变应性性疾病包括但不限于哮喘、食物变态反应(可用相关的变应原治疗)，乳糜泻(celiac disease，可用谷蛋白变应原和/或IL-27治疗)；神经疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症(可用例如脑源性神经营养因子(braindevated neurotropic factor)和睫状神经营养因子(ciliary neurotropic factor)治疗)；癌症(可用IL-1、集落刺激因子或干扰素-W治疗)；骨质疏松症(可用例如转化生长因子F3治疗)；糖尿病(可用例如胰岛素治疗)；心血管疾病(可用组织血纤维蛋白溶酶原活化因子治疗)；动脉粥样硬化(可用例如细胞因子和细胞因子拮抗剂治疗)；血友病(可用例如凝血因子治疗)；退行性肝疾病(可用例如肝细胞生长因子或干扰素a治疗)；肺疾病，例如囊肿性纤维化(可用例如α-抗胰蛋白酶治疗)；肥胖；病原体感染，例如病毒或细菌感染(可用任意数目的以上提到的组合物或抗原治疗)；等。
根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)还可用于治疗传染病。在一个实施方案中，用经根据本发明革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)局部地产生或分泌的毒素中和抗体可获得针对梭状芽孢杆菌(Clostridium)相关的疾病(优选艰难梭状芽孢杆菌相关的疾病(Clostridium dificileassociated disease，CDAD))的被动免疫。CDAD是通过两种外毒素介导的，毒素A(肠毒素，参见例如Genbank NC_009089.1，区域795843..803975的DNA序列或YP_001087137.1的蛋白质序列)和毒素B(细胞毒素，参见例如NC_009089.1，区域：787393.794493的DNA序列或YP_001087135.1的蛋白质序列)。二者都是与肠上皮细胞结合的高分子质量蛋白质，当它们被内化并催化胞质rho蛋白的糖基化时导致细胞死亡、炎症和腹泻。它们还参与了促进艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)毒力、定植、以及中性粒细胞趋化和活化。该细菌自身不是侵入性的并且不引起组织损害。通过用抗体中和艰难梭状芽孢杆菌毒素，病原体的致病机制被阻断，其在肠道中繁盛的能力可被削弱，而对微生物生态的影响可以降到最低，允许正常微生物群落恢复。该方法的医疗优势可包括更迅速的恢复、更少的复发、并在正常肠道菌群中缓解抗生素抗性选择压力。因此，在一个优选的实施方案中，本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)还含有、表达、产生和/或分泌的中和抗体，所述中和抗体针对梭状芽孢杆菌(优选艰难梭状芽孢杆菌)毒素A和/或毒素B，其中这些毒素各自优选具有以上指出的序列。技术人员读者将会理解，除了全长抗体之外，可以使用如本文中其他地方描述的多种功能性片段或经修饰或变体抗体。
技术人员读者将理解，本文中明确记载的疾病仅是示例性的并且其记载绝非旨在将本文中所教导的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的用途限制到这些具体的疾病。相反，技术人员读者理解，本文中公开的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)原则上可用于表达任何目的表达产物(优选多肽)，其不仅可以与所记载的那些相关而且可以与人和动物中多种另外的疾病或病症相关。因此，一旦合适的表达产物(优选多肽，例如抗原和/或预防性和/或治疗性基因产物(多肽或蛋白质))已经被选定或确定用于给定的疾病(ailment)，技术人员将能够使用本发明的试剂来实现其表达、分离和/或递送。
本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以悬浮在药物制剂中用于向患有待治疗之疾病的人或动物施用。这样的药物制剂包括但不限于活宿主细胞和适合于施用的介质。重组宿主细胞可以在常规赋形剂(例如乳糖、其他糖、碱和/或碱土硬脂酸盐、碳酸盐和/或硫酸盐(例如，硬脂酸镁、碳酸钠和硫酸钠)、高岭土、二氧化硅、香料(flavorant)和香味剂(aroma))的存在下冻干。
如此冻干的根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以以胶囊、片剂、颗粒剂和散剂的形式制备，其各自可通过经口途径施用。
或者，一些革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以在合适的介质中配制成水悬浮液或者冻干的细菌可以临用前混悬在合适的介质中，这样的介质包括本文中提到的赋形剂或其他赋形剂(例如葡萄糖、甘氨酸和糖精钠)。
对于经口施用，可配制胃抗性经口剂型，该剂型(gastroresistant oral dosageform)可以包括提供革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的控制释放的化合物，并且由此提供其中所编码的所期望蛋白质的控制释放。例如，该经口剂型(包括片剂、微丸(pellet)、颗粒剂和散剂)可以用赋形剂(通常为聚合物、纤维素衍生物和/或亲脂性物质)的薄层进行包衣，所述赋形剂抵抗胃中(但不抵抗肠中)的溶解和破坏，从而允许通过胃，有利于在肠中的崩解、溶出和吸收。
经口剂型可以设计为允许革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)(以及任选的其治疗性和预防性基因产物)的缓慢释放，例如控制释放、持续释放、延长释放、持续作用的片剂或胶囊。这些剂型通常含有常规的或公知的赋形剂，例如亲脂性、聚合物、纤维素、不溶性、可溶胀的赋形剂。控制释放制剂可用于包括肠、结肠、生物黏附的任意其他递送位点或舌下递送(即，牙黏膜递送)和支气管递送。当本发明的组合物被直肠或阴道施用时，药物制剂可以包括栓剂和乳膏剂。在这种情况下，宿主细胞混悬在还包括脂质的常用赋形剂的混合物中。每种前述的制剂在本领域中是公知的，并且描述于例如以下的参考文献：Hansel等(1990，Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems，第5版，William和Wilkins)，Chien1992，Novel drug delivery system，第二版，M.Dekker)，Prescott等(1989，Novel drug delivery，J.Wiley&Sons)，Cazzaniga等，(1994，Oraldelayed release system for colonic specific delivery，Int.J.Pharm.i08：7′)。
优选地，灌肠剂制剂可以用于直肠施用。术语“灌肠剂”用于涵盖旨在用于直肠使用的流体制剂。灌肠剂一般可以单一剂量容器供给并含有溶解在水、甘油、聚乙二醇或其他合适溶剂中的一种或更多种活性物质。
本发明的优选实施方案提供了肠溶包衣胶囊，其包含稳定的冷冻干燥的、干燥的或喷雾干燥的有活力的本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，其特征在于使用非吸湿剂(non-hygroscopic agent)稳定所述有活力的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)。如本文中所使用的非吸湿剂旨在包括通常用于药物组合物之制剂的任何赋形剂，并且其中所述非吸湿剂在环境40％RH表现出不超过约8wt％、优选不超过约wt7％以及更优选不超过约6wt％(例如约1wt％至约5wt％，更特别的少于或等于2wt％)的平衡水分吸收(equilibrium moisture uptake)。所述非吸湿剂可是多元醇例如甘露醇、麦芽糖醇、异麦芽糖(多元醇糖)或磷酸盐(例如无水磷酸二钙磷酸氢钙、磷酸氢钙)或例如糖(如蔗糖)。
前述制剂中使用的胶囊通常选自：明胶胶囊、淀粉胶囊、羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊等；特别是HPMC胶囊。为了有活力细菌的肠递送，本发明的肠溶包衣胶囊应该在低pH(高至pH5.5)稳定并且在较高pH(pH5.5以上)有加速溶出谱。当胶囊在约pH6.8崩解1小时以内时实现最佳的释放。因此，在本发明的另一个实施方案中，用肠溶聚合物对胶囊进行包衣以提供在高至pH5.5稳定的肠溶包衣胶囊并且其在pH5.5以上是可溶的，特别是在pH6.0以上，更特别的在约pH6.8具有快速溶出谱。
用于肠溶包衣的肠溶聚合物通常由可形成薄膜的聚合物质组成，其在pH5.5以上是可溶的，特别在pH6.0以上。可用于本发明的一些不同实施方的可形成薄膜的聚合物一般选自：纤维素衍生物、丙烯酸共聚物、马来酸共聚物、聚乙烯衍生物、虫胶(shellac)等；特别是选自以下的丙烯酸共聚物：苯乙烯-丙烯酸共聚物、丙烯酸甲酯-丙烯酸共聚物，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸丁酯-苯乙烯-丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(例如Eudragit L100、Eudragit S或Eudragit S100(各自为商品名，从Pharma，Germany市售可得))、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(例如Eudragit L100-55(商品名，从Pharma，Germany市售可得))、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸-丙烯酸辛酯共聚物等，更特别的是可形成薄膜的聚合物由甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物组成。
此外，在干燥、喷雾干燥或冷冻干燥之前向细菌生物质添加不同稳定化合物(冷冻保护剂)的组合。该稳定化合物的组合包括淀粉水解产物和谷氨酸盐和/或多元醇，导致干燥的、喷雾干燥的或冷冻干燥的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的改善的存活或稳定性。
本文中所述的制剂和胶囊可用作药物、营养品、食品添加剂、功能性食品、医疗食品、起子培养物和/或益生菌组合物。
因此，根据本发明，在一个优选的实施方案中，本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)或包含这些革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的(药物)组合物可以经黏膜(例如经口、经鼻、直肠、阴道或支气管途径)向动物或人施用(通过任一种可应用于特定途径的现有技术制剂)。用于施用的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的剂量将取决于许多因素，其包括细菌的类型和由此编码的基因、待治疗之疾病的的类型和严重程度以及待使用的施用途径。因此，无法限定用于本发明之各个或每个实施方案的精确剂量，但一旦配备了本发明，对本领域技术人员来说将是容易地显而易见的。不管怎样剂量可以逐个案例的方式确定，通过在施用预定数量的细胞后使用公知的方法(例如那些称作ELISA或Biacore(参见实施例))测量治疗性和/或预防性蛋白质的血清水平浓度。对所递送的重组蛋白质的动力学曲线和半衰期的分析提供了充分的信息以允许确定革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的有效剂量范围。
在一个实施方案中，当革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)表达抗原时，本发明可因此还提供了疫苗。优选地，所述抗原可以在人和动物中引起免疫应答并且用作疫苗。术语“疫苗”等于这样的可药用组合物，当其以有效量施用于动物或人对象时能够诱导对包含在疫苗中所包含之抗原的抗体和/或在对象中引起保护性免疫。本发明的疫苗将包含本文中所教导的任选的用编码该抗原之核酸或载体转化的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，以及还任选地赋形剂。这样的疫苗还可以包含佐剂，即增强对抗原之免疫应答的化合物或组合物。佐剂包括但不限于：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油或烃乳剂，以及潜在有用的可药用人佐剂如BCG(卡-介杆菌(bacilleCalmetle-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
在一个方面中，本发明涉及用于处理或治疗的方法，其包括将革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)或组合物(优选治疗和性/或预防性药物组合物)施用于有此需要的个体。
如上所述的，包含根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的组合物可以是起子培养物、益生菌组合物或食品添加剂。因此，本发明在一个方面涉及包含本文中所述之革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的起子培养物、益生菌组合物或食品添加剂。
起子培养物可以是例如液体培养物、液体加压培养物、冷冻或干燥的形式，包括例如干燥的、冷冻干燥的形式和喷涂/流化床干燥的形式、或冷冻或冷冻干燥浓缩的。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的起子培养物，其是干燥的、喷雾干燥的、冷冻的或冷冻干燥的。所述培养物可以在真空中或在例如N2、CO2等的气氛下包装。例如，起子培养物可以产生于或分布于密闭的封闭壳(enclosure)(优选无热原)中，所述可封闭壳由刚性、非柔性或柔性的合适的塑料或其他材料制造，可以向发酵处添加待发酵的有机物质或任选地在单独的起子培养基中第一次培养以获得高密度培养物。
除了根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，起子培养物还可以含有缓冲剂、生长刺激营养物(例如，可吸收的碳水化合物或氮源)或防腐剂(例如，冷冻保护的化合物)或其他载体(如果期望的话)例如奶粉或糖。
起子培养物可以是纯的培养物，即可以含有根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的一个单一隔离种群的生物质，即原则上从一个细胞起源的克隆。在另一个实施方案中，起子培养物可以是共培养物，即可以包含多于一种的本发明之革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，还任选包含另外的微生物(例如细菌或酵母)。
可以优选的是，起子培养物或高密度培养物含有一种或更多种本发明之革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的至少102个菌落形成单位(colony forming unit，CFU)，例如至少103CFU/g、至少104CFU/g，例如至少105CFU/g、至少106CFU/g，例如至少107CFU/g、至少108CFU/g、例如至少109CFU/g、至少1010CFU/g，例如至少1011CFU/g、至少1012CFU/g、或至少1013CFU/g。
通常，起子培养物或高密度培养物可以添加到起子培养基或有机物质或底物以在一种或更多种细菌菌株(以及任选地一种或更多种酵母株菌株)的有活力细胞的浓度中发酵，所述细菌菌株是至少102(CFU)的一种或更多种细菌菌株(以及任选地一种或更多种酵母株菌株)，例如至少103CFU/g、至少104CFU/g，例如至少105CFU/g、至少106CFU/g，例如至少107CFU/g、至少108CFU/g、例如至少109CFU/g、至少1010CFU/g、例如至少1011CFU/g、至少1012CFU/g、至少1013CFU/g的有机物质、培养基或底物。
在一个实施方案中，本发明涉及本文中所限定的起子培养物用于制备食品产品或涉及包含缺乏纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性之革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的食品添加剂或益生菌组合物或药物。在一个优选的实施方案中，编码内源性PtcC的基因已经被部分或完全地缺失、破坏或失活，例如不能产生本文中其他地方所述的功能性ptcC基因产物。在另一个优选的实施方案中，起子培养物或食品添加剂或益生菌组合物或药物中的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)含有如本文中其他地方所述的功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶(例如otsB)和/或功能性异源性海藻糖6-磷酸合酶(例如otsA)。
在另一个实施方案中，本发明涉及本文中所限定的起子培养物或食品添加剂或益生菌组合物或药物，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。在一个优选的实施方案中，编码内源性TrePP的基因已经被部分或完全地缺失、破坏或失活，例如不能产生如本文中其他地方所述的功能性TrePP基因产物。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及本文中所述的起子培养物或食品添加剂、益生菌组合物或药物，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)过表达(优选组成型过表达)一种或更多种如本文中其他地方所述的编码海藻糖转运蛋白(优选内源性海藻糖转运蛋白)的基因。
还在另一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的起子培养物、益生菌组合物或食品添加剂或药物，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)过表达本文中所述的一种或更多种异源性基因产物(优选一种或更多种预防性和/或治疗性基因产物)。
在一个实施方案中，本文中所述的起子培养物、益生菌组合物或食品添加剂是干燥的、冷冻的、喷雾干燥的、干燥的或冷冻干燥的。
如以上指出的，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)用于制备益生菌组合物、起子培养物(优选用于用作食品添加剂或用于制备食品产品或用于制备药物)的用途。在另一个优选的方面，本发明涉及起子培养物或益生菌组合物作为食品添加剂或用于制备食品产品的用途。
本文所使用的术语“食品添加剂”是指(优选地配制在组合物中的)革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，其可添加到人或动物食品或饲料，适合用于不经进一步修饰或作为替代地进一步修饰(例如食物或饲料的完全或部分的发酵或者食物或饲料之一种或更多种组分的完全或部分的发酵)之后消费。例如(但不限于此)，根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)或根据本发明的组合物(例如本发明所述的起子培养物)可用于乳制品工业，特别是用于制备经发酵的乳产品，也称作培养的乳制品食品、培养的乳制品产品或培养的奶产品。发酵过程提高产品的货架期，并且增加口感并提高乳的可消化性。本文所指的食物产品的实例包括但不限于：奶酪、酸奶(yoghurt)、酸奶油(sour cream)、酪乳(buttermilk)、嗜酸菌酸奶(acidophilus milk)......
在一方面中，本发明还涉及用于制备本文中所限定之药物、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物的方法，其中所述起子培养物优选地是用于制备食品产品的起子培养物，所述方法包括以下步骤：
i)在培养基中繁殖革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，
所述培养基包含能够被所述革兰氏阳性(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵的底物物质；以及
ii)将如此繁殖的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)分别配制为药物、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物。
用于繁殖革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的方法，以及能够被革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵的培养基或底物是本领域中公知的。在一个实施方案中，制剂作为药物、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物包含配制为液体培养物、液体加压培养物、冷冻或干燥的形式(包括例如干燥的、冷冻干燥的形式和喷涂/流化床干燥的形式、或冷冻或冷冻干燥浓缩的)。优选地，所述制剂包括干燥、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。
在另一方面中，本发明还涉及用于制备食品产品的方法，其包括将本文中所限定的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，本文中所限定的食品添加剂、本文中所限定的益生菌组合物或本文中所限定的起子培养物与能够被所述革兰氏阳性(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质混合。底物物质通常是碳源、优选碳水化合物或糖。能够被革兰氏阳性(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵的碳水化合物包括但不限于单糖或二糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖......在一个实施方案中，用于制备食品产品的方法包括以下步骤：
i)提供本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物；
ii)提供底物物质或包含能够被所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质的组合物(优选无毒或可食用组合物)；
iii)将本文中所限定的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，本文中所限定的食品添加剂、本文中所限定的益生菌组合物或本文中所限定的起子培养物与所述底物物质或组合物混合
iv)任选地繁殖所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，和/或用所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵所述底物物质或组合物。
在一方面中，本发明还涉及通过或可通过本文中所述的方法直接或间接获得的食品产品。
如前所述，根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)有利地在细胞内积累海藻糖。因此，在一方面中，本发明还涉及用于在革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中内部积累海藻糖的方法，例如海藻糖存在于生长培养基，或者外部的或外源性添加的海藻糖，所述方法包括在包含能够被所述革兰氏阳性(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质的培养基中繁殖根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)。在一个实施方案中，用于在革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中内部积累海藻糖的方法包括以下步骤：
i)提供本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)、或起子培养物；
ii)提供底物物质或包含能够被所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质的组合物(优选无毒或可食用组合物)；
iii)将本文中所限定的LAB或本文中所限定的起子培养物与所述底物物质或组合物混合；
iv)任选地繁殖所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，和/或用所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵所述底物物质或组合物。
根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)有利地示出改善的对胁迫的抗性以及改善的制造、加工和/或贮藏特性。因此，在一方面中，本发明涉及用于改善革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)之胁迫抗性或制造、加工和/或贮藏特性的方法，其包括修饰革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)，例如使其缺乏PtcC活性。在一个实施方案中，编码内源性PtcC的基因已经部分地或完全地缺失、破坏或失活，例如不能产生功能性ptcC基因产物。优选地，胁迫抗性或制造、加工和/或贮藏特性是选自以下的一种或更多种胁迫抗性或制造、加工和/或贮藏特性：对酸条件的抗性，对胆汁盐的抗性，对热的抗性、对盐的抗性、对干燥、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥的抗性，以及渗透抗性。
在一个实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)的确含有如本文中其他地方所述的功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶(例如otsB)和/或功能性异源性海藻糖6-磷酸合酶(例如otsA)。
在另一个实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。在一个优选的实施方案中，编码内源性TrePP的基因已被部分地或完全地缺失、破坏或失活，例如不能产生如本文中其他地方所述的功能性TrePP基因产物。
在另一个实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)过表达(优选组成型过表达)如本文中其他地方所述的一种或更多种编码海藻糖转运蛋白(优选内源性海藻糖转运蛋白)的基因。
还在另一个实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)过表达如本文中其他地方所述的一种或更多种异源性基因产物(优选一种或更多种预防性和/或治疗性基因产物)。
在一个实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，所述方法还包括干燥、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)、药物、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物的步骤。
本发明人还出人意料地发现根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)能够细胞内积累海藻糖，而不添加外部添加的海藻糖。有利的是，根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)可以在任选地甚至没有外部添加之海藻糖的培养基中繁殖，但仍然内部地积累海藻糖。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的方法，所述方法包括将本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在缺乏或基本上缺乏海藻糖的培养基、或缺乏或基本上缺乏外部或外源性添加之海藻糖的培养基中维持或繁殖。有利的是，这样的培养基可以包含另一个可发酵的碳源，例如但不限于麦芽糖和/或葡萄糖。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在包含能够被所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质的培养基中维持或繁殖，其中所述底物物质包含较少(例如次优的)、不包含或基本不包含海藻糖。或者，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在包含能够被所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质的培养基中维持或繁殖，其中所述底物物质包含麦芽糖。在一个优选的实施方案中，本发明涉及任何本文中所述的方法，其中根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在包含能够被所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)发酵之底物物质的培养基中维持或繁殖，其中所述底物物质包含麦芽糖并且其中所述所述底物物质包含较少(例如次优的)、不包含或基本不包含海藻糖。
如本文中使用，包含没有或基本上没有海藻糖或者没有外部添加的或外源性海藻糖的培养基是指不含有海藻糖或仅含有少量的海藻糖的培养基。优选地，在这样的培养基中海藻糖的量或浓度太低而不允许细菌能够将其用作唯一碳源。在一个实施方案中，培养基含有少于100mM、优选少于50mM、更优选少于25mM，例如少于15mM、少于10mM、少于5mM、少于2mM或少于1mM。在另一个实施方案中，在另一个实施方案中，培养基含有少于2w/w％或少于2v/w％的海藻糖，优选少于1w/w％或少于1v/w％的海藻糖，更优选少于0.5w/w％或少于0.5v/w％的海藻糖，例如少于0.3、少于0.2、少于0.1、0.05或少于0.01w/w％或v/w％的海藻糖。在另一个实施方案中，培养基含有少于碳源或可发酵之碳水化合物总量的20％、优选少于10％、更优选少于5％(例如少于3％、少于2％或少于1％)的海藻糖。
在另一个方面，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中积累细胞内海藻糖的用途。在一个优选的实施方案中，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在不存在或基本上不存在海藻糖的情况下在所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中积累细胞内海藻糖的用途。在另一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在麦芽糖(优选作为唯一或基本上唯一碳源)上维持或繁殖时在所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中积累细胞内海藻糖的用途。
如上所述，根据本发明的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)示出改善的对多种环境胁迫的抗性以及改善的制造、加工和/或贮藏特征。因此，在一方面中，本发明涉及本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)在所述革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中改善胁迫抗性或改善制造、加工和/或贮藏特征的用途。在另一方面中，本发明涉及用于在革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)中改善胁迫抗性或改善制造、加工和/或贮藏特征的方法，其包含产生如本文中所述的革兰氏阳性细菌(优选乳酸菌(LAB)或双歧杆菌)。
在一个实施方案中，胁迫抗性选自：对酸条件的抗性，对胆汁盐的抗性、抗热性、对盐的抗性、寒冷抗性以及渗透抗性，优选地选自对酸条件或胆汁盐的抗性，更优选对胆汁盐的抗性。在另一个实施方案中，制造、加工和/或贮藏特征选自：干燥、冷冻、冷冻干燥、喷雾干燥或在培养基中贮藏，优选冷冻、冷冻干燥，更优选冷冻干燥。
本发明的方面和实施方案还被以下非限制性实施例所支持。
实施例
表1提供了在本文中描述的菌株中遗传修饰的概要，除了图4中使用的菌株在表2中给出。
表1
本文中所述的菌株中遗传修饰的概述。指出了：a)海藻糖操纵子的结构：是否天然海藻糖操纵子启动子(Ptre)在海藻糖PTS转运蛋白之前(Ptre＞＞PTS)以及是否trePP被缺失(KO)或没有(野生型；wt)；b)ptcC基因的结构：野生型(wt)，通过插入终止密码子或基因缺失失活(KO)；c)不存在(-)或存在功能性失活(突变体)otsB或野生型otsB；或者在thyA启动子之后在thyA基因座插入或者在usp45基因之后作为第二顺反子插入(usp45＞＞otsB)；d)thyA基因的结构：野生型(wt)或通过基因缺失或cargo基因的插入(基因置换)失活(KO)；e)不存在(-)或uidA、hIL-10或抗TNF CDP870cargo基因的性质和结构，在hIIA启动子控制下(PhIIA＞＞)在thyA基因座插入，或者在usp45或gapB基因的下游(usp45＞＞；gapB＞＞)插入。所有的菌株源自乳酸乳球菌MG1363。
表2
所构建的鉴定海藻糖出口之菌株的概述。构建trePP缺陷的菌株以允许海藻糖积累并且在其中从乳酸乳球菌COG功能性策略“碳水化合物转运和代谢”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/cogtik.cgi？gi＝20494&cog＝G(基因和蛋白质命名从这里获得)获得的一组精选的基因被失活。指出了失活基因的基因ID以及失活的蛋白质产物。
通过寡核苷酸指导的重组工程(oligonucleotide directed recombinneering)来进行基因失活，在各自的目的基因中引入框内终止密码子。所有的菌株衍生自乳酸乳球菌MG1363。
实施例1：trePP失活后细胞内海藻糖积累
实验
菌株在50ml GM17T+500mM海藻糖中于30℃培养过夜(A)或24小时(B)，通过离心收集细胞并测定海藻糖含量：用0.25M碳酸盐缓冲液洗涤10ml当量的过夜培养物3次，之后测定细胞沉淀的重量(湿重)。使用裂解基质B和MP Fasprep-24设备以6m/s持续40秒(MPBiomedicals)在1ml0.25M碳酸盐缓冲液中裂解细胞。通过离心分离裂解细胞的上清液并在99℃加热30分钟。通过离心移除细胞碎片并且使用海藻糖测定试剂盒(K-TREH010/10，Megazyme，Ireland)测定海藻糖浓度。简言之，通过海藻糖酶将样品中的海藻糖水解成D-葡萄糖，并且释放的D-葡萄糖通过酶己糖激酶磷酸化并且腺苷-5′三磷酸(ATP)成为葡萄糖-6-磷酸，同时形成的腺苷-5′二磷酸(ADP)。在酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下，葡萄糖-6-磷酸被烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)氧化为葡糖-6-磷酸，伴随形成还原型烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。在这个反应中形成的NADPH的量是以D-葡萄糖之量进行化学计量的并且因此是以海藻糖之量进行化学计量的。通过在340nm吸光度的提高测量NADPH(相对于添加海藻糖之前的OD340)。通过使用系列稀释的海藻糖标准品计算海藻糖值并且表示为mg/g湿细胞沉淀重量(ww)。
结果
细胞内海藻糖积累可能在trePP失活之后、otsB表达或其组合之后，如在图1中指出的。图1(A)描述了TrePP野生型菌株(sAGX0037和sAGX0137)不积累海藻糖。在sAGX0137(含有非功能性突变体otsB)中trePP的失活导致SAGX0147，允许海藻糖的积累。野生型otsBSAGX0037的插入导致SAGX0139，允许海藻糖的积累。otsB和trePP KO的组合导致海藻糖积累的适度提高(sAGX0148)，其通过在乳酸乳球菌海藻糖操纵子(sAGX0167)的两个磷酸转移酶系统(PTS)基因之前插入的强组成型PhIIA启动子(其公开于WO2008/084115)而极大地增强。图1(B)示出TrePP野生型菌株sAGX0085不能积累海藻糖。trePP KO(sAGX0169)的失活仅允许海藻糖的积累。
从图1中显而易见的是，TrePP野生型菌株不积累海藻糖。trePP的基因破坏(基因缺失但也点突变)允许外源性海藻糖的细胞内积累。在菌株sAGX0147中存在非功能性otsB突变体基因，而菌株sAGX0169、SAGX0309和sAGX0319不携带otsB基因。除了thyA基因座中存在的hTFF1cargo基因，菌株sAGX0169除了trePP的破坏之外不携带其他遗传改变。在trePPKO菌株中的海藻糖积累是出人意料的，因为根据现有技术会相信这严重依赖于海藻糖-6-磷酸磷酸酶(otsB或类似物)。这样的功能还未在乳酸乳球菌中描述过并且将不会被预料到存在，因为它将通过海藻糖-6-磷酸转变成惰性的细胞内海藻糖而削弱乳酸乳球菌对海藻糖的代谢。出乎意料地，我们这里观察到这个功能存在于乳酸乳球菌中。TrePP KO可通过基因缺失进行，如本文所做或通过建立终止密码子或框移突变或启动子突变或鉴别自发的非功能性trePP突变体。当otsB这样存在(sAGX0139)或与trePP KO组合(sAGX0148)或甚至还与位于在乳酸乳球菌海藻糖操纵子(sAGX0167)之两个磷酸转移酶系统(PTS)基因前的强组成型启动子PhIIA(PhIIA＞＞trePTC)的插入组合时，海藻糖积累是可能的。otsB的优选位置(如它在本文中使用的)是以申请号为1168495.7和11173588.2之欧洲专利申请中所述构型(usp45＞＞rpmD＞＞otsB，其中rpmD是rpmD之前的基因间区)作为固有usp45基因之后的第二顺反子。
实施例2：外源性海藻糖的积累提供针对胆汁裂解的保护
实验
菌株在50ml GM17T或GM17T+500mM海藻糖中于30C培养过夜，通过离心收集细胞并且在25ml0.9％NaCl中重悬。获取样品并通过平板接种合适的稀释物(初始)确定CFU。在T0，添加25ml含1％牛胆汁的0.9％NaCl并且将细胞悬液在37℃孵育8小时。在T0、1、2、4、6和8小时获取样品。通过平板接种合适的稀释物确定CFU(图2A)，基本上按照实施例1中的描述测定海藻糖浓度(图2B)。
结果
细胞内海藻糖保护免受胆汁裂解并且细胞内海藻糖的损失与对胆汁盐裂解的抗性降低相一致。因此，海藻糖的泄露对于在胆汁中的长期稳定性来说是有问题的。
图2中指出，外源性海藻糖在乳酸乳球菌细胞中的积累提供了针对胆汁裂解的保护。细胞内海藻糖的释放限制了及时的海藻糖保护效果。当与没有细胞内海藻糖的乳酸乳球菌细胞相比(sAGX0167，不用海藻糖预培养)时，已经积累海藻糖(SAGX0167+海藻糖、sAGX0309+海藻糖和sAGX0319+海藻糖)即如(图2B)中所述在500mM海藻糖中培养的乳酸乳球菌细胞示出与细胞内海藻糖的浓度成比例的针对胆汁裂解的及时有力的保护。在0.5％牛胆汁中降低存活(图2A)与细胞内海藻糖的释放相一致(图2B)。
实施例3：外源性海藻糖的积累提供针对胆汁裂解的保护
实验
通过离心收集细胞并在1×M9盐溶液中重悬。在T0、1、2、4小时获取样品并确定浓度，基本如实施例1中所述。数据对于所有ptcC wt菌株来说是示例性的。
结果
积累之后，海藻糖某种程度上通过到目前为止未鉴定或未曾预料到的海藻糖出口从细胞泄漏并可在上清液中回收。
图3A表明，海藻糖可通过从头合成以及从生长培养基摄取之后而在细胞内积累(sAGX0167在500mM海藻糖中培养，如在图1中所述)。从头合成的以及外源性积累的海藻糖二者均从细胞释放。图3B表明，细胞内海藻糖的损失导致培养物上清液中存在的海藻糖提高(本文中表示为mg海藻糖/10ml培养物以允许细胞内和细胞外海藻糖浓度之间的比较)。实施例4：表2中描述了在多种菌株中的海藻糖积累和释放
实验
表2中描述的菌株在补充了100mM(图4A)或500mM(图4B)海藻糖的GM17中培养。收集细胞并在M9缓冲液(Difco)中重悬。在T0、2、4和8小时测定细胞内海藻糖含量，基本上如在实施例1中所述。如在图3中所描述的，除了sAGX0248(ptcC KO)之外，所有菌株示出类似的海藻糖释放。
结果
从COG数据库(碳水化合物转运和代谢部分)中选择20种乳酸乳球菌MG1363寡糖转运蛋白并且寡核苷酸指导的重组工程在trePP KO背景(sAGX0272；海藻糖积累所需要的)中破坏其基因(表2；图4)。仅ptcC的破坏避免了海藻糖的释放。
人们无法预测表2中所列的基因中哪一个参与了海藻糖的释放。海藻糖操纵子(llmg_0453；llmg_0454)中存在的任意一个PTS转运蛋白基因的破坏对海藻糖的摄取或释放没有影响。ptcC基因(编码纤维二糖特异性PTS系统IIC组分)的破坏消除了积累所海藻糖的泄露，因此，PtcC是海藻糖出口并且该蛋白导致海藻糖的泄露。celB的破坏(纤维二糖特异性PTS系统IIC组分)对海藻糖摄取和释放没有影响。在trePP KO背景中ptcC的破坏阻止了所有的海藻糖释放。
实施例5：表2中描述多种菌株中的海藻糖积累和释放
实验
菌株在GM17T+500mM海藻糖中于30℃培养过夜，通过离心收集细胞并且在等体积1×M9(图5A)或含0.5％牛胆汁的0.9％NaCl(图5B)中重悬并且在37℃孵育24小时。在T0、1、2、4、6、8、12和24小时获取样品。如在实施例1中所述测定细胞内的海藻糖浓度。
结果
组合的ptcC KO(终止密码子插入以及基因缺失)和PhIIA＞＞trePTC(海藻糖转运蛋白的组成型高表达)允许高海藻糖输入和完全的细胞内保留。
图5指出ptcC的失活阻止(于M9盐水中，图A)或延迟(在0.5％牛胆汁中，图B)细胞内海藻糖的释放。在乳酸乳球菌海藻糖操纵子的两个PTS基因之前存在的强组成型PhIIA启动子(如WO2008/084115中所述，其通过引用以其整体并入本文)恢复参考菌株积累外源性海藻糖的能力(也参见图4)。
实施例6：外源性海藻糖的积累提供针对胆汁裂解的保护
实验
菌株在GM17T+500mM海藻糖中于30℃培养过夜，通过离心收集细胞并在一半体积的0.9％NaCl中重悬。获取样品并通过平板接种合适的稀释物(初始)确定CFU。在T0添加一半体积的含1％牛胆汁的0.9％NaCl并且在37℃孵育8小时。在T0、1、2、4、6、8、12和24小时获取样品。测定海藻糖含量(图6A，基本上如实施例1)并且通过平板接种(仅0～8小时)合适的稀释物(初始)确定CFU，并且绘制作为初始T0值的％(图6B)。
结果
保留细胞内海藻糖的能力增强导致改善的胆汁抗性。
图6指出乳酸乳球菌细胞中外源性海藻糖的积累提供针对胆汁裂解的保护。细胞内海藻糖的释放(A)与在0.5％牛胆汁(B)中存活降低一致。ptcC的失活及时延长了细胞内海藻糖的存在并且因此还及时改善了针对牛胆汁的抗性。
实施例7：TrePP KO菌株能够将葡萄糖或麦芽糖转变成细胞内海藻糖。麦芽糖刺激trePP KO菌株摄取海藻糖。
实验
菌株在指出的培养基中培养过夜。基本上如实施例1所述测定海藻糖。
结果
TrePP KO已经获得了利用碳源(例如葡萄糖或麦芽糖)来积累海藻糖的能力。这尚未在现有技术中描述，因为海藻糖可在MM17T(即用麦芽糖作为单一碳源)中的细胞内积累。
图7指出TrePP KO菌株(ptcC wt和ptcC KO二者)能够将葡萄糖或麦芽糖转变成细胞内海藻糖(柱1和2，柱5～8)。在trePP KO菌株(柱9和10)中麦芽糖增强了从生长培养基摄取和积累细胞外海藻糖。
当用以下培养时，TrePP KO菌株积累海藻糖：
1.用葡萄糖作为碳源(GM17T；柱1和2)
2.用葡萄糖作为碳源以及细胞外海藻糖(GM17T+500mM海藻糖；柱3和4)
3.用葡萄糖作为碳源(MM17T；柱5和6)
4.用葡萄糖和麦芽糖作为碳源(GM M17T；柱7和8)
5.用麦芽糖作为碳源以及海藻糖(GM17T+500mM海藻糖；柱9和10)
实施例8：冻干后的存活
实验
表3A：优化培养的200L培养物(无动物蛋白质的发酵培养基)通过超滤和渗滤浓缩10倍并在浓缩的冷冻保护剂混合物(如WO2010/124855中所述)中重悬。确定细菌悬液的CFU计数/ml。将悬液批量填充到分析盘中，将盘称重并冻干。为了活力评估，将经冻干的合适重量份用合适体积的经纯化水重构并且确定CFU计数/ml。通过CFU在冻干之前与之后的比值确定活力％。
表B：过夜的20L培养物(GM17T+500mM海藻糖)通过离心浓缩100倍并在浓缩的冷冻保护剂混合物(如WO2010/124855中所述)中重悬。确定细菌悬液的CFU计数/ml。将悬液大批地或在小瓶(2.5ml填充体积)中冻干。为了活力评估，用2.5ml经纯化的水将冻干的2.5ml小瓶重构并且确定CFU计数/ml。通过CFU在冻干之前与之后的比值确定活力％。2个独立的生产批次(sAGX0167和sAGX0309)在冻干后产生＞100％存活。
(A)和(B)二者冻干的粉末还用合适的赋形剂配制以标准化CFU/g。将sAGX0037、sAGX0167和sAGX0309填充到HPMC胶囊中，最小值为1.2×1011CFU/胶囊。胶囊用纤维素膜包裹(banded)并用甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物包衣作为肠溶包衣膜，用于靶向递送至小肠和结肠。
基本上如在实施例1中所述测定海藻糖。
结果
如表3中指出的，可积累海藻糖的菌株示出极大增强的对冷冻干燥期间所经历干燥胁迫的抗性。
表3
实施例9：通过猪肠期间的存活
实验
通过外科手术为母猪(＞150kg)在近端十二指肠和近端结肠装配插管。在十二指肠插管中，插入包封的、冷冻干燥的sAGX0037和sAGX0167。在施用后0、2、4、6、8和10小时从结肠插管对结肠内容物取样。活力％确定为样品中活的(CFU计数)和总的(活的和死的，Q-PCR分析)乳酸乳球菌之间的比值。数值在表4中给出。
结果
在大肠系统(猪)中可积累海藻糖的菌株示出极大增强的存活(独立于进食或禁食状态)。
表4和图8表明，当与冷冻干燥的且包封的SAGX0037(表4A)相比时，冷冻干燥的且包封的sAGX0167(细胞内海藻糖积累的预培养；表4B)示出增强了在通过猪肠期间的存活，当猪禁食24小时(图8A)以及在以及在随意可获得食物期间都是如此。
表4
实施例10：产生生物质之后可积累海藻糖
实验
所指示的菌株在GM17T中培养过夜(30℃，16小时)并且通过离心收集(4000rpm，15分钟)。在新鲜的GM17T+500mM海藻糖中重悬细菌沉淀并孵育。如实施例1中所述，在T＝0、1、2和4小时测定细胞内海藻糖含量。
结果
如图9中所显示的，当细菌随时间孵育时，在生物质产生后可积累海藻糖。如在图9B中所指出的，这仅可在trePP KO菌株中实现(sAGX0090vs其他)并且不需进一步的基因插入或缺失(sAGX0169)。otsB(sAGX0167、sAGX0346、sAGX0354、sAGX0360)的另外的存在刺激海藻糖积累。
实施例11：麦芽糖可刺激细胞内海藻糖的积累
实验
所指示的菌株在GM17T、+/-500mM海藻糖、GM17T+0.5％麦芽糖(GMM17T)+500mM海藻糖或者M17T+0.5％麦芽糖(MM17T)+500mM海藻糖中培养过夜(overnight，ON；30℃，16小时)并且通过离心收集(4000rpm，15分钟)。如实施例1中所述测定细胞内海藻糖含量。
结果
如在图10中指出的，在过夜培养的培养物中麦芽糖刺激细胞内海藻糖的积累
实施例12：麦芽糖可在生物质的产生期间或之后被转变成细胞内海藻糖
实验
所指示的菌株在GM17T中培养过夜(ON，30℃，16小时)，通过离心收集(4000rpm，15分钟)细胞，在M17T+0.5％麦芽糖(MM17T)中重悬并孵育8小时(＞8h MM17T)。或者，所指示的菌株在MM17T中培养过夜(ON)。如实施例1中所述测定细胞内的海藻糖含量。
结果
如图11中所示，麦芽糖可在生物质的产生期间或之后被转变成细胞内海藻糖。
缩写
ADP 腺苷-5′二磷酸
抗TNF 识别肿瘤坏死因子的抗体
ATP 腺苷-5′三磷酸
celB 纤维二糖特异性PTS系统IIC组分
CFU 菌落形成单位
COG 蛋白质的直系同源组的簇
eno 烯醇化酶(磷酸丙酮酸水合酶)基因(基因ID：4797432)
gapB 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(基因ID：4797877)
Gene ID 基因识别符
GM17 Oxoid M17+0.5％葡萄糖
GM17T Oxoid M17+0.5％葡萄糖+0.2mM胸苷
GMM17T Oxoid M17+0.5％葡萄糖+0.5％麦芽糖+0.2mM胸苷
hIL-10 人白介素-10
HPMC 羟丙基甲基纤维素
hTFF-1 人三叶因子-1
KO 敲除；基因缺失、基因置换、基因破坏
M 0.5％麦芽糖
M17 Oxoid M17
M9 M9盐(Difco)
GM17 Oxoid M17+0.5％麦芽糖
GM17T Oxoid M17+0.5％麦芽糖+0.2mM胸苷
n/a 不适用的
NADP+ 烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸
NADPH 还原型烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸
ODx 在x nm波长的光密度
otsA 大肠杆菌渗透调节海藻糖合酶A；海藻糖-6-磷酸合酶
otsB 大肠杆菌渗透调节海藻糖合酶B；海藻糖-6-磷酸磷酸酶
otsBA otsB和otsA的偶联表达单元
pgmB β-葡糖磷酸变位酶(基因ID：4797271)
PhIIA HU-样DNA结合蛋白基因的启动子(基因ID：4797353)
ptcC 纤维二糖特异性PTS系统IIC组分
Ptre 海藻糖操纵子启动子
PTS 磷酸转移酶系统
rpmD 50S核糖体蛋白L30基因前的基因间区
T 0.2mM胸苷
thyA 胸苷合酶基因(基因ID：4798358)
TNF 肿瘤坏死因子
trePP 海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(基因ID：4797140)
trePTC 在乳酸乳球菌海藻糖操纵子中推定的磷酸转移酶基因(分别地，llmg_0453和
llmg_0454；基因ID：4797778和基因ID：4797039)
TX X小时时间点
uidA 大肠杆菌β-D-葡糖醛酸糖苷酶
usp45 未鉴定的分泌型45-kDa蛋白质基因(基因ID：4797218)
wt 野生型
ww 湿细胞沉淀重量

Claims (38)

1.乳球菌属(Lactococcus sp.)细菌，其缺乏纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性，其中编码内源性PtcC的基因已被部分地或完全地缺失、破坏或失活，使得所述乳球菌属不能产生功能性ptcC基因产物，其中所述乳球菌属细菌包含一种或更多种编码海藻糖转运蛋白的基因并且其中所述细菌还缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。
2.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其包含已被部分地或完全地缺失、破坏或失活的编码内源性TrePP的基因。
3.根据权利要求2所述的乳球菌属细菌，其中编码内源性TrePP的基因不能产生功能性TrePP基因产物。
4.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其中所述海藻糖转运蛋白是内源性海藻糖转运蛋白。
5.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其包含功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。
6.根据权利要求5所述的乳球菌属细菌，其中所述海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB。
7.根据权利要求6所述的乳球菌属细菌，其中所述otsB是大肠杆菌(E.coli)otsB。
8.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其包含一种或更多种异源性基因产物。
9.根据权利要求8所述的乳球菌属细菌，其中所述一种或更多种异源性基因产物是一种或更多种预防性和/或治疗性基因产物或者抗原。
10.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其中所述乳球菌属细菌是干燥的或冷冻的。
11.根据权利要求10所述的乳球菌属细菌，其中所述乳球菌属细菌是喷雾干燥的或冷冻干燥的。
12.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其用作药物。
13.药物、食品添加剂、益生菌组合物或起子培养物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的乳球菌属细菌。
14.根据权利要求13所述的起子培养物，其中所述起子培养物用于制备食品产品。
15.用于制备药物或用于制备食品添加剂或用于制备起子培养物或用于制备益生菌组合物的方法，其包括：
i)在培养基中繁殖根据权利要求1至11中任一项所述的乳球菌属细菌，所述培养基包含能够被所述乳球菌属细菌发酵的底物物质，以及
ii)将所述乳球菌属细菌配制成药物、食品添加剂、起子培养物或益生菌组合物。
16.用于在乳球菌属细菌中内部积累海藻糖的方法，所述方法包括在包含能够被所述乳球菌属细菌发酵之底物物质的培养基中繁殖所述乳球菌属细菌，其中所述乳球菌属细菌缺乏纤维二糖特异性PTS系统IIC组分(PtcC)活性，其中编码内源性PtcC的基因已被部分地或完全地缺失、破坏或失活，使得所述乳球菌属不能产生功能性ptcC基因产物，其中所述乳球菌属细菌包含一种或更多种编码海藻糖转运蛋白的基因并且其中所述细菌还缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述乳球菌属细菌是非致病性细菌。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述培养基包含麦芽糖或葡萄糖或麦芽糖与葡萄糖的组合作为碳源。
19.根据权利要求18所述的方法，其中麦芽糖或葡萄糖或麦芽糖与葡萄糖的组合是主要或唯一碳源。
20.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述培养基不含有外部添加的海藻糖。
21.用于改善乳球菌属细菌之胁迫抗性或贮藏特征的方法，所述方法包括在所述细菌中部分地或完全地缺失、破坏或失活编码内源性PtcC的基因使得所述乳球菌属不能产生功能性ptcC基因产物，其中所述乳球菌属细菌包含一种或更多种编码海藻糖转运蛋白的基因并且其中所述细菌还缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中乳球菌属细菌之胁迫抗性或贮藏特征选自：对酸条件的抗性，对胆汁盐的抗性，对干燥、冷冻或冷冻干燥的抗性，渗透抗性及其任意组合。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述乳球菌属细菌缺乏PtcC活性。
24.根据权利要求21所述的方法，其中在所述乳球菌属细菌中编码内源性TrePP的基因已被部分地或完全地缺失、破坏或失活。
25.根据权利要求24所述的方法，其中编码内源性TrePP的基因不能产生功能性TrePP基因产物。
26.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述乳球菌属细菌包含一种或更多种编码海藻糖转运蛋白的基因。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述海藻糖转运蛋白是内源性海藻糖转运蛋白。
28.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述乳球菌属细菌包含功能性异源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述otsB是大肠杆菌otsB。
31.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述乳球菌属细菌包含编码一种或更多种异源性基因产物的一种或更多种异源性基因。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或更多种异源性基因产物是一种或更多种预防性和/或治疗性基因产物或抗原。
33.根据权利要求21或22所述的方法，其还包括对所述乳球菌属细菌进行冷冻或冷冻干燥。
34.用于制备食品产品的方法，其包括将根据权利要求13或14所述的食品添加剂或起子培养物与能够被所述乳球菌属细菌发酵的底物物质混合。
35.根据权利要求34所述的方法，其还包括对所述底物物质进行发酵。
36.食品产品，其可通过根据权利要求34或35所述的方法获得。
37.根据权利要求1所述的乳球菌属细菌，其中所述乳球菌属细菌是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
38.根据权利要求37所述的乳球菌属细菌，其中所述乳酸乳球菌是乳酸乳球菌菌株MG1363。
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