JPH0367582A - プロテアーゼ欠損 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は所望のポリペプチド（本明細書で使用される１
ポリペプチドはタンパク質をｉむ任意の有益なアミノ酸
鎖を意味する）の発現訃よび分泌に有益なバシラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）株に関する。
ポリペプチドはタンパク質をｉむ任意の有益なアミノ酸
鎖を意味する）の発現訃よび分泌に有益なバシラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）株に関する。
従来の技術
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は遺伝子工学によるベク
ターからの異種ポリペプチドを発現する為の宿主として
用いられてきた。バシラス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）のごと
きグラム陽性宿主の使用によシ、大腸菌のごときグラム
陰性菌中での異種遺伝子の発現に付随するいくつかの問
題が避けられる０例えば、グラム陰性菌は所望の生成物
から分離するのが困難な内毒素を産生ずる。さらに大腸
菌のごときグラム陰性菌は異種生成物の分泌に容易には
適応せず。
ターからの異種ポリペプチドを発現する為の宿主として
用いられてきた。バシラス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）のごと
きグラム陽性宿主の使用によシ、大腸菌のごときグラム
陰性菌中での異種遺伝子の発現に付随するいくつかの問
題が避けられる０例えば、グラム陰性菌は所望の生成物
から分離するのが困難な内毒素を産生ずる。さらに大腸
菌のごときグラム陰性菌は異種生成物の分泌に容易には
適応せず。
細胞内に隔離された生成物の回収には多くの時間を要し
、長たらしく、潜在的に問題が多い、それに加え、バシ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は非病原性であシ、十分に
特性付けられた機構によシタンパク質を分泌できる。
、長たらしく、潜在的に問題が多い、それに加え、バシ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株は非病原性であシ、十分に
特性付けられた機構によシタンパク質を分泌できる。
発現系にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株を使用す
る際の一般的問題点は培養培地から異種ポリペプチドを
回収する前にそれを分解する多量のプロテアーゼを産生
ずる事である。このタンパク質分解活性の大多数の原因
となるプロテアーゼは栄養欠乏条件下（細胞が胞子形成
の準備をするような）指数増殖期の終シに産生される。
る際の一般的問題点は培養培地から異種ポリペプチドを
回収する前にそれを分解する多量のプロテアーゼを産生
ずる事である。このタンパク質分解活性の大多数の原因
となるプロテアーゼは栄養欠乏条件下（細胞が胞子形成
の準備をするような）指数増殖期の終シに産生される。
２つの主たる細胞外プロテアーゼ、ａｐｒ遺伝子の生成
物であるアルカリセリンプロテアーゼ（ズプチリシン）
およびｎｐｒ遺伝子の生成物である中性メタロプロテア
ーセは培地中に分泌されるが、主たる細胞内セリンプロ
テアーゼ（Ｉｓｐ−１）は細胞内に産生される。これら
の３つのプロテアーゼの１つまたはそれ以上のレベルが
正常よυ低い遺伝的に異なったバシラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）株が作シ出されたが、しかしこれらの株において
も精製に先立って異種遺伝子産物の分解を起こす十分に
高いレベルのプロテアーゼを産生ずる。
物であるアルカリセリンプロテアーゼ（ズプチリシン）
およびｎｐｒ遺伝子の生成物である中性メタロプロテア
ーセは培地中に分泌されるが、主たる細胞内セリンプロ
テアーゼ（Ｉｓｐ−１）は細胞内に産生される。これら
の３つのプロテアーゼの１つまたはそれ以上のレベルが
正常よυ低い遺伝的に異なったバシラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）株が作シ出されたが、しかしこれらの株において
も精製に先立って異種遺伝子産物の分解を起こす十分に
高いレベルのプロテアーゼを産生ずる。
５ｔａｈｌ ら（ジャーナル オプ バクテリオロジ
ー １９８４．１５０：４１１）ｔＬ染色体のズプチリ
シン構造遺伝子がｔ？ く１上で誘導された欠失突然変
異によシ置き換えられたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
プロテアーゼ突然変異体について記載している。この突
然変異を運ぶ株は細胞外セリンプロテアーゼ活性が野生
株の１０優のみである。Ｙａｎｇらは（ジャーナル オ
プ バクテリオロン−。１９Ｂ４，１３０：１５）染色
体の天然プロテアーゼ遺伝子が±２ ビトロで誘導され
た欠失突然変異を持つ遺伝子に置き換えられたバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ突然変異体について
記載しているｍ Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋらは（ＷＯ８３
１０１８２５Ｊ天然染色体遺伝子配列を不活性化セグメ
ント挿入物をその中に持つ部分的相同ＤＮＡ配列で置換
して構築されたズプチリシン活性が欠除シタバシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株について記載しているｏ ＫａＷ
ａｍｕｒ！Ｌ らは（ジャーナル オブ ）くクテリ
オロジー、１９８４，１３０：４４２）ｎＰｒ釦よびａ
ｐｒ 遺伝子中に障害を運び、野生株の４％未満の細
胞外プロテアーゼ活性のレベルしか発現シないバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株について記載している。Ｋｏｉ
ｄｅ らは（ジャーナル オブ −（クテリオロジー、
１９Ｂ６．１６７：１１０）ｉｓｐ−１遺伝子のクロー
ニングおよび配列決定訃よび人工的欠失遺伝子の染色体
組込みによるｉａｐ −１陰性突然変異体について記載
している。
ー １９８４．１５０：４１１）ｔＬ染色体のズプチリ
シン構造遺伝子がｔ？ く１上で誘導された欠失突然変
異によシ置き換えられたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
プロテアーゼ突然変異体について記載している。この突
然変異を運ぶ株は細胞外セリンプロテアーゼ活性が野生
株の１０優のみである。Ｙａｎｇらは（ジャーナル オ
プ バクテリオロン−。１９Ｂ４，１３０：１５）染色
体の天然プロテアーゼ遺伝子が±２ ビトロで誘導され
た欠失突然変異を持つ遺伝子に置き換えられたバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ突然変異体について
記載しているｍ Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋらは（ＷＯ８３
１０１８２５Ｊ天然染色体遺伝子配列を不活性化セグメ
ント挿入物をその中に持つ部分的相同ＤＮＡ配列で置換
して構築されたズプチリシン活性が欠除シタバシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株について記載しているｏ ＫａＷ
ａｍｕｒ！Ｌ らは（ジャーナル オブ ）くクテリ
オロジー、１９８４，１３０：４４２）ｎＰｒ釦よびａ
ｐｒ 遺伝子中に障害を運び、野生株の４％未満の細
胞外プロテアーゼ活性のレベルしか発現シないバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株について記載している。Ｋｏｉ
ｄｅ らは（ジャーナル オブ −（クテリオロジー、
１９Ｂ６．１６７：１１０）ｉｓｐ−１遺伝子のクロー
ニングおよび配列決定訃よび人工的欠失遺伝子の染色体
組込みによるｉａｐ −１陰性突然変異体について記載
している。
細胞外プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒｊ＝ｒよびジ１）が
欠失した遺伝学的に改造された株は野生型７％ ７ラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株が行うよシも有意に低いレベル
のプロテアーゼ活性を産生ずる。グロテアーセ基質ｔａ
む培地上で増殖せしめた場合、これらの細菌はタンパク
質分解活性がごくわずかかまたは全くないことを示し、
コロニーのまわりの除去Ｉｔ（かさ）の出現がないこと
で測定される。これらの二重の突然変異体から産生され
るいくつかの異種ポリペプチドシよびタンパク質はバシ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の野生型床で産生された場合
よシ安定であるが、それにもかかわらず精製に先立って
本質的には分解される。
欠失した遺伝学的に改造された株は野生型７％ ７ラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株が行うよシも有意に低いレベル
のプロテアーゼ活性を産生ずる。グロテアーセ基質ｔａ
む培地上で増殖せしめた場合、これらの細菌はタンパク
質分解活性がごくわずかかまたは全くないことを示し、
コロニーのまわりの除去Ｉｔ（かさ）の出現がないこと
で測定される。これらの二重の突然変異体から産生され
るいくつかの異種ポリペプチドシよびタンパク質はバシ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の野生型床で産生された場合
よシ安定であるが、それにもかかわらず精製に先立って
本質的には分解される。
発明が解決しようとする課題および課題を解決するため
の手段 本発明は筐だ特性付けられていない６つのプロテアーゼ
遺伝子の１つまたはそれ以上に突然変異ｔｉむ改良され
たバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｎｉｌ胞を提供し；細
胞はまた好適には主たる細胞外プロテアーゼをコードし
ているａｐｒおよびｎｐｒ遺伝子中にも突然変異ｔｉみ
、その結果これらの細胞外プロテアーゼの細胞による産
生を阻止する。本発明の突然変異は、タンパク質分解活
性ａｐｒ遺伝子産物の細胞による産生を阻害するａｐｒ
遺伝子中の突然変異、タンパク質分解活性残余プロテア
ーセ１（ＲＰ−１） の細胞による産生を阻害するＲ
Ｐ−［−コードしている遺伝子（ここでは＠ＲＰ−１”
遺伝子）中の突然変異、および残余プロテアーゼ１１（
ＲＰ−１１）をコードしている遺伝子（ここでは、”Ｒ
Ｐ−１’″遺伝子）中の突然変異を含んでいる。ａｐｒ
遺伝子およびＲＰ−用遺伝子でコードされているプロテ
アーゼは新規タンパク質である。
の手段 本発明は筐だ特性付けられていない６つのプロテアーゼ
遺伝子の１つまたはそれ以上に突然変異ｔｉむ改良され
たバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｎｉｌ胞を提供し；細
胞はまた好適には主たる細胞外プロテアーゼをコードし
ているａｐｒおよびｎｐｒ遺伝子中にも突然変異ｔｉみ
、その結果これらの細胞外プロテアーゼの細胞による産
生を阻止する。本発明の突然変異は、タンパク質分解活
性ａｐｒ遺伝子産物の細胞による産生を阻害するａｐｒ
遺伝子中の突然変異、タンパク質分解活性残余プロテア
ーセ１（ＲＰ−１） の細胞による産生を阻害するＲ
Ｐ−［−コードしている遺伝子（ここでは＠ＲＰ−１”
遺伝子）中の突然変異、および残余プロテアーゼ１１（
ＲＰ−１１）をコードしている遺伝子（ここでは、”Ｒ
Ｐ−１’″遺伝子）中の突然変異を含んでいる。ａｐｒ
遺伝子およびＲＰ−用遺伝子でコードされているプロテ
アーゼは新規タンパク質である。
最も好適には１本発明の突然変異は遺伝子のコードして
いる領域内の欠失であシ、全ＮＡ？Ｄコード領域の欠失
を含んでおシ；もしくは、突然変異はプロテアーゼコー
ド領域内の天然に存在する塩基対の１つまたはそれ以上
の塩基対の置換または挿入から戊っている。
いる領域内の欠失であシ、全ＮＡ？Ｄコード領域の欠失
を含んでおシ；もしくは、突然変異はプロテアーゼコー
ド領域内の天然に存在する塩基対の１つまたはそれ以上
の塩基対の置換または挿入から戊っている。
本発明のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＪｆＢ胞はまた
細胞内セリンプロテアーゼ■をコードシテいル１ｐ−１
遺伝子中の突然変異を含み、およびさらに胞子形成を阻
止する突然変異ヲ含むであろうし、それによシ胞子形成
−依存性グロチアーゼを産生ずる細胞の能力を減少させ
る；好適にはこの突然変異は初期段階で胞子形成を阻止
するが、精製ＤＮＡによシ形質転換される細胞の能力を
除去するものではなく：最も好適にはこの突然変異はｓ
ｐｏ ＯＡ突然変異（以下に記載）である。本発明はさ
らに。
細胞内セリンプロテアーゼ■をコードシテいル１ｐ−１
遺伝子中の突然変異を含み、およびさらに胞子形成を阻
止する突然変異ヲ含むであろうし、それによシ胞子形成
−依存性グロチアーゼを産生ずる細胞の能力を減少させ
る；好適にはこの突然変異は初期段階で胞子形成を阻止
するが、精製ＤＮＡによシ形質転換される細胞の能力を
除去するものではなく：最も好適にはこの突然変異はｓ
ｐｏ ＯＡ突然変異（以下に記載）である。本発明はさ
らに。
ａｐｒおよびｎｐｒ遺伝子およびａｐｒ遺伝子、ＲＰ−
１遺伝子およびＲＰ−１遺伝子からなる遺伝子群の１つ
ｉたはそれ以上の遺伝子中に突然変異を含むように宿主
を改良することによシバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
ｌ宿主細胞中の安定な異種ポリペプチドの産生のための
方法を提供する。
１遺伝子およびＲＰ−１遺伝子からなる遺伝子群の１つ
ｉたはそれ以上の遺伝子中に突然変異を含むように宿主
を改良することによシバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
ｌ宿主細胞中の安定な異種ポリペプチドの産生のための
方法を提供する。
本発明はまた精製ＤＮＡ、ＤＮＡを含む発現ベクターお
よび任意のプロテアーゼＲＰ−１．ＲＰ−ｉまたはａｐ
ｒ遺伝子産生物をコードしているＤＮＡで形質転換され
た宿主バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を特色とし：
好適にはそのようなりＮＡＦｉ枯草菌から誘導される。
よび任意のプロテアーゼＲＰ−１．ＲＰ−ｉまたはａｐ
ｒ遺伝子産生物をコードしているＤＮＡで形質転換され
た宿主バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を特色とし：
好適にはそのようなりＮＡＦｉ枯草菌から誘導される。
本発明Ｆｉまた実質的に純粋なＥｐｒ、残余グロテアー
セＩ（ＲＰ−１ｎよび残余プロテアーゼ■（ＲＰ−ｆｉ
）と称されるまだ特徴付けられていない他のプロテアー
ゼの分離によびＲＰ−１およびＲＰ−ＩＩプロテアーゼ
の特徴付けを特色とする；ここでは１実質的に純粋”と
は重量で９０僑を超えて純粋なことを意味する。
セＩ（ＲＰ−１ｎよび残余プロテアーゼ■（ＲＰ−ｆｉ
）と称されるまだ特徴付けられていない他のプロテアー
ゼの分離によびＲＰ−１およびＲＰ−ＩＩプロテアーゼ
の特徴付けを特色とする；ここでは１実質的に純粋”と
は重量で９０僑を超えて純粋なことを意味する。
術語”・ｐｒ遺伝子’ ”ＲＰ−１遺伝子′″および
＠ＲＰ−１遺伝子”はここでは枯草菌中でのこれらの呼
称に対応している各々の遺伝子を意味し。
＠ＲＰ−１遺伝子”はここでは枯草菌中でのこれらの呼
称に対応している各々の遺伝子を意味し。
他ｔＤハシラス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）種牛のこれらの遺
伝子の進化的相同性は（他のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）タンパク質の場合のごとく相同であｌ））ｍと種の
間で重要でない点で変化していると予想できる。
伝子の進化的相同性は（他のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）タンパク質の場合のごとく相同であｌ））ｍと種の
間で重要でない点で変化していると予想できる。
枯草醒のＲＰ−１およびＲＰ−３１遺伝子はまた各々互
と？よぴ二■蝉伝子とも称されている。多くの場合、進
化相同体間の配列相同性は十分によく。
と？よぴ二■蝉伝子とも称されている。多くの場合、進
化相同体間の配列相同性は十分によく。
そのため１つの種から誘導された遺伝子は常法によシ、
他の種からの進化相同体を得るためのハイプリダイゼー
シ鵬ングローブとして使用することができる。さらに、
これらの術語は筐た。もちろん、遺伝コードの重複性の
ため、コードするアミノ酸残基が変化しないような塩基
変化がなされている遺伝子も含んでいる。
他の種からの進化相同体を得るためのハイプリダイゼー
シ鵬ングローブとして使用することができる。さらに、
これらの術語は筐た。もちろん、遺伝コードの重複性の
ため、コードするアミノ酸残基が変化しないような塩基
変化がなされている遺伝子も含んでいる。
本明細書に記載された方法を用いると、プロテアーゼを
産生ずる能力が著しく減少したバシラスＣＢａｃｉｌｌ
ｕｓ）株が作られ、それ故、培養培地内へ分泌されうる
異種ポリペプチドの発現のための（著しい分解なしで）
宿主として有益である。本発明のバシラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）細胞は関連する活性をコードしている遺伝子中
にいくつかの突然変異を含んでいるけれど増殖可能であ
るだけでなく健全である。
産生ずる能力が著しく減少したバシラスＣＢａｃｉｌｌ
ｕｓ）株が作られ、それ故、培養培地内へ分泌されうる
異種ポリペプチドの発現のための（著しい分解なしで）
宿主として有益である。本発明のバシラス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）細胞は関連する活性をコードしている遺伝子中
にいくつかの突然変異を含んでいるけれど増殖可能であ
るだけでなく健全である。
本発明に従って任意の望まれるポリペプチドが発現でき
る１例えば、ホルモン、ワクチン、抗ウィルスタンパク
質、抗腫瘍タンパク質、抗体または凝固タンパク質のご
とき医学的に有益なタンパク質；および酵素または殺虫
剤のごとき農業および工業的に有益なタンパク質ニジよ
び本発明にょう阻害される１つまたはそれ以上のプロテ
アーゼを含むバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主中で不
安定な任意の他のポリペプチド。
る１例えば、ホルモン、ワクチン、抗ウィルスタンパク
質、抗腫瘍タンパク質、抗体または凝固タンパク質のご
とき医学的に有益なタンパク質；および酵素または殺虫
剤のごとき農業および工業的に有益なタンパク質ニジよ
び本発明にょう阻害される１つまたはそれ以上のプロテ
アーゼを含むバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主中で不
安定な任意の他のポリペプチド。
本発明の他の特色および利点は以下に記載するその好適
な実施態様の記載および特許請求の範囲から明らかにな
るであろう。
な実施態様の記載および特許請求の範囲から明らかにな
るであろう。
好適な実施態様
最初に図を簡単に説明する。
図１は枯草菌中性プロテアーゼ遺伝子をコードしている
２、４ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ挿入物および中性プロテアー
ゼ遺伝子中に欠失を持つ同一挿入物を各々含むプラスミ
ドル３フ１ Ｔｈよびｐ３７１Δ、およびバシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ｃａｔ 遺伝子を含む９３７１
３０Ｍの一連の図による説明である。
２、４ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ挿入物および中性プロテアー
ゼ遺伝子中に欠失を持つ同一挿入物を各々含むプラスミ
ドル３フ１ Ｔｈよびｐ３７１Δ、およびバシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ｃａｔ 遺伝子を含む９３７１
３０Ｍの一連の図による説明である。
図２は生遺伝子のヌクレオチド配列の一部に対応する■
ｐ−標識オリゴヌクレオチドで調べたＨｉｎｄｕ消化ｌ
５７５およびｌ５７５ＮΔＤＮＡのサザンプロットであ
る。
ｐ−標識オリゴヌクレオチドで調べたＨｉｎｄｕ消化ｌ
５７５およびｌ５７５ＮΔＤＮＡのサザンプロットであ
る。
図３は枯草菌ズブ゛チリシン遺伝子をコードしているグ
ラスミドｐＡｓＯＯ７の６．５ｋｂ挿入物および欠失プ
ラスミドｐＡｓ １３ の構築の説明である。
ラスミドｐＡｓＯＯ７の６．５ｋｂ挿入物および欠失プ
ラスミドｐＡｓ １３ の構築の説明である。
図４は細胞内部セリンプロテアーゼｌ５Ｐ−１をコード
している２、７ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入物を含むゲラスズ
ドｐＩｓＰ−１，釦よびｌ５Ｆ−１欠失プラスミドｐＡ
Ｌ６の構築を説明している。
している２、７ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入物を含むゲラスズ
ドｐＩｓＰ−１，釦よびｌ５Ｆ−１欠失プラスミドｐＡ
Ｌ６の構築を説明している。
図５はクローン化ａｐｒ遺伝子の図による説明であシ、
制限酵素認識部位を示している。
制限酵素認識部位を示している。
図６は生遺伝子のＤＮＡ配列である。
図７は欠失生遺伝子およびバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｃａｔ遺伝子ｆ：含むプラスミド
ｐＮＰ９の構築の図による説明である。
ｐＮＰ９の構築の図による説明である。
図８はＲＰ−１の最初の２８残基およびＲＰｌ遺伝子を
クローン化するのに使用されるグローブの対応するＤＮ
Ａ配列のアミノ酸配列である。
クローン化するのに使用されるグローブの対応するＤＮ
Ａ配列のアミノ酸配列である。
図９はＲＰ−１タンパク質をコードしているプラスミド
ｐＣＲ，８３０６，５ｋｂの挿入物の制限地図である。
ｐＣＲ，８３０６，５ｋｂの挿入物の制限地図である。
図１０はＲＰ−１グロテアーセをコードしているＤＮＡ
のＤＮＡ配列である。
のＤＮＡ配列である。
図１１は３つの内部Ｒ，Ｐ−１フラグメント（ａ。
ｂ、ｃ）のアミノ酸配列および遺伝子（ａ） 、 （ｂ
）および（ｃ）のクローン化に使用される６つの推測化
合物のヌクレオチド配列である。
）および（ｃ）のクローン化に使用される６つの推測化
合物のヌクレオチド配列である。
図１２はＢＲＴ９０および７０７で調べ九〇Ｐ２４１染
色体ＤＮＡのサザン プロットである。
色体ＤＮＡのサザン プロットである。
図１３は（ａ） ｐ Ｌ Ｐ Ｉの３．６ｋｂ Ｐｇ
ｔ Ｉ 挿入物の制限地図、（ｂ）欠失Ｒ，Ｐ−１遺
伝子の構築および（０）バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
染色体の中のＲＰ−ＩＩ欠失の作成に使用されたプラス
ミドの図である。
ｔ Ｉ 挿入物の制限地図、（ｂ）欠失Ｒ，Ｐ−１遺
伝子の構築および（０）バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
染色体の中のＲＰ−ＩＩ欠失の作成に使用されたプラス
ミドの図である。
図１４はａｐ−ｕをコードしているＤＮＡのＤＮＡ配列
である。
である。
実質的にタンパク質分解活性が欠けているバシ之王（Ｊ
ａｃｉｌｌｕａ）株を作シ出すのに従った一般的戦略を
以下に概説する。
ａｃｉｌｌｕａ）株を作シ出すのに従った一般的戦略を
以下に概説する。
２つの既知の主な細胞外プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒお
よびｎｐｒ）の欠失突然変異体を最初に構築する。主な
細胞内プロテアーゼをコードしている１ａｐ１遺伝子を
続いて欠失させ３重プロテアーゼ欠失突然変異体を作シ
出す。２重か噴たは３重欠失突然変異体にａｐｏ ＯＡ
突然変異を導入し。
よびｎｐｒ）の欠失突然変異体を最初に構築する。主な
細胞内プロテアーゼをコードしている１ａｐ１遺伝子を
続いて欠失させ３重プロテアーゼ欠失突然変異体を作シ
出す。２重か噴たは３重欠失突然変異体にａｐｏ ＯＡ
突然変異を導入し。
細胞中に存在する胞子形成依存プロテアーゼ活性を著し
く低下させる。これまで未知のプロテアーゼをコードし
ている遺伝子を単離し、その完全なヌクレオチド配列を
決定する。遺伝子６Ｐｒｉｔ ３４５アミノ酸の１次生
成物をコードして！？６、それはズプチリシン（Ａｐｒ
）＆よび枯草菌の主たる内部セリンプロテアーゼ（Ｉｓ
ｐ−１） の両方と部分的に相同である。この遺伝子
の欠失はインビトロで作成され、３重プロテアーゼ欠失
宿主内に導入される。残余プロテアーゼＲＰ−Ｉをコー
ドしている新しく同定された遺伝子中の欠失を続いて導
入し、実質的に減少したプロテアーゼ活性を持ち、ＲＰ
−１１活性のみを発現する枯草菌の株を作υ出す。ＲＰ
−１ａ精製されておシ、このプロテア−＋／′をコード
している遺伝子のクローン化に使用される核酸プローブ
の作製に使用するため、アミノ酸配列の一部が決定され
ている。遺伝子のクローニングによシ、ＲＰ−１を遺伝
子が欠失してシシ。
く低下させる。これまで未知のプロテアーゼをコードし
ている遺伝子を単離し、その完全なヌクレオチド配列を
決定する。遺伝子６Ｐｒｉｔ ３４５アミノ酸の１次生
成物をコードして！？６、それはズプチリシン（Ａｐｒ
）＆よび枯草菌の主たる内部セリンプロテアーゼ（Ｉｓ
ｐ−１） の両方と部分的に相同である。この遺伝子
の欠失はインビトロで作成され、３重プロテアーゼ欠失
宿主内に導入される。残余プロテアーゼＲＰ−Ｉをコー
ドしている新しく同定された遺伝子中の欠失を続いて導
入し、実質的に減少したプロテアーゼ活性を持ち、ＲＰ
−１１活性のみを発現する枯草菌の株を作υ出す。ＲＰ
−１ａ精製されておシ、このプロテア−＋／′をコード
している遺伝子のクローン化に使用される核酸プローブ
の作製に使用するため、アミノ酸配列の一部が決定され
ている。遺伝子のクローニングによシ、ＲＰ−１を遺伝
子が欠失してシシ。
それ故ＲＰ−用を産生できないバシラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）株を作製することが可能であった。
ｕｓ）株を作製することが可能であった。
プロテアーゼ遺伝子欠失の構＠および減少したプロテア
ーゼ活性を示すバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の調製
の詳細な方法は以下に記載する。
ーゼ活性を示すバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の調製
の詳細な方法は以下に記載する。
一般的方法
多欠失バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の構築のための
方法を以下に記載する。枯草菌染色体ＤＮＡの単離はＤ
ｕｂｎａｕら（１９７１，ジャーナル オプ モレキュ
ラーバイオロジー ５６：２０９）によシ記載されてい
るごとくして行った。枯草１１株をトリプトース血液寒
天基剤（デイ７コラボラトリーズ）上または最小グルコ
ース培地で増殖させ。
方法を以下に記載する。枯草菌染色体ＤＮＡの単離はＤ
ｕｂｎａｕら（１９７１，ジャーナル オプ モレキュ
ラーバイオロジー ５６：２０９）によシ記載されてい
るごとくして行った。枯草１１株をトリプトース血液寒
天基剤（デイ７コラボラトリーズ）上または最小グルコ
ース培地で増殖させ。
Ａｎａｇｎｏａｔｏｐｏｕｔｏｓらの方法（ジャーナル
オブ バクテリオロジー １９３１，８１：７４１）
によシコンピテントにする。大腸菌ＪＭ１０７を増殖し
、 ＨａｎａｈａＩＩの方法（ジャーナル オブモレキ
ュラー バイオロジー １９８３．１６６：５８７）に
よシコンビテントにする。枯草菌および大ｙＩＩＪ［か
らのプラスミドＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍらのＩＩ法（
ヌクレイックアシッズ リサーチ、１９７９．７：１３
１３）によう調製する。枯草菌にかけるプラスミド形質
転換はＧｒｙｃｚａｎらによシ（ジャーナル オプ バ
クテリオクジ−１９フ８．１３４：１３８）記載されて
いるごとくして実施する。
オブ バクテリオロジー １９３１，８１：７４１）
によシコンピテントにする。大腸菌ＪＭ１０７を増殖し
、 ＨａｎａｈａＩＩの方法（ジャーナル オブモレキ
ュラー バイオロジー １９８３．１６６：５８７）に
よシコンビテントにする。枯草菌および大ｙＩＩＪ［か
らのプラスミドＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍらのＩＩ法（
ヌクレイックアシッズ リサーチ、１９７９．７：１３
１３）によう調製する。枯草菌にかけるプラスミド形質
転換はＧｒｙｃｚａｎらによシ（ジャーナル オプ バ
クテリオクジ−１９フ８．１３４：１３８）記載されて
いるごとくして実施する。
プロテアーゼ検定
２つの異ったプロテアーゼ基質、アゾコールシよびカゼ
イン（両方とも１４Ｃまたは発色団レゾルフィンで標識
）、がプロテアーゼ検定に使用されるが、カゼイン基質
がタンパク質分解活性に対してよシ感度が良い。培養上
澄み液試料は定常期にはいって２または２０時間で検出
された。アゾコールに基づいたプロテアーゼ検定は１０
０μｌの培養上澄み液を９００μｇ の５０ｍＭ）Ｕス
、ｐＨ−８，５ｍＭＣａＣＪ、 ｋよび１０ｒ！ｖ ０
７ゾコール（シグマ、タンパク質分解切断された場合、
可溶性発色団を放出するタンパク質コラーゲンの共有結
合で修飾された不溶性型）に添加する事によシ実施する
。溶液を６７℃にて５０分間一定に振とうさせながら３
０分間インキュベートする０反応液を遠心分離して不溶
性アゾコールを除去し、溶液のＡ。、を決定する。阻害
剤は反応混合物と３７℃にて５分間前もってインキュベ
ートする。
イン（両方とも１４Ｃまたは発色団レゾルフィンで標識
）、がプロテアーゼ検定に使用されるが、カゼイン基質
がタンパク質分解活性に対してよシ感度が良い。培養上
澄み液試料は定常期にはいって２または２０時間で検出
された。アゾコールに基づいたプロテアーゼ検定は１０
０μｌの培養上澄み液を９００μｇ の５０ｍＭ）Ｕス
、ｐＨ−８，５ｍＭＣａＣＪ、 ｋよび１０ｒ！ｖ ０
７ゾコール（シグマ、タンパク質分解切断された場合、
可溶性発色団を放出するタンパク質コラーゲンの共有結
合で修飾された不溶性型）に添加する事によシ実施する
。溶液を６７℃にて５０分間一定に振とうさせながら３
０分間インキュベートする０反応液を遠心分離して不溶
性アゾコールを除去し、溶液のＡ。、を決定する。阻害
剤は反応混合物と３７℃にて５分間前もってインキュベ
ートする。
非常に少量の残余プロテアーゼ活性を測定せねばならな
い場合は、 １４ Ｃ−カゼインまたはりゾルフィン−
標識カゼインを基質として使用する。
い場合は、 １４ Ｃ−カゼインまたはりゾルフィン−
標識カゼインを基質として使用する。
１４ｃｍカゼイン試験にかいては培養上澄み液（１００
μＡりを１ｘ１０＠ｃｐｍの１４（１−カゼインにュー
イングランド ヌクレア）を含む１００ｐｉの５０
ｍ Ｍ ）リス、５ｍＭＣａＣｌ＊に加える。溶液を６
７℃にて３０分間インキュベートする６反応液を氷上に
置き、２０μｇのＢＳＡを担体タンパク質として添加す
る。冷１０４ＴＣＡＬ３００μｌ）を添加し、混合物は
氷上に１０分間保つ、溶液を遠心分離して沈澱タンパク
質を除き、上澄み液はシンテレ−シーン カウンターに
て計数する。レゾルフィン−標識カゼイン検定では、培
養上澄み液を等容量のトリス−Ｃｔ 緩衝液、ｐＨａｏ
中のレゾルツイーン−標識カゼインと５７℃にて種々の
時間インキュベートする。インキュページｌンに続き、
非加水分解基質をＴＣＡにて沈澱させ。
μＡりを１ｘ１０＠ｃｐｍの１４（１−カゼインにュー
イングランド ヌクレア）を含む１００ｐｉの５０
ｍ Ｍ ）リス、５ｍＭＣａＣｌ＊に加える。溶液を６
７℃にて３０分間インキュベートする６反応液を氷上に
置き、２０μｇのＢＳＡを担体タンパク質として添加す
る。冷１０４ＴＣＡＬ３００μｌ）を添加し、混合物は
氷上に１０分間保つ、溶液を遠心分離して沈澱タンパク
質を除き、上澄み液はシンテレ−シーン カウンターに
て計数する。レゾルフィン−標識カゼイン検定では、培
養上澄み液を等容量のトリス−Ｃｔ 緩衝液、ｐＨａｏ
中のレゾルツイーン−標識カゼインと５７℃にて種々の
時間インキュベートする。インキュページｌンに続き、
非加水分解基質をＴＣＡにて沈澱させ。
得られる発色性上澄み液を分光々置針によシ定量する。
ジェ遺伝子の欠失
Ｙａｎｇら（ジャーナル オプ パクテリオロジ１９８
４．１３０：１５）に従うとジ工遺伝子は枯草！！ＤＮ
Ａの重複Ｅｃｏ Ｒｌ ｋよびＢｉｎｄｕ制限断片内に
自まれでシシ、遺伝子配列の大多数は２．４ｋｂ Ｈｉ
ｎｄ Ｉ 断片上に位置している。この断片がｎｐｒ
欠失の作製のために選択された。
４．１３０：１５）に従うとジ工遺伝子は枯草！！ＤＮ
Ａの重複Ｅｃｏ Ｒｌ ｋよびＢｉｎｄｕ制限断片内に
自まれでシシ、遺伝子配列の大多数は２．４ｋｂ Ｈｉ
ｎｄ Ｉ 断片上に位置している。この断片がｎｐｒ
欠失の作製のために選択された。
２．４ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ Ｗｒ片をｉむ蘭々のクロー
ンは以下のごとくして調製されたゲノムＨｉｎｄｕ断片
のクローンパンクから単離された。染色体ＤＮＡは枯草
菌株ｌ５７５から単離され、 Ｂｉｎｄ Ｉ で消化
され０．８％アガロースゲル上の電気泳動によシ大きさ
で分画される。２−４ｋｂの大きさのＤＮＡをゲルから
電気的に溶出する。精製ＤＮＡはＢｉｎｄｕで消化され
、アルカリホスファターゼで処理されたｐＵＣ９ＤＮＡ
（ベセスダ リサーチ。
ンは以下のごとくして調製されたゲノムＨｉｎｄｕ断片
のクローンパンクから単離された。染色体ＤＮＡは枯草
菌株ｌ５７５から単離され、 Ｂｉｎｄ Ｉ で消化
され０．８％アガロースゲル上の電気泳動によシ大きさ
で分画される。２−４ｋｂの大きさのＤＮＡをゲルから
電気的に溶出する。精製ＤＮＡはＢｉｎｄｕで消化され
、アルカリホスファターゼで処理されたｐＵＣ９ＤＮＡ
（ベセスダ リサーチ。
ラボラトリーズ、ロックビル、Ｍｄから入手可能な大腸
菌レプリコン）と結合し、大腸醒抹ＪＭ１０７のコンピ
テント細胞を形質転換し、ＬＢ＋５０μｇ７−７ムピシ
リン上に置くと１０００のＲ Ａｍｐ コロニーを得る。
菌レプリコン）と結合し、大腸醒抹ＪＭ１０７のコンピ
テント細胞を形質転換し、ＬＢ＋５０μｇ７−７ムピシ
リン上に置くと１０００のＲ Ａｍｐ コロニーを得る。
クローン化生性プロテアーゼ遺伝子断片を含むコロニー
は常法のコロニー／）イプリダイゼーシ嘗ン法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ら、１９８３． ’ モレキｘラークロ
ーニング、実験手引書”コールド スプリンクハーバー
、ニューヨーク）によシ同定される。簡単に記すと、形
質転換体を、ニトロセルロースフィルターに移し、ｉ＠
菌して核酸を放出させｎｐｒ％異的プローブで調べる。
は常法のコロニー／）イプリダイゼーシ嘗ン法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ら、１９８３． ’ モレキｘラークロ
ーニング、実験手引書”コールド スプリンクハーバー
、ニューヨーク）によシ同定される。簡単に記すと、形
質転換体を、ニトロセルロースフィルターに移し、ｉ＠
菌して核酸を放出させｎｐｒ％異的プローブで調べる。
ヌクレオチド５２０および５４００間のｎｐｒ 遺伝子
配列と相補的な２０塩基のオリゴヌクレオチド（Ｙａｎ
ｇら、上記文献）がプローブとして使用された。配列は
５′ＧＧＣＡＣＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣ３’で
ある。
配列と相補的な２０塩基のオリゴヌクレオチド（Ｙａｎ
ｇら、上記文献）がプローブとして使用された。配列は
５′ＧＧＣＡＣＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣ３’で
ある。
２．４ｋｂ Ｈｉｎｄ厘挿入物を含む代表的クローンが
同定され、ｐ３７１ と名付けられた（図１）。
同定され、ｐ３７１ と名付けられた（図１）。
ｐ３７１に訃ける」ユ遺伝子の欠失型はｔとビトロで誘
導された。ｐ ３７１ ＤＮＡ ｆ：ｌ’ｌμＩおよび
Ｈｉｎｄｕで消化することによＦ）−５ａｏｂｐ内１Ｒ
ｓａｌＵ片が欠失した。遺伝子の５′末端；てつながっ
ている３００ｂｐＨｉｎｄｌ−Ｒｓａ１７ラグメン）＆
よび遺伝子の３沫端につながっている１２２０ｂｐＲｓ
ａｌ−旦１ｎｄｌ断片（図１参照）を単離し、Ｈｉｎｄ
ｌ＆よびアルカリホス７フターゼ処理ｐＵｃ９内へクロ
ーン化する。これによシｎｐｒ遺伝子の中心部分が欠失
する。結合されたＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０７を形質転換
する。所望のｎｐｒ遺伝遺伝入内欠失つクローンは制限
酵素分析によシ同定された。このプラスミドはｐ３７１
Δと称される。
導された。ｐ ３７１ ＤＮＡ ｆ：ｌ’ｌμＩおよび
Ｈｉｎｄｕで消化することによＦ）−５ａｏｂｐ内１Ｒ
ｓａｌＵ片が欠失した。遺伝子の５′末端；てつながっ
ている３００ｂｐＨｉｎｄｌ−Ｒｓａ１７ラグメン）＆
よび遺伝子の３沫端につながっている１２２０ｂｐＲｓ
ａｌ−旦１ｎｄｌ断片（図１参照）を単離し、Ｈｉｎｄ
ｌ＆よびアルカリホス７フターゼ処理ｐＵｃ９内へクロ
ーン化する。これによシｎｐｒ遺伝子の中心部分が欠失
する。結合されたＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０７を形質転換
する。所望のｎｐｒ遺伝遺伝入内欠失つクローンは制限
酵素分析によシ同定された。このプラスミドはｐ３７１
Δと称される。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中の要素の選択を容易に
する為にベクター上に選択可能マーカーをコードしてい
る遺伝子が導入された。クロラムフェニコール耐性（Ｃ
ｍｒ）をコードしているバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
ｃａｔ遺伝子を１，３ｋｂ ８ａｌ ｌ断片上のグラ
スミドｐＭＩ １１０１ （Ｙｏｕｎｇｍａｎ ら。
する為にベクター上に選択可能マーカーをコードしてい
る遺伝子が導入された。クロラムフェニコール耐性（Ｃ
ｍｒ）をコードしているバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
ｃａｔ遺伝子を１，３ｋｂ ８ａｌ ｌ断片上のグラ
スミドｐＭＩ １１０１ （Ｙｏｕｎｇｍａｎ ら。
１９８４、プラス□ド１２：１−９）から単離し。
ｐ３７１ΔのＳａｌ １部位内へクローン化する。この
ＤＮＡで大腸１ｉＪＭ１０７を形質転換し、形質転換体
はクロラムフェニコール耐性でスクリー二方を含む代表
的プラスミドは９３７１３０ｍ（図１）と名付けられた
。
ＤＮＡで大腸１ｉＪＭ１０７を形質転換し、形質転換体
はクロラムフェニコール耐性でスクリー二方を含む代表
的プラスミドは９３７１３０ｍ（図１）と名付けられた
。
ベクターｐ３７１ΔＣｍは大腸菌レプリコンｐＵＣ１９
から誘導されてカシ、それ故バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）宿主中では複製できない、相同配列間の相互的組換
えによシ受容体宿主の染色体中の野生型ｎｐｒ遺伝子が
ベクター上に含１れている欠失ｎｐｒ遺伝子に交換され
た。Ｃｍｒマーカー遺伝子はグロテアーセ遺伝子配列を
含めてベクターがすでに組み込１れている細胞の選択を
可能にする。
から誘導されてカシ、それ故バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）宿主中では複製できない、相同配列間の相互的組換
えによシ受容体宿主の染色体中の野生型ｎｐｒ遺伝子が
ベクター上に含１れている欠失ｎｐｒ遺伝子に交換され
た。Ｃｍｒマーカー遺伝子はグロテアーセ遺伝子配列を
含めてベクターがすでに組み込１れている細胞の選択を
可能にする。
欠失ｎｐｒ遺伝子が組み込まれているベクター配列はそ
れにそったｎｐｒ遺伝子のコピーを取シながら、低い頻
度で染色体から自発的に分割される。
れにそったｎｐｒ遺伝子のコピーを取シながら、低い頻
度で染色体から自発的に分割される。
染色体中の欠失プロテアーゼの保持はＣｍ’分離物中の
プロテアーゼ活性の欠落を検定することによシ確認する
。
プロテアーゼ活性の欠落を検定することによシ確認する
。
特に、コンピテント枯草＠ｌ５７５細胞が９３７１３０
ｍ で形質転換され Ｃｍ ｒ で選択された。野生
型遺伝子に隣接して、または置き換わった欠失５狂遺伝
子がおそらく組み込まれている約２０００のコロニーが
選択され、それらはクロラムフェニコール耐性であった
。コロニーの約２５４がでんぷん寒天上によシ小さい除
去圏を形成し、野生型遺伝子が遺伝子の欠失型に置き換
えられていた事を示している。これらの細胞培、養物か
らの上澄み液ては中性プロテアーセ活性は検出されなか
った。対照的に、野生型ｌ５７５細胞からの培養液内に
は高水準の中性プロテアーゼ活性が検出された。欠失プ
ロテアーセ遺伝子の１つの組込みコピーをｉむが、ベク
ター配列が除去されている分離物は以下のごとくして続
いて選択された。
ｍ で形質転換され Ｃｍ ｒ で選択された。野生
型遺伝子に隣接して、または置き換わった欠失５狂遺伝
子がおそらく組み込まれている約２０００のコロニーが
選択され、それらはクロラムフェニコール耐性であった
。コロニーの約２５４がでんぷん寒天上によシ小さい除
去圏を形成し、野生型遺伝子が遺伝子の欠失型に置き換
えられていた事を示している。これらの細胞培、養物か
らの上澄み液ては中性プロテアーセ活性は検出されなか
った。対照的に、野生型ｌ５７５細胞からの培養液内に
は高水準の中性プロテアーゼ活性が検出された。欠失プ
ロテアーセ遺伝子の１つの組込みコピーをｉむが、ベク
ター配列が除去されている分離物は以下のごとくして続
いて選択された。
Ｃｍｒコロニーの培養物は選択することなく液体培地中
で一夜増殖させた後ＴＢＡＢ培地上に塗布する。これら
のコロニーＦｉ続いてクロラムフェニコールを含む培地
上に写し取シ、クロラムフェニコール存在下で増殖しな
いものを同定しオリジナルのプレートから選択する。そ
のようなＮｐｒ陰性コロニーの１つが選択されｌ５７５
ＮΔ と称された。
で一夜増殖させた後ＴＢＡＢ培地上に塗布する。これら
のコロニーＦｉ続いてクロラムフェニコールを含む培地
上に写し取シ、クロラムフェニコール存在下で増殖しな
いものを同定しオリジナルのプレートから選択する。そ
のようなＮｐｒ陰性コロニーの１つが選択されｌ５７５
ＮΔ と称された。
１８７５ＮΔ中のｌ■遺遺伝円内欠失は枯草菌ｌ８７５
Ｎおよびｌ８７５ＮΔから単離されたＨｉｎｄ Ｉｆ消
化ＤＮＡを”ｌＰ−標識Ｊは一特異性オリゴヌクレオチ
ドで調べる標準的サザンプロット分析（サザン、１９７
１ジャーナル オブモレキュラー バイオロー／−９８
：５０３）ＩＣよシ確認する。野生型ｌ５７ＳＮ Ｄ
ＮＡ中の２．４ｋｂＨｉｎｄｌ断片およびｌ５７５ＮΔ
ＤＮＡ中の１．８ｋｂ断片とハイブリダイズするプロー
ブはｌ５７５ＮΔ にかいて３００ｂｐＯｎｐｒ遺伝子
が欠失している事を示している（図２参照）。
Ｎおよびｌ８７５ＮΔから単離されたＨｉｎｄ Ｉｆ消
化ＤＮＡを”ｌＰ−標識Ｊは一特異性オリゴヌクレオチ
ドで調べる標準的サザンプロット分析（サザン、１９７
１ジャーナル オブモレキュラー バイオロー／−９８
：５０３）ＩＣよシ確認する。野生型ｌ５７ＳＮ Ｄ
ＮＡ中の２．４ｋｂＨｉｎｄｌ断片およびｌ５７５ＮΔ
ＤＮＡ中の１．８ｋｂ断片とハイブリダイズするプロー
ブはｌ５７５ＮΔ にかいて３００ｂｐＯｎｐｒ遺伝子
が欠失している事を示している（図２参照）。
５桁遺伝子の欠失
ズプチリシン遺伝子（ａｐｒ）をりａ−ン化するため最
初にｌ５７５ ＤＮＡからのゲノムライブラリーが調製
された。染色体ＤＮＡが単離され。
初にｌ５７５ ＤＮＡからのゲノムライブラリーが調製
された。染色体ＤＮＡが単離され。
ＥｃｏＲＩ で消化し、α８優アガロースゲルを通し
た電気泳動によ砂分離する。５−８ｋｂの大きさの範囲
の断片をゲルからの電気的溶出によシ精製する。断片に
見セＲＩ 消化ｐＢＲ３２８ＤＮＡにュー イングラン
ド バイオラボから一般でも入手可能である）を結合し
、コンピテント大腸菌ＪＭ１０７細胞を形質転換する。
た電気泳動によ砂分離する。５−８ｋｂの大きさの範囲
の断片をゲルからの電気的溶出によシ精製する。断片に
見セＲＩ 消化ｐＢＲ３２８ＤＮＡにュー イングラン
ド バイオラボから一般でも入手可能である）を結合し
、コンピテント大腸菌ＪＭ１０７細胞を形質転換する。
形質転換体はヌクレオチド５０５および５２０の間のａ
ｐｒ 遺伝子配列と相同の脅威０Ｐ−標＠１７−ｍｅ
ｒ オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする
かによ？） ａｐｒ遺伝子挿入物を含むグラスミドをス
クリーニングするＣ３ｔａｈｌら、１９８ｊ、 ジャー
ナル オプ パクテリオロジー １５８：４１１）。
ｐｒ 遺伝子配列と相同の脅威０Ｐ−標＠１７−ｍｅ
ｒ オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする
かによ？） ａｐｒ遺伝子挿入物を含むグラスミドをス
クリーニングするＣ３ｔａｈｌら、１９８ｊ、 ジャー
ナル オプ パクテリオロジー １５８：４１１）。
グローブとハイブリダイズする６、５ｋｂＥｃｏＲＩ挿
入物を持つクローンを選択し、ｐＡｓＯＯ７と名付ける
（図３）、６．５ｋｂ 断片はズプチリシン遺伝子を完
全にコードしている配列を含んでいる。
入物を持つクローンを選択し、ｐＡｓＯＯ７と名付ける
（図３）、６．５ｋｂ 断片はズプチリシン遺伝子を完
全にコードしている配列を含んでいる。
ａｐｒ遺伝子の突然変異体は２つの内部ｋＩ断片を欠失
させることによシ作製する（図３）。
させることによシ作製する（図３）。
ｐＡ８００７を最初にＨｐａｌ で消化し、希釈溶液
中（５μｇ／ｍｌ）で結合して再環化することによシ２
つのｋｌ断片を除去する。ＪＭｌ ０７細胞の形質転換
によシ約２００のＡｍｐｒコロニーが生じた。これらの
形質転換体の１つは１つの内部Ｈｐａｌ 部位を持つ
４．８ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物を含んでいた。それはｐＡ
８１２ と名付けられた。
中（５μｇ／ｍｌ）で結合して再環化することによシ２
つのｋｌ断片を除去する。ＪＭｌ ０７細胞の形質転換
によシ約２００のＡｍｐｒコロニーが生じた。これらの
形質転換体の１つは１つの内部Ｈｐａｌ 部位を持つ
４．８ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物を含んでいた。それはｐＡ
８１２ と名付けられた。
ａｐｒ遺伝子の欠失は遺伝子の３′末ｎｔ超えて５００
ｂｐ伸びていたが、ここのＤＮＡには枯草菌に必須のど
んな遺伝子も含まれてはいなかった。
ｂｐ伸びていたが、ここのＤＮＡには枯草菌に必須のど
んな遺伝子も含まれてはいなかった。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ｃａｔ遺伝子を含む１
．３ｋｂｓａｌｌ 断片をバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）宿主染色体中の組み込み体の選択のためｐＡ８１２の
５ａｌｌｌｉＳ位内へクローン化する（前記のごとく）
。
．３ｋｂｓａｌｌ 断片をバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）宿主染色体中の組み込み体の選択のためｐＡ８１２の
５ａｌｌｌｉＳ位内へクローン化する（前記のごとく）
。
プラスミドＤＮＡで大腸菌ＪＭｌ ０７ｙ形質転換し、
アムピシリン含有培地上に撒布すると約５０のＡｍｐ’
コロニーが回収され、７．５μｇ／−クロラＡフェニコ
ール含有培地上でレプリカ平板法を行う、５０のうち３
つがＣｍｒであった。これらの３つのコロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離し。
アムピシリン含有培地上に撒布すると約５０のＡｍｐ’
コロニーが回収され、７．５μｇ／−クロラＡフェニコ
ール含有培地上でレプリカ平板法を行う、５０のうち３
つがＣｍｒであった。これらの３つのコロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離し。
制限消化によシ分析した。プラスミドの１つが所望の制
限パターンを持って卦シ、ｐＡ８１３ と名付けられた
（図６）。
限パターンを持って卦シ、ｐＡ８１３ と名付けられた
（図６）。
枯草菌染色体内への欠失プロテアーゼ遺伝子の組み込み
を促進するためａ ｐＡｓ１５がｌ５７５ＮΔ株内へ導
入されＣｍｒ形質転換体として選択された。形質転換体
は続いて５μｇ／ｍｊ Ｃｍ ｋよび１．５僑カセイ
ンを含むＴＢＡＢプレート上に塗布することによシ野生
型ａｐｒ遺伝子が欠失遺伝子で置換されているかをスク
リーニングする。かさを産生しないいくりかのコロニー
が上に記載したごとくＣｍｒ遺伝子が喪失したとして選
択された。
を促進するためａ ｐＡｓ１５がｌ５７５ＮΔ株内へ導
入されＣｍｒ形質転換体として選択された。形質転換体
は続いて５μｇ／ｍｊ Ｃｍ ｋよび１．５僑カセイ
ンを含むＴＢＡＢプレート上に塗布することによシ野生
型ａｐｒ遺伝子が欠失遺伝子で置換されているかをスク
リーニングする。かさを産生しないいくりかのコロニー
が上に記載したごとくＣｍｒ遺伝子が喪失したとして選
択された。
代表的な形質転換体が選択されＧＰ １９９と名付けら
れた。
れた。
欠失中性プロテアーゼ遺伝子のみを持つ株と同様に２重
プロテアーセ欠失株からの培養液中のプロテアーセ活性
が検定された。 Ｎｐ ｒ”’ 、 Ａｐｒ−突然変異
細胞中のプロテアーゼ活性は野生型のレベルの約４−７
１であシ、一方Ｎｐｒ″″突然変異体はよシ高いレベル
のプロテアーゼ活性を示した。
プロテアーセ欠失株からの培養液中のプロテアーセ活性
が検定された。 Ｎｐ ｒ”’ 、 Ａｐｒ−突然変異
細胞中のプロテアーゼ活性は野生型のレベルの約４−７
１であシ、一方Ｎｐｒ″″突然変異体はよシ高いレベル
のプロテアーゼ活性を示した。
ａｍｙ Ｂ突然変異
グロテアーセ欠損株をバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ア
ミラーセの産生に関して試験した０種々のプラスミド構
築物によシ産生されるアミラーセのレベルを検定するに
は野生型遺伝子のかわｂに宿主内ヘ突然変異体アミラー
ゼレベルを導入する必要がある。この工程は本発明には
必須ではなくまたプロテアーゼ活性のレベルには影響を
及ぼさない：これは染色体がコードするアミラーゼ存在
下ではプラスミドがコードしているアミラーゼレベルを
決定できないので実施されるのである。ａｍｙＥ対立遺
伝子は枯草菌株ＪＦ２０６（ｔｚ上Ｃ２、斐望Ｅ ）か
らＧＰ１９９内へコングレッシ３ンとして知られている
形質転換／選択法によシ形質転換された。
ミラーセの産生に関して試験した０種々のプラスミド構
築物によシ産生されるアミラーセのレベルを検定するに
は野生型遺伝子のかわｂに宿主内ヘ突然変異体アミラー
ゼレベルを導入する必要がある。この工程は本発明には
必須ではなくまたプロテアーゼ活性のレベルには影響を
及ぼさない：これは染色体がコードするアミラーゼ存在
下ではプラスミドがコードしているアミラーゼレベルを
決定できないので実施されるのである。ａｍｙＥ対立遺
伝子は枯草菌株ＪＦ２０６（ｔｚ上Ｃ２、斐望Ｅ ）か
らＧＰ１９９内へコングレッシ３ンとして知られている
形質転換／選択法によシ形質転換された。
この方法は形質転換を行うＤＮＡが過剰に与えられた場
合１つ以上の染色体ＤＮＡによシ形質転換されるコンピ
テント枯草菌細胞の能力に頼っている。この方法におい
ては最初に、アミラーゼの産生不能のごとき選択不可能
なマーカーの共転移のためのスクリーニングを容易にす
、るための選択可能マーカー遺伝子の発現を検定するこ
とによシ集団中のコンピテント細胞を選択する。
合１つ以上の染色体ＤＮＡによシ形質転換されるコンピ
テント枯草菌細胞の能力に頼っている。この方法におい
ては最初に、アミラーゼの産生不能のごとき選択不可能
なマーカーの共転移のためのスクリーニングを容易にす
、るための選択可能マーカー遺伝子の発現を検定するこ
とによシ集団中のコンピテント細胞を選択する。
ＪＦ２０６またはＪＬｎ’ｌＹ Ｅ 突然変異を含む
類似の株から全染色体ＤＮＡを単離する。飽和＠度（〜
１μｇ）でコンピテント細胞 １９９ （ｍ＠を１ｅｕ
−、ｈｉｇ−）を形質転換し、Ｈｌｇ 形質転換体を
メチオニンおよびロイシンを補充した最小培地上で選択
する。形質転換体はでんぷん−アズール含有上面寒天層
を持つ平板上でアミラーゼマイナス表現型のスクリーニ
ングを行うａＨｌｍ の５優のコロニーはかさを産生
ずる事ができずアミラーゼ遺伝子に欠損がある事を示し
ている。そのような形質転換体の１つがプロテアーゼ欠
損表現型で検定され、ＧＰ２００と名付けられた。
類似の株から全染色体ＤＮＡを単離する。飽和＠度（〜
１μｇ）でコンピテント細胞 １９９ （ｍ＠を１ｅｕ
−、ｈｉｇ−）を形質転換し、Ｈｌｇ 形質転換体を
メチオニンおよびロイシンを補充した最小培地上で選択
する。形質転換体はでんぷん−アズール含有上面寒天層
を持つ平板上でアミラーゼマイナス表現型のスクリーニ
ングを行うａＨｌｍ の５優のコロニーはかさを産生
ずる事ができずアミラーゼ遺伝子に欠損がある事を示し
ている。そのような形質転換体の１つがプロテアーゼ欠
損表現型で検定され、ＧＰ２００と名付けられた。
２重プロテアーゼ突然変異体の培養液からの上澄み液試
料はアゾコールを基質として使用するプロテアーゼ活性
の検定を行った。この基質で検定した場合、２重プロテ
アーゼ突然変異株のプロテアーゼ活性は野性型レベルの
４１であった。よシ高感度基質である１◆Ｃ−カゼイン
をプロテアーゼ検定に使用した場合、２重突然変異は野
生型枯草菌活性の５−７唾の活性を示した。この株にお
いてはプロテアーゼ活性は低いけれども、これらのプロ
テアーゼ欠損細胞によう産生されるある種の異種遺伝子
産生物が安定ではなく残余プロテアーゼ活性の存在を示
している。そこで残余プロテアーゼ活性の原因となる遺
伝子の同定および変更が考えられた。
料はアゾコールを基質として使用するプロテアーゼ活性
の検定を行った。この基質で検定した場合、２重プロテ
アーゼ突然変異株のプロテアーゼ活性は野性型レベルの
４１であった。よシ高感度基質である１◆Ｃ−カゼイン
をプロテアーゼ検定に使用した場合、２重突然変異は野
生型枯草菌活性の５−７唾の活性を示した。この株にお
いてはプロテアーゼ活性は低いけれども、これらのプロ
テアーゼ欠損細胞によう産生されるある種の異種遺伝子
産生物が安定ではなく残余プロテアーゼ活性の存在を示
している。そこで残余プロテアーゼ活性の原因となる遺
伝子の同定および変更が考えられた。
残余プロテアーゼ活性の特徴付けをする為に。
２重プロテアーゼ突然変異株の培養液のプロテアーゼレ
ベルを下げる多数の既知のプロテアーゼ阻害剤の能力を
試験した。セリン プロテアーゼ活性の阻害剤として知
られているＰＭＳＦＣフェニルメチルスルホニル フル
オリド）が最も有効である事が観察された。 Ａｐｒ
Ｎｐｒバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の増殖培養
液へのＰＭＳＦの添加はうまく、これらの細胞で合成お
よび分泌される異種ペプチドおよびタンパク質の安定性
を増加させた。これらの結果は残余分解活性の少くとも
一部はセリン プロテアーゼによるものである事を示し
ている。
ベルを下げる多数の既知のプロテアーゼ阻害剤の能力を
試験した。セリン プロテアーゼ活性の阻害剤として知
られているＰＭＳＦＣフェニルメチルスルホニル フル
オリド）が最も有効である事が観察された。 Ａｐｒ
Ｎｐｒバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の増殖培養
液へのＰＭＳＦの添加はうまく、これらの細胞で合成お
よび分泌される異種ペプチドおよびタンパク質の安定性
を増加させた。これらの結果は残余分解活性の少くとも
一部はセリン プロテアーゼによるものである事を示し
ている。
ズプチリシンは枯草菌によシ分泌される主たるセリン
プロテアーゼである：しかしながら。
プロテアーゼである：しかしながら。
１ｓｐ−１遺伝子Ｃｌ５Ｐ−１）にニジコードされてい
るセリン プロテアーゼは胞子形成の間細胞内に蓄積さ
れていることが示されている（ ５ｒｉｖａａｔａｖａ
ら、１９８１．フルヒープ ７オー マイクロバイオク
ジ−１２９：２２７）、残余プロテアーゼ活性がｌ５Ｆ
−１によるものかを明らかにするため、１ｓｐ−１遺伝
子が欠失したものをｔとビトロで作製し、２重−１０テ
アーセ欠失抹内へ取シ込ませた。
るセリン プロテアーゼは胞子形成の間細胞内に蓄積さ
れていることが示されている（ ５ｒｉｖａａｔａｖａ
ら、１９８１．フルヒープ ７オー マイクロバイオク
ジ−１２９：２２７）、残余プロテアーゼ活性がｌ５Ｆ
−１によるものかを明らかにするため、１ｓｐ−１遺伝
子が欠失したものをｔとビトロで作製し、２重−１０テ
アーセ欠失抹内へ取シ込ませた。
暉吐−１遺伝子の欠失
暉旺−１遺伝子は枯草菌染色体ＤＮＡの２．７ｋｂＢａ
ｍＨＩ断片内に含まれているＬＫｏｉｄｅら。
ｍＨＩ断片内に含まれているＬＫｏｉｄｅら。
１９８６、ジャーナル オブ パクテリオロジー１６７
：１１０）。精製ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し＋ ２．
７ｋｂ の大きさの範囲を７ガロースゲルから電気的
に溶出し、ＢａｍＨＩ 消化ｐＢＲ３２Ｂ内へ連結し
、大腸菌ＪＭ１０７細胞を形質転換する。１係カゼイン
含有ＬＢ培地上でかさを産生ずる１つのＡｍｐｒ ：１
ｅ＋ニーが選択されｐＩｓＰ−１と名付けられた。ＤＮ
Ａの制限分析によると。
：１１０）。精製ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し＋ ２．
７ｋｂ の大きさの範囲を７ガロースゲルから電気的
に溶出し、ＢａｍＨＩ 消化ｐＢＲ３２Ｂ内へ連結し
、大腸菌ＪＭ１０７細胞を形質転換する。１係カゼイン
含有ＬＢ培地上でかさを産生ずる１つのＡｍｐｒ ：１
ｅ＋ニーが選択されｐＩｓＰ−１と名付けられた。ＤＮ
Ａの制限分析によると。
ｐＩｓＰ−１はＤ哩−１遺伝子配列と相同の合成２５塩
基０Ｐ−標識オリゴヌクレオテドプロープ（５’ＡＴＧ
ＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＧＣＴＴＧＡＴＣＣ３’）
ＬＫｏｉｄｅら前記文献）とＩ・イブリダイズする２、
７ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ挿入物を運んでいる。５ａｌｌ
＆よびＢｃｏＲＩ 消化によシ発生する制限パターンか
らもｐＩｓＦ−１中の探」−１遺伝子の存在が確認され
た。
基０Ｐ−標識オリゴヌクレオテドプロープ（５’ＡＴＧ
ＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＧＣＴＴＧＡＴＣＣ３’）
ＬＫｏｉｄｅら前記文献）とＩ・イブリダイズする２、
７ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ挿入物を運んでいる。５ａｌｌ
＆よびＢｃｏＲＩ 消化によシ発生する制限パターンか
らもｐＩｓＦ−１中の探」−１遺伝子の存在が確認され
た。
欠失は遺伝子の中央に位置している独特のｆｌＬ１１部
位を利用して１ｓｐ−１遺伝子内に作製された。ベクタ
ー中に別の８ａｌｌＩＩｆ１位があるので。
位を利用して１ｓｐ−１遺伝子内に作製された。ベクタ
ー中に別の８ａｌｌＩＩｆ１位があるので。
最初に２．７ ｋｂ Ｂａｎ ＨＩ遺伝子挿入物ｋＰＢ
Ｒ３２２の誘導体（ｐＡＬ４）のシ＞ｍＨＩ 部位に
クローン化し、それによシシ吐１部位を除く（図４）。
Ｒ３２２の誘導体（ｐＡＬ４）のシ＞ｍＨＩ 部位に
クローン化し、それによシシ吐１部位を除く（図４）。
生じるプラスミド、ｐＡＬ５ はそれ故υ哩−１遺伝子
内に独特のＳａｌ １部位を持っている。ｐＡＬ５ Ｄ
ＮＡをＳａｌ ｌで消化し、Ｂａ１３１ エキソヌク
レアーゼで３７℃にて５分間処理して遺伝子配列の−ｓ
′を欠失させ再連結する。このＤＮＡでＪＭ１０７’ｉ
形質転換し、得られるＡｍｐ コロ−−の小さくなっ
たＢａｍＨＩ挿入物をスクリーニングする。ＢａｍＨＩ
挿入物内に１．２ｋｂ の欠失を持りプラスミドを選択
し、ｐＡＬ６と名付けた（図４）。
内に独特のＳａｌ １部位を持っている。ｐＡＬ５ Ｄ
ＮＡをＳａｌ ｌで消化し、Ｂａ１３１ エキソヌク
レアーゼで３７℃にて５分間処理して遺伝子配列の−ｓ
′を欠失させ再連結する。このＤＮＡでＪＭ１０７’ｉ
形質転換し、得られるＡｍｐ コロ−−の小さくなっ
たＢａｍＨＩ挿入物をスクリーニングする。ＢａｍＨＩ
挿入物内に１．２ｋｂ の欠失を持りプラスミドを選択
し、ｐＡＬ６と名付けた（図４）。
５ａｌｌ 断片上の大腸菌プラスミドｐＭ１１１０１
から前記のごとくして但遺伝子を精製し。
から前記のごとくして但遺伝子を精製し。
ｐＡＬ ６のＢ ｃｏ ＲＶ部位へクローン化する。得
られるＤＮＡで２重グロテアーセ突然変異株を形質転換
しくＧＰ２００）−欠失Ｉ８．Ｐ−１遺伝子を含む組込
み体を前記のごとく選択する。５重−グロテアーセ欠失
ａｔｔＧ Ｐ ２０８ （ａｐｒ Δ、 ｎｐｒΔ。
られるＤＮＡで２重グロテアーセ突然変異株を形質転換
しくＧＰ２００）−欠失Ｉ８．Ｐ−１遺伝子を含む組込
み体を前記のごとく選択する。５重−グロテアーセ欠失
ａｔｔＧ Ｐ ２０８ （ａｐｒ Δ、 ｎｐｒΔ。
ｉｍｐ−１Δ）と称されている。カセイ／基質を用い、
３ｆ［−突然変異株（Ａｐｒ″″、Ｎｐｒ 、ｌ５
ｐ−１）のグロテアーセ活性が測定され、大体２１突然
変異抹と同じの野生型レベルの４％であることが観察さ
れた。
３ｆ［−突然変異株（Ａｐｒ″″、Ｎｐｒ 、ｌ５
ｐ−１）のグロテアーセ活性が測定され、大体２１突然
変異抹と同じの野生型レベルの４％であることが観察さ
れた。
残った４係の残余プロテア−”ＩＩ’活性は明らかに前
に記載したパシロペプチダーゼＦと呼ばれているエステ
ラーゼＬＲｏｉｔｓｃｈら、１９８３．ジャーナル オ
プ バクテリオクジ−，１５５：１４５）かまたは未知
の未同定プロテアーゼ遺伝子（群）によるもＯであろう
。
に記載したパシロペプチダーゼＦと呼ばれているエステ
ラーゼＬＲｏｉｔｓｃｈら、１９８３．ジャーナル オ
プ バクテリオクジ−，１５５：１４５）かまたは未知
の未同定プロテアーゼ遺伝子（群）によるもＯであろう
。
胞子形成突然変異の導入
ある種のプロテアーゼの産生が枯草菌の胞子形成に伴っ
ていることが示されている為、我々のプロテアーゼ欠損
宿主中の胞子形成を阻止する突然変異が自まれでいた方
が有益であろうし、それによυこれらの抹における胞子
形成−依存プロテアーゼ産生を更に減少させるであろう
、胞子形成過程を段階０で阻止する突然変異は施主され
るプロテアーゼのレベルを減少させるが、精製ＤＮＡに
よシ形質転換される細胞の能力を除去しない。
ていることが示されている為、我々のプロテアーゼ欠損
宿主中の胞子形成を阻止する突然変異が自まれでいた方
が有益であろうし、それによυこれらの抹における胞子
形成−依存プロテアーゼ産生を更に減少させるであろう
、胞子形成過程を段階０で阻止する突然変異は施主され
るプロテアーゼのレベルを減少させるが、精製ＤＮＡに
よシ形質転換される細胞の能力を除去しない。
５ｐｏＯＡ 突然変異はグロテアーセ合成を減少させ
るのに特に有効であることが示されてきた（Ｆｅｒｒａ
ｒｉら、１９Ｂ６．ジャーナｋ オプ パクテリオロ
ジー １６６：１７３）。
るのに特に有効であることが示されてきた（Ｆｅｒｒａ
ｒｉら、１９Ｂ６．ジャーナｋ オプ パクテリオロ
ジー １６６：１７３）。
セリン プロテア−−１！’Ｃｌ５Ｐ−１）の産生を除
去するための我々の戦略の第１の状況のごとく最初に２
重プロテアーゼ欠損株内へＩＩ１ＯＡ 突然変異を導
入する。康終的には６重−釦よび４重プロテアーゼ欠損
株内へＩＰＯＯＡ突然変異を導入する。この我々の発明
の特色は枯草菌宿主にかける異種遺伝子生成物の産生の
ための発現ベクター内に含まれるプロモーターが胞子形
成−特異性プロモーター（例えばｓｐｏ ＶＧプロモー
ター）でない場合にのみ有益である。
去するための我々の戦略の第１の状況のごとく最初に２
重プロテアーゼ欠損株内へＩＩ１ＯＡ 突然変異を導
入する。康終的には６重−釦よび４重プロテアーゼ欠損
株内へＩＰＯＯＡ突然変異を導入する。この我々の発明
の特色は枯草菌宿主にかける異種遺伝子生成物の産生の
ための発現ベクター内に含まれるプロモーターが胞子形
成−特異性プロモーター（例えばｓｐｏ ＶＧプロモー
ター）でない場合にのみ有益である。
枯草１１抹Ｊ Ｈ３４６（５ＰｏＯＡ、 Ｐｒｏｔ”Ａ
ｍｙ＋、 Ｍｅｔ ） または類似のｇ３ＯＡ 突然
変異を持つ株から染色体ＤＮＡの飽和ｉｆ：ｇ！４＃！
シ、コンピテントＧＰ２００細胞（ｓｐｏ Ｉ Ｐｒ
ｏｔＡｍ）Ｆ−、Ｍ ｅ ｔ″″）を形質転換する０Ｍ
ｅｔ 形質転換体は最小培地プレート上の増殖によシ
選択される。得られる形質転換体は胞子形成欠損表現型
のための胞子形成培地（デイフコ）上の検定（なめラカ
ナコロニー形態トよび褐色のピグメンＨａ生）により
ｓｐｏ ＯＡ 対立遺伝子の共形質転換でスクリーニ
ングする。約９％のＭｅｔ 形質転換体がａｐｏ ＯＡ
対立遺伝子で共形質転換されているらしい：これら
の多くはでんぷん−アズールまたはカゼイン含有プレー
ト上で再スクリーニングして、受容体がドナーＤＮＡか
ら無傷のアミラー＋！またはプロテアーセ遺伝子で共形
質転換されていないことを確認する。検出可能なプロテ
アーゼ活性を示さない１つの形質転換体がＧＰ２０５（
ａｐｏｏ人。
ｍｙ＋、 Ｍｅｔ ） または類似のｇ３ＯＡ 突然
変異を持つ株から染色体ＤＮＡの飽和ｉｆ：ｇ！４＃！
シ、コンピテントＧＰ２００細胞（ｓｐｏ Ｉ Ｐｒ
ｏｔＡｍ）Ｆ−、Ｍ ｅ ｔ″″）を形質転換する０Ｍ
ｅｔ 形質転換体は最小培地プレート上の増殖によシ
選択される。得られる形質転換体は胞子形成欠損表現型
のための胞子形成培地（デイフコ）上の検定（なめラカ
ナコロニー形態トよび褐色のピグメンＨａ生）により
ｓｐｏ ＯＡ 対立遺伝子の共形質転換でスクリーニ
ングする。約９％のＭｅｔ 形質転換体がａｐｏ ＯＡ
対立遺伝子で共形質転換されているらしい：これら
の多くはでんぷん−アズールまたはカゼイン含有プレー
ト上で再スクリーニングして、受容体がドナーＤＮＡか
ら無傷のアミラー＋！またはプロテアーセ遺伝子で共形
質転換されていないことを確認する。検出可能なプロテ
アーゼ活性を示さない１つの形質転換体がＧＰ２０５（
ａｐｏｏ人。
ａｎｙ Ｂ ＊ ａｐｒＡ ｅ ｎｐｒ Ｅ ）と命名
された。 こＯ宿主によシ産生されるプロテアーゼレベ
ルは、カゼインが基質である場合、 ８ｐｏ＋宿主の細
胞外液で観察されるレベルの０．１４であった。
された。 こＯ宿主によシ産生されるプロテアーゼレベ
ルは、カゼインが基質である場合、 ８ｐｏ＋宿主の細
胞外液で観察されるレベルの０．１４であった。
同様の方法で、３重プロテアーゼ欠失突然変異体ＧＰ２
０８（ａｐｒＡ、ａｐｒＡ、１ａｐ−１Δ）Ｔｈよび４
重プロテアーセ欠失突然変異体ＧＰ２１６（ａｐｒΔａ
ｎｐｒΔ−ｔｓｐ−１Δ、 ａｐｒＡ、以下に記載され
る）内へ５ｐｏＯＡ突然変異が導入された。
０８（ａｐｒＡ、ａｐｒＡ、１ａｐ−１Δ）Ｔｈよび４
重プロテアーセ欠失突然変異体ＧＰ２１６（ａｐｒΔａ
ｎｐｒΔ−ｔｓｐ−１Δ、 ａｐｒＡ、以下に記載され
る）内へ５ｐｏＯＡ突然変異が導入された。
得られる８ｐｏ−株は各々ＧＰ２１０およびＧＰ２３５
である。これらの株は発現ベクターが胞子形成依存プロ
モーターに基づいていない場合に有益である。
である。これらの株は発現ベクターが胞子形成依存プロ
モーターに基づいていない場合に有益である。
新プロテアーゼ遺伝子の同定
残余プロテアーゼ活性の原因となる遺伝子の同定訃よび
クローニングは１ＭＡ胞がカゼイングレート上のかさの
出現で検出するには十分多量の酵素（群）を産生しない
ので、常法を用いては困難であろうと予測された。もし
、それが高コピーベクター上複製され、遺伝子（群）の
コピー数（およびそれ故のプロテアーゼ産生）が検出可
能なレベルまで増幅されるなら遺伝子（＃）の単離が可
能であろうと判断された。この戦略によシ、バシラス（
ＢａｃｉｌｌｕｓＪ遺伝子パンクからの新規プロテアー
ゼ遺伝子の単離が可能であった。これらの新規プロテア
ーゼ遺伝子の最初Ｏものはａｐｒ （細胞外プロテアー
ゼの略）命名された。この新規遺伝子の欠失突然変異体
はイン ビトロで誘導され。
クローニングは１ＭＡ胞がカゼイングレート上のかさの
出現で検出するには十分多量の酵素（群）を産生しない
ので、常法を用いては困難であろうと予測された。もし
、それが高コピーベクター上複製され、遺伝子（群）の
コピー数（およびそれ故のプロテアーゼ産生）が検出可
能なレベルまで増幅されるなら遺伝子（＃）の単離が可
能であろうと判断された。この戦略によシ、バシラス（
ＢａｃｉｌｌｕｓＪ遺伝子パンクからの新規プロテアー
ゼ遺伝子の単離が可能であった。これらの新規プロテア
ーゼ遺伝子の最初Ｏものはａｐｒ （細胞外プロテアー
ゼの略）命名された。この新規遺伝子の欠失突然変異体
はイン ビトロで誘導され。
前記遺伝子置換法によｐ Ａｐｒ−、Ｎｐｒ″″、Ｉａ
ｐバ残余プロテアーゼ活性の原因となる遺伝子を運ぶク
ローンを得るため、枯草ＩＩＧＰ２０８ＤＮＡのＳａｕ
６Ａ ライブラリーが調製された。染色体ＤＮＡ１
に単離し、５ａｕ３Ａｏ部分消化にかけ、アガロースゲ
ル上で大きさによる分画を行う、３−７ｋｂの大きさの
範囲の断片をゲルから溶出し、大腸菌力よびバシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の両方で複製可能なシャトルベクタ
ーｐＥａ ２２４（ｐＢＲ３２２のラージＢｃｏＲＩ−
Ｐｖｕ ｆｉ断片とｐＢＤ３４の２−ジＥｃｏ ＲＩ−
Ｐｖｕ ＩＩ フラグメントとの連結によシ誘導され
るＣＧｒｙｃｚａｎら、１９７Ｂ、ＰＮＡＳ７５：１４
２８））の角己■部位内へクローン化する。連結ＤＮＡ
で大腸菌ＪＭ１０７を形質転換し、カゼインを含む培地
に遺布する。１２００の大腸護コロニーのどれもカゼイ
ンプレート上でかさをｉ生しなかったが、精製プラスミ
ドＤＮＡの制限分析によるとクローンの約９０％が約４
ｋｂの平均の大きさの挿入物を含んでいた。クローンで
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主を形質転換し、以下
のごとくプロテアーゼ活性でスクリーニングした。大１
ｉｋ菌形質転換体は各々１００コロニーの１２の９（Ｇ
ｌ−０１２）に分はプールされた。
ｐバ残余プロテアーゼ活性の原因となる遺伝子を運ぶク
ローンを得るため、枯草ＩＩＧＰ２０８ＤＮＡのＳａｕ
６Ａ ライブラリーが調製された。染色体ＤＮＡ１
に単離し、５ａｕ３Ａｏ部分消化にかけ、アガロースゲ
ル上で大きさによる分画を行う、３−７ｋｂの大きさの
範囲の断片をゲルから溶出し、大腸菌力よびバシラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の両方で複製可能なシャトルベクタ
ーｐＥａ ２２４（ｐＢＲ３２２のラージＢｃｏＲＩ−
Ｐｖｕ ｆｉ断片とｐＢＤ３４の２−ジＥｃｏ ＲＩ−
Ｐｖｕ ＩＩ フラグメントとの連結によシ誘導され
るＣＧｒｙｃｚａｎら、１９７Ｂ、ＰＮＡＳ７５：１４
２８））の角己■部位内へクローン化する。連結ＤＮＡ
で大腸菌ＪＭ１０７を形質転換し、カゼインを含む培地
に遺布する。１２００の大腸護コロニーのどれもカゼイ
ンプレート上でかさをｉ生しなかったが、精製プラスミ
ドＤＮＡの制限分析によるとクローンの約９０％が約４
ｋｂの平均の大きさの挿入物を含んでいた。クローンで
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主を形質転換し、以下
のごとくプロテアーゼ活性でスクリーニングした。大１
ｉｋ菌形質転換体は各々１００コロニーの１２の９（Ｇ
ｌ−０１２）に分はプールされた。
プールされたコロニーを液体培地ＩＢ＋５０μｇ／−ア
ムピシリン）中で増殖させてプラスミドＤＮＡｔ単離し
、枯草ｍＧＰ ２０８ （ａｐｒＡ。
ムピシリン）中で増殖させてプラスミドＤＮＡｔ単離し
、枯草ｍＧＰ ２０８ （ａｐｒＡ。
ａｐｒＡ、１ｓｐ−１Δ）を形質転換し、カゼイングレ
ート上に塗布する。プールされたＧ１１からの形質転換
体Ｏ約５４の筐わシにかさが観察された。
ート上に塗布する。プールされたＧ１１からの形質転換
体Ｏ約５４の筐わシにかさが観察された。
陽性コロニーの各々から１ラスミドＤＮＡを単離し、制
限酵素消化によシ地図を作製した。形質転換体のすべて
が約４ｋｂの同一の挿入物（図５）ヲ含んでいた。これ
らの１ラスミドのうちの１つを選択しｐＮＰｌ と命
名した。
限酵素消化によシ地図を作製した。形質転換体のすべて
が約４ｋｂの同一の挿入物（図５）ヲ含んでいた。これ
らの１ラスミドのうちの１つを選択しｐＮＰｌ と命
名した。
養液中に残っている残余プロテアーゼ活性は宿主によシ
産生される総プロテアーセ活性のほんの少しのパーセン
トの活性によシ説明された。ａｐｒ遺伝子にようコード
されているプロテアーゼの型を特徴付けるため、枯草＠
ＧＰ２０８／ｐＮＰ１ によシ分泌されるプロテアー
ゼに対する異った阻害剤の効果を試した。
産生される総プロテアーセ活性のほんの少しのパーセン
トの活性によシ説明された。ａｐｒ遺伝子にようコード
されているプロテアーゼの型を特徴付けるため、枯草＠
ＧＰ２０８／ｐＮＰ１ によシ分泌されるプロテアー
ゼに対する異った阻害剤の効果を試した。
定常期にはいって２１１８間の培養培地を得、’４Ｃ−
カゼインを基質として用いて検定する。ＧＰ２０８に存
在するプロテアーゼ活性のレベルは前記標準的プロテア
−−１！／検定法で検出される程十分高くはないが、増
幅ａｐｒ遺伝子を運んでいるＧＰ２０８／ｐＮＰ１の培
養培地中では認知できるプロテアーセ活性が検出された
。ｅｐｒプロテアーゼ活性は１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび
１ｍＭ ＢＭＳＦの両方の存在下で阻止され、それは
陽イオンの存在を活性に必要とするセリン−プロテアー
ゼをコードしている（他のセリンプロテアーゼＩ ｓｐ
−１もまたＥＤＴＡおよびＢＭＳＦで阻害される）。
カゼインを基質として用いて検定する。ＧＰ２０８に存
在するプロテアーゼ活性のレベルは前記標準的プロテア
−−１！／検定法で検出される程十分高くはないが、増
幅ａｐｒ遺伝子を運んでいるＧＰ２０８／ｐＮＰ１の培
養培地中では認知できるプロテアーセ活性が検出された
。ｅｐｒプロテアーゼ活性は１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび
１ｍＭ ＢＭＳＦの両方の存在下で阻止され、それは
陽イオンの存在を活性に必要とするセリン−プロテアー
ゼをコードしている（他のセリンプロテアーゼＩ ｓｐ
−１もまたＥＤＴＡおよびＢＭＳＦで阻害される）。
ａｐｒ 遺伝子のサブクローニング
ｐＮＰ１挿入物から２．７ｋｂ壮■Ｉ−塾生Ｉ副断片が
単離され、ｐＢＤ３４の誘導体であるｐＢｓ８１／６Ｌ
合成リンカ−會用いＬ狙■ 部位１Ｈｉｎｄ １都立に
変えることによシ誘導される）内へクローン化された。
単離され、ｐＢＤ３４の誘導体であるｐＢｓ８１／６Ｌ
合成リンカ−會用いＬ狙■ 部位１Ｈｉｎｄ １都立に
変えることによシ誘導される）内へクローン化された。
このサブクローン化１ＩＩｉ片を運ぶ形質転換体はカゼ
インプレート上にかさを産生でき、全プロテアーゼ遺伝
子がこの唾片内に存在していることを示している０代表
的クローンはｐＮＰ３ と命名された。
インプレート上にかさを産生でき、全プロテアーゼ遺伝
子がこの唾片内に存在していることを示している０代表
的クローンはｐＮＰ３ と命名された。
ｔ ６ ｋｂ Ｅｃｏ ＴＬＶ 副断片をｐＢｓ８１／
６内へサブクローニングし、カゼインプレートにノ）ロ
ーを作るコロニー１に選択することによＦ）ｐＮＰ５挿
入物内の遺伝子の位置がさらに規定された。ハローを形
成し、且つ１．６ｋｂ 挿入物１−含む第５図のクロー
ンは、ｐＮＰ５ と名付けられｆｃ、この断片内のグ
ロテアーセ遺伝子の存在はさらにｐＮＰｌからの４ｋｂ
挿入物のこの部分を欠失させることによシ確認された。
６内へサブクローニングし、カゼインプレートにノ）ロ
ーを作るコロニー１に選択することによＦ）ｐＮＰ５挿
入物内の遺伝子の位置がさらに規定された。ハローを形
成し、且つ１．６ｋｂ 挿入物１−含む第５図のクロー
ンは、ｐＮＰ５ と名付けられｆｃ、この断片内のグ
ロテアーセ遺伝子の存在はさらにｐＮＰｌからの４ｋｂ
挿入物のこの部分を欠失させることによシ確認された。
ｐＮＰｌを且ｃｏ ＲＩＶで消化し。
１、６ ｋｂ Ｅｃｏ ＲＶ挿入物の取シ込みを起こさ
ずにベクターの再環化が起こるような条件下再結合する
。このＤＮＡでＧＰ２０８に形質転換し、コロニーをカ
ゼインプレート上でスクリー二／グした。
ずにベクターの再環化が起こるような条件下再結合する
。このＤＮＡでＧＰ２０８に形質転換し、コロニーをカ
ゼインプレート上でスクリー二／グした。
９５傷を超える形質転換体がかさを作らず、これらのク
ローンからプロテアーゼ遺伝子はすでに欠失しているこ
とを示している１代表的クローンが選択されｐＮＰ６と
名付けられた。（かさを産生ずるわずかなパーセントの
クローンは遺伝子の染色体コピーとプラスミド内の相同
配列の間の組換えによシ生じる天然ｅｐｒ遺伝子を運ぶ
ベクターを持っていると推定される。） ジｖ遺伝子のヌクレオチド訃よび推論されるアミノ酸配
列 サブクローニングによび欠失実験によシブロチアーゼ遺
伝子の大部分は１．６ｋｂ Ｅｃｏ ＲＶ断片（図５）
上に含まれていたことが確立された。
ローンからプロテアーゼ遺伝子はすでに欠失しているこ
とを示している１代表的クローンが選択されｐＮＰ６と
名付けられた。（かさを産生ずるわずかなパーセントの
クローンは遺伝子の染色体コピーとプラスミド内の相同
配列の間の組換えによシ生じる天然ｅｐｒ遺伝子を運ぶ
ベクターを持っていると推定される。） ジｖ遺伝子のヌクレオチド訃よび推論されるアミノ酸配
列 サブクローニングによび欠失実験によシブロチアーゼ遺
伝子の大部分は１．６ｋｂ Ｅｃｏ ＲＶ断片（図５）
上に含まれていたことが確立された。
１．６ｋｂＥｃｏＲＶ断片のヌクレオチド配列決定（図
６）は、左端から４５０ｂｐから始まシ右端まで進むほ
とんど完全な断片を釦おりオープンリーディングフレー
ムを明らかにした（図２参照）。
６）は、左端から４５０ｂｐから始まシ右端まで進むほ
とんど完全な断片を釦おりオープンリーディングフレー
ムを明らかにした（図２参照）。
推定されたアミノ酸配クリとＧＥＮＢＡＮＫの他のアミ
ノ酸配列との比軟はＯＲ，Ｆに工υコードされているタ
ンパク質がズプチリシンＬ ５ｔａｈｌら。
ノ酸配列との比軟はＯＲ，Ｆに工υコードされているタ
ンパク質がズプチリシンＬ ５ｔａｈｌら。
１９８４−ジャーナル オブ バクテリオロン−１５８
：４１１）釦よび枯草菌１６８からの工ＩＩＰ −Ｉ
ＣＫｏｉｄｅら、１９８６．ジャーナル オプ バクテ
リオロジー １６７：１１０）の両方と強い相同性（約
４０４）を持っていることを示している。こＯプロテア
ーゼ遺伝子の最も可能性のある開始コドンは図６の位置
１のＡＴＧである。
：４１１）釦よび枯草菌１６８からの工ＩＩＰ −Ｉ
ＣＫｏｉｄｅら、１９８６．ジャーナル オプ バクテ
リオロジー １６７：１１０）の両方と強い相同性（約
４０４）を持っていることを示している。こＯプロテア
ーゼ遺伝子の最も可能性のある開始コドンは図６の位置
１のＡＴＧである。
このＡＴＧ（ＯＲＰの第２のコドン）に先立って優れた
共通枯草菌リボンーム結合部位 （ＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡ ）が存在する。さらに。
共通枯草菌リボンーム結合部位 （ＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡ ）が存在する。さらに。
このメチオニンに続く最初の２６アミノｆＲは典型的枯
草菌シグナル配列に似ている；２つの陽性荷電アミノ酸
の短い配列、続いての１５疎水性アミノ酸、ヘリックス
−破壊プロリン、および典型的Ａｌ ａ Ｘ Ａｌ ａ
シグナルペプチダーゼ切断部飲ＣＰｅｒ１ｍａｎら、
１９８３．ジャーナルオプ ％Ｌ／キュラー バイオロ
ジー １６７１９１）。
草菌シグナル配列に似ている；２つの陽性荷電アミノ酸
の短い配列、続いての１５疎水性アミノ酸、ヘリックス
−破壊プロリン、および典型的Ａｌ ａ Ｘ Ａｌ ａ
シグナルペプチダーゼ切断部飲ＣＰｅｒ１ｍａｎら、
１９８３．ジャーナルオプ ％Ｌ／キュラー バイオロ
ジー １６７１９１）。
配列分析は１．６ｋｂ ＥｃｏＲＶ 断片はＥｐｒプロ
テアーセ活性を十分にコードしているけれども。
テアーセ活性を十分にコードしているけれども。
０凡Ｆは下流旦ｃｏＲＶ都立の末端を越して続いている
ことを示している。遺伝子の３′末端の地図作製のため
１重なっているＫｐｎｌからＳａｔ １断片のＤＮＡ配
列が決定された（図６）、図２に示したごと＜、ＯＲＦ
の末端はＥｃｏＲＶＩｌｌＩｌＩＩｌの７１７ｂｐ下流
であることが観察されておシ、また全ａｐｒ遺伝子Ｆｉ
３４５のアミノ酸タンパクａｔコードしている事が見い
出されておシ、その最初の３８０のアミノ酸はズプチリ
シンと相同である（図６ ）、 １．６ｋｂＥｃｏ Ｒ
Ｖ断片中ＫＩＩ−）’されているＮ−末端４０５のアミ
ノ酸でグロテアーセ活性には十分であるのでＣ−末端の
２４０のアζノ酸はタンパク質分解活性には明らかに必
須ではない。
ことを示している。遺伝子の３′末端の地図作製のため
１重なっているＫｐｎｌからＳａｔ １断片のＤＮＡ配
列が決定された（図６）、図２に示したごと＜、ＯＲＦ
の末端はＥｃｏＲＶＩｌｌＩｌＩＩｌの７１７ｂｐ下流
であることが観察されておシ、また全ａｐｒ遺伝子Ｆｉ
３４５のアミノ酸タンパクａｔコードしている事が見い
出されておシ、その最初の３８０のアミノ酸はズプチリ
シンと相同である（図６ ）、 １．６ｋｂＥｃｏ Ｒ
Ｖ断片中ＫＩＩ−）’されているＮ−末端４０５のアミ
ノ酸でグロテアーセ活性には十分であるのでＣ−末端の
２４０のアζノ酸はタンパク質分解活性には明らかに必
須ではない。
ジは タンパク質の構造
４ｙ ζＬ！での転写−翻訳実験がタンパク質の大き
さの確立に使用された。グラスミドｐＮＰ５Ｄ Ｎ Ａ
（全ｅ２ｚ 遺ｕｘ子を持’） ２．７ ｋｂ Ｏ匹
８１−旦０１断片ｆ：含む）を８３〇−結合転写／翻訳
系にュー イングランドヌクレア）に添加したところ約
７５，０００ダルトンのタンパク質が台底された。（更
に６α０００シよび３４，０００ダルトンのタンパク質
もまた観察されたが多分７５．０００ ダルトンのタ
ンパク質の部分切ＩＩｒまたは分解ａｔ表わしているの
であろう、）この大きさは推定されたアミノ酸配列に基
づいた第１次産物の予想分子量６９．７０２ダルトンと
非常によく一致している。
さの確立に使用された。グラスミドｐＮＰ５Ｄ Ｎ Ａ
（全ｅ２ｚ 遺ｕｘ子を持’） ２．７ ｋｂ Ｏ匹
８１−旦０１断片ｆ：含む）を８３〇−結合転写／翻訳
系にュー イングランドヌクレア）に添加したところ約
７５，０００ダルトンのタンパク質が台底された。（更
に６α０００シよび３４，０００ダルトンのタンパク質
もまた観察されたが多分７５．０００ ダルトンのタ
ンパク質の部分切ＩＩｒまたは分解ａｔ表わしているの
であろう、）この大きさは推定されたアミノ酸配列に基
づいた第１次産物の予想分子量６９．７０２ダルトンと
非常によく一致している。
９υプロテアーゼのアミノ−末端の半分とズプチリシン
の間の相同性ｕ Ｂ ｐ ｒ ％またズプチリシンのプ
ロ配列と同じ大きさの（７０−８０アミノ酸）プロ配列
でプレプロ酵素として産生されるであろう事を示唆して
いる。もし本当なら、訟よびもし更なる部分切断がなけ
れば成熟Ｂｐｒ＠素は約５８．０００の分子量を持つと
議論されるであろう。
の間の相同性ｕ Ｂ ｐ ｒ ％またズプチリシンのプ
ロ配列と同じ大きさの（７０−８０アミノ酸）プロ配列
でプレプロ酵素として産生されるであろう事を示唆して
いる。もし本当なら、訟よびもし更なる部分切断がなけ
れば成熟Ｂｐｒ＠素は約５８．０００の分子量を持つと
議論されるであろう。
しかしながら培養上澄の試験では本タンパク質は約３４
，０００（Ｚ、１分子量を持つ事を示している。
，０００（Ｚ、１分子量を持つ事を示している。
ａｐｒ遺伝子（ＰＮＰ３またはｐＮＰ５）１ｉ−持つプ
ラスミドまたはただ親グラスミド単独ＬｐＢｓ ８１／
６）を含む枯草ｉ！ｉ抹ＧＰ２０３によシ分泌されるタ
ンパク質の５Ｄｓ−ｐＡｏｎによる比較ではｐＮＰ３
にクローン化されたＺ７ｋｂ虫ｚＢｌ−８ａｌ ｌ
断片は約３４，０００＆よび３８，０００ダルトンのタ
ンパク質Ｑ産生七指示し、一方、ｐｐＮＰｓ中に同じ方
向性で（図１）クローン化した１、６ｋｂ ＥｃｏＲＶ
断片はただ３４，０００ダルトンタンパクＩＸＯ産生の
みを指示した。この２つのタンパク質は部分切断または
タンパク質加水分解性分解によシ生じ九Ｅ Ｐ ｒ
タンパク質の異った型であろう。明らかに、・ｐｒ遺伝
子の６′の１／３を欠（１，６ｋｂ ＩＬｉＲＶ 断片
は全遺伝子が存在する場合に観察されるものと同じよう
な大きさの活性プロテアーゼの産生を指示できる。この
事は１０テア一ゼＦｉ通常Ｃ−末ｌｓの部分切断を受け
ることを示唆している。
ラスミドまたはただ親グラスミド単独ＬｐＢｓ ８１／
６）を含む枯草ｉ！ｉ抹ＧＰ２０３によシ分泌されるタ
ンパク質の５Ｄｓ−ｐＡｏｎによる比較ではｐＮＰ３
にクローン化されたＺ７ｋｂ虫ｚＢｌ−８ａｌ ｌ
断片は約３４，０００＆よび３８，０００ダルトンのタ
ンパク質Ｑ産生七指示し、一方、ｐｐＮＰｓ中に同じ方
向性で（図１）クローン化した１、６ｋｂ ＥｃｏＲＶ
断片はただ３４，０００ダルトンタンパクＩＸＯ産生の
みを指示した。この２つのタンパク質は部分切断または
タンパク質加水分解性分解によシ生じ九Ｅ Ｐ ｒ
タンパク質の異った型であろう。明らかに、・ｐｒ遺伝
子の６′の１／３を欠（１，６ｋｂ ＩＬｉＲＶ 断片
は全遺伝子が存在する場合に観察されるものと同じよう
な大きさの活性プロテアーゼの産生を指示できる。この
事は１０テア一ゼＦｉ通常Ｃ−末ｌｓの部分切断を受け
ることを示唆している。
プラスミドｐＮＰ３上にＩＩｉ遺伝子を含むとヱ；Ｆ２
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）抹ＧＰ２０８はＨｐｒ プロテア
ーゼの遇慮生に使用で＊、それは続いて常法によシ精製
できる。
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）抹ＧＰ２０８はＨｐｒ プロテア
ーゼの遇慮生に使用で＊、それは続いて常法によシ精製
できる。
枯草函染色体上の３１の地図作製のため、染色体のａｐ
ｒ遺伝子部位に薬剤耐性マーカーが導入され、挿入の泣
置決足のためフ１−ジＰＢ８１−開始形質導入が使用さ
れた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ｃｕｔ）遺伝子を含む１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ＃片
を５■遺伝子を含む大腸菌グラスミド上の独特のＥｃｏ
凡工＠位（ｐＮＰ２は図７に示しである）内にクローン
化する。得らｔＬｂｆう；ｘ、ミ）’（ｐＮＰ７）ｆ枯
草１ＧＰ２０８の形質転換に使用し、クロラムフェニコ
ール耐性形質転換体を選択する。このプラスミドは枯草
菌中では自律的に複裏できないので、Ｃｍｒ形質転換体
は１ラスミド上のクローン比」は遺伝子および遺伝子の
染色体コピー間の１回の相互組換えによって生じたこと
が予想される。地図作製実験は挿入されたｃａｔ遺伝子
および」」遺伝子は５ａｃＡ３２１に強く結合されて釦
シ（７７％７優共形質尋入ｐｕｒ Ａ’１６には弱く結
合されてにシ（５優共形質尋入）、またｈｉｓ Ａ１に
は結合されていない。これらの発見は、他の低動の１０
テアーセ遺伝子が含まれていない遺伝地図の領域のｓａ
ｃ Ａ の近くにａｐｒ遺伝子が位置している事ヲ示
唆している。
ｒ遺伝子部位に薬剤耐性マーカーが導入され、挿入の泣
置決足のためフ１−ジＰＢ８１−開始形質導入が使用さ
れた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ｃｕｔ）遺伝子を含む１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ＃片
を５■遺伝子を含む大腸菌グラスミド上の独特のＥｃｏ
凡工＠位（ｐＮＰ２は図７に示しである）内にクローン
化する。得らｔＬｂｆう；ｘ、ミ）’（ｐＮＰ７）ｆ枯
草１ＧＰ２０８の形質転換に使用し、クロラムフェニコ
ール耐性形質転換体を選択する。このプラスミドは枯草
菌中では自律的に複裏できないので、Ｃｍｒ形質転換体
は１ラスミド上のクローン比」は遺伝子および遺伝子の
染色体コピー間の１回の相互組換えによって生じたこと
が予想される。地図作製実験は挿入されたｃａｔ遺伝子
および」」遺伝子は５ａｃＡ３２１に強く結合されて釦
シ（７７％７優共形質尋入ｐｕｒ Ａ’１６には弱く結
合されてにシ（５優共形質尋入）、またｈｉｓ Ａ１に
は結合されていない。これらの発見は、他の低動の１０
テアーセ遺伝子が含まれていない遺伝地図の領域のｓａ
ｃ Ａ の近くにａｐｒ遺伝子が位置している事ヲ示
唆している。
プロテアーゼ活性を欠く突然変異体バシラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ） ｋ作製するには５′末端が欠失したクロー
ン化遺伝子を構築し、染色体中の野生型遺伝子との直き
換えに使用する。最初にｐＮＰ２ ’ｉＢａｍＨＩで消
比しく！と遺伝子内の非反復部位を切断する）、それか
ら直線状プラスくドＤＮＡ′をＢａ１３１エキンヌクレ
アーゼで３２℃にて５分間処理し、再結合して大腸菌Ｊ
Ｍ１０７を形質転換する、２０の形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを単離し、ＥａｏＲＩｊ）よびＨｌ ｎｄ口
で消化してａｐｒ遺伝子挿入物を除去し、ゲル電気泳動
によシ分析する。
ｌｌｕｓ） ｋ作製するには５′末端が欠失したクロー
ン化遺伝子を構築し、染色体中の野生型遺伝子との直き
換えに使用する。最初にｐＮＰ２ ’ｉＢａｍＨＩで消
比しく！と遺伝子内の非反復部位を切断する）、それか
ら直線状プラスくドＤＮＡ′をＢａ１３１エキンヌクレ
アーゼで３２℃にて５分間処理し、再結合して大腸菌Ｊ
Ｍ１０７を形質転換する、２０の形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを単離し、ＥａｏＲＩｊ）よびＨｌ ｎｄ口
で消化してａｐｒ遺伝子挿入物を除去し、ゲル電気泳動
によシ分析する。
プラスミドの１つは２．７ｋｂ断片が２．３ｋｂ Ｅｅ
ｏＲＩ−Ｈ１ｎｄｊ断片で置き換わってカシ、・ｐｒ遺
伝子配列から４００塩基対が失われていた事を示してい
る。このプラスミドはｐＮＰ８ と称される（図７）。
ｏＲＩ−Ｈ１ｎｄｊ断片で置き換わってカシ、・ｐｒ遺
伝子配列から４００塩基対が失われていた事を示してい
る。このプラスミドはｐＮＰ８ と称される（図７）。
この欠失突然変異体が前記の遺伝子置換法によシ枯草１
１１０Ｆ２０Ｂ内へ導入された。ｐＥｃｃ ｌからのＨ
ｃｏＲ１断片を含むｃａｔ遺伝子がｐＮＰ８のＥｅｏＲ
Ｉ部位に導入されｐＮＰ９が作製された（図７）、この
大腸菌プラスミドを枯草ＩＧＰ２０８の形質転換に使用
し、Ｃｍｒコロニーを選択する。この形質転換体の大部
分は非常に小さいかさを産生し、残シの３０鳴はカゼイ
ンプレート上かさを産生しなかった。かさすなわちプロ
テアーゼ活性がないことは染色体ＤＮＡＴｈよびプラス
ミドＤＮＡのコンカテマーからの相同配列間の２重の交
差によう生じる：これらの株は大腸菌レグリコンおよび
欠失・ｐｒ遺伝子の２つのコピーが側面に接したｃａｔ
遺伝子を含んでいる。重複を解くため・ｐｒ遺伝子の２
つのコピー間の組み換えを受けた（しかし、それはシ４
遺伝子および大腸菌レプリコンが捨てられている）味ラ
スフリーユングし、単一のコロニーが選択され、＊剤選
択なしでリッチ培地中で一夜増殖させる。この培養から
生じた個々のコロニーを薬剤耐性でスクリーニングする
とこれらの約０．１１がＣ−ｓであることが観察された
。４つのプロテアーゼ遺伝子（生。
１１０Ｆ２０Ｂ内へ導入された。ｐＥｃｃ ｌからのＨ
ｃｏＲ１断片を含むｃａｔ遺伝子がｐＮＰ８のＥｅｏＲ
Ｉ部位に導入されｐＮＰ９が作製された（図７）、この
大腸菌プラスミドを枯草ＩＧＰ２０８の形質転換に使用
し、Ｃｍｒコロニーを選択する。この形質転換体の大部
分は非常に小さいかさを産生し、残シの３０鳴はカゼイ
ンプレート上かさを産生しなかった。かさすなわちプロ
テアーゼ活性がないことは染色体ＤＮＡＴｈよびプラス
ミドＤＮＡのコンカテマーからの相同配列間の２重の交
差によう生じる：これらの株は大腸菌レグリコンおよび
欠失・ｐｒ遺伝子の２つのコピーが側面に接したｃａｔ
遺伝子を含んでいる。重複を解くため・ｐｒ遺伝子の２
つのコピー間の組み換えを受けた（しかし、それはシ４
遺伝子および大腸菌レプリコンが捨てられている）味ラ
スフリーユングし、単一のコロニーが選択され、＊剤選
択なしでリッチ培地中で一夜増殖させる。この培養から
生じた個々のコロニーを薬剤耐性でスクリーニングする
とこれらの約０．１１がＣ−ｓであることが観察された
。４つのプロテアーゼ遺伝子（生。
ｎｐｒ ＊ ｉｓｐ −１および・ｐｒ）内に欠失を含
むそのような味の１つ、ＧＰ２１６が更なる研究のため
選択された。
むそのような味の１つ、ＧＰ２１６が更なる研究のため
選択された。
染色体・ｐｒ遺伝子の欠失はサザンハイプリダイゼーシ
ｌンによう確認された。Ｑ ｍ ｒ親株同様ＧＰ２１６
はカゼインプレート上にかさを産生することができない
、しかしながら液体培養にかける１４（１−カゼインプ
ロテアーセ検定はａｐｒ突然変異単独では残余プロテア
ーゼ活性を完全に除去しない事を示している。・ｐｒ
ａ ａｐｒ ＊ ｎｐｒ ｈよび力哩が欠失している
株はΣ法、担υおよびｌａｐのみに突然変１４を持つ抹
よシも有意に少ないグクテアーゼの産生とはならなかり
た。最後に、４重プロテアーゼ欠失味の増殖および胞子
形成が標準実験室培地を用いて検定された。野生型と比
較した場合、ＬＢ培地中での増殖は何の差異も観察され
なかった。同機に３０時間Ｄ８Ｍ培地上で増殖させた後
の胞子形成ａ度にかいても何ら評価する程の差異は見ら
れなかった（ＧＰ２０８ｔｉｒよびＧＰ２１６に対して
１×１０ 胞子／１１ｊ）。
ｌンによう確認された。Ｑ ｍ ｒ親株同様ＧＰ２１６
はカゼインプレート上にかさを産生することができない
、しかしながら液体培養にかける１４（１−カゼインプ
ロテアーセ検定はａｐｒ突然変異単独では残余プロテア
ーゼ活性を完全に除去しない事を示している。・ｐｒ
ａ ａｐｒ ＊ ｎｐｒ ｈよび力哩が欠失している
株はΣ法、担υおよびｌａｐのみに突然変１４を持つ抹
よシも有意に少ないグクテアーゼの産生とはならなかり
た。最後に、４重プロテアーゼ欠失味の増殖および胞子
形成が標準実験室培地を用いて検定された。野生型と比
較した場合、ＬＢ培地中での増殖は何の差異も観察され
なかった。同機に３０時間Ｄ８Ｍ培地上で増殖させた後
の胞子形成ａ度にかいても何ら評価する程の差異は見ら
れなかった（ＧＰ２０８ｔｉｒよびＧＰ２１６に対して
１×１０ 胞子／１１ｊ）。
新しいタンパク分解活性の同定
枯草直の床の４つの非必須プロテアーゼ遺伝子ａｐｒ
ｎｐｒ 暉嗅−１および」「が欠失させられている。
ｎｐｒ 暉嗅−１および」「が欠失させられている。
これらの欠失は野生株に比較して約９６優８ｐｏ＋宿主
の培養上澄液中の総細胞外グロテアーセを減少させてい
るが、バシラス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）中でのプロテアー
ゼー不安定化生底物の産生には残っている４鳴の残余プ
ロテアーゼ活性を減少または除去することが望ましい。
の培養上澄液中の総細胞外グロテアーセを減少させてい
るが、バシラス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）中でのプロテアー
ゼー不安定化生底物の産生には残っている４鳴の残余プ
ロテアーゼ活性を減少または除去することが望ましい。
アゾコール検定を使用し、多プロテアーセ欠失枯草＠株
（ａｐｒΔ・ジ「Δ・ジ１６・幻Ｂｐ−１１ｈ）で１九
制御タンパク質をコードしているｓａｃ Ｑ”遺伝子も
含んでいるＧＰ２２７中のこの残余活性を説明する２つ
の新規グロテアーセが同定された。
（ａｐｒΔ・ジ「Δ・ジ１６・幻Ｂｐ−１１ｈ）で１九
制御タンパク質をコードしているｓａｃ Ｑ”遺伝子も
含んでいるＧＰ２２７中のこの残余活性を説明する２つ
の新規グロテアーセが同定された。
ｓａｃ Ｑ 遺伝子産物は残余プロテアーゼ活性を含む
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中の分解性＃素の産生を
促進するように機能し、それは同−譲シ受は人に対して
ｌＩＩ渡された同時係属中の出願Ｕ、 Ｓ、 ８．Ｎ９
２１．３４３ 号の主題であシ、引釣としてここに含
まれている。ｓａｃ Ｑ による促進のため、ＧＰ２
２７株は５ａｃＱ を欠＜ＧＰ２１６よシも本質的に
多いプロテアーゼ活性を童み出す。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中の分解性＃素の産生を
促進するように機能し、それは同−譲シ受は人に対して
ｌＩＩ渡された同時係属中の出願Ｕ、 Ｓ、 ８．Ｎ９
２１．３４３ 号の主題であシ、引釣としてここに含
まれている。ｓａｃ Ｑ による促進のため、ＧＰ２
２７株は５ａｃＱ を欠＜ＧＰ２１６よシも本質的に
多いプロテアーゼ活性を童み出す。
一般には、枯草１ｉＧＰ２２７の培餐液からの上澄液は
濃宿され、ゲル濾過カラムを通して分画されグロテアー
セ活性が検定される。２つの別々の活性のピークがカラ
ムから溶出され、よシ大きなおよびよシ小さな分子量種
に対し各々ＲＰ−ＩＴｈよびＲＰ−１１Ｌ残余プロテア
ーゼの略）と呼ぶ。
濃宿され、ゲル濾過カラムを通して分画されグロテアー
セ活性が検定される。２つの別々の活性のピークがカラ
ムから溶出され、よシ大きなおよびよシ小さな分子量種
に対し各々ＲＰ−ＩＴｈよびＲＰ−１１Ｌ残余プロテア
ーゼの略）と呼ぶ。
続いてのこれら２つのピークの分析によシ、各々は異っ
た酵素活性で説明されることが確認された。
た酵素活性で説明されることが確認された。
ＲＰＩｋよびＲＰ−１タンパク質の単＠釦よび特徴付け
、およびＲＰ−１シよびＲＰ−１遺伝子各々の欠失突然
変異体の作製を以下に記載する。
、およびＲＰ−１シよびＲＰ−１遺伝子各々の欠失突然
変異体の作製を以下に記載する。
ＢＰ−１の単１１！および特徴付は
簡単で効率の良い精製スキームが廃培賽液からのＲＰ−
１の単離の為に開発された。培養ＨをＭＲ８ラクトバシ
ラス培地（デイフコ、マルトースをグルコースに置換し
て）中で増殖させ。
１の単離の為に開発された。培養ＨをＭＲ８ラクトバシ
ラス培地（デイフコ、マルトースをグルコースに置換し
て）中で増殖させ。
５ＩＹ１０ らせん状カートリッジを付けたアミコン
ＣＨ２ＰＲ，系を用いて約１０倍に濃縮する。濃縮上澄
み液を５０ｍＭ ＭＢＳ 、 ０．４Ｍ ＮａＣ１、ｐ
Ｈ６，８に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化した８Ｗ
３０００ ＨＰＬＣゲル濾過カラムで分画する。
ＣＨ２ＰＲ，系を用いて約１０倍に濃縮する。濃縮上澄
み液を５０ｍＭ ＭＢＳ 、 ０．４Ｍ ＮａＣ１、ｐ
Ｈ６，８に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化した８Ｗ
３０００ ＨＰＬＣゲル濾過カラムで分画する。
グロテアーセ活性を含む分画は前記の１ゾコール検定を
改良して使用し同定する。
改良して使用し同定する。
グロテアーセ活性が陽性の分画（よシ大きな分子量の種
に対応する）をプールし、ＹＭ５メンプランを付けた攪
拌セル食用いて濃縮し、５０ｍＭＭＥ８．１００ｍＭＫ
Ｃｌ、ｐＨ６，７に対して透析し、同一の緩衝液で平衡
化したベンズアミジン−セフ１０一ス液体アフイニテイ
カラムに加える。
に対応する）をプールし、ＹＭ５メンプランを付けた攪
拌セル食用いて濃縮し、５０ｍＭＭＥ８．１００ｍＭＫ
Ｃｌ、ｐＨ６，７に対して透析し、同一の緩衝液で平衡
化したベンズアミジン−セフ１０一ス液体アフイニテイ
カラムに加える。
カラムに加えられたほとんどのタンパク質（９７％）は
樹脂に結合しないが、ＲＰ−１タンパク質は定量的に結
合し、２５０ｍＭＫＣｌでカラムから溶出される。
樹脂に結合しないが、ＲＰ−１タンパク質は定量的に結
合し、２５０ｍＭＫＣｌでカラムから溶出される。
べ７Ｘ７ミジン精製ＲＰ−１０８ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に
よシタンパク質は？！Ｍｉ超える均質性を持ち、約４７
．０００ダルトンの分子量を持っていた事が明らかにさ
れた。上に概説した方法による精製によシ比活性が１４
０ＩＩ！Ｉ増加し、全回収率は約１０４であった。
よシタンパク質は？！Ｍｉ超える均質性を持ち、約４７
．０００ダルトンの分子量を持っていた事が明らかにさ
れた。上に概説した方法による精製によシ比活性が１４
０ＩＩ！Ｉ増加し、全回収率は約１０４であった。
等電点電気泳動ゲルによ＃）ＲＰ−１は４．４から４．
７の間のｐＩｔ持ち、高酸性／塩基性残基組成であるこ
とを示している。酵素はａＯの食過ｐＨを持ち、アゾコ
ールが基質として用いられた場合最高温度は３０℃であ
った。ＰＭＳＦで完全に阻害され、それがセリンプロテ
アーセである事を示唆しているが、ＥＤＴＡでは５０ｍ
Ｍのような高濃度でも阻害されない。
７の間のｐＩｔ持ち、高酸性／塩基性残基組成であるこ
とを示している。酵素はａＯの食過ｐＨを持ち、アゾコ
ールが基質として用いられた場合最高温度は３０℃であ
った。ＰＭＳＦで完全に阻害され、それがセリンプロテ
アーセである事を示唆しているが、ＥＤＴＡでは５０ｍ
Ｍのような高濃度でも阻害されない。
ＢＰ−１はＮ−区一ペンゾリルーＬ−アルギ巳ン エチ
ル エステル、フェニルアラニン メチルエステル、チ
ロシン エチルエステルおよびフェニルアラニン エチ
ルエステルのごトキエステル基質同様変性コラーゲンお
よびカセインのごときタンパク質基質ｔｏ＝ｃ−ｏ一対
０−Ｃ−Ｎ−結合）の加水分解を触媒するが１合成基質
Ｎ−φ−ベンゾイルーＬ−アルギニン−４−ニトロアニ
リド中のアルギニンペグチド結合の加水分解は触媒しな
い、ひとまとめにして、これらのデータはＲＰ−■がセ
リン エンドプロテイナーゼであシ、エステラーゼ活性
を持ち、セリン プロテアーセのズプチリシン スーパ
ーファミリーに萬していることを示している。さらに、
これらの特徴はＲＰ−ｌは普通バシロペ１テダーゼＦと
呼ばれている（Ｂｇｙｓｒら、１９６Ｂ、アルキーブオ
ブパイオケミストリーアンドバイオフイジックス、１２
８：４４２およびＲｏｉｔｓａｈ ら＠ １９８３．
ジャーナル オブ バクテリオロジー １５５．１４５
）＃累かもしれない事を示している。パシロペプチダー
セＦは糖タンパク質であることが報告されているが、Ｂ
Ｐ−１に炭水化物が伴われているのは観察されなかった
。
ル エステル、フェニルアラニン メチルエステル、チ
ロシン エチルエステルおよびフェニルアラニン エチ
ルエステルのごトキエステル基質同様変性コラーゲンお
よびカセインのごときタンパク質基質ｔｏ＝ｃ−ｏ一対
０−Ｃ−Ｎ−結合）の加水分解を触媒するが１合成基質
Ｎ−φ−ベンゾイルーＬ−アルギニン−４−ニトロアニ
リド中のアルギニンペグチド結合の加水分解は触媒しな
い、ひとまとめにして、これらのデータはＲＰ−■がセ
リン エンドプロテイナーゼであシ、エステラーゼ活性
を持ち、セリン プロテアーセのズプチリシン スーパ
ーファミリーに萬していることを示している。さらに、
これらの特徴はＲＰ−ｌは普通バシロペ１テダーゼＦと
呼ばれている（Ｂｇｙｓｒら、１９６Ｂ、アルキーブオ
ブパイオケミストリーアンドバイオフイジックス、１２
８：４４２およびＲｏｉｔｓａｈ ら＠ １９８３．
ジャーナル オブ バクテリオロジー １５５．１４５
）＃累かもしれない事を示している。パシロペプチダー
セＦは糖タンパク質であることが報告されているが、Ｂ
Ｐ−１に炭水化物が伴われているのは観察されなかった
。
ＢＰ−１のための遺伝子のクローニングＩ’ＬＰ−１の
アミノ末端の２８のアミノ酸の配列が連続エドマン分解
によシ自動気相配列決定装置上で決定され、これは図８
に示しである。ＤＮＡグローブ配列（８１ヌクレオチド
）は枯草菌にかいてこれらのアミノ酸のための最も頻繁
な使用コドンに基づいて合成された（図８）、ＲＰ−１
ＯＮ−末端アミノ酸配列は２つのトリプトファン残基を
ｆｉんでいる（位＠、７および１８）、）ｌＪ７）ファ
ンにはコドン軸重がないので、この事はＲＰ−Ｉをコー
ドしている遺伝子のための高度に％異的なグローブの徊
築を容易にする。
アミノ末端の２８のアミノ酸の配列が連続エドマン分解
によシ自動気相配列決定装置上で決定され、これは図８
に示しである。ＤＮＡグローブ配列（８１ヌクレオチド
）は枯草菌にかいてこれらのアミノ酸のための最も頻繁
な使用コドンに基づいて合成された（図８）、ＲＰ−１
ＯＮ−末端アミノ酸配列は２つのトリプトファン残基を
ｆｉんでいる（位＠、７および１８）、）ｌＪ７）ファ
ンにはコドン軸重がないので、この事はＲＰ−Ｉをコー
ドしている遺伝子のための高度に％異的なグローブの徊
築を容易にする。
高分子量ＤＮＡは枯草菌株ＧＰ２１６から単離され、い
く種類かの制限酵素で各々消化され、断片は化８％アガ
ロース ゲルを通した電気泳動を通して分離する。ゲル
はサザンの方法（前記文献）によジニトロセルロースフ
ィルター上ヘプロットされ、半一ストリンジェントな条
件下（５Ｘ３８Ｃ。
く種類かの制限酵素で各々消化され、断片は化８％アガ
ロース ゲルを通した電気泳動を通して分離する。ゲル
はサザンの方法（前記文献）によジニトロセルロースフ
ィルター上ヘプロットされ、半一ストリンジェントな条
件下（５Ｘ３８Ｃ。
２０４ホルムアミド、ＩＸデンハーツ、３７℃にて）３
８Ｐ末端−１８ｍ合成ＲＰ−１特異的グローブと一部ハ
イブリダイズさせる。ハイプリダイゼーＶｖｓｙｌｃａ
１． ブｏｙ）ｔ２Ｘ８８ｃ、ＣＬ１４ＢＤＢ中室温に
て、１時間洗浄する。
８Ｐ末端−１８ｍ合成ＲＰ−１特異的グローブと一部ハ
イブリダイズさせる。ハイプリダイゼーＶｖｓｙｌｃａ
１． ブｏｙ）ｔ２Ｘ８８ｃ、ＣＬ１４ＢＤＢ中室温に
て、１時間洗浄する。
ＢＰ−１特異的プローブは制限消化物の各々のただ１つ
のバンドのみにハイブリダイズし、グローブがＲＰ−１
遺伝子に対し特異的であることを示している。Ｐｓｔｌ
消化物にかいてはグローブは６．５ ｋｂ フラグメン
トにハイブリダイズし、それはクローニングのためには
都合のよい大きさであシ、またＲＰ−１遺伝子のほとん
どまたはすべて會含むのに十分な大きさである。
のバンドのみにハイブリダイズし、グローブがＲＰ−１
遺伝子に対し特異的であることを示している。Ｐｓｔｌ
消化物にかいてはグローブは６．５ ｋｂ フラグメン
トにハイブリダイズし、それはクローニングのためには
都合のよい大きさであシ、またＲＰ−１遺伝子のほとん
どまたはすべて會含むのに十分な大きさである。
以下のごとくして枯草１！ｌ！ＤＮＡから６−７ｋｂの
大きさの範囲のＰｓｔｌ挿入物を含むクローンバンクが
調製された。抹ＧＰ２１６の染色体ＤＮＡをＰｓｔｌ
で消化し、ａ、８鳴アガロースゲル上で分離する。６
−７ｋｂ ０ＤＮＡ断片をゲルから電気的溶出によシ精
製し、リガーゼ処理によるベクターの再環化を防ぐため
子クシ腸ホスフ１ターゼで前もって処理しであるＰａｔ
ｌ消化ｐＢＲ３２２と連結する。連結ＤＮＡでコンピ
テント大腸菌ＤＨ５ｍ胞を形質転換し、テトラサイクリ
ン含有培地上に虚布する。約５Ｘ１０’のＴ・ｔｒ形質
転換体をＬ ソｏ８０ ｑｂハロ −７ｋｂ ｔｖｍ囲
の大きさの挿入物を持つグラスミドを含んでいた。
大きさの範囲のＰｓｔｌ挿入物を含むクローンバンクが
調製された。抹ＧＰ２１６の染色体ＤＮＡをＰｓｔｌ
で消化し、ａ、８鳴アガロースゲル上で分離する。６
−７ｋｂ ０ＤＮＡ断片をゲルから電気的溶出によシ精
製し、リガーゼ処理によるベクターの再環化を防ぐため
子クシ腸ホスフ１ターゼで前もって処理しであるＰａｔ
ｌ消化ｐＢＲ３２２と連結する。連結ＤＮＡでコンピ
テント大腸菌ＤＨ５ｍ胞を形質転換し、テトラサイクリ
ン含有培地上に虚布する。約５Ｘ１０’のＴ・ｔｒ形質
転換体をＬ ソｏ８０ ｑｂハロ −７ｋｂ ｔｖｍ囲
の大きさの挿入物を持つグラスミドを含んでいた。
−組の５５０形質転換体＝１ｐ−槻識ＲＰ−７特異性プ
ローブでのコロニーハイプリダイゼーシ璽ンによ、９Ｒ
Ｐ−１挿入物の存在をスクリーニングしたところ、これ
らの形質転換体の７つがプローブと強くハイブリダイズ
することが観察された。
ローブでのコロニーハイプリダイゼーシ璽ンによ、９Ｒ
Ｐ−１挿入物の存在をスクリーニングしたところ、これ
らの形質転換体の７つがプローブと強くハイブリダイズ
することが観察された。
６つの陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、Ｐ
ｓｔｌおよびＨｌｎｄ ｊによる制限消化パターンが分
析された。６つすべてのクローンが同一の制限パターン
を持ってシシ、それらの１つからのプラスミドはｐｃＲ
８３と名付けられた。
ｓｔｌおよびＨｌｎｄ ｊによる制限消化パターンが分
析された。６つすべてのクローンが同一の制限パターン
を持ってシシ、それらの１つからのプラスミドはｐｃＲ
８３と名付けられた。
種々の制限酵素を用い１図９に示されたｐＣＲ８５挿入
物の制限地図が作製された。成熟ＲＰ−■プロテアーゼ
ＯＮ−末端の２８の７ミノ！！をコードしているＲＰ−
ｊオリゴマー グローブがサザンの方法（上記文献）に
よシルＣＲ８３の制限消化物とハイブリダイズされた。
物の制限地図が作製された。成熟ＲＰ−■プロテアーゼ
ＯＮ−末端の２８の７ミノ！！をコードしているＲＰ−
ｊオリゴマー グローブがサザンの方法（上記文献）に
よシルＣＲ８３の制限消化物とハイブリダイズされた。
プローブが［Ｌ６５ｋｂ ０Ｃ１ａ Ｉ −Ｂｅｅ Ｒ
Ｖ断片とハイブリダイズすることが１！察され、この断
片は遺伝子の５′末端を含んでいることが示唆された。
Ｖ断片とハイブリダイズすることが１！察され、この断
片は遺伝子の５′末端を含んでいることが示唆された。
ＢＰ−１遺伝子の方向性を決定するため、Ｃ１ａｌ−Ｅ
ｅｏ ＲＶ断片の鎖を別々に単鎖ファージＭ１３内へク
ローン化した０Ｍ１３クローンがＲＰ−１オリゴマーで
調べられ、その結果はＲＰ−１遺伝子が図９の地図に従
うと左側から右側の方向に配向していることが示された
。
ｅｏ ＲＶ断片の鎖を別々に単鎖ファージＭ１３内へク
ローン化した０Ｍ１３クローンがＲＰ−１オリゴマーで
調べられ、その結果はＲＰ−１遺伝子が図９の地図に従
うと左側から右側の方向に配向していることが示された
。
図９に示したごと（Ｐｍｔｌ挿入物の一部のＤＮＡ配列
が決定され、８１の塩基対配列（図１０で下Ｈを引いた
）がタンパク質の最初の２８のアミノ酸をコードしてい
る配列と正確に対応していることが観察された。図１０
で示したＢｑｌｌおよびＣｌａｌ部位は図９で示したそ
れらと同一であシ。
が決定され、８１の塩基対配列（図１０で下Ｈを引いた
）がタンパク質の最初の２８のアミノ酸をコードしてい
る配列と正確に対応していることが観察された。図１０
で示したＢｑｌｌおよびＣｌａｌ部位は図９で示したそ
れらと同一であシ。
さらに＊ ＢａｏＲＶｌ１１位は図９に示された制限＃
素地図中に示されたものと同一である。ＢＰ−（コード
領域を取シ囲む非翻訳領域の部分もまた図１０に示され
ている：５′非翻訳領域内の下線を付けたＤＮＡ配列は
推定リポソーム結合部位に対応する・ ＤＮＡ配列はオープンリーディングフレームが１５の位
置（図１０中）で始まシ、２２７０の位置まで伸びてい
ることを明らかにした。最も可能性の高いこのオープン
リーディングフレームのための開始コドンは図１０の１
の位置のＡＴＧであろう、このＡＴＧに先立ってリポソ
ーム結合部位ｔＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＡ）があシ、そ
れは−１７，４ＫｃａｌのΔＱ計算（［を持っていた。
素地図中に示されたものと同一である。ＢＰ−（コード
領域を取シ囲む非翻訳領域の部分もまた図１０に示され
ている：５′非翻訳領域内の下線を付けたＤＮＡ配列は
推定リポソーム結合部位に対応する・ ＤＮＡ配列はオープンリーディングフレームが１５の位
置（図１０中）で始まシ、２２７０の位置まで伸びてい
ることを明らかにした。最も可能性の高いこのオープン
リーディングフレームのための開始コドンは図１０の１
の位置のＡＴＧであろう、このＡＴＧに先立ってリポソ
ーム結合部位ｔＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＡ）があシ、そ
れは−１７，４ＫｃａｌのΔＱ計算（［を持っていた。
このＭ＠ｔに続く最初の２９アミノ酸は枯草菌シグナル
配列と似ている；５つの陽性に荷電したアミノ酸１−含
む短い配列、続いての１６の疎水性残基、ヘリックス−
ｆｉ１ｍプロリン、シよび典型的人１ａ−Ｘ−Ａｌａシ
グナルベグチダーゼ切断部位。シグナルベグチダーゼ切
断部位らしい後ＩＣ１３４残基の１１０”領域があシ、
続いて成熟タンパク質が始まっていることがＮ−末端ア
よ）酸配列の決定によシ確認された。タンパク質配列か
らは不確かであったＮ−末端の最初のアミノ酸はＤＮＡ
配列の５８３−５８５の位置のＡｌａ 残基と確認さ
れた。全成熟タンパク質は４９６のアミノＭを含み予想
分子量は５２，７２９ダルトンである。この大きさは４
７、０００ダルトンの精製タンパク質の決定された分子
量とかなシの一致を示した。さらに、成熟＃素の予測等
電点（４，０４）はＩｌｉ察された４、４−４．７のｐ
Ｉと良く一致していた。ＧＥＮＢＡＮＫからＢＰ−１が
ズプチリン、ｌ８Ｐ−Ｉに対して部分的に相同であシ（
３０４）、・ｐｒ遺伝子産物に対してよシ低い程度（２
７１）で相同である事が示された。
配列と似ている；５つの陽性に荷電したアミノ酸１−含
む短い配列、続いての１６の疎水性残基、ヘリックス−
ｆｉ１ｍプロリン、シよび典型的人１ａ−Ｘ−Ａｌａシ
グナルベグチダーゼ切断部位。シグナルベグチダーゼ切
断部位らしい後ＩＣ１３４残基の１１０”領域があシ、
続いて成熟タンパク質が始まっていることがＮ−末端ア
よ）酸配列の決定によシ確認された。タンパク質配列か
らは不確かであったＮ−末端の最初のアミノ酸はＤＮＡ
配列の５８３−５８５の位置のＡｌａ 残基と確認さ
れた。全成熟タンパク質は４９６のアミノＭを含み予想
分子量は５２，７２９ダルトンである。この大きさは４
７、０００ダルトンの精製タンパク質の決定された分子
量とかなシの一致を示した。さらに、成熟＃素の予測等
電点（４，０４）はＩｌｉ察された４、４−４．７のｐ
Ｉと良く一致していた。ＧＥＮＢＡＮＫからＢＰ−１が
ズプチリン、ｌ８Ｐ−Ｉに対して部分的に相同であシ（
３０４）、・ｐｒ遺伝子産物に対してよシ低い程度（２
７１）で相同である事が示された。
多コピーレプリコン上のＲＰ−１遺伝子のクローニング
ＰＣＲ８３からＰ易ｔｌ断片を取シ、エリスロマイシン
およびカナマイシン耐性をコードしている多コピーバシ
ラス（Ｂａｅｌｌｌｕｍ）レプリコンである線状ｐＢＤ
９のＰａｔ ｌ内へ結合する。結合ＤＮ人でコンビテン
）ＧＰ２２７Ｍ胞（５ａｅＱ 促進法）を形質転換し
、カナマイシン耐性形質転換体を選択する。 ６．５ｋ
ｂ□Ｉ挿入物を運んでいるグラスミドを選びｐＣＲ８８
と呼ぶ。
およびカナマイシン耐性をコードしている多コピーバシ
ラス（Ｂａｅｌｌｌｕｍ）レプリコンである線状ｐＢＤ
９のＰａｔ ｌ内へ結合する。結合ＤＮ人でコンビテン
）ＧＰ２２７Ｍ胞（５ａｅＱ 促進法）を形質転換し
、カナマイシン耐性形質転換体を選択する。 ６．５ｋ
ｂ□Ｉ挿入物を運んでいるグラスミドを選びｐＣＲ８８
と呼ぶ。
この挿入物がＢＰ−１遺伝子をコードしていることを確
認するため、ｐＣＲ，８８またはｐＢＤ９を含むＧＰ２
２７＋１１［［１を選択的条件下ＭＲｆ９培地中。
認するため、ｐＣＲ，８８またはｐＢＤ９を含むＧＰ２
２７＋１１［［１を選択的条件下ＭＲｆ９培地中。
６７℃にて５０時間増殖させる。上澄み液試料を集め、
プロテアーゼ活性を検定する。ｐＣＲ８８培讐物からの
上澄み液はｐＢＤ９培養物からのものよシ約１０倍以上
のプロテアーセ活性を含んでいた。さらに、この分泌プ
ロテアーゼ活性はＰＭ８Ｆによシ阻Ｗを受け、シよび変
性タンパク貿ゲル上で分画すると、ｐｃＲ８８試料から
の上澄み液は４７ｋｄ の余分のタンパク質を含んで
いた。これらの結果からＢＰ−１遺伝子が６．５ｋｂ断
片内にコードされてカシ、多コピーレプリコン中への配
列のクローニングはａｐ−Ｉりｙパ／質の過生産を導く
ことが確立された。
プロテアーゼ活性を検定する。ｐＣＲ８８培讐物からの
上澄み液はｐＢＤ９培養物からのものよシ約１０倍以上
のプロテアーセ活性を含んでいた。さらに、この分泌プ
ロテアーゼ活性はＰＭ８Ｆによシ阻Ｗを受け、シよび変
性タンパク貿ゲル上で分画すると、ｐｃＲ８８試料から
の上澄み液は４７ｋｄ の余分のタンパク質を含んで
いた。これらの結果からＢＰ−１遺伝子が６．５ｋｂ断
片内にコードされてカシ、多コピーレプリコン中への配
列のクローニングはａｐ−Ｉりｙパ／質の過生産を導く
ことが確立された。
枯草菌染色体上のＲＰ−１遺伝子の位置ＲＰ−１遺伝子
（虫）部位での染色体への薬剤耐性マーカーの組み込み
シよびｅａｔ挿入物の位ｒｊＩｔを決定するための７テ
ージＰＢＳ ｌ−開始形質導入を用いて、枯草菌染色体
上のｂｐｒ の位置の地図作製を行った。クロラムフ
ェニコール アセチルトランス７エラーセ（ｅａｔ）遺
伝子ヲ含む１．３ｋｂのＳｍａ Ｉ Ｍ片をｐｃＲ９２
（ｐｃＲ８３の五ＯｋｂＢｇｌｌｌがｐＵＣ１８にクロ
ーン化されている）の非連続４蜆凡Ｖ 部位内へクロー
ン化する。ＢｃｏＲＶ 部位はｂｐｒのコード領域に
ある（図１０）、得られるプラスミドｐＡ８１１２
はＥｅｏＲＩ で消化して線状となし、枯草菌株ＧＰ
２１６の形質転換に使用し、り０ツムフ工ニコール耐性
形實転換体を選択する（ＧＰ２３８）。
（虫）部位での染色体への薬剤耐性マーカーの組み込み
シよびｅａｔ挿入物の位ｒｊＩｔを決定するための７テ
ージＰＢＳ ｌ−開始形質導入を用いて、枯草菌染色体
上のｂｐｒ の位置の地図作製を行った。クロラムフ
ェニコール アセチルトランス７エラーセ（ｅａｔ）遺
伝子ヲ含む１．３ｋｂのＳｍａ Ｉ Ｍ片をｐｃＲ９２
（ｐｃＲ８３の五ＯｋｂＢｇｌｌｌがｐＵＣ１８にクロ
ーン化されている）の非連続４蜆凡Ｖ 部位内へクロー
ン化する。ＢｃｏＲＶ 部位はｂｐｒのコード領域に
ある（図１０）、得られるプラスミドｐＡ８１１２
はＥｅｏＲＩ で消化して線状となし、枯草菌株ＧＰ
２１６の形質転換に使用し、り０ツムフ工ニコール耐性
形實転換体を選択する（ＧＰ２３８）。
Ｃｍｒ形質転換体は線状プラスミドおよび染色体の間の
２Ｎ交差の結果と予測される（マーカー置換）ａｂｐｒ
遺伝子を中断させて染色体中にｃｕｔ遺伝子が組み込ま
れていることを確認するためテザン ハイプリダイゼー
シ■ンが使用された。地図作製実験は、挿入された二１
遺伝子および四は強＜ｐｙｒＤｌ（８９ｓ）と結合Ｌ−
ｌｌ”ｂＬｍｅｔｃ と弱く結合している（４４）こ
とを示している。中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒ）を
コードしている遺伝子もまた染色体のこの領域で地図作
製を行ったところ、ｎｐｒ ａ ｐｙｒとはｂｐｒより
弱く結合しく４５％および３２僑）、ｍｅｔＣとはｂｐ
ｒよシ強く結合（１８嘔および２１４）していた。
２Ｎ交差の結果と予測される（マーカー置換）ａｂｐｒ
遺伝子を中断させて染色体中にｃｕｔ遺伝子が組み込ま
れていることを確認するためテザン ハイプリダイゼー
シ■ンが使用された。地図作製実験は、挿入された二１
遺伝子および四は強＜ｐｙｒＤｌ（８９ｓ）と結合Ｌ−
ｌｌ”ｂＬｍｅｔｃ と弱く結合している（４４）こ
とを示している。中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒ）を
コードしている遺伝子もまた染色体のこの領域で地図作
製を行ったところ、ｎｐｒ ａ ｐｙｒとはｂｐｒより
弱く結合しく４５％および３２僑）、ｍｅｔＣとはｂｐ
ｒよシ強く結合（１８嘔および２１４）していた。
ＲＰ−１遺伝子欠失物の構築
ＢＰ−１配列内の内部欠失はイン ビトロで発生させた
。ｐＣＲ８３挿入物中のＣ１ｍ ｌおよび旦ｃｏ ＲＶ
部位間の６５０ ｂｐの欠失は事実上、ｇ熟ＲＰ−１タ
ンパク質のアミノ末端側のほとんど半分をコードしてい
る配列を除去することになる。
。ｐＣＲ８３挿入物中のＣ１ｍ ｌおよび旦ｃｏ ＲＶ
部位間の６５０ ｂｐの欠失は事実上、ｇ熟ＲＰ−１タ
ンパク質のアミノ末端側のほとんど半分をコードしてい
る配列を除去することになる。
欠失は以下の方法によシ行った。
ｐＣＲ７８（６，５ｋｂ Ｐａｔ Ｉ断片を含むｐＢＲ
化しであるｐＵｃ１８（−一ガラクトシダーゼをコード
している大１＆１ｉｌａａＺ遺伝子を含む）に結合する
。結合混合物で大腸薗ＤＨ３１ｆｍ胞を形質転換する一
ｘｇａｔ Ｔｈよびアムビシリン含有ＬＢ培地上へ塗布
すると、８つの白色コロニーカ生シ、β−ガラクトシダ
ーセをコードしている遺伝子内への断片の挿入を示して
いる。これらのコロニーから調製されたプラスミドＤＮ
Ａは８りのコロニーのうちの７つが４．５ｋｂ 挿入物
を持つプラスミドを含むことを示した。そのようなプラ
スミドの１つ。
化しであるｐＵｃ１８（−一ガラクトシダーゼをコード
している大１＆１ｉｌａａＺ遺伝子を含む）に結合する
。結合混合物で大腸薗ＤＨ３１ｆｍ胞を形質転換する一
ｘｇａｔ Ｔｈよびアムビシリン含有ＬＢ培地上へ塗布
すると、８つの白色コロニーカ生シ、β−ガラクトシダ
ーセをコードしている遺伝子内への断片の挿入を示して
いる。これらのコロニーから調製されたプラスミドＤＮ
Ａは８りのコロニーのうちの７つが４．５ｋｂ 挿入物
を持つプラスミドを含むことを示した。そのようなプラ
スミドの１つ。
ｐＫＴ２をＥｃｏＲＶおよび旦幻Ｉで消化し、クレノー
断片で処理してＣ１ｍ ｌ末端を平滑化し、自己結合に
よシ再環化する。その後結合されたＤＮＡで大ｇＪｉＤ
Ｈ５Ｊｉｌ胞を形質転換する。約１００の形質転換体が
生じ、Ａｍｐｒ形質転換体から１ラスミドＤＮＡが単離
され、制限消化によシ分析された。８つのコロニーのう
ち８つともＣ１ａ Ｉ −ＥｃｏＲＶ断片が欠失してい
た。そのようなプラスミドの１つをｐＫＴ２’と名付け
た。前記のごとくバシラス（Ｂａａｉｌｌｕｓ ）組み
込み体の選択に使用するため、ｐＢｅａＩからのＢｃｏ
Ｒ＋ｌ断片上に運ばれているｃａｔ遺伝子１ｐＫＴ２’
内へ結合する。
断片で処理してＣ１ｍ ｌ末端を平滑化し、自己結合に
よシ再環化する。その後結合されたＤＮＡで大ｇＪｉＤ
Ｈ５Ｊｉｌ胞を形質転換する。約１００の形質転換体が
生じ、Ａｍｐｒ形質転換体から１ラスミドＤＮＡが単離
され、制限消化によシ分析された。８つのコロニーのう
ち８つともＣ１ａ Ｉ −ＥｃｏＲＶ断片が欠失してい
た。そのようなプラスミドの１つをｐＫＴ２’と名付け
た。前記のごとくバシラス（Ｂａａｉｌｌｕｓ ）組み
込み体の選択に使用するため、ｐＢｅａＩからのＢｃｏ
Ｒ＋ｌ断片上に運ばれているｃａｔ遺伝子１ｐＫＴ２’
内へ結合する。
ヱリ遺伝子を挿入するにはｐＫＴ２’ｆ：ＥｅｏＲｌで
消化し、子クシ腸アルカリホスフテターセで処理台する
。結合ＤＮＡでＤＨ５細胞を形質転換し。
消化し、子クシ腸アルカリホスフテターセで処理台する
。結合ＤＮＡでＤＨ５細胞を形質転換し。
Ａｍｐｒコロニーはクロラムフェニコール含有ＬＢ培地
上に移す。１００のコロニーのうち２つがＣｍ’であっ
た。これらの２つのコロニーからプラスミドＤＮＡが単
離され、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によｊ） １
．３ｋｂ ｃａｔ遺伝子断片の存在が確認された。これ
らのプラスミドのうちの１つ、ｐＫＴ３が遺伝子置換法
によるＧＰ２１６株内への欠失遺伝子の導入に使用され
た。
上に移す。１００のコロニーのうち２つがＣｍ’であっ
た。これらの２つのコロニーからプラスミドＤＮＡが単
離され、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によｊ） １
．３ｋｂ ｃａｔ遺伝子断片の存在が確認された。これ
らのプラスミドのうちの１つ、ｐＫＴ３が遺伝子置換法
によるＧＰ２１６株内への欠失遺伝子の導入に使用され
た。
このＤＮＡでＧＰ２１６’ｉ形質転換し、クロラムフェ
ニコール耐性コロ二−カ選択されｉ、ａつのＣｍＲコロ
ニーから染色体ＤＮＡが抽出され。
ニコール耐性コロ二−カ選択されｉ、ａつのＣｍＲコロ
ニーから染色体ＤＮＡが抽出され。
サザン ハイプリダイゼーシ日ンによシ分析された。１
つのクローンはベクター上および染色体内の相同配列間
の２重交差によシ生じる欠失ＲＰ−■遺伝子の２つのコ
ピーを含んでいた。クロラム７エ二コール選択なしで増
殖させ、その後りｏ２ムフェニコール含有ＴＢＡＢ培地
上でレプリカ平板法を行う、１つのＣｍ ｍコロニーが
単離され。
つのクローンはベクター上および染色体内の相同配列間
の２重交差によシ生じる欠失ＲＰ−■遺伝子の２つのコ
ピーを含んでいた。クロラム７エ二コール選択なしで増
殖させ、その後りｏ２ムフェニコール含有ＴＢＡＢ培地
上でレプリカ平板法を行う、１つのＣｍ ｍコロニーが
単離され。
サザン分析で欠失した遺伝子が染色体中の野生型ＢＰ−
１遺伝子で置換されていた。この株は。
１遺伝子で置換されていた。この株は。
ＧＰ２４０と呼ぶことＫする。ＧＰ２４０の培養液から
の上澄み液の分析によ、９ＲＰ−１活性が存在しないこ
とが確認された。
の上澄み液の分析によ、９ＲＰ−１活性が存在しないこ
とが確認された。
ＢＰ−ｆｌの単離シよび特徴付け
ＲＰ−１ｔ；１．ベソズアζジンーセファロースまたは
例えばアルギニン−セフ１０−スシよびヘモグロビン−
アガロースのごとき他のプロテアーゼーアフィニティ樹
脂に結合せず、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過およびボリアクリルアよドゲル寛気泳動のごとき通常
の精製技術を使う必要があることが認められたのでＢＰ
−１のための精製スキームはＲＰ”ｌよシもよシ大がか
シである。
例えばアルギニン−セフ１０−スシよびヘモグロビン−
アガロースのごとき他のプロテアーゼーアフィニティ樹
脂に結合せず、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過およびボリアクリルアよドゲル寛気泳動のごとき通常
の精製技術を使う必要があることが認められたのでＢＰ
−１のための精製スキームはＲＰ”ｌよシもよシ大がか
シである。
ＧＰ２２７培養物の濃縮粗上澄み液をｐＨ６，８で平衡
化したＤＥＡＥ−セフ１セル（陰イオン交換）で分画す
る。このｐＨではＲＰ−１タンパク質は樹脂に結合でき
ない：しかしながら、加えた全タンパク質の約８０鳴（
ＢＰ−１を含む）が樹脂に結合し、それ故試料から除去
される。カラム溶出物は次にＰＨ４８で平衡化したＣＭ
−セフテロースＣＬ−６Ｂを用いる陽イオン交換クロマ
トグラフィーによシ分画する。これらの条件下。
化したＤＥＡＥ−セフ１セル（陰イオン交換）で分画す
る。このｐＨではＲＰ−１タンパク質は樹脂に結合でき
ない：しかしながら、加えた全タンパク質の約８０鳴（
ＢＰ−１を含む）が樹脂に結合し、それ故試料から除去
される。カラム溶出物は次にＰＨ４８で平衡化したＣＭ
−セフテロースＣＬ−６Ｂを用いる陽イオン交換クロマ
トグラフィーによシ分画する。これらの条件下。
ＲＰ−１は樹脂に結合でき、カラムから０．５ＭＫ（Ｊ
で溶出する。陽イオン交換工程の分解能を更に促進させ
るため、）ＬＰ−ｆｉ溶出物は次にＮａ Ｃ１の直線濃
度勾配によう展開する４、６Ｘ２５０ａｍＷＣＸ（弱陽
イオン交換）ＨＰＬＣカラムによシ再分画する。ＷＣＸ
プールは続いてＴＳＫ−１２５ＨＰＬＣカラムにより大
きさで分画される。ＲＰ−ＩＩピークをその後同じカラ
ムで２度分画すると。
で溶出する。陽イオン交換工程の分解能を更に促進させ
るため、）ＬＰ−ｆｉ溶出物は次にＮａ Ｃ１の直線濃
度勾配によう展開する４、６Ｘ２５０ａｍＷＣＸ（弱陽
イオン交換）ＨＰＬＣカラムによシ再分画する。ＷＣＸ
プールは続いてＴＳＫ−１２５ＨＰＬＣカラムにより大
きさで分画される。ＲＰ−ＩＩピークをその後同じカラ
ムで２度分画すると。
５Ｄ８−ＰＡＧＢによる分析でほとんど均一なＴＬｐ−
ｉ調製試料を得る。プロテアーゼは６９００倍以上精製
され、ＧＰ２２７の培養液中の総タンパク質の約（ＬＯ
１％であることを示している。もしくは、ＲＰ−１″″
であり、 ａａｅＱ 促進配列を含むバシラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）株から約３０倍以上のＲＰ−１１が精製
できる（ Ｕ、 Ｓ、 Ｓ、 Ｎ９２１．３４３号、同
一１ｍ１）受は人に対して譲渡され。
ｉ調製試料を得る。プロテアーゼは６９００倍以上精製
され、ＧＰ２２７の培養液中の総タンパク質の約（ＬＯ
１％であることを示している。もしくは、ＲＰ−１″″
であり、 ａａｅＱ 促進配列を含むバシラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）株から約３０倍以上のＲＰ−１１が精製
できる（ Ｕ、 Ｓ、 Ｓ、 Ｎ９２１．３４３号、同
一１ｍ１）受は人に対して譲渡され。
ここに引例として含マれている）、なぜなら、そのよう
な株によシ産生されるＲＰ−１の量は本質的に増加し、
培養液中の総タンパク質の約０．５噂を示している。
な株によシ産生されるＲＰ−１の量は本質的に増加し、
培養液中の総タンパク質の約０．５噂を示している。
ＲＰ−１はＰＭ８Ｐ処理に対して敏感でなく。
それ故セリン プロテアーゼではない、８Ｄ８−ＰＡＧ
Ｅ分析はＲＰｉが２７．３ｋｄ の分子量を持ってい
ることを示している。ＲＰ−１がｐＨ６，７でＤＥＡＥ
Ｋ、ｐＨａ３−１’ＰＡＥ−３００（ＨＰＬＣ陰イオン
カラム）Ｋ結合しない事は。
Ｅ分析はＲＰｉが２７．３ｋｄ の分子量を持ってい
ることを示している。ＲＰ−１がｐＨ６，７でＤＥＡＥ
Ｋ、ｐＨａ３−１’ＰＡＥ−３００（ＨＰＬＣ陰イオン
カラム）Ｋ結合しない事は。
タンパク質がａ３を超える塩基性等電点を持っている事
を示している（ ｐ １＝ａ７ クロマトフオーカシ
ングによる）、ＲＰ−１はジチオスレイトール（ＤＴＴ
、スに７ヒドリル還元剤）Ｋ対して非常に敏感で、アゾ
コール検定にかいては１ｍＭの低いａ度で定量的に阻害
される。ＲＰ−１はまた他のスルフヒドリル試薬と金属
キレート剤の組合せ（即ちメルカプトエタノールとＢＤ
’ｒＡ）に対しても敏感である。スルフヒドリル試薬に
よるプロテアーゼの阻害は比較的精であシ、Ｃ，ヒスト
ゼシよびカルボキシペグチダーゼ人のごとき少数のプロ
テアーゼでしか記載されていない、ＲＰ−■はまたフェ
ニルアラニン メチルエステルおよびｎ−をＢＯＣ−Ｌ
−グルタミン酸−ｃｔＩ−７ｘ、 ニルエステルを加水
分解するその能力で示されるとときエステラーゼ活性も
持っている。
を示している（ ｐ １＝ａ７ クロマトフオーカシ
ングによる）、ＲＰ−１はジチオスレイトール（ＤＴＴ
、スに７ヒドリル還元剤）Ｋ対して非常に敏感で、アゾ
コール検定にかいては１ｍＭの低いａ度で定量的に阻害
される。ＲＰ−１はまた他のスルフヒドリル試薬と金属
キレート剤の組合せ（即ちメルカプトエタノールとＢＤ
’ｒＡ）に対しても敏感である。スルフヒドリル試薬に
よるプロテアーゼの阻害は比較的精であシ、Ｃ，ヒスト
ゼシよびカルボキシペグチダーゼ人のごとき少数のプロ
テアーゼでしか記載されていない、ＲＰ−■はまたフェ
ニルアラニン メチルエステルおよびｎ−をＢＯＣ−Ｌ
−グルタミン酸−ｃｔＩ−７ｘ、 ニルエステルを加水
分解するその能力で示されるとときエステラーゼ活性も
持っている。
配列決定のためのＲＰ−ｆｉの可能な最もきれいな試料
を得るため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
ｍを含む最終精製工程を実施した。
を得るため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
ｍを含む最終精製工程を実施した。
電気泳動に続いてタンパク質を電気泳動的にゲルからポ
リビニリデン ジフルオリド（ｐＶＤＦ）膜のシートに
移すｎＲＰ−１は疎水性膜上１ぬれた点”として視覚化
され、相当する領域をシートから切シ出し、そのアミノ
末端アミノ酸配列が決定された。ＲＰ−ＩＩの１５アミ
ノ酸末端残基の配列は（８ｅｒ −ｌｉｅ −ＩＩ＠−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ −Ａｓｐ −Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−１１ｅ−８＠ｒ−８＠ｒ−Ｔｈｒ −Ｔｈｒ
）セリンシよびアルギニン残基に富んでいる。セリン
シよびアルギニンは高い度合いのコドンｓ、１ｉを持り
ているので、この事は高度に特異的なグローブの作製の
困難さを増加させる。それ故、更なるア安ノ酸配列情報
１−１つまたはそれ以上の非縮重アミノ酸残基金含む内
部ペプチドから得た。
リビニリデン ジフルオリド（ｐＶＤＦ）膜のシートに
移すｎＲＰ−１は疎水性膜上１ぬれた点”として視覚化
され、相当する領域をシートから切シ出し、そのアミノ
末端アミノ酸配列が決定された。ＲＰ−ＩＩの１５アミ
ノ酸末端残基の配列は（８ｅｒ −ｌｉｅ −ＩＩ＠−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ −Ａｓｐ −Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−１１ｅ−８＠ｒ−８＠ｒ−Ｔｈｒ −Ｔｈｒ
）セリンシよびアルギニン残基に富んでいる。セリン
シよびアルギニンは高い度合いのコドンｓ、１ｉを持り
ているので、この事は高度に特異的なグローブの作製の
困難さを増加させる。それ故、更なるア安ノ酸配列情報
１−１つまたはそれ以上の非縮重アミノ酸残基金含む内
部ペプチドから得た。
ＲＰ−Ｈの内部ペプチド断片の配列分
精ｇ′ｆＬｐ−ＩＩのトリプシンペプチドを産生し。
逆相ＨＰＬＣｔ用いて単離する。アミノ酸トリプト７テ
ンおよびメチオニンそれぞれはただ１つのアミノ酸コド
ンによりコードされているので、これらのアミノ酸の両
方の１つまたはそれ以上をコードしている合成ヌクレオ
チドプローブまたは１推−１体”はその相補ヌクレオチ
ド配列に対して非常に１％異的であろう。
ンおよびメチオニンそれぞれはただ１つのアミノ酸コド
ンによりコードされているので、これらのアミノ酸の両
方の１つまたはそれ以上をコードしている合成ヌクレオ
チドプローブまたは１推−１体”はその相補ヌクレオチ
ド配列に対して非常に１％異的であろう。
ＲＰ−皿トリプシン消化混合物のＨＰＬＣクロマドダラ
ムは３つの波長でモニターされた：２１０ｎｍ（ペプチ
ド結合）、２２７ｎｍ（芳香族残基。
ムは３つの波長でモニターされた：２１０ｎｍ（ペプチ
ド結合）、２２７ｎｍ（芳香族残基。
即ちフェニルアラニン、チロシン、トリプトフラン）お
よび２９２ｎｍ（）リプトン１ンの共役環構造）、２９
２ｎｍでの跡がトリブトファン残基を含むＲＰ−ＩＩの
ペプチドの同定に使用された。
よび２９２ｎｍ（）リプトン１ンの共役環構造）、２９
２ｎｍでの跡がトリブトファン残基を含むＲＰ−ＩＩの
ペプチドの同定に使用された。
２１０ｎｍ の跡は配列分析のための分離された（即ち
単一種のペプチド）断片の基線會得るために使用された
。２１０ｎｍＴｈよび２９２ｎｍの跡に基づいて配列決
定のため３つの断片が選択された：Ｔ９０．Ｔ９４およ
びＴ９２．推測体オリゴマーがこれらの断片のアミノ酸
配列に基づいて合成された。
単一種のペプチド）断片の基線會得るために使用された
。２１０ｎｍＴｈよび２９２ｎｍの跡に基づいて配列決
定のため３つの断片が選択された：Ｔ９０．Ｔ９４およ
びＴ９２．推測体オリゴマーがこれらの断片のアミノ酸
配列に基づいて合成された。
図１１（ａＪはＲＰ−ｆｌ断片Ｔ９［１において得られ
たアミノ末端配列である。全体で１５残基が得られ、そ
の６７％はただ１つまたは２つのみの可能なコドン會持
っている。断片Ｔ２Ｏの配列に基づいて構築されたプロ
ーブ（ＢＲＴ９０）の特異性は予想されるトリ１トフア
ン残基（位［１１１２）の存ａＫよシ促進された。′４
々の位置のかっこ内の数は各々の残基に対する可能な数
のコドンを示している。
たアミノ末端配列である。全体で１５残基が得られ、そ
の６７％はただ１つまたは２つのみの可能なコドン會持
っている。断片Ｔ２Ｏの配列に基づいて構築されたプロ
ーブ（ＢＲＴ９０）の特異性は予想されるトリ１トフア
ン残基（位［１１１２）の存ａＫよシ促進された。′４
々の位置のかっこ内の数は各々の残基に対する可能な数
のコドンを示している。
ＲＰ−ｆｉ断片Ｔ９４のアミノ末端配列が図１１−）に
示されている。決定された３０残基のどれにもトリ１ト
７１ンは観察されなかった。ただの３６鳴の残基が（番
号１−２５）２つの可能なコトンを持つが、対応する７
５の塩基から成るグローブ（７０７）はＴ９０グローブ
によシ行われる確証ハイプリダイセージｌン実験のため
に有益である。
示されている。決定された３０残基のどれにもトリ１ト
７１ンは観察されなかった。ただの３６鳴の残基が（番
号１−２５）２つの可能なコトンを持つが、対応する７
５の塩基から成るグローブ（７０７）はＴ９０グローブ
によシ行われる確証ハイプリダイセージｌン実験のため
に有益である。
第６のおよび最後のプローブはＲＰ−用フラグメン）Ｔ
９２から得られる配列情報に基づいて構築された（図１
１（Ｑ）、この配列の始まシカよび終シの比較的高い度
合の縮重のため、グローブは残基１５−２７に基づいて
構築された。得られた５９−員の１０−ブ（７１５）
は残基の半分がただ１つまたは２つの可能なコドンし
か持たないペプチドをコードしている。さらにこのグロ
ーブの％異性は位ｗｔ２６および２７のメチオニンおよ
びトリグト７１ンの縦に並んだ位置によシ促進される。
９２から得られる配列情報に基づいて構築された（図１
１（Ｑ）、この配列の始まシカよび終シの比較的高い度
合の縮重のため、グローブは残基１５−２７に基づいて
構築された。得られた５９−員の１０−ブ（７１５）
は残基の半分がただ１つまたは２つの可能なコドンし
か持たないペプチドをコードしている。さらにこのグロ
ーブの％異性は位ｗｔ２６および２７のメチオニンおよ
びトリグト７１ンの縦に並んだ位置によシ促進される。
Ｒ，Ｐ−ｆｌのクローニング
染色体ＤＮＡｔ一種々の制限酵素で切断し、放射性オリ
ゴマーグローブＢＲＴ９０シよび７０７を用いる一連の
ハイブリダイゼータ１ｙを実施する。
ゴマーグローブＢＲＴ９０シよび７０７を用いる一連の
ハイブリダイゼータ１ｙを実施する。
両方のプローブとも Ｐで標識されてシシ、半一スト
リンジェント条件下（ＳｘＳ８Ｃ，１０１ホルムアミド
、１×デンハート、１００μｔ／−変性サケ精子ＤＮＡ
、３７℃）ＢａｍＨｌ−Ｂｇｌｌ−Ｈｉｎ ｃ Ｍ 、
旦０Ｉまたはｌ蝕Ｒ１で消化したＧＰ２４１ＤＮＡのサ
ザン プロットにハイブリダイズさせる。１８時間のハ
イプリダイゼータ１ンの後、プロットを２ｘｓｓｃ、０
．１４ ＳＤＳで３７℃にて１時間洗浄し、その後同じ
緩衝液で４５℃にて１時間洗浄する。結果を図１２に示
した。両方のグローブが同一の制限断片にハイブリダイ
ズした：Ｈ１ｎｅ１．〜１ｋｂ 、Ｐａｔ Ｉ＊３−
４ｋｂおよＵＢｅｏ Ｒ１，６−７ｋｂ、７ａ−７’は
ｔ７ｔＢａｍＨ１およびＢｇ目ト消化ＤＮＡの非常に大
きな断片とハイブリダイズした。
リンジェント条件下（ＳｘＳ８Ｃ，１０１ホルムアミド
、１×デンハート、１００μｔ／−変性サケ精子ＤＮＡ
、３７℃）ＢａｍＨｌ−Ｂｇｌｌ−Ｈｉｎ ｃ Ｍ 、
旦０Ｉまたはｌ蝕Ｒ１で消化したＧＰ２４１ＤＮＡのサ
ザン プロットにハイブリダイズさせる。１８時間のハ
イプリダイゼータ１ンの後、プロットを２ｘｓｓｃ、０
．１４ ＳＤＳで３７℃にて１時間洗浄し、その後同じ
緩衝液で４５℃にて１時間洗浄する。結果を図１２に示
した。両方のグローブが同一の制限断片にハイブリダイ
ズした：Ｈ１ｎｅ１．〜１ｋｂ 、Ｐａｔ Ｉ＊３−
４ｋｂおよＵＢｅｏ Ｒ１，６−７ｋｂ、７ａ−７’は
ｔ７ｔＢａｍＨ１およびＢｇ目ト消化ＤＮＡの非常に大
きな断片とハイブリダイズした。
３−４ ｋｂ ０Ｐｓｔ Ｉ断片が以下のとと＜ＤＮＡ
ライブラリー〇ＷＩＩ成に使用された。ｐＢＲ，３２２
をＰ・ｔｌで消化し、ＣＩＡＰで処理する。大きさで選
択し九３−４．５ｋｂの旦０１−消化ＧＰ２４１染色体
ＤＮＡを１８１７ガｏ−ｘ ゲル力ら電気的に溶出す
る。約ｌ１１μｇのＰｓｔｌ−切断ｐＢＲ３２２Ｔｈよ
び０．２５ｇ０ｔイズ一週択ＤＮＡを１６℃にて一夜結
合する。結合ＤＮＡで大腸菌ＤＨ５ｍｌ！！を形質転換
する。約１０ＬＯＯＯＯ＝ｙａニーが得られ、その３０
１が挿入ＤＮＡを持つプラスミドを含んでいた。１４０
０のフロニーをニトロセルロースフィルターで１５μｇ
／ｙａＪｆトラサイクリン含有のＬＢプレート上ヘバッ
チする。
ライブラリー〇ＷＩＩ成に使用された。ｐＢＲ，３２２
をＰ・ｔｌで消化し、ＣＩＡＰで処理する。大きさで選
択し九３−４．５ｋｂの旦０１−消化ＧＰ２４１染色体
ＤＮＡを１８１７ガｏ−ｘ ゲル力ら電気的に溶出す
る。約ｌ１１μｇのＰｓｔｌ−切断ｐＢＲ３２２Ｔｈよ
び０．２５ｇ０ｔイズ一週択ＤＮＡを１６℃にて一夜結
合する。結合ＤＮＡで大腸菌ＤＨ５ｍｌ！！を形質転換
する。約１０ＬＯＯＯＯ＝ｙａニーが得られ、その３０
１が挿入ＤＮＡを持つプラスミドを含んでいた。１４０
０のフロニーをニトロセルロースフィルターで１５μｇ
／ｙａＪｆトラサイクリン含有のＬＢプレート上ヘバッ
チする。
コロニーｆ：３７℃にて一夜増殖させた後、コロニーを
溶解し、ＤＮＡを変性し、シよび細胞破片を除去するた
めにフィルターを処理する。フィルターはその後８０℃
にて２時間焼く、コロニーハイプリダイゼーシ嘗ンは放
射性標識プローブ７０７を用いて実施された。ハイブリ
ダイゼーシ嘗ン条件はサザンプロット実験で用いた条件
と同一である。４つの陽性コロニーからのグラスミドＤ
ＮＡの分析によシ１両方の１０−プと強くハイブリダイ
ズする五６ｋｂ挿入物を持つグラスミドＤＮＡを含む１
つが同定された。このプラスミド（ｐＬＰｌ）は図１３
（ｂ）に示しである。
溶解し、ＤＮＡを変性し、シよび細胞破片を除去するた
めにフィルターを処理する。フィルターはその後８０℃
にて２時間焼く、コロニーハイプリダイゼーシ嘗ンは放
射性標識プローブ７０７を用いて実施された。ハイブリ
ダイゼーシ嘗ン条件はサザンプロット実験で用いた条件
と同一である。４つの陽性コロニーからのグラスミドＤ
ＮＡの分析によシ１両方の１０−プと強くハイブリダイ
ズする五６ｋｂ挿入物を持つグラスミドＤＮＡを含む１
つが同定された。このプラスミド（ｐＬＰｌ）は図１３
（ｂ）に示しである。
ｐＬＰｌの制限地図（図１３（ａ）は種々の制限エンド
ヌクレアーゼを用いるｐＬｐｌの消化、大きさで分画し
た消化物のニトロ・セルロース上への移動、および固定
化された制限断片の前記放射性標識オリゴマーによる探
査によう作製された。ＲＰ−塁タンパク質内の全５６７
ミノＷ１をコードしている３つのオリゴマーのすべてが
１．１ ｋｂ Ｈ１ｎｃｎ断片とハイブリダイズする事
が決定された。
ヌクレアーゼを用いるｐＬｐｌの消化、大きさで分画し
た消化物のニトロ・セルロース上への移動、および固定
化された制限断片の前記放射性標識オリゴマーによる探
査によう作製された。ＲＰ−塁タンパク質内の全５６７
ミノＷ１をコードしている３つのオリゴマーのすべてが
１．１ ｋｂ Ｈ１ｎｃｎ断片とハイブリダイズする事
が決定された。
１．１ｋｂＨ１ｎ ｃ ＩＩ ＩＦｒ片が単離されＭ１
３ｍｐ１８内へクローン化された。旦１ｎａｌｌ断片を
含む７アージクローンはオリゴマー１０−プの１つとの
ハイブリダイゼーシｌンによシ同定された。旦ｌｎｅ用
断片のＤＮＡ配列は断片のほとんどにわたる（図１４中
の一２４位から９３９位）オープンリーディングフレー
ムを明らかにした。このオープンリーディングフレーム
に対しての最も可能性のある開始コドンは図１４の位１
！１０人ＴＧである。
３ｍｐ１８内へクローン化された。旦１ｎａｌｌ断片を
含む７アージクローンはオリゴマー１０−プの１つとの
ハイブリダイゼーシｌンによシ同定された。旦ｌｎｅ用
断片のＤＮＡ配列は断片のほとんどにわたる（図１４中
の一２４位から９３９位）オープンリーディングフレー
ムを明らかにした。このオープンリーディングフレーム
に対しての最も可能性のある開始コドンは図１４の位１
！１０人ＴＧである。
とのＡＴＧに先立って−１６，０ＫｃａｌのΔＧ計算ａ
ｔ持り枯草陳リポソーム結合部位（ＡＡＡＧＧＡＧＧ
）がある、このＭｅｔ に続く最初の６３のアミノ酸
は枯草□シグナル配列に似ている：４りの陽性に荷電し
たアミノ酸配列いての１８の疎水性残基、ヘリックス−
破壊プロリンおよび典型的なＡｌａ−Ｘ−Ａ１ｍシグナ
ルペプチダーゼ１Ｊ！ＪｖＲｓ位。
ｔ持り枯草陳リポソーム結合部位（ＡＡＡＧＧＡＧＧ
）がある、このＭｅｔ に続く最初の６３のアミノ酸
は枯草□シグナル配列に似ている：４りの陽性に荷電し
たアミノ酸配列いての１８の疎水性残基、ヘリックス−
破壊プロリンおよび典型的なＡｌａ−Ｘ−Ａ１ｍシグナ
ルペプチダーゼ１Ｊ！ＪｖＲｓ位。
推測されたシグナルペプチダーゼ切断部位の後には５８
残基の１プロ”領域が観察され、続いて精製タンパク質
のＮ−末端アミノ酸配列で決定されているごとく成熱タ
ンパク質の開始となる。アミノ末端の１６残基には下縁
が引かれてかシ＠Ｎ−末端”と示されている。３つの推
測体が推論されたアミノ酸配列にもまた下線が引かれて
かシ。
残基の１プロ”領域が観察され、続いて精製タンパク質
のＮ−末端アミノ酸配列で決定されているごとく成熱タ
ンパク質の開始となる。アミノ末端の１６残基には下縁
が引かれてかシ＠Ｎ−末端”と示されている。３つの推
測体が推論されたアミノ酸配列にもまた下線が引かれて
かシ。
Ｔ９４．Ｔ９２ｊ？よびＴ２Ｏで表わされている。
決定されたペプチドのアミノ酸配列はヌクレオチド３７
９−３８１でコードされているセリン残基シよびヌクレ
オチド５９１−３９３でコードされているシスティン残
基を除いて推論アミノ酸配列と一致している。決定され
たアミノ酸配列は各々システィン（Ｔ９４ペプチド、１
４位）およびアスパラギン残基（Ｔ９４ペプチド、１８
位）を予言してｔｎた（図１１）、全成熟タンパク質は
２２１のアミノ酸を含むと推論され、予言される分子量
ｔｉＺ＆９４１ダルトンである。この大きさは精製タン
パク質の決定された分子量２８，０００ダルトンと大体
一致している。
９−３８１でコードされているセリン残基シよびヌクレ
オチド５９１−３９３でコードされているシスティン残
基を除いて推論アミノ酸配列と一致している。決定され
たアミノ酸配列は各々システィン（Ｔ９４ペプチド、１
４位）およびアスパラギン残基（Ｔ９４ペプチド、１８
位）を予言してｔｎた（図１１）、全成熟タンパク質は
２２１のアミノ酸を含むと推論され、予言される分子量
ｔｉＺ＆９４１ダルトンである。この大きさは精製タン
パク質の決定された分子量２８，０００ダルトンと大体
一致している。
推論されたアミノ酸配列はＧＥＮＢＡＮＫの他の配列と
わずかな相同性しか示さなかった。最も強い相同性はヒ
ト プロテアーゼＥおよびウシグロカルボキシペプチダ
ーゼＡに対スルＲＰ−ｆｉ円の２５のアミノ酸配列（１
３１−１５５，ヌクレオチド３９１−４６５でコードさ
れている；図１４）であった。
わずかな相同性しか示さなかった。最も強い相同性はヒ
ト プロテアーゼＥおよびウシグロカルボキシペプチダ
ーゼＡに対スルＲＰ−ｆｉ円の２５のアミノ酸配列（１
３１−１５５，ヌクレオチド３９１−４６５でコードさ
れている；図１４）であった。
さらにＲＰ−１を遺伝子の正体を確認するため。
３６ｋｂＰａｔｌ断片が多−コピーバシラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）レプリコン上に遺伝子組換えされ。
ｌｌｕｓ）レプリコン上に遺伝子組換えされ。
ＲＰ−ｎタンパク質の過生産が試験された。この目的の
ためには、バシラス（Ｂａｃｉｎｎｕｓ）プラスミドル
Ｂｓ８１／６ （Ｃｍｒ、Ｎ＠ｏｒ）がＲＰ−１遺伝
子を含む大腸菌クローン内へ挿入された。プラｘミ）’
ｐＬＰ１（ａＯｋｂ）ｔＥａｏ ＲＩ”ｔ”消化しくヱ
見１１挿入物の外側の１つの部位で切断）。
ためには、バシラス（Ｂａｃｉｎｎｕｓ）プラスミドル
Ｂｓ８１／６ （Ｃｍｒ、Ｎ＠ｏｒ）がＲＰ−１遺伝
子を含む大腸菌クローン内へ挿入された。プラｘミ）’
ｐＬＰ１（ａＯｋｂ）ｔＥａｏ ＲＩ”ｔ”消化しくヱ
見１１挿入物の外側の１つの部位で切断）。
ＥａｏＲｌ−消化ｐＢａ ８１ ／６ （４，５ｋｂ
：図１３（ａ））に結合させる。得られるプラスミド（
ｐｃＲ１３０）でＧＰ２４ＩＩを形質転換し、クロラム
フェニコールまたはネオマイシン耐性形質転換体を選択
する。
：図１３（ａ））に結合させる。得られるプラスミド（
ｐｃＲ１３０）でＧＰ２４ＩＩを形質転換し、クロラム
フェニコールまたはネオマイシン耐性形質転換体を選択
する。
この形質転換体の培養液からの上澄み試料はプラスミド
ルＢｓ８１／６ のみを含む細胞からの上澄み液よシ
も６−４倍以上のアゾコール−加水分解活性を含んでい
ることが観察され、ＲＰ−ＩＩのための遺伝子は五６ｋ
ｂ Ｐｓｔ １断片内に全部台まれていた。
ルＢｓ８１／６ のみを含む細胞からの上澄み液よシ
も６−４倍以上のアゾコール−加水分解活性を含んでい
ることが観察され、ＲＰ−ＩＩのための遺伝子は五６ｋ
ｂ Ｐｓｔ １断片内に全部台まれていた。
枯草菌染色体上のＲＰ−ｎ遺伝子の位置枯草菌染色体上
のＢＰ−１１遺伝子（！ ）の地図を作るため、以下に
記載するｍｐｒ 遺伝子の部位で染色体に挿入されて
いるｃｕｔ遺伝子ヲ含むＧＰ２３１株が使用され、 ｃ
ａｔ挿入の位置の決定のために７１−ジＰＢ８１形質導
入が使用される。
のＢＰ−１１遺伝子（！ ）の地図を作るため、以下に
記載するｍｐｒ 遺伝子の部位で染色体に挿入されて
いるｃｕｔ遺伝子ヲ含むＧＰ２３１株が使用され、 ｃ
ａｔ挿入の位置の決定のために７１−ジＰＢ８１形質導
入が使用される。
地図作製実験は挿入されたｃａｔ遺伝子シよび−ｍｐｒ
はａｙｓＡ１４（７％共形質導入）釦よびａｒｏ１９０
６ （３３１共形質導入）に結合されてｋＦ）、 ｐｕ
ｔ Ａ１６ ｋよびｄａｌには結合されていなかった。
はａｙｓＡ１４（７％共形質導入）釦よびａｒｏ１９０
６ （３３１共形質導入）に結合されてｋＦ）、 ｐｕ
ｔ Ａ１６ ｋよびｄａｌには結合されていなかった。
このデータはｍｐｒは０７８ Ａおよびａｒｏ １の間
にある事を示してシシ、遺伝子地図のこの領域にプロテ
アーゼ遺伝子がｆＡまれでいることはられまで知られて
いない。
にある事を示してシシ、遺伝子地図のこの領域にプロテ
アーゼ遺伝子がｆＡまれでいることはられまで知られて
いない。
他の枯草菌グロテアーセのために記載されたごと＜、Ｒ
Ｐ−１バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失突然変異体は
染色体上の完全コピーをａｐ −ｎ遺伝子の欠失作りか
え物で置換して構築する。全ＲＰ−■遺伝子の欠失を確
かめるため、挿入物中の２つのＨｐａ １部位の閣のＤ
ＮＡ領域を欠失させる（図１３（ａ））。この領域は１
，１ ｋｂ ）ｌｉｎｅ １ｉｆｔ片の全部およびさら
にＨｌｎｃ ｌ断片０上流の０．９ｋｂのＤＮＡを含ん
でいる。
Ｐ−１バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失突然変異体は
染色体上の完全コピーをａｐ −ｎ遺伝子の欠失作りか
え物で置換して構築する。全ＲＰ−■遺伝子の欠失を確
かめるため、挿入物中の２つのＨｐａ １部位の閣のＤ
ＮＡ領域を欠失させる（図１３（ａ））。この領域は１
，１ ｋｂ ）ｌｉｎｅ １ｉｆｔ片の全部およびさら
にＨｌｎｃ ｌ断片０上流の０．９ｋｂのＤＮＡを含ん
でいる。
欠失を作製するには、プラスミドｐＬＰ１（３，６ｋｂ
Ｐｓｔ Ｉ断片を含むｐＢＲ３２２りｏ −７） ｆ
旦■Ｉで消化し、アガロースゲル上大きさによる分画を
行う。ｐＬＰｌ の消化によ＃）２ｋｂの内部Ｈｐａ
ｌｌ！ｉ片およびベクター中心ＳシよびＰａｔｌ挿入物
と接したセグメントを含むよシ大きなＨｐａｌ断片が放
出される（図１３（ｃ））、よシ大きなＨｐａｌ断片を
精製し、ｐＭｘｌｌｏｌかｂＯ／Ｑ：？ムフェニコール
ー耐性（ｅａｔ ）遺伝子（Ｙｏｕｎｇｍａｎら１９８
４、上記文献］かまたはｐＵＢ１１００１１導体である
ｐＫＴ４からのプレオマイシン耐性（ｂｌ・）遺伝子（
ハシラス ストック センターコロンパス オハイオ、
から入手可能）１−含む精製平滑端化ＤＮＡ酢片と結合
する。
Ｐｓｔ Ｉ断片を含むｐＢＲ３２２りｏ −７） ｆ
旦■Ｉで消化し、アガロースゲル上大きさによる分画を
行う。ｐＬＰｌ の消化によ＃）２ｋｂの内部Ｈｐａ
ｌｌ！ｉ片およびベクター中心ＳシよびＰａｔｌ挿入物
と接したセグメントを含むよシ大きなＨｐａｌ断片が放
出される（図１３（ｃ））、よシ大きなＨｐａｌ断片を
精製し、ｐＭｘｌｌｏｌかｂＯ／Ｑ：？ムフェニコール
ー耐性（ｅａｔ ）遺伝子（Ｙｏｕｎｇｍａｎら１９８
４、上記文献］かまたはｐＵＢ１１００１１導体である
ｐＫＴ４からのプレオマイシン耐性（ｂｌ・）遺伝子（
ハシラス ストック センターコロンパス オハイオ、
から入手可能）１−含む精製平滑端化ＤＮＡ酢片と結合
する。
ｃａｔ遺伝子はｐＥｃａｌから１．６ｋｂＯ８ｍｍｌ断
片として単離されている。このＤＮＡを単離されたｐＬ
Ｐｌ のよｐ大き」庄υＩＩＩＦｉ片と結合する。
片として単離されている。このＤＮＡを単離されたｐＬ
Ｐｌ のよｐ大き」庄υＩＩＩＦｉ片と結合する。
その後結合ＤＮＡで大ｐｉｋ菌ＤＨ５細胞を形質転換す
る。約２０のＴｅｔ’コロニーを生じる。コロニーをＬ
ＢＪ１ｉ１地＋５μｇノークロラムフェニコール上にパ
ッチした場合１つのコロニーがＣｍ’であることが見い
出された。このコロニーからのプラスミドＤＮＡを分析
するとｃａｔ遺伝子の存在が確認された。
る。約２０のＴｅｔ’コロニーを生じる。コロニーをＬ
ＢＪ１ｉ１地＋５μｇノークロラムフェニコール上にパ
ッチした場合１つのコロニーがＣｍ’であることが見い
出された。このコロニーからのプラスミドＤＮＡを分析
するとｃａｔ遺伝子の存在が確認された。
このグラスミドはｐＬＰ２ と称された。
プラスミドｐＬＰ２（図１３（ｅ））七Ｐｓｔｌで消化
し、ＧＰ２４１を形質転換する。この形質転換体は約２
８０のＣｍｒコａｘ−を与えた：更なる研究のたｋｂｌ
りのコロニーが選択された（ＧＰ２３１）。
し、ＧＰ２４１を形質転換する。この形質転換体は約２
８０のＣｍｒコａｘ−を与えた：更なる研究のたｋｂｌ
りのコロニーが選択された（ＧＰ２３１）。
ＧＰ２３１のコンピテント細胞が調製され、ｐＤＰ１０
４（ｓａｃＱ）で形質転換された：１０のＴ＠ｔｒコロ
品−が生じた。４つのコロニー１ｋＭＲＩＳ培地中で増
殖させ、 ５ａａＱ の存在は上昇したアミノペプチ
ダーゼレベルによシ確認される。この株はＧＰ２３２と
称される。
４（ｓａｃＱ）で形質転換された：１０のＴ＠ｔｒコロ
品−が生じた。４つのコロニー１ｋＭＲＩＳ培地中で増
殖させ、 ５ａａＱ の存在は上昇したアミノペプチ
ダーゼレベルによシ確認される。この株はＧＰ２３２と
称される。
ｃａｔ遺伝子はしばしば他のベクターの選択に使用され
るので、ハシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体上０ＲＰ
−１遺伝子の欠失の印を付けるのに異った抗生物質耐性
もまた使用される：即ちｐＵＢｌｌｏのプレオマイシン
耐性遺伝子０月１遺伝子はｐＵＢｌｌｏの誘導体である
プラスミドｐＫＴ４からＥ（４） ＲＶ −８ｍｍ ｌ
断片として単離され、大５ＷＩＤＨ５，＠胞を形質
転換する前に精製したよシ大きなＨｐａｌ 断片に結
合する（図１３（ｃ））：テトラテイクリン耐性形質転
換体を選択し、２μｇ／ｒｔｔｌの最終濃度で７レオマ
イシン（プレオマイシンの誘導体）を含むＴＢＡＢプレ
ート上にパッチングすることによシフレオマイシンに対
する耐性でスクリーニングする。４７のＴ＠ｔ’形質転
換体がそのようにしてスクリーニングされ、７つはまた
７レオマイシン耐性でもあった６ ｂｌｅ遺伝子の挿入
はこれらのクローンから単離されるグラスミドの制限分
析によシ確認された。Ｃれらの１ツスミドの１つｐｃＲ
１２５（図１３（ｅ））が以下に記載するごとく遺伝子
置換法によ、りＧＰ２４１ 株内へのｂｌ・遺伝子マ
ーカーを含む欠失遺伝子の導入に使用される。
るので、ハシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体上０ＲＰ
−１遺伝子の欠失の印を付けるのに異った抗生物質耐性
もまた使用される：即ちｐＵＢｌｌｏのプレオマイシン
耐性遺伝子０月１遺伝子はｐＵＢｌｌｏの誘導体である
プラスミドｐＫＴ４からＥ（４） ＲＶ −８ｍｍ ｌ
断片として単離され、大５ＷＩＤＨ５，＠胞を形質
転換する前に精製したよシ大きなＨｐａｌ 断片に結
合する（図１３（ｃ））：テトラテイクリン耐性形質転
換体を選択し、２μｇ／ｒｔｔｌの最終濃度で７レオマ
イシン（プレオマイシンの誘導体）を含むＴＢＡＢプレ
ート上にパッチングすることによシフレオマイシンに対
する耐性でスクリーニングする。４７のＴ＠ｔ’形質転
換体がそのようにしてスクリーニングされ、７つはまた
７レオマイシン耐性でもあった６ ｂｌｅ遺伝子の挿入
はこれらのクローンから単離されるグラスミドの制限分
析によシ確認された。Ｃれらの１ツスミドの１つｐｃＲ
１２５（図１３（ｅ））が以下に記載するごとく遺伝子
置換法によ、りＧＰ２４１ 株内へのｂｌ・遺伝子マ
ーカーを含む欠失遺伝子の導入に使用される。
１ラスミドｐｃＲ１２５ｔＥｃｏＲ１で消化し。
線状プラスミドＤＮＡをＧＰ２４１の７レオマイシン耐
性への形質転拠に使用する。耐性形質転換体はグレート
に渡った０−５μｇ／ｗｉｌ ７レオマイシンｏｎ度勾
配を含むＴＢＡＢ寒天プレート上に形質転換細胞を塗布
することによう選択された。
性への形質転拠に使用する。耐性形質転換体はグレート
に渡った０−５μｇ／ｗｉｌ ７レオマイシンｏｎ度勾
配を含むＴＢＡＢ寒天プレート上に形質転換細胞を塗布
することによう選択された。
プレート上約２．５μｇ／−の７レオマイシンに耐性の
形質転換体はＴＢＡＢフレオマイシンプレート上で単集
落精製され、その後選択用抗生物質を含まないＴＢＡＢ
上で増殖させる（ＧＰ２６３株）。
形質転換体はＴＢＡＢフレオマイシンプレート上で単集
落精製され、その後選択用抗生物質を含まないＴＢＡＢ
上で増殖させる（ＧＰ２６３株）。
陽性制御要素、１ＩａａＱ と共に、ＲＰ−１欠失シ
よびＲＰ−１遺伝子中Ｋ ｃａｔまたは真挿入物を持つ
株の細胞外酵素産生１％にプロテアーゼおよびエステラ
ーゼ活性が評価された。
よびＲＰ−１遺伝子中Ｋ ｃａｔまたは真挿入物を持つ
株の細胞外酵素産生１％にプロテアーゼおよびエステラ
ーゼ活性が評価された。
下記の表１に与えられたデータは５つのプロテアーゼ遺
伝子ａｐｒ （ズプチリシン）、生（中性プロテアーゼ
）、・ｐｒ（Ｍｌ胞外プロテアーゼ）。
伝子ａｐｒ （ズプチリシン）、生（中性プロテアーゼ
）、・ｐｒ（Ｍｌ胞外プロテアーゼ）。
１ａｐ（内部セリングロテアー（／）Ｔｈよび」１に無
効な突然変異を運ぶ枯草１ｔｌｋＧＰ２３９中の５ａｃ
Ｑ の存在はＲＰ−■プロテアーゼ（これはまたエス
テラーゼ活性も持っている）の産生を促進していること
を示している。５ａＣＱ 制御要素を運ぶ枯草間の株
からＢＰ−ｆｉを削った場合のプロテアーゼ産生への影
響を評価するため、以下の実験が実施された。
効な突然変異を運ぶ枯草１ｔｌｋＧＰ２３９中の５ａｃ
Ｑ の存在はＲＰ−■プロテアーゼ（これはまたエス
テラーゼ活性も持っている）の産生を促進していること
を示している。５ａＣＱ 制御要素を運ぶ枯草間の株
からＢＰ−ｆｉを削った場合のプロテアーゼ産生への影
響を評価するため、以下の実験が実施された。
ａｐ−ｕ欠失株ＧＰ２３２の独立したクローンは無視で
きる量しかエステラーゼ活性を産生ぜず。
きる量しかエステラーゼ活性を産生ぜず。
アゾコールを基質として用いると検出可能なレベルのエ
ンドプロテアーゼ活性がない事が示された（、？！１
）、プロテアーゼ活性が存在しないのを確認するため、
ＧＰ２３２からの培養上澄み液を上澄み液の１−と等価
物が検出できるような程度まで濃縮する。上澄み液の１
−と等価物とアゾコール基質１に２．５時間インキエベ
ートした後でさえ欠失ＲＰ−ｆｉ株においては検出可能
なプロテアーゼ活性はなかった。それに比較して、５０
μｌのＧＰ２５９からの上澄み液は典型的には５５℃で
１時間のインキュペーシーン後アゾコール検定において
２．０以上のＡ□ｅ’ｆｅ与える。（ｓａｅＱ の存在
はこの株の培養液中に存在するアミノペプチダーゼの量
を測定する事によシ確認され、それは５ａｅＱ ｔ″
欠く類似の抹よシ５０−８０倍高い。）従って、バシラ
ス（Ｂｍａｉｌｌｕ＋ｓ）中の２つの残余プロテアーゼ
ＢＰ−１：Ｔｈよびａｐ−１の欠失で前記条件下アゾコ
ールを基質として用いて測定されるごとく、細胞外エン
ドグロテアーセの産生がほとんどできない味を得ること
、になる。
ンドプロテアーゼ活性がない事が示された（、？！１
）、プロテアーゼ活性が存在しないのを確認するため、
ＧＰ２３２からの培養上澄み液を上澄み液の１−と等価
物が検出できるような程度まで濃縮する。上澄み液の１
−と等価物とアゾコール基質１に２．５時間インキエベ
ートした後でさえ欠失ＲＰ−ｆｉ株においては検出可能
なプロテアーゼ活性はなかった。それに比較して、５０
μｌのＧＰ２５９からの上澄み液は典型的には５５℃で
１時間のインキュペーシーン後アゾコール検定において
２．０以上のＡ□ｅ’ｆｅ与える。（ｓａｅＱ の存在
はこの株の培養液中に存在するアミノペプチダーゼの量
を測定する事によシ確認され、それは５ａｅＱ ｔ″
欠く類似の抹よシ５０−８０倍高い。）従って、バシラ
ス（Ｂｍａｉｌｌｕ＋ｓ）中の２つの残余プロテアーゼ
ＢＰ−１：Ｔｈよびａｐ−１の欠失で前記条件下アゾコ
ールを基質として用いて測定されるごとく、細胞外エン
ドグロテアーセの産生がほとんどできない味を得ること
、になる。
表 １
ＧＰ２３８ （ＬＯ４
ＧＦ２３９ １．７
０Ｐ２３２．ＡＩ ２．９
ＧＰ２３２．Ａｌ 五４
ＧＰ２３２．ＢＩ １．９
ＧＰ２３２．Ｂｌ ２．５
０．１３ α０２
８４ １．１６
ＮＤ ＣｌＯ２
ＮＤ Ｑ、１１
ＮＤ （ＬｌＯ
ＮＤ Ｑ、１０
アミノペプチダーゼはＬ−ロイシン−ｐ−二トロア＝
ＩＪドを基質として用いて測定された（１単位Ｂ１分当
シマイクロモルの基質が加水分解）。
ＩＪドを基質として用いて測定された（１単位Ｂ１分当
シマイクロモルの基質が加水分解）。
プロテアーゼは標準アゾコール検定を使用して測定され
た（１単位コ江５のＡ。・７時間）。エステラーゼはＮ
−をＢＯＣ−グルタミン酸−一一フェニルエステルを基
質として使用して測定された（１単位は１弁当シマイク
クモルの基質が加水分解される）０株ＧＰ２！ｔ８は遺
伝子型Δａｐｒ ＊Δｎｐｒ 、Δ＠ｐｒｅΔｉｓｐ、
Δｒｐ−１を持ち：株ＧＰ２３９は遺伝子型Δａｐｒ、
Δｎｐｒ 、Δ＠ｐｒｅΔｉｓｐ 、Δｒｐ −１＊
５ａｃＱ を持ち：訃よびＧＰ２３２Ａｌ、ＡＩｌ、
Ｂｌ＆よびＢｌはａａａＱ％よびｃａｔ挿入によるＢＰ
−Ｉｎ中の欠失を含むＧＰ２３２の独立したクローンで
ある。ＮＤは検出できなかった事を意味している。
た（１単位コ江５のＡ。・７時間）。エステラーゼはＮ
−をＢＯＣ−グルタミン酸−一一フェニルエステルを基
質として使用して測定された（１単位は１弁当シマイク
クモルの基質が加水分解される）０株ＧＰ２！ｔ８は遺
伝子型Δａｐｒ ＊Δｎｐｒ 、Δ＠ｐｒｅΔｉｓｐ、
Δｒｐ−１を持ち：株ＧＰ２３９は遺伝子型Δａｐｒ、
Δｎｐｒ 、Δ＠ｐｒｅΔｉｓｐ 、Δｒｐ −１＊
５ａｃＱ を持ち：訃よびＧＰ２３２Ａｌ、ＡＩｌ、
Ｂｌ＆よびＢｌはａａａＱ％よびｃａｔ挿入によるＢＰ
−Ｉｎ中の欠失を含むＧＰ２３２の独立したクローンで
ある。ＮＤは検出できなかった事を意味している。
表２を参照すると、前記のよシ高感度レゾルフィンー標
識カゼイン検定を用いて、いくつかのプロテアーゼー欠
失抹のプロテアーゼ活性がまた試験されている。表２に
示したごとく、６つのグロテアーセ遺伝子が欠失し丸味
ＧＰ２６３はアゾコール試験では検出可能なプロテアー
ゼ活性を示していないが、そのような活性でもレゾルフ
ィン−標識カゼイン試験にかいては検出された。ＧＰ２
６６のｓｐｏ ＯＡ誘導体であるＧＰ２７１は両方の試
験で検出可能なグロテアーセ活性を示さず。
識カゼイン検定を用いて、いくつかのプロテアーゼー欠
失抹のプロテアーゼ活性がまた試験されている。表２に
示したごとく、６つのグロテアーセ遺伝子が欠失し丸味
ＧＰ２６３はアゾコール試験では検出可能なプロテアー
ゼ活性を示していないが、そのような活性でもレゾルフ
ィン−標識カゼイン試験にかいては検出された。ＧＰ２
６６のｓｐｏ ＯＡ誘導体であるＧＰ２７１は両方の試
験で検出可能なグロテアーセ活性を示さず。
ＧＰ２６５で検出されたプロテアーゼ活性は胞子形成制
御下であるらしい事を示している。ＧＰ２６３の培養液
中に存在する少ないカゼイン−検出可能活性はそのＰＭ
ＳＦによる阻害に対する感度から明らかにセリン プロ
テアーゼ群に嘱している。ＰＭ８Ｆ存在下では、ＧＰ２
６３の培養物中に検出可能なグロテアーセ活性は存在し
ない。
御下であるらしい事を示している。ＧＰ２６３の培養液
中に存在する少ないカゼイン−検出可能活性はそのＰＭ
ＳＦによる阻害に対する感度から明らかにセリン プロ
テアーゼ群に嘱している。ＰＭ８Ｆ存在下では、ＧＰ２
６３の培養物中に検出可能なグロテアーセ活性は存在し
ない。
表 ２
残余活性
ｔｔ、。におけみ野生
型へのＳ）
抹
遺伝子型
２
８７５
０Ｐ ２０２
Ｐ２Ｏ３
Ｐ２６３
Ｐ２７１
野生型
Δａｐｒ 、Δｎｐｒ 。
ｍｙＢ
Δａｐｒ、Δｎｐｒ。
Δ１鵬ｐ−１．ａｍｙｇ。
ｍ＠ｔ
Δａｐｒ・Δｎｐｒｓ
Δ１ａｐ−ＬΔｅｐｒ 。
Δｂｐｒ 、Δｍｐ ｒ ＊
Δｈｐｒ、ａｍｙＢ、ｍ＠ｔ
ｓｐｏＯＡｍΔａｐｒ。
Δｎｐｒ ＠Δｉ ｓ ｐ−１＊
１００ １００
８
ＮＤ
［Ｌ５−１
ＮＤ
Ｄ
１ アゾコールを基質として用いて測定２ レゾルフィ
ンカゼインを基質として用いて測定 他の実施態様 他の実施態様も特許請求の範囲に含まれる１例えば、い
くつかの列にかいて本発明のプロテアーゼ（群）′１に
コードしている遺伝子または遺伝子評の突然変異または
欠失を起こすよシむしろ発現する方がｅＪｌまれるであ
ろう０例えばクリーニング屋の洗濯活性の改良または工
業過程での使用のごとき目的のためグロテアーセを生産
するにはこれをやらなければならない、この事は制御Ｄ
ＮＡ（適当なバシラス（Ｂａｅｌｌｌｕｌ）グロモータ
ーシよび必要ならリポソーム結合部位および／またはシ
グナルコード配列）をプロテアーゼーコード遺伝子の上
流に挿入するか′または、もしくはプロテアーゼーコー
ド遺伝子をバシラス（Ｂ畠ａｉｌｌｕ畠）発現または分
泌ベクター内へ挿入することによシ達威される：ベクタ
ーはプロテアーゼ産生（または分泌］ヘバシラス（Ｂａ
ａｌｌｌｕｓ ）株を形質転換でき。
ンカゼインを基質として用いて測定 他の実施態様 他の実施態様も特許請求の範囲に含まれる１例えば、い
くつかの列にかいて本発明のプロテアーゼ（群）′１に
コードしている遺伝子または遺伝子評の突然変異または
欠失を起こすよシむしろ発現する方がｅＪｌまれるであ
ろう０例えばクリーニング屋の洗濯活性の改良または工
業過程での使用のごとき目的のためグロテアーセを生産
するにはこれをやらなければならない、この事は制御Ｄ
ＮＡ（適当なバシラス（Ｂａｅｌｌｌｕｌ）グロモータ
ーシよび必要ならリポソーム結合部位および／またはシ
グナルコード配列）をプロテアーゼーコード遺伝子の上
流に挿入するか′または、もしくはプロテアーゼーコー
ド遺伝子をバシラス（Ｂ畠ａｉｌｌｕ畠）発現または分
泌ベクター内へ挿入することによシ達威される：ベクタ
ーはプロテアーゼ産生（または分泌］ヘバシラス（Ｂａ
ａｌｌｌｕｓ ）株を形質転換でき。
常法によシ単離する。もしくは、 ５ａａＱ Ｏどと
き制御遺伝子を含む宿主株内へベクター上のプロテアー
ゼ遺伝子の１つまたはそれ以上のコピーを挿入すること
によジグロチアーゼが過剰生産できる。
き制御遺伝子を含む宿主株内へベクター上のプロテアー
ゼ遺伝子の１つまたはそれ以上のコピーを挿入すること
によジグロチアーゼが過剰生産できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドル３フ１ 、ｐ３７１Δおよび９３
７１３０Ｍ の模式図である。 図２は、Ｈ１ｎｄｌｌ消化ｌ８７５＆よびｌ８７５ＮΔ
ＤＮＡのサザンブロ、ト分析の模式図である。 図６は、プラスミドｐＡ８００７の６．５ｋｂ挿入物お
よびグツスミドｐＡＳ１３の構築を説明する図である。 図４は、プラスミドｐＩ８Ｐ−１からプラスミドｐＡＬ
６ ｆ：構築する工程図である。 図５は、シシ遺伝子の制限部位を示す図である。 図６−１．６−２．６−３シよび６−４は、５」遺伝子
のＤＮＡ配列を示す一連の図である。 図７は、１ラスミドｐＮ９の構築の工程図である。 図８は、ＲＰ−１の最初の２８残基シよびＲＰ−■遺伝
子をクローン化するのに使用される１０−ブに相当する
ＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列の図である。 図９は、プラスミドルＣＲ８５の＆５ｋｂ挿入物の制限
地図である。 図１０−１．１０−２．１０−３シよび１０−４は、Ｒ
Ｐ−１プロテアーゼをコードしているＤＮＡの配列を示
す一連の図である。 図１１ａは、ＲＰ−１１ｔｌｉＦｒ片Ｔ９０のアミノ末
端配列を示す図である。 図１１ｂは、ＲＰ−ｉＭ片Ｔ９４のアミノ酸配列を示す
図である。 図１１ｃは、ＲＰ−１［断片Ｔ９２の配列情報に基いて
構築されたプローブの配列を示す図である。 図１２は、ＧＰ２４１染色体ＤＮＡのサザンプロット分
析の模式図である。 図１３＆は、ｐＬＰＩｏ！Ａ、６ｋｂＯＰｓｔＩ挿入物
の制限地図である。 図１３ｂは、欠失ＲＰ−１遺伝子を構築する工程図であ
る。 図１３ｅは、バシラス染色体中のＢＰ−１欠失の作成に
使用されたプラスミドの図である。 図１４−１および図１４−２は、ＲＰ−ＩＩをコードし
ているＤＮＡの配列を示す一連の図である。 図面の浄！（内容に変更／ｚＬ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、 ２ ＩＳ７５ＮΔ ５７５ ρＢＲ３２２ 托纏ヨむ０本と１ｎ配 Ｅ−Ｉ’ｓ−＋ ＜ａｉ （ＪＧＬ、 ＠＞
＜ｏ ＜（Ｉｆ Ｅ−ＩＱ、 ｏｈ○ｃｕ 〇−
＜ψ ０−０し０− ■ψ 嬬ｈＥ−４ψ （！１（Ｉ
ＩＣ５句 ０ω ０へ０句 ０１）トー托単嘗ミ托訃１
８１針 式孝筆車托托じ針社 Ｏｃ Ｏへ ０− トー ○ＣＯΦ ベー ペーご１や
Ｅ 賞七 ごシ４＊０１）ペ一 ベーＥ−ＩＧＬ、 （
Ｊ自Ｃ）＞■−ご戸に１ ご七 ８」Ｏａｌ Ｃり
（ＩＩ ａｗ Ｃ！１（ＩＩ ＱａｏＱ＞
Ｅ−１ｃＱ ＜−、−１走用は本社じはむ ０１）＜ｈ ｏし ＵＥ ｕｐ ドー ０− ■−
。 ３，４き＝ Ｅ＊ 姿富イ。ト。べ一車おむくｖ装
置＃挽托 ドパ 〇：５Ｅ−４ａ ｕｇｄ ＣＪＳ−Ｉｏｋ
ｈｐ ｏ。 白も 目二 ３Ｈｇ需 冒り仲 。８０ユＱ句 トで
〇−〇−べ句べ燭 ＯＣべ暢（ｊ＞ ｏａ３ ｏａ＋
Ｑｔｔ＋ ○ω ０句０− トレ ０ω トψ
０句 ごシ冒そ冒＝ご□呂１れむ号よ ご二４工計目本８つ歌は 重目七旨怪は２′；＞生型 ○ｅｉｏ ＣＪ？ ＜ｌ：ｉ ＜ニー１−１
（Ｊｒ−Ｉ Ｅ−＋ＡＪ Ｃ）ｂＤ Ｃ３ｂ１）尊
眉社泪車目針纏＃訃 ψ− の０ 哨Ｑ ４９６− １ ３．６ ｋｂ ＦＩＧ、 ９ ＦＩＧ、 １３８、 ＦＩＧ、 １３ｂ ＥｃｏＲＩ７’／’Ｊイど Ｆｃｏ尺Ｉｒの消社 ｌ− ＦＩＧ。 ２Ａ ＦＩＧ。 ２Ｂ プローブ ＲＴ９０ プローブ ０７
７１３０Ｍ の模式図である。 図２は、Ｈ１ｎｄｌｌ消化ｌ８７５＆よびｌ８７５ＮΔ
ＤＮＡのサザンブロ、ト分析の模式図である。 図６は、プラスミドｐＡ８００７の６．５ｋｂ挿入物お
よびグツスミドｐＡＳ１３の構築を説明する図である。 図４は、プラスミドｐＩ８Ｐ−１からプラスミドｐＡＬ
６ ｆ：構築する工程図である。 図５は、シシ遺伝子の制限部位を示す図である。 図６−１．６−２．６−３シよび６−４は、５」遺伝子
のＤＮＡ配列を示す一連の図である。 図７は、１ラスミドｐＮ９の構築の工程図である。 図８は、ＲＰ−１の最初の２８残基シよびＲＰ−■遺伝
子をクローン化するのに使用される１０−ブに相当する
ＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列の図である。 図９は、プラスミドルＣＲ８５の＆５ｋｂ挿入物の制限
地図である。 図１０−１．１０−２．１０−３シよび１０−４は、Ｒ
Ｐ−１プロテアーゼをコードしているＤＮＡの配列を示
す一連の図である。 図１１ａは、ＲＰ−１１ｔｌｉＦｒ片Ｔ９０のアミノ末
端配列を示す図である。 図１１ｂは、ＲＰ−ｉＭ片Ｔ９４のアミノ酸配列を示す
図である。 図１１ｃは、ＲＰ−１［断片Ｔ９２の配列情報に基いて
構築されたプローブの配列を示す図である。 図１２は、ＧＰ２４１染色体ＤＮＡのサザンプロット分
析の模式図である。 図１３＆は、ｐＬＰＩｏ！Ａ、６ｋｂＯＰｓｔＩ挿入物
の制限地図である。 図１３ｂは、欠失ＲＰ−１遺伝子を構築する工程図であ
る。 図１３ｅは、バシラス染色体中のＢＰ−１欠失の作成に
使用されたプラスミドの図である。 図１４−１および図１４−２は、ＲＰ−ＩＩをコードし
ているＤＮＡの配列を示す一連の図である。 図面の浄！（内容に変更／ｚＬ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、 ２ ＩＳ７５ＮΔ ５７５ ρＢＲ３２２ 托纏ヨむ０本と１ｎ配 Ｅ−Ｉ’ｓ−＋ ＜ａｉ （ＪＧＬ、 ＠＞
＜ｏ ＜（Ｉｆ Ｅ−ＩＱ、 ｏｈ○ｃｕ 〇−
＜ψ ０−０し０− ■ψ 嬬ｈＥ−４ψ （！１（Ｉ
ＩＣ５句 ０ω ０へ０句 ０１）トー托単嘗ミ托訃１
８１針 式孝筆車托托じ針社 Ｏｃ Ｏへ ０− トー ○ＣＯΦ ベー ペーご１や
Ｅ 賞七 ごシ４＊０１）ペ一 ベーＥ−ＩＧＬ、 （
Ｊ自Ｃ）＞■−ご戸に１ ご七 ８」Ｏａｌ Ｃり
（ＩＩ ａｗ Ｃ！１（ＩＩ ＱａｏＱ＞
Ｅ−１ｃＱ ＜−、−１走用は本社じはむ ０１）＜ｈ ｏし ＵＥ ｕｐ ドー ０− ■−
。 ３，４き＝ Ｅ＊ 姿富イ。ト。べ一車おむくｖ装
置＃挽托 ドパ 〇：５Ｅ−４ａ ｕｇｄ ＣＪＳ−Ｉｏｋ
ｈｐ ｏ。 白も 目二 ３Ｈｇ需 冒り仲 。８０ユＱ句 トで
〇−〇−べ句べ燭 ＯＣべ暢（ｊ＞ ｏａ３ ｏａ＋
Ｑｔｔ＋ ○ω ０句０− トレ ０ω トψ
０句 ごシ冒そ冒＝ご□呂１れむ号よ ご二４工計目本８つ歌は 重目七旨怪は２′；＞生型 ○ｅｉｏ ＣＪ？ ＜ｌ：ｉ ＜ニー１−１
（Ｊｒ−Ｉ Ｅ−＋ＡＪ Ｃ）ｂＤ Ｃ３ｂ１）尊
眉社泪車目針纏＃訃 ψ− の０ 哨Ｑ ４９６− １ ３．６ ｋｂ ＦＩＧ、 ９ ＦＩＧ、 １３８、 ＦＩＧ、 １３ｂ ＥｃｏＲＩ７’／’Ｊイど Ｆｃｏ尺Ｉｒの消社 ｌ− ＦＩＧ。 ２Ａ ＦＩＧ。 ２Ｂ プローブ ＲＴ９０ プローブ ０７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ｅｐｒ（細胞外プロテアーゼ）遺伝子内に突然変異
を含む￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、
その結果前記細胞によるタンパク質分解に活性な￥ｅｐ
ｒ￥遺伝子産物の産生が阻害を受けている細胞。 ２、さらに細胞外プロテアーゼをコードしている￥ａｐ
ｒ￥（ズプチリシン）および￥ｎｐｒ￥（中性プロテア
ーゼ）遺伝子内に突然変異を含む特許請求の範囲第１項
記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、
前記突然変異の結果前記細胞による前記コードしている
タンパク質分解活性の産生が阻害を受けている細胞。 ３、ＲＰ− I （残余プロテアーゼ）をコードしている
遺伝子内に突然変異を含む￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ￥）細胞で、その結果前記細胞によるタンパク質
分解に活性なＲＰ− I の産生が阻害を受けている細胞
。 ４、さらに細胞外プロテアーゼをコードしている￥ａｐ
ｒ￥および￥ｎｐｒ￥内に突然変異を含む特許請求の範
囲第３項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）
細胞で、前記突然変異の結果前記細胞による前記コード
されているタンパク質分解活性の産生が阻害を受けてい
る細胞。 ５、ＲＰ−IIをコードしている遺伝子内に突然変異を含
む￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、その
結果前記細胞によるタンパク質分解に活性なＲＰ−IIの
産生が阻害を受けている細胞。 ６、さらにＲＰ−IIをコードしている遺伝子内に突然変
異を含む特許請求の範囲第３項記載の￥バシラス￥（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、その結果前記細胞による
タンパク質分解に活性なＲＰ−IIの産生が阻害を受けて
いる細胞。 ７、さらにＲＰ−IIをコードしている遺伝子内に突然変
異を含む特許請求の範囲第１項記載の￥バシラス￥（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、その結果前記細胞による
タンパク質分解に活性なＲＰ−IIの産生が阻害を受けて
いる細胞。 ８、特許請求の範囲第１項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記細胞はさらにＲＰ− I
をコードしている遺伝子内に突然変異を含み、前記突然
変異の結果、前記細胞によるタンパク質分解に活性なＲ
Ｐ− I の産生が阻害を受けている細胞。 ９、特許請求の範囲第４項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記細胞はさらにＲＰ−IIを
コードしている遺伝子内に突然変異を含み、前記突然変
異の結果、前記細胞による前記タンパク質分解に活性な
ＲＰ−IIの産生が阻害を受けている細胞。 １０、特許請求の範囲第８項記載の￥バシラス￥（￥Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記細胞はさらにＲＰ−I
Iをコードしている遺伝子内に突然変異を含み、前記突
然変異の結果、前記細胞による前記タンパク質分解に活
性なＲＰ−IIの産生が阻害を受けている細胞。 １１、さらに細胞外プロテアーゼをコードしている、￥
ａｐｒ￥および￥ｎｐｒ￥遺伝子内に突然変異を含む特
許請求の範囲第８項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ￥）で、前記突然変異の結果、前記細胞による前
記コードされたタンパク質分解活性の産生が阻害を受け
ている細胞。 １２、さらに細胞外プロテアーゼをコードしている￥ａ
ｐｒ￥および￥ｎｐｒ￥遺伝子内に突然変異を含む特許
請求の範囲第７項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ￥）細胞で、前記突然変異の結果前記細胞による前
記コードされているタンパク質分解活性の産生が阻害を
受けている細胞。 １３、さらに細胞外プロテアーゼをコードしている￥ａ
ｐｒ￥および￥ｎｐｒ￥遺伝子内に突然変異を含む特許
請求の範囲第５項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ￥）細胞で、前記突然変異の結果前記細胞による前
記コードされているタンパク質分解活性の産生が阻害を
受けている細胞。 １４、さらにＲＰ−IIをコードしている遺伝子内に突然
変異を含む特許請求の範囲第１１項記載の￥バシラス￥
（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記突然変異の結果
前記細胞による前記タンパク質分解に活性なＲＰ−IIの
産生が阻害を受けている細胞。 １５、各々の前記突然変異が遺伝子のコード領域内の欠
失を含む特許請求の範囲第１１項記載の￥バシラス￥（
￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞。 １６、各々の前記突然変異が遺伝子のコード領域内の欠
失を含む特許請求の範囲第１２項記載の￥バシラス￥（
￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞。 １７、各々の前記突然変異が遺伝子のコード領域内の欠
失を含む特許請求の範囲第１４項記載の￥バシラス￥（
￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞。 １８、特許請求の範囲第１１項記載の￥バシラス￥（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記細胞はさらに細胞内
プロテアーゼをコードする￥ｉｓｐ￥−１遺伝子内に突
然変異を含んでいる細胞。 １９、さらにＲＰ−II遺伝子内に突然変異を含む特許請
求の範囲第１８項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ￥）細胞で、その細果前記細胞によるタンパク質分
解に活性なＲＰ−IIの産生が阻害を受けている細胞。 ２０、特許請求の範囲第１１項記載の￥バシラス￥（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記細胞は１つまたはそ
れ以上の胞子形成−依存プロテアーゼを産生する前記細
胞の能力を減少させるような突然変異をさらに含んでい
る細胞。 ２１、特許請求の範囲第１４項記載の￥バシラス￥（￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞で、前記細胞は１つまたはそ
れ以上の胞子形成−依存プロテアーゼを産生する前記細
胞の能力を減少させるような突然変異をさらに含んでい
る細胞。 ２２、前記突然変異が胞子形成の初期段階を阻止するが
、精製ＤＮＡで形質転換される細胞の能力は除去しない
、特許請求の範囲第２０または２１項記載の￥バシラス
￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞。 ２３、前記突然変異が￥ｓｐｏ￥ＯＡ遺伝子内である特
許請求の範囲第２２項記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ￥）細胞。 ２４、前記細胞が枯草菌である特許請求の範囲第２３項
記載の￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞。 ２５、さらに異種ポリペプチドをコードする遺伝子を含
む特許請求の範囲第１−２１項のいずれか１項の￥バシ
ラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞。 ２６、前記異種ポリペプチドが医学的に有益なタンパク
質である特許請求の範囲第２５項記載の細胞。 ２７、前記医学的に有益なタンパク質がホルモン、ワク
チン、抗ウィルスタンパク質、抗腫瘍タンパク質、抗体
または血液凝固タンパク質である特許請求の範囲第２６
項記載の細胞。 ２８、前記異種ポリペプチドが農業上または工業上有益
なタンパク質である特許請求の範囲第２５項記載の細胞
。 ２９、前記農業上または工業上有益なポリペプチドが殺
虫剤または酵素である特許請求の範囲第２８項記載の細
胞。 ３０、￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞中で
異種ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法は
前記細胞中で発現されるように修飾された前記異種ポリ
ペプチドをコードしている遺伝子を前記細胞内へ導入す
ることからなり、前記￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ￥）細胞は￥ａｐｒ￥および￥ｎｐｒ￥遺伝子中に突
然変異を含んでおり、およびさらにＥｐｒプロテアーゼ
、ＲＰ− I またはＲＰ−IIをコードしている１つまた
はそれ以上の遺伝子中の突然変異も含んでいる、方法。 ３１、前記細胞がさらに細胞内プロテアーゼ I をコー
ドしている￥ｉｓｐ￥− I 遺伝子内に突然変異を含ん
でいる特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２、前記異種ポリペプチドは通常￥バシラス￥（￥Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ￥）細胞中では不安定である特許請求の
範囲第３０または３１項記載の方法。 ３３、前記細胞が枯草菌細胞である特許請求の範囲第３
２項記載の方法。 ３４、前記細胞がさらに１つまたはそれ以上の胞子形成
−依存プロテアーゼを産生する前記細胞の能力を滅じる
ような突然変異を含み、その突然変異は￥ｓｐｏ￥ＯＡ
遺伝子内に存在する、特許請求の範囲第３０または３１
項記載の方法。 ３５、前記異種ポリペプチドが医学的に有益なタンパク
質である特許請求の範囲第３０または３１項記載の方法
。 ３６、前記異種ポリペプチドが農業上または工業上有益
なタンパク質である特許請求の範囲第３０または３１項
記載の方法。 ３７、￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）￥ｅｐｒ
￥遺伝子を含む精製ＤＮＡ。 ３８、ＲＰ− I をコードしている￥バシラス￥（￥Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ￥）遺伝子を含む精製ＤＮＡ。 ３９、ＲＰ−IIをコードしている￥バシラス￥（￥Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ￥）遺伝子を含む精製ＤＮＡ。 ４０、￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）￥ｅｐｒ
￥遺伝子および前記遺伝子と機能的に組み合わされてい
る制御ＤＮＡを含むベクター。 ４１、ＲＰ− I をコードしている￥バシラス￥（￥Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ￥）遺伝子および前記遺伝子と機能的に
組み合わされている制御ＤＮＡを含むベクター。 ４２、ＲＰ−IIをコードしている￥バシラス￥（￥Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ￥）遺伝子および前記遺伝子と機能的に組
み合わされている制御ＤＮＡを含むベクター。 ４３、特許請求の範囲第４０、４１または４２項記載の
ベクターで形質転換された￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ￥）細胞。 ４４、実質的に純粋な￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ￥）Ｅｐｒプロテアーゼ。 ４５、実質的に純粋な￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ￥）残余プロテアーゼ I （ＲＰ− I ）。 ４６、実質的に純粋な￥バシラス￥（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ￥）残余プロテアーゼII（ＲＰ−II）。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27342388A | 1988-11-18 | 1988-11-18 | |
| US273423 | 1988-11-18 | ||
| US34742889A | 1989-05-04 | 1989-05-04 | |
| US347428 | 1989-05-04 | ||
| US39652189A | 1989-08-21 | 1989-08-21 | |
| US396521 | 1989-08-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0367582A true JPH0367582A (ja) | 1991-03-22 |
| JP3210315B2 JP3210315B2 (ja) | 2001-09-17 |
Family
ID=27402569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30064589A Expired - Lifetime JP3210315B2 (ja) | 1988-11-18 | 1989-11-18 | プロテアーゼ欠損 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5620880A (ja) |
| EP (1) | EP0369817B1 (ja) |
| JP (1) | JP3210315B2 (ja) |
| AT (1) | ATE137265T1 (ja) |
| AU (1) | AU4476689A (ja) |
| CA (1) | CA2003078A1 (ja) |
| DE (1) | DE68926333T2 (ja) |
| DK (1) | DK577989A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2008231063A (ja) * | 2007-03-22 | 2008-10-02 | Takano Foods Kk | 納豆菌ワクチン |
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| US5792623A (en) * | 1992-04-06 | 1998-08-11 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent |
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| AU8401798A (en) * | 1997-07-15 | 1999-02-10 | Genencor International B.V. | Proteases from gram-positive organisms |
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| US6300117B1 (en) | 1997-09-15 | 2001-10-09 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram-positive organisms |
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| US6521440B1 (en) | 1997-09-15 | 2003-02-18 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram-positive organisms |
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