NL9000753A - Dna-fragment, ten minste coderend voor een deel van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kda van lactococcus lactis stammen zoals de lactococcus lactis ssp. lactis stam mg1363, combinaties hiervan met voor homologe of heterologe eiwitten coderende dna-sequenties alsmede de hiermee verkregen homologe en heterologe eiwitten. - Google Patents

Description

DNA-fragment, ten minste coderend voor een deel van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kDa van Lactococcus lactis stammen zoals de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MG1363. combinaties hiervan met voor homologe of heterologe eiwitten coderende DNA-sequenties alsmede de hiermee verkregen homologe en heterologe eiwitten.

De uitvinding heeft o.a. betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste coderen voor een deel van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kDa van Lactococcus lactis stammen zoals de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MGI363.

Zoals bekend worden lactococcen (Lactococcus lactis ssp lactis en L.lactis ssp. cremoris) op grote schaal als startercultures bij de bereiding van zuivelprodukten zoals kaas, boter en karnemelk toegepast. Recentelijk is de volledige nucleotide-sequentie van de genen voor twee extracellulaire eiwitten, n.l. proteinase prtP [Vos et al., J. Biol. Chem. 264 (1989b), 13579-13585; Kok et al., Appl. Environ. Microbiol. 50 (1985), 94-101 en De Vos et al., Gene 85. (1989)» 169-176] en het bacteriocine nisine [Buchman et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), l6260-16266] bepaald. Het proteinase wordt gesynthetiseerd als een prepro-eiwit met een consensus ala/ala signaal-peptidase I splitsingsplaats tussen de aminozuurresiduen 33 en 34. Aangetoond is, dat het signaal-peptide de secretie van heterologe eiwitten in melkzuurbacteriën regelt [Simons et al., Proceedings 2nd Netherlands Biotechnology Congress, (1988), I83-I87]. Het proteinase vertoont een belangrijke sequentie-homologie met een aantal serine-proteinases van de subtilisine-familie en bevat eveneens een C-terminaal membraananker [Vos et al., 1989b loc.cit].

Het gen voor het bacteriocine nisine codeert voor een precursor-polypeptide van 57 aminozuren met een molecuulgewicht van 7500. Een signaalpeptide van 23 aminozuren is hierbij afgeleid, wat afwijkt van de consensus signaalpeptide-regels zoals opgesteld door Von Heijne, J. Mol. Biol. 184 (1985). 99~105· Een reeks van posttranslationale modificaties waaronder dehydratatie van serine- en threonine-residuen en verknoping met cysteine-residuen worden vereist voor het verkrijgen van biologisch aktief nisine.

Mede gezien het bovenstaande heeft Aanvraagster getracht meer inzicht te verkrijgen in de eigenschappen en de structuur van extracellulaire eiwitten van lactococcen. Dit onderzoek werd in het bijzonder uitgevoerd voor het vaststellen van optimale omstandigheden voor het verkrijgen van extracellulaire proteïnen, in het bijzonder homologe en heterologe extracellulaire eiwitten met lactococcen als gastheer.

Uit het onderzoek van Aanvraagster kwam als onverwacht resultaat naar voren, dat de bij het onderzoek betrokken Lactococcus-stammen alle een eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van ca. 60 kDa secreteren, dat in relatief grote hoeveelheden werd geproduceerd. Dit "60 kDa-ei-wit", dat de precursor is van een 45 kDa ”mature” gedeelte van 434 aminozuren met een in vergelijking met algemeen bekende eiwitten tamelijk afwijkende aminozuursamenstelling en -verdeling, wordt in het kader van de uitvinding als "Usp45" aangeduid. Het gen van dit eiwit van de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MGI363 is door Aanvraagster onderzocht en opgehelderd. Meer in het bijzonder bleek de nucleotide-sequen-tie van het "usp45" gen o.a. een open leesraam van 1384 baseparen te bezitten, dat voor een eiwit met 461 aminozuren codeert. Het "mature" gedeelte, dat met Asp op positie 28 [D(28)] aanvangt, wordt voorgegaan door een signaalsequentie, coderend voor een signaalpeptide met 27 aminozuren. Het gen bevat voorts stroomopwaarts een consensus promotor sequentie en een ribosoombindingsplaats-sequentie; deze onderdelen van het usp45~gen kunnen hetzij afzonderlijk hetzij tezamen gecombineerd worden met een gen van een homoloog of heteroloog eiwit, dat vervolgens via een gastheer tot expressie kan worden gebracht onder verkrijging van een extracellulair homoloog of heteroloog eiwit.

De uitvinding heeft derhalve in de eerste plaats betrekking op een DNA-fragment, dat ten minste een deel omvat van de sequentie, welke stroomopwaarts is gelegen van de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kDa van Lactococcus lactis-stammen zoals de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MGI363. Meer in het bijzonder omvat het DNA-fragment ten minste een deel van de sequentie, stroomopwaarts gelegen van de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire 60 kDa eiwit, welk "mature" gedeelte overeenkomstig Fig. 4 met D(28) aanvangt.

Met voordeel omvat het DNA-fragment in kwestie ten minste de signaalsequentie welke codeert voor Μ (1) tot en met A (27) zoals weergegeven in Fig.4. Voorts kan het bovenaangeduide DNA-fragment tevens de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire 60 kDa eiwit van Lactococcus lactis stammen omvatten, zoals bijvoorbeeld de totale, in Fig.4 weergegeven sequentie, welke weergegeven sequentie van de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MGI363 stamt.

Daar de essentie van de onderhavige uitvinding in hoofdzaak gele- gen is in het bereiden van homologe en heterologe eiwitten in voor voedingsmiddelen aanvaardbare gastheren zoals lactococcen, heeft de uitvinding in het bijzonder betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste een deel omvatten van de sequentie, welke - zoals bovenstaand is aangegeven - stroomopwaarts is gelegen van de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire 60 kDa eiwit van Lacto-coccus lactis stammen, zoals de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MGI363. alsook een extra sequentie, welke voor een homoloog of hetero-loog eiwit codeert. Voorbeelden van geschikte homologe en veelal in commercieel opzicht interessante eiwitten zijn o.a. componenten van het proteolytische systeem van Lactococcus lactis zoals proteinases en peptidases. Als voorbeelden van geschikte heterologe eiwitten worden o.a. chymosine, prochymosine, pseudo-chymosine alsook α-amylase genoemd.

Daar de bovenbedoelde DNA-fragmenten met de gewenste coderingen tot expressie dienen te worden gebracht heeft de uitvinding eveneens betrekking op plasmiden, welke ten minste een bovenbedoeld DNA-fragment bevatten, op gastheren, welke een geschikt plasmide volgens de uitvinding of in het genoom een bovenbedoeld DNA-fragment bevatten alsmede op de eiwitten, verkregen door het kweken van de gemodificeerde gastheren.

De via de voor de voedingsindustrie aanvaardbare gastheren zoals melkzuurbacteriën e.d. bereide homologe en heterologe eiwitten kunnen op de voor de toepassing van deze eiwitten geijkte wijze worden gebruikt. Bijvoorbeeld kan het heterologe eiwit prochymosine via een uit de stand der techniek bekende methode worden omgezet tot chymosine, dat een bij de kaasbereiding vereiste bewerking kan uitvoeren.

De uitvinding wordt aan de hand van de onderstaande onderzoeksresultaten nader toegelicht.

MATERIALEN EN METHODEN

(a) Bacterie-stammen, fagen en plasmiden

Bij het onderzoek volgens de uitvinding worden de in de onderstaande tabel A vermelde stammen gebruikt.

TABEL A

Bacteriestammen

Stam Kenmerken Bron of referentie E.coli JM83 ara rpsL /\ (lac-proAB) Messing (1983)* JM103 supE thi /\ (lac-ProAB) Messing (1983)* MB406 supE recB22 recC21 sbcB15 W.Dove,University

of Wisconsin, USA

L.lactis ssp lactis MG1363 Plasmide-vrij Gasson (1983)** IL1403 Plasmide-vrij Chopin et al.(1984) RI NIZO*** NZ22186 Nis+ Suc+ NIZO*** NCDOI76 var.diacetylactis National Collection of

Dairy Organisms (NCDO) ssp cremoris SK110 Prt+ Lac+ De Vos & Davies,(1984)****

NCD01200 Prt+ Lac+ NCDO

WG2 Prt+ Lac+ NIZO*** * Methods in Enzymology 101 (1983)» blz.20-78· ** J. Bacteriol. 1$4 (1983), blz.1-9; tevens gedeponeerd bij het

Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn, Nederland onder Nr. CBS 364.89 *** Aanvraagster **** In 3rd European Congress on Biotechnology, Vol.III, Verlag Chemie, Weinheim 1984, blz. 201-205-

Als cloneringsvector voor de constructie van een genoom-biblio-theek werd de lambda-faag 47.1 gebruikt [Loenen & Brammar, Gene 10 (198Ο), 249_259]· verdere subclonering werd in pUC19 [Vierra and Messing, Gene 19 (1982), 259-268] en in M13mpl8/mpl9 [Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106] uitgevoerd.

(b) Media, enzymen en chemicaliën

De lactococcen werden in een op wei gebaseerd medium: 5% wei-permeaat, 0,5% casiton (Difco), 1,9% β-glycerofosfaat en 0,5% glucose gekweekt. Voor het kweken van Lactobacillus-, Leuconostoc- en Strepto-coccus-stammen werd het casiton door 1,5% gistextract (Difco) vervangen.

De media, welke toegepast werden voor E.coli waren "Luria broth'· (L-broth) [Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1972] en trypticase pepton [Baltimore Biological Laboratories] als suspensie of in vaste vorm met 1,5% agar. Supplementen werden met de onderstaande concentraties toegevoegd:

Carbenicilline [Beecham Pharmaceuticals] 100pg/ml, X-Gal [5~broom-4-chloor-3-indolyl-(5-D-galactopyranoside; Boehringer] 40pg/ml, en IPTG [isopropy1- β-D -thiogalactopyranoside; Bethesda Research Laboratories, (BRL)] 25yg/ml.

Restrictie-endonucleasen en ‘'reverse transcriptase" werden van BRL betrokken. T4 DNA ligase, polynucleotide-kinase werden van New England Biolabs en Sequenase van United States Biochemical Corporation betrokken. [a3^p]dATP en [ )£ (3000Ci/mmol.) werden van Amers-ham betrokken. De oligonucleotiden werden met een Biosearch Cyclone DNA synthesizer [New Brunswick Scientific Corp.] gesynthetiseerd.

(c) Constructie en screening van een genoom-bibliotheek van L.lactis ssp. lactis MGI363

Het chromosomale DNA werd als volgt geëxtraheerd: L.lactis cellen werden gekweekt tot Aggo = 1,0 en geprotoplasteerd in THMS-buffer (25% sucrose, 30 mM Tris-HCl, pH=8,0, 3 mM MgC^) met 2 mg/ml lysozyme [Sigma] gedurende 1 uur bij 37°C· Na centrifugeren (6000g) werden de protoplasten opnieuw gesuspendeerd in 1/20 volume TE (10 mM Tris-HCl, pH=8,0, 1 mM EDTA) en 3“4 maal met fenol geëxtraheerd. Vervolgens werd het DNA tegen TE gedialyseerd.

Op de door Maniatis et al., beschreven wijze [Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982] beschreven wijze werd in faag lambda 47.1 onder toepassing van "packaging"-mengsels van Promega een genoom-bibliotheek geconstru eerd. De bibliotheek werd in E.coli stam MB406 ingebouwd en replica’s werden op nitrocellulosefilters [Schleicher and Schuell] vervaardigd. De filters werden gedurende 1 uur in PBS-buffer (10 mM natriumfosfaat, pH=7,0, 0,85% NaCl) met 1% bovine serum albumine (BSA) geblokkeerd en gedurende ten minste 4 uur met antilichamen tegen het 60 kDa eiwit in de PBS buffer met 0,1# BSA geïncubeerd. De blots werden vervolgens met Swine anti rabbit geroxidase conjugaat (Swarpo) (Dakopatts) geïncubeerd. De eiwitten werden door incubering in substraatoplossing (40pg 4-chloor-1-naftol in 100 ml van 50 mM Tris-HCl, pH=7,5 met 30μ1 H2O2) zichtbaar gemaakt.

(e) RNA-extractie L.lactis ssp. lactis stam MGI363 cellen werden bij 30°C gekweekt totdat AgQQ = 0,4-0,6. De cellen werden in THMS-buffer met 10 mg/ml lysozyme gedurende 10 min. op ijs geprotoplasteerd en gecentrifugeerd. Het RNA werd uit de protoplasten geëxtraheerd met behulp van de hete-fenol-methode [Markham et al., J. Mol. Biol. 178 (1984), 237“248].

(f) Eiwitpurificatie

Extracellulaire eiwitten van L.lactis ssp. lactis stam MGI363 werden door middel van SDS/PAGE (sodiumdodecylsulfaat/polyacrylamide-gel electroforese) [Laemmli, Nature 227 (1970), 68Ο-685] geanalyseerd. Het 60 kDa-eiwit werd uit de gel gesneden en door isotachoforese [Öfverstedt et al., Anal. Biochem. 134 (1983). 361-365] teruggewonnen.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

(a) Karakterisering van gesecreteerde eiwitten van lactococcen L.lactis ssp. lactis en L.lactis ssp. cremoris-stammen zoals weergegeven in Tabel A, werden onderzocht op gesecreteerde eiwitten door het analyseren van cultuursupernatant-fracties met SDS/PAGE [Laemmli, 1970 loc.cit.]. Zoals weergegeven in Fig. IA secreteren alle onderzochte stammen proteïnen, waarvan het eiwit dat in overmaat voorkwam een schijnbaar molecuulgewicht had van 50-60 kDa. De hoeveelheid van het gesecreteerde eiwit werd op 2-4 pg/ml/Aggo geschat.

Om na te gaan, of deze 50-60 kDa-eiwitten een onderlinge verwantschap vertoonden, werden antilichamen tegen het "60 kDa-eiwit”, dat uit de plasmide-vrije L.lactis ssp. lactis stam MGI363 werd geïsoleerd, in konijnen opgewekt. Western blot analyse [Towbin et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA J6 (1979). 4350-4354] van de cultuursupernatant-fracties vertoonde een sterke reactie tussen de 50-60 kDa-eiwitten van alle onderzochte stammen en de geïsoleerde antilichamen (Fig. 1B), wat aangeeft, dat er een immunologisch verband tussen deze eiwitten bestaat. In de celextracten van de onderzochte stammen konden geen 50-60 kDa eiwitten worden gedetecteerd, wat aangeeft dat deze eiwitten op efficiënte wijze in het extracellulaire medium worden gesecreteerd en niet met het celmembraan zijn geassocieerd, hetgeen wel het geval is voor componenten van het proteolytische systeem van lactococcen [Vos et al., 1989b. loc.cit. en Kok et al., 1985, loc.cit.].

Extracellulaire eiwitten van Leuconostoc paramesenteroides, Strep-tococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lb.acidophilus en Lb.bulgaricus-stammen vertoonden geen reactie met de bovenaangeduide antilichamen, wat aangeeft, dat het eiwit zeer specifiek is voor lactococcen-substammen en geen immunologische tegenhanger heeft in andere melkzuurbacteriën.

(b) Cloneren en tot expressie brengen van het gen van het 60 kDa eiwit in E.coli

Aangezien de plasmide-vrije Lactococcus lactis ssp. lactis stam MG1363 in staat is het 60 kDa eiwit te produceren werd chromosomaal DNA van deze stam als uitgangsmateriaal voor het cloneren van het gen van het 60 kDa-eiwit genomen. Er werd een genoom-bibliotheek van L.lactis ssp. lactis MGI363 geconstrueerd en met de bovenaangeduide geïsoleerde antilichamen gescreend. Een restrictie-enzym-digestiemap van de DNA-insertie van een van de fagen, dat reageerde met antilichamen wordt in Fig. 2 weergegeven.

Om te verifiëren, of het gen voor het 60 kDa-eiwit aanwezig was op deze insertie werd Southern blot analyse op het insertie-DNA uitgevoerd. Voor dit doel werden de 10 amino-terminale aminozuren van het "mature" gedeelte met een gasfase sequenator (Applied Biosystems) bepaald. De sequentie bleek Asp-Thr-Asn-Ser-Asp-Ile-Ala-Lys-Gln-Asp (D-T-N-S-D-I-A-K-Q-D) te zijn. Gemengde oligonucleotide-monsters werden van de laatste zes aminozuren van deze sequentie afgeleid, welke het minst gedegenereerde codon-gebruik had. Hybridisatie-studies van het gedi-gesteerde faag-DNA met deze monsters gaven aan, dat het gen voor het 60 kDa-eiwit zich op een KpnI/EcoRI fragment van ± 3 kb (Fig. 2A) bevond.

Om aan te geven, dat dit fragment het complete gen voor het 60 kDa-eiwit bevatte, werd het gedoneerd in pUC19, wat pNZIOll opleverde. Western blot analyse van celextracten van E.coli JM83 met pNZIOll toonde de synthese van het eiwit aan (Fig. 3» laan 2). Bovendien kon een aanzienlijke hoeveelheid van het 60 kDa-eiwit in de periplasmatische fractie van de cellen (laan 4) worden gedetecteerd. Om na te gaan of de kleine hoeveelheid van 60 kDa-eiwit welke nog steeds in de gestripte cel (laan 3) aanwezig was, te wijten was aan een onvolledige isolatie van de periplasmatische fractie werden β-lactamase-bepalingen [Miller, 1972, loc.cit.] uitgevoerd. De mate van β-lactamase-activiteit in de periplasmatische fractie in vergelijking met de gestripte cellen (4:1) kwam volledig overeen met de hoeveelheden van het 60 kDa-eiwit, dat in deze twee fracties werd gedetecteerd. Op grond hiervan kon worden geconcludeerd, dat het 60 kDa-eiwit naar het periplasmatische deel van E.coli cellen wordt getransporteerd.

Uit het bovenstaande kan worden afgeleid, dat de regulatore sequenties van dit lactococcus-gen en het signaal-peptide van het gen-produkt in E.coli worden herkend.

(c) Nucleotide-sequentie van het gen voor het 60 kDa-eiwit

De nucleotide-sequentie van het KpnI/Clal fragment uit pNZIOll werd bepaald (Fig. 4) onder toepassing van de sequentie-strategie zoals in Fig. 2B is weergegeven. De DNA-sequentie, welke voor de eerste 10 N-terminale aminozuren van het "mature" gedeelte codeert, werd op de nucleotide-positie 97“H3 gevonden en vormt het begin van een open leesraam dat voor een "mature" gedeelte van 434 aminozuren codeerde, gevolgd. Dit eiwit bezat een voorspeld molecuulgewicht van 44628 Da en werd, zoals boven reeds vermeld, "Usp45" genoemd.

Stroomopwaarts van de "mature" N-terminus zijn drie in frame initiatiecodons gelocaliseerd. Het meest waarschijnlijke initiatiecodon is ATG op positie 1 (zie Fig.4), aangezien het een precursor-gebied voorafgaat, dat de karakteristieke eigenschap van een signaalpeptide bezit: verscheidene basische residuen, gevolgd door een hydrofobe reeks van 15-20 residuen en een korter ongeladen gebied, dat met een aminozuur met een kleine zijketen eindigt [Von Heijne, 1985. loc.cit.]. Alhoewel de hoogste splitsingswaarschijnlijkheid voor het signaal peptidase I aan de C-terminale kant van Ala-l8 is volgens de Von Heijne (1986)-regels, wordt de waargenomen splitsing na Ala-27 in de sequentie Val-X-Ala eveneens regelmatig in prokaryoten gevonden, in het bijzonder in gram-positieve stammen [Von Heijne en Abrahmsen, FEBS Letters 244 (1989). 439-446].

Het ATG startcodon op positie 1 wordt voorafgegaan door twee potentiële ribosoom-bindingsplaatsen [Shine and Dalgarno, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA Jl (1974), 1342-1346], namelijk de sequentie GGAGG op positie -26 tot -22 en AAAG op -10 tot -8. De berekende vrije energie van de laatstgenoemde is slechts -4,6 kcal/mol [Tinoco et al., Nature 246 (1973). 40-41]. Ribosoom-bindingsplaatsen van genen uit lactococcen [De Vos, FEMS Microbiol. Rev. 46 (1987)» 281-295] en andere gram-posi-tieve organismen zoals Bacilli [McLauglin et al., J. Biol. Chem. 256 (I98I), II283-H29I] bezitten gewoonlijk vrije energie-waarden tussen -10 en -15 kcal/mol. Voor de andere mogelijkheid kon een vrije ener-gie-waarde van -l4,4 kcal/mol worden berekend. Echter is de afstand tot het ATG-codon 21 bp. Deze lengte past niet in de Shine and Dalgarno-hypothese.

Primer-extensie-experimenten [Debarbouille and Raibaud, J. Bacteriol. 153 (1983). 1221-1227] werden uitgevoerd (Fig. 5B) en lieten zien, dat de transcriptie van het usp45 gen met een adenine-residu op de nucleotidepositie -44 werd geïnitieerd. Een consensus -10 hexanucleoti-de-sequentie (TATAAT) werd op positie -56 tot -51 gevonden. De meest waarschijnlijke overeenkomende -35 sequentie is TTAAGG (-76 tot -71), ofschoon de afstand tussen de twee kleiner is (14 bp) dan normaliter wordt gevonden in promotors in E.coli [Hawley & McClure, Nucl. Acids. Res. 11 (1983), 2237-2255] en L.lactis [De Vos, FEMS Microbiol. Rev. 46 (1987), 281-295 en Van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987), 2452-2457].

Inspectie van de DNA-sequentie toonde de aanwezigheid van verscheidene zich herhalende sequenties: de hexanucleotide-sequentie GC[A/C/G/T]CAA treedt 19 maal in het gen op, waarvan 16 maal in het open leesraam, terwijl de meer gedegenereerde frequentie TC[A/T]AG[C/T] 16 keer optreedt. Vertaling van deze sequentie resulteert in 12 serine doubletten, waarvan 7 achter elkaar in één deel van het Usp45 optreedt, wat resulteert in een ongebruikelijke aminozuur-sequentie in het onderhavige eiwit .

Stroomafwaarts van het TAG stopcodon van het usp45 gen werd een inverted repeat gevonden op de nucleotide-positie 1414 tot 1452, wat een hairpin-achtige structuur met een vrije energie van -8,2 kcal/mol kan vormen [Tinoco et al., Nature 246 (1973)» 40-41]. De gevormde hair-pin wordt aan beide zijden door A- of T-residuen geflankeerd en zou op grond hiervan als rho-onafhankelijke, bi-directionele terminator van het transcriptie kunnen fungeren. Northern blot analyse openbaarde een boodschapper RNA van 1500 nucleotiden (Fig. 5A), wat overeenkomt met de afgeleide transcriptie-terminatie.

(d) Aminozuur-sequentie van het Usp45~eiwit

De aminozuur-sequentie van usp45, zoals weergegeven in Fig. 4, onthult een hoog gehalte aan serine- en alanine-residuen, tezamen meer dan 32#. In één gebied van het eiwit , te weten de residuen 264-316, vormen serine-residuen 33 van de 53 residuen, waaronder een continue reeks van 16 residuen.

LEGENDA

Fig. 1: Gel-analyse van extracellulaire eiwitten van L♦lactis-stammen.

Supernatanten van logaritmisch groeiende cultures werden tegen water gedialyseerd en door lyofilisatie geconcentreerd. Monsters werden met 10% SDS/PAGE [Laemmli, 1970, loc.cit.] en Western blotting geanalyseerd.

Panel A toont een Coomassie brilliant blauw-kleuring van 1,0 ml supernatant. Lanen: (1) Mgl363, (2) IL1403, (3) Rl, (4) NZ22186, (5) NCD0176, (6) SK1128, (7) NCD01200, (8) WG2. De positie van de 50-60 kDa-eiwitten wordt aangegeven. De lanen worden aan de linkerzijde door molecuulgewicht-markers, uitgedrukt in kDa geflankeerd.

Panel B is een Western blot van een gel, dat geladen is met 0,2 ml van dezelfde monsters, verkregen na incubatie met een antilichaam tegen het 60 kDa-eiwit van MGI363. De plaats van de 50-60 kDa-eiwit is aangegeven.

Fig. 2: Restrictiemap en sequentie-strategie van het gen, dat voor het 60 kDa-eiwit van MGI363 codeert.

(a) Restrictiemap van het geïnserteerde DNA van een positieve faag-cloon. Hybridisatie met de gemengde reeks oligo-nucleotiden 5'-GA[C/T]-AT[A/C/T]-GCN-AA[A/G]-CA[A/G]-3' als monster wordt met een zwarte balk aangegeven.

(b) Restrictiemap en sequentie-strategie van het KpnI/Clal fragment van pNZIOll. De map geeft het coderingsgebied van het gen (gearceerde staaf) weer. De pijlen geven de lengte en richting van de individuele gesequenteerde gebieden weer. M13-primers en synthetische oligo-primers (gemarkeerd met *) werden toegepast. De sequentie werd bepaald onder toepassing van de dideoxy-keten-terminatie-methode [Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA jk (1977), 5463-5467] volgens het sequenase-protocol [Tabor & Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 4767-4771] uitgevoerd.

Fig. 3: Analyse van de eiwitten, gecodeerd door E.coli JM83 cellen met pNZIOll.

De cellen werden met behulp van een osmotische shock [Neu & Heppel, J. Biol. Chem. 240 (1965), 3685-3692] gefractioneerd, wat resulteerde in een periplasmatische fractie en een gestripte celfractie. De Western blot werd met het antilichaam tegen het 60 kDa-eiwit uit MGI363 geïncubeerd. Lanen: (1) JM83 met pUC19, ongefractioneerde cellen. (2), (3) en (4) JM83 met pNZIOll. (2) ongefractioneerde cellen, (3) gestripte cellen, (4) periplasmatische fractie. (5) MGI363, cultuur supernatant. De positie van het 60 kDa-eiwit is aangegeven.

Fig. 4: Nucleotide-sequentie van het usp45 gen en de daarvan afgeleide aminozuur-volgorde.

De dubbel onderstreepte sequenties stellen de -35 en -10 promotor-boxen weer. De start van de transcriptie wordt met een pijl aangegeven. De twee potentiële ribosoom-bindingsplaatsen zijn onderstreept .

De experimenteel bepaalde N-terminale aminozuren (Asp 28 - Asp 37) van het "mature" gedeelte zijn onderstreept.

Stroomafwaarts van het gen is een inverted repeat met stippel-lijn-pijlen aangegeven, welke een rho-onafhankelijke terminator van de transcriptie voorstelt.

Fig. 5? RNA-analyse en Northern blotting.

A: Het totale RNA werd op een glyoxaal-agarose-gel [Thomas, I98O] geanalyseerd en op een Genescreen-filter (NEN/Dupont) overgebracht. Vervolgens werd de blot onderzocht met een M13~gegenereerd monster, dat complementair met het usp45~gen is.

Lanen: (1) 5 pg totaal RNA, (2) 20 pg totaal RNA. Het 1,5 kb transcript wordt aangegeven. De posities van de RNA-markers (BRL) worden in kb weergegeven.

B: Bepaling van de transcriptie-initiatie van het usp45~gen. cDNA werd gegenereerd door reverse transcriptase-verlenging met de oligoprimer 5'CAGCAGAAAGTATCACTG 3' (nucleotide-positie 55 tot 37). De sequentie-volgorde, verkregen met toepassing van dezelfde primer werd toegepast als marker. De overeenkomstige DNA-sequentie wordt weergegeven en de positie van de transcriptie-initiatie-plaats en de -10 en -35 boxen zijn weergegeven.

Claims (12)

1. DNA-fragment, ten minste een deel omvattend van de sequentie, welke stroomopwaarts is gelegen van de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar mol-gewicht van 60 kDa van Lactococcus lactis stammen.

2. DNA-fragment volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het ten minste een deel omvat van de sequentie, welke stroomopwaarts is gelegen van de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire 60 kDa eiwit van de Lactococcus lactis ssp. lactis stam MG1363·

3. DNA-fragment volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het ten minste een deel omvat van de sequentie, stroomopwaarts gelegen van de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire 60 kDa eiwit, welk "mature" gedeelte overeenkomstig Fig. 4 met D (28) aanvangt.

4. DNA-fragment volgens conclusie 3. met het kenmerk, dat het fragment ten minste de signaalsequentie omvat, die codeert voor Μ (1) tot en met A (27), zoals weergegeven in Fig. 4.

5. DNA-fragment volgens een of meer der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het fragment tevens de sequentie, coderend voor het "mature" gedeelte van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kDa omvat.

6. DNA-fragment volgens conclusie 5. met het kenmerk, dat het fragment de in Fig.4 weergegeven sequentie omvat.

7. DNA-fragment volgens een of meer der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat het fragment tevens een extra sequentie, welke voor een homoloog of heteroloog eiwit codeert, omvat.

8. DNA-fragment volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat het homologe eiwit een component van het proteolytische systeem van Lactococcus lactis zoals een proteinase of peptidase is.

9. DNA-fragment volgens conclusie 7. met het kenmerk, dat het heterologe eiwit pseudo-chymosine, prochymosine, chymosine of a-amylase is.

10. Plasmide, dat ten minste een DNA-fragment volgens een of meer der conclusies 1-9 bevat.

11. Gastheer, bij voorkeur een lactococcus-stam, welke in het genoom een DNA-fragment volgens een of meer der conclusies 5~9 of een plasmide volgens conclusie 10 omvat.

12. Eiwit, verkregen door kweken van een gastheer volgens conclusie 11 en winnen van het extracellulaire eiwit uit het cultuur-medium.