JPH03501801A

JPH03501801A - クローン化プロテインｇ変異体遺伝子及びそれから発現されたプロテインｇ変異体

Info

Publication number: JPH03501801A
Application number: JP63505645A
Authority: JP
Inventors: ファーンストック，スティーブン　アール．
Original assignee: ファルマシア、エルケービー、バイオテクノロジー、アクチエボラーグ
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1991-04-25
Also published as: US5082773A; WO1988010306A1; EP0363436A1; FI896017A0; EP0363436A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】クローン化プロティンＧ変異体遺伝子及びそれから発現されたプロティンＧ変異体関連出願との相互参照本出願は、１９８７年６月１９日付で出願された米国特許出ｉｌｉ第６３，９５９号の一部継続出願である。

発明の分野本出願は、ストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロティンＧの生合成について特定する遺伝子のクローニング、プロティンＧの免疫グロブリン結合性を有するプロティンＧ変異体についてコードするクローン化遺伝子、並びにプロティンＧ及びプロティンＧ様変異体ポリペプチドを産生ずるためのクローン化遺伝子で形質転換された生物の用法に関する。

発明の背景非免疫メカニズムで抗体に結合する分子たる細菌Ｆｃレセプターに関して、近年関心が増加している。この結合性は抗体分子のＦａｂ部分に位置する抗原認識部位に対するのではなく、抗体のＦｃ部分に対するものである。

Ｆｃ領域は多数のタイプの抗体に共通であって、このため細菌Ｆｃレセプターは多数のタイプの抗体と結合することができる。この性質は、いくつかの免疫化学的応用特表千３−５０１８０１　（４）に関して細面Ｆｃレセプターを有用なものにしている。

細１ｌＦｃレセプターは、主に抗体の検出、抗体の精製及び病気の治療に関していくつかの有用な又は潜在的に有用な用途を有している。抗体の検出は、特異的モノクローナル抗体の分泌に関するハイブリドーマクローンのスクリーニング、免疫動物の免疫応答測定及び競合結合アッセイによる抗原の定量を含めて、免疫学における実験室研究のいくつかの段階において要求される。細菌Ｆｃレセプターを用いた抗体検出方法は、他の検出方法よりも高感度であって干渉及び高バックグラウンドシグナルをうけにくいことが判明した〔ボイル、　Ｍ、　Ｄ、Ｐ、。

バイオテクニクス、第２巻、第３３４−３４０頁。

１９８４年（Ｂｏｙｌｅ、Ｍ、Ｄ、Ｐ、　、Ｂｊｏｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓ、２：３３４−３４０（１９８４））　）。

Ｆｃレセプターは、タンパク質薬物の精製に及び治療剤として用いられる抗体を精製する上でも有用である。

いくつかの方法が知られているが、ポピユラーな方法では、固定された細菌Ｆｃレセプターのカラムによるアフィニティークロマトグラフィーの利用を要する。

この方法は、カラムが何回も再使用可能であって精製費用を下げうろことから好ましい。

細菌Ｆｃレセプターのいくつかの可能な臨床的用法が現在研究中である。それらによれば、固定細菌Ｆｃレセプターの体外カラムに血漿を通し、しかる後処理血漿を再注入する。例えば、テナン、　Ｄ、Ｓ、ら、二ニーイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、第３０５巻。

第１１９５−１２００頁、１９８１年［Ｔｅｎａｎ、Ｄ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

３０５：１１９５−１２００（１９８１）　）参照。

最もよく知られる細ＮＦｃレセプターはスタフィロコッカスＯアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｅｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロティンＡであって、免疫グロブリンＩｇＧの不変Ｆｃドメインに結合する。他の細菌Ｆｃレセプターも同定された。

これらのうち１つは、ＧグループのストレプトコッカスのプロティンＧとして知られる。プロティンＧはプロティンＡと類似しているが、プロティンＧはいくつかの重要な利点を有している。例えば、プロティンＧはヒトＩｇＧの全サブクラスと結合するが、一方プロチインＡはＩ　ｇＧ３サブクラスと結合しない〔レイス、に、Ｊ。

ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１３２巻、第３０９８−３１０２頁、１９８４年（Ｒｅｉｓ、Ｋ１．ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩＩＩｌＩｕｎｏｌｏｇｙ、１３２：３０９８−３１０２（１９８４）））　ｏ更にプロティンＧはＩｇＧに特異的であるが、プロティンＡの場合のようにタイプＩｇＡ及びＩｇＭのヒト抗体とは交差反応しない〔ミーμ、Ｅ、Ｂ、　（Ｍｙｈｒｅ、Ｅ、Ｂ、）及びクロンボール、　Ｇ、　（Ｋｒｏｎｖａｌｌ、Ｇ、）ら、　“規定タイプのストレプトコッカス１ｇレセプターの免疫グロブリン特異性゛、ストレプトコッカス及びストレプトコッカス疾患の基本概念、Ｊ、Ｅ、ホルム（Ｊ、Ｅ、）Ｉｏｔｌｌ）及びＰ、クリステンセン（Ｐ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）　’ｄＡ集、レッドブック社（Ｒｅｄｂｏｏｋ、Ｌｔｄ、）、チャートシー、サリー州、！２０９−２１０頁、１９８３年〕。しかも、プロティンＧはある動物のＩｇＧと結合するが、プロティンＡはこれと弱くしか又は全く結合しない。これらには、ウシ、ヒツジ及びヤギＩｇＧ１並びにウマＩｇＧのいくつかのサブクラスがある〔レイス、に、Ｊ、ら、前掲〕。プロティンＧは、ネズミモノクローナル抗体−のいくつかのサブクラスとの結合に関してプロティンＡより優れていることも判明した〔ビョルク、Ｌ、　（Ｂｊｏｒｃｋ、Ｌ、）及びクロンボール。

Ｇｏ、ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１３３Ｓ。

第９６９−９７４頁、１９８４年〕。これらの理由から、プロティンＧは様々な応用例において選択される細菌Ｆｃレセプターとなりやすいのであろう。

現在、プロティンＧはそれを天然で産生ずるストレプトコッカス株からの精製研究のための調査により得られる。例えば、ストレプトコッカス細胞は、プロティンＧを可溶化するためタンパク質分解酵素（例えば、パパイン又はトリプシン）で処理され、しかる後プロティンＧ（細胞壁タンパク質である）を更に精製するため公知のタンパク質精製操作（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過及びアフィニティークロマトグラフィー）に付された（欧州特許出願公開節１３１，１４２号明細書）。

プロティンＧの利点、用法及び潜在的用法を示すプニめ、組換えＤＮＡ法を用いてタンパク質を産生じうろことが望まれる。したがって、本発明の目的は、プロティンＧについてコードする遺伝子をクローニングし、クローン化遺伝子で微生物宿主を形質転換しかつプロティンＧ産生条件下で宿主を培養することによりプロティンＧを産生ずることである。

発明の要旨本発明は、プロティンＧのＩｇＧ結合性を有するＦｃレセプタータンパク質についてコードするクローン化遺伝子を提供する。本遺伝子はストレプトコッカス種のランスフィールド（Ｌａｎｃｅｆｊｅｌｄ）　Ｇグループ株から得られ、クローニングベクター中に挿入される。組換えベクターで安定的に形質転換された原核生物の細胞が開示されている。１つの形質転換株は、プロティンＧの性質を有するタンパク質についてコードする遺伝子をもつ第一のベクターと、その遺伝子を含まずかつ宿主株中で第一ベクターを安定的に維持するための隠れたヘルパープラスミドとして機能する第二のベクターとを含んでいる。他の形質転換体は、ヘルパープラスミドがもはや不要となるようにプロティンＧタンパク質についてコードする遺伝子を含んだＤＮＡインサートが修正されたベクターを有している。形質転換株はプロティンＧ産生条件下で培養される。

本発明は、分子の活性結合部位に関するタクレオチド配列及びアミノ酸配列の同定についても提供する。本発明者によってクローン化された１つの遺伝子は、２つの活性部位を含んでいる。第二のクローン化遺伝子は、３つの活性部位を含んでいる。

本発明は、プロティンＧの免疫グロブリン結合性を有部位に相当しかつプロティンＧのＩｇＧ結合特性を示す１以上のアミノ酸配列を含んだプロティンＧ変異体ポリペプチドの、組換えベクターを用いた産生法についても提供する。

図面の簡単な説明第１図は、プロティンＧコードＤＮＡ断片をクローニングする上で使用に適したベクターであるプラスミドｐＧＸ１０６６の顕著な特徴について示した図である。

第２図は、プロティンＧコードＤＮＡ断片を含んだ組換えプラスミドベクターであるプラスミドｐＧＸ４５３３の部分制限地図について示している。

第３図は、プロティンＧ遺伝子のＤＮＡ配列及びその遺伝子でコードされたアミノ酸配列について示している。

Ｎ４図は、クローン化プロティンＧ遺伝子及びＩｇＧ結合に関与するそのタンパク質産物の反復構造の制限地図について示している。

第５図は、プロティンＧコード断１片を含んだバクテリオファージベクターであるｍＧＸ４５４７の部分制限地図について示している。

第６図は、Ｂ構造の２つの完全コピーを含みかつＢ１及びＢ２から遠位の全アミノ酸配列を欠くバクテリオファージベクターであるｍＧＸ７８８０の部分制限地図について示している。

第７図は、プロティンＧコード断片を含んだＢ、ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｊｓ）を形質転換するために用いられる組換えプラスミドベクターであるプラスミドｐＧＸ４５８２の制限地図について示している。

第８図は、ストレプトコッカスＧＸ７８０９から得られるクローン化プロティンＧ遺伝子でコードされるようなプロティンＧ上の活性部位Ｂ１及びＢ２の位置について示している。

第９図は、ストレプトコッカスＧＸ７８０５から得られるクローン化プロティンＧ遺伝子に関するＤＮＡ及びアミノ酸配列について示している。この遺伝子は、３つの活性部位を含むプロティンＧについてコードする。

第１０図は、株ＧＸ７８０５及びＧＸ７８０９から得られるプロティンＧの反復構造間の関係について示している。

第１１図は、活性部位配列より上流のコード配列が欠失したプラスミドｐＧＸ４５８２からのプラスミドｐＧＸ４５９５の組立て方について示している。

Ｗ、１２図は、活性部位より下流のコード配列が欠失したプラスミドｍＧＸ７８７２からのプラスミドｐＧＸ４５９７及びｐＧＸ４５９９の組立て方について示している。

第１３図は、各々プラスミドｐＧＸ４５９７及びｐＧＸ４５９９とプロモーター０ＬＰＲを含むプラスミドｐＧＸ２６０６とからのプラスミドｐＧＸ５２０３（プロティンＧ変異体タイプ２を発現する）及びｐＧＸ５２０４　（プロティンＧ変異体タイプ３を発現する）の組立て方について示している。

第１４図は、プロティンＧ変異体タイプ１についてコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＧＸ４５９２の組立て方について示している。

ｊｉ！１５図は、プロティンＧ変異体タイプ５についてコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＧＸ５２４５の組立て方について示している。

第１６図は、各々プロティンＧ変異体タイプ６及びユ１についてコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＧＸ５２４７及びｐＧＸ５２４６の組立て方について示している。

Ｎ１７図は、プロティンＧ変異体タイプ７についてコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＧＸ５２４４の組立て方について示している。

第１８図は、各々プロティンＧ変異体タイプ８及び９についてコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＧＸ５２５５及びｐＧＸ５２６８の組立て方について示している。

第１９図は、プロティンＧ変異体ライブ１０についてコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＧＸ５２６６の組立て方について示している。

好ましい態様の詳細な説明本発明は、クローン化プロティンＧ遺伝子に関する。

プロティンＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ストレプトコッカス種のランスフィールドＧグループ株から単離され、クローニングベクター中に挿入される。本発明のもう１面は、クローン化プロティンＧ遺伝子を含む組換えベクターで宿主細胞を形質転換しかつプロティンＧが細胞から産生されるようなタンパク質産生条件下で形質転換細胞を培養することによるプロティンＧの産生に関する。

本発明の更にもう１面はプロティンＧ変異体の産生に関するが、その場合の変異体とは１分子当たりで１〜２０のプロティンＧ結合部位を含んでいる。このプロティンＧ変異体は下記式を有するニー　（・Ｂ−ｂ−）　− 上記式中、Ｂとは第９図で示されるようなり１、Ｂ２、又はＢ３で表示されるＢ１及びＢ２を含んだハイブリッド配列である；ｂは第８図で示されている；Ｄは１〜特表千３−５０１８０１　（６）２０である。上記式を存するかかるプロティンＧ変異体は、天然でプロティンＧ遺伝子に隣接しかつ組換え宿主で発現されうるプロティンＧの量を制限Ｔる致死配列を含んでいない。

“ハイブリッド配列”という用託は、Ｂ１及びＢ２に対応する各配列部分を含みかつプロティンＧの免疫グロブリン結合性を留めたＤＮＡ又はアミノ酸配列を意味する。このようなハイブリッド配列は第９図で示され、Ｂ３と表記されている。このハイブリッド配列は、Ｂ１の配列２４５−２８２に融合したＢ２のアミノ酸配列２９８−３１４に相当するＢ１部分を含んでいる。このため、プロティンＧの免疫グロブリン結合性を留めたすべてのこのようなハイブリッド配列は本発明の範囲内にスすると考えられる。

本発明の方法による組換えＤＮＡ技術でのプロティンＧ遺伝子のクローニング及び大腸菌（Ｅｓｃｈｃｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｌ）又はバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　５ｕｂｔｌｌｉｓ）のような細菌宿主におけるプロティンＧの産生は、タンパク質を得るための現在の方法よりもいくつかの利点を提供する。

本発明の方法によれば、比較的高い産生レベルで微生物プロティンＧ及びプロティンＧ変異体ポリペプチドが得られる。しかも、タンパク質はそれが更に好都合に単離されうる条件下で産生され、タンパク質は非病原性宿主中で産生される。

クローン化遺伝子は様々なマルチコピー発現ベクター中に神大され、組換え発現ベクターで形質転換された培養大腸菌細胞中でこれらの有益なＩｇＧ結合タンパク質を高レベルで発現する。大腸菌又はＢ、ズブチリス細胞でのプロティンＧ産生は、普通病原株であるプロティンＧ産生ストレゾトコツカ２株の培養よりも好ましい。

加えて、ストレプトコッカス細胞の細胞壁からプロティンＧを放出させるために用いられてきたパパイン及びトリプシンのようなタンパク質分解酵素は、プロティンＧ産物を分解してしまう。このため、ストレプトコッカス細胞からプロティンＧを単離するための公知方法では、低分子量分解形のプロティンＧを産生じてしまう。

本発明においてプロティンＧ遺伝子のクローニングに関する最初の工程は、プロティンＧを産生ずるストレプトコッカス株の単離である。これは、いずれかの適切な免疫アッセイ技術を用いてＩｇＧ結合活性に関し様々な株をアッセイすることにより行われる。本発明者により用いられる技術は、以下の例セクションで詳細に記載されたコロニー免疫アッセイである。次いで、ＩｇＧ結合活性を有することが判明した株は、Ｉ　ｇＧ３との結合能力がプロティンＧに関して望まれる性質であることから、Ｉ　ｇＧ３及び非分別１ｇＧとの結合能力に関して試験される。Ｉ　ｇＧ３又は非分別１ｇＧのいずれかで覆われた赤血球を用いる血球凝集アッセイ（下記例で詳細に記載されている）は、プロティンＧ産生株を同定するために好都合な方法である。スタフィロコッカス・アウレウスのコワン（Ｃｏｖａｎ）　Ｉ　（スジョクィスト、Ｊ、、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第７８巻、第４７１−４９０頁、１９７７年（Ｓｊｏｑｕｌｓｔ、Ｊ、。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７８：４７１−４９０（１９７７）））のような公知プロティンＡ産生株は、プロティンＡがＩ　ｇＧ３ではなく非分別１ｇＧと結合することから、コントロールとして用いられる。

染色体ＤＮＡは、望ましい細胞密度まで栄養培地中で株を培養し、しかる後当業界で公知のいずれか慣用的な化学的、機械的及び／又は酵素的方法で細胞を溶解させることにより、プロティンＧを産生ずることが判明した株から単離される。

慣用的な抽出及び沈降操作が染色体ＤＮＡを単離するために用いられる。クローニング用に適したサイズのＤＮＡ断片は、超音波処理又はブレングー中での高速攪拌のような公知の機械的方法、あるいはランダムな断片を生じるＤＮアーゼ１又は特定部位で開裂する制限エンドヌクレアーゼでの部分的消化のような酵素的方法によって得られる。

次いで、染色体ＤＮＡ断片はクローニングベクター中に挿入される。いずれの適切なプラスミド又はバクテリオファージクローニングベクターも使用可能である。適切なベクターであるためには、それはいくつかの有用な性質を有しているべきである。それは、意図した微生物宿主細胞中で機能的な複製源と、ベクターで形質転換された宿主細胞の同定に役立つ（抗生物質耐性遺伝子のような）選択マーカーとを有しているべきである。更にそれは、挿入されたＤＮＡ断片を許容してしかも正常に複製しうるべきである。好ましくは、ベクターは１以上の独特な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有しており、その部位でＤＮＡ断片はベクターの複製能を破壊せずに挿入することができる。

適切なりローニングベクターとしては、λｇｔｌｌのようなファージ誘導体〔ヤング及びデービス、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第１１９４−１１９８頁。

１９８３年（Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ＮａｉｌｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＬＩＳＡ、８０：１１９４−１１９８（１９１１３＞））、Ｍ１３ｍｐ９　（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製〕のような様々なファージＭ１３由来ベクター、ｐＢＲ３２２のようなプラスミド及び多数の他のものがある〔オールド（Ｏｌｄ）及びプリムローズ（Ｐｒｌｅｒｏｓｅ）、遺伝子操作の原理、第２版。

カリフォルニア大学出版、ＭＢ２−３５及び４６−４７頁、１９８１年〕。本発明者は、第１図で示されたｐＢＲ３２２由来プラスミドベクターｐＧＸ１０６６を使用した。

特表千３−５０１８０１　（７）ストレプトコッカスＤＮＡは、ホモポリマーテーリングによるか又はリンカ−分子を用いてクローニングベクター中に挿入される（オールド及びプラムローズ。

前掲。

第９２頁）。有利には、ベクターは制限エンドヌクレアーゼで直鎖化され、染色体ＤＮＡも直鎖化ベクター分子の末端に結合しうるＤＮＡ断片を生じる制限エンドヌクレアーゼで消化される。このため、ストレプトコッカス由来ＤＮＡ断片は、有利なことに酵素Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いた標準的反応でクローニングベクター中に挿入される。

細菌細胞は標準的操作を用いて組換えクローニングベクターにより形質転換され、細菌コロニーがプロティンＧの産生に関してスクリーニングされる。下記例で記載されたコロニー免疫アッセイ及び血球凝集アッセイのようなアッセイは、プロティンＧ産生組換え株の同定に適している。下記例１で更に詳細に記載されているように、同定された最初の陽性コロニーは不安定であった。このコロニーが数回再画線培養される精製操作を介して、安定であってかつプロティンＧを産生ずるクローンの誘導体が得られた。この株は大腸菌ＧＸ７８２０と命名された。

この株からプラスミドＤＮＡが単離され、次いで制限分析しかる後ゲル電気泳動によって分析された。本枕は２つのプラスミドを含むことが調べられた。ｐＧＸ１０６６Ｘと命名された。１つはｐＧＸ１０６６クローニングベクターとほぼ同様のサイズと思われ、ｐＧＸ４５３０と命名された他は１１キロ塩基対＜ｋｂｐ）インサートを含むｐＧＸ１０６６と思われる。本発明者は特定の理論に拘束されるわけではないが、例中で詳細に示されているように、ｐＧＸ１０６６Ｘはアンピシリン耐性がもはや完全でないｐＧＸ１０６６の誘導体たる“隠れたヘルパープラスミド”である。原形質転換株はおそら＜ｐＧＸ１０６６及びｐＧＸ４５３０を含んでいたのであり、該株は、ｐＧＸ１０６６がアンピシリン耐性を示すために存在している場合にｐＧＸ４’５３０がそのプラスミドを保持しうる選択圧力の欠落に基づき細胞から欠失したため不安定であった。アンピシリン耐性遺伝子を不活化させる変異をうけたｐＧＸ１０６６Ｘが出現したならば、（完全アンピシリン耐性遺伝子を有する）ｐＧＸ４５３０を保持したそれらの宿主細胞のみがアンピシリンプレート上で生存しえた。プラスミドｐＧＸ１０６６Ｘは、おそらくそれが細胞中においてｐＧＸ４５３０のコピー数を制限するように機能することから、双方のプラスミドを含む細胞中に保持されている。プラスミドｐＧＸ４５３０単独では、それが宿主にとって致死的なアミノ酸配列についてコードすることから、宿主細胞にとって致死的である（例１参照）。しかしながら、同 −宿主細胞中におけるｐＧＸ１０６６Ｘの存在は、ｐＧＸ４５３０のコピー数を許容しうるレベルまで低下させる。プラスミドは同一の“不適合群”に属し、即ちプラスミドは細胞中での維持のため互いに競合し、その結果各プラスミドは宿主細胞中で他のコピー数を制限する。大腸菌株ＧＸ７８２０はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、受理番号第５３４６０号が付された。

大Ｂ菌株は、ＧＸ７Ｂ２０株から単離されたプラスミドの混合物で形質転換された。形質転換によりいくつかの小さな強い陽性コロニーを得たが、一部のみ（約２０％）がＧＸ７８２０に似ていた。これらの小さな強い陽性コロニーから２つの安定な変異体が単離されたが、これらはヘルパープラスミドを有しておらずかつ原ＧＸ７８２０よりもプロティンＧに関して強い陽性である。

ＧＸ７８２３と命名された１つの株は、プラスミドｐＧＸ４５３０中におけるインサートの２キロ塩基対（ｋｂｐ）断片を欠失したプラスミド（ｐＧＸ４５３３）を有している。大腸菌株ＧＸ７８２３はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受理番号第５３４６１号が付された。

ＧＸ７８２２と命名された他は、ＧＸ７８２３株に保有されたプラスミド中における欠失部分の一端に非常に近い位置で原インサート内に３　ｋｂｐのＤＮＡインサートを獲得したプラスミドを有している。プロティンＧ遺伝子は、ｐＧＸ４５３３におけるストレプトコッカスＤＮＡインサートの１．９キロ塩基対（ｋｂｐ）断片上に位置していた。

プロティンＧ産生レベルを改善するため、クローン化プロティンＧ遺伝子は様々な発現ベクター中に挿入することができる。発現ベクターは、遺伝子発現、即ちＤＮＡからｍＲＮＡへの転写しかる後ｍＲＮＡから遺伝子がコードするタンパク質への翻訳に必要なりＮＡ配列を有する“調節領域”を含んでいる。プロティンＧ遺伝子はその天然発現シグナルを含んでいるか、又はこれらのシグナルが除去されて、クローン化プロティンＧ遺伝子の構造部分（即ち、遺伝子のタンパク質コード部分）が選択された宿主生物中でプロティンＧ遺伝子を指示しうる発現ベクター中に含まれた他の発現シグナルに常法に従い作動可能に融合される。例えば、宿主微生物が大腸菌である場合には、発現ベクターはｔｒｐプロモータバクテリオファージＰＬプロモーター／オペレーター及び多数の他のような公知の調節領域を含んでいてもよい。

本発明の一態様において、発現ベクターは宿主微生物の染色体領域と相同的なりＮＡ配列を更に含んでいる。

この組立でによって、相同性領域で宿主染色体中にベクターを直線的に組込むことができる。この方法の利点は、特表千３−５０１８０１　（３）無ベクター細胞に関する陰性選択に基づき宿主からのプロティンＧ配列欠失の見込みが少ないことである。

プロティンＧは、このような発現ベクターで形質転換された細菌細胞において高レベルで産生される。加えて、細胞内でのプロティンＧ産生は所望の細胞密度で（遺伝子発現を開始するために）誘導されるプロモーター／オペレーター系を用いて制御され、即ちその場合に組換え細菌細胞培養物中の細胞密度が所望のレベルに達するまで遺伝子発現が可逆的に抑制される。このため、異種タンパク質産生の細胞増殖に関する潜在的な否定的効果は回避される。

クローン化プロティンＧ遺伝子を含む形質転換細胞は、プロティンＧが細胞から産生されるようなタンパク質産生条件下で培養される。大規模醗酵操作を含めｔ４培養条件は、当業界で周知である。細胞は、細胞増殖を支える炭素、窒素の同化源及び必須無機物を含有したいずれか適切な栄養培地中においてｐＨ及び温度のいずれか生理学上適合しうる条件下で培養される。タンパク質産生培養条件は、宿主細胞を形質転換するために用いられるベクターのタイプに応じて変わる。

例えばある発現ベクターでは、遺伝子発現を開始させてプロティンＧを産生させるため、ある温度で細胞増殖、即ち細胞増殖培地へのある化学物質の添加を要求する調節領域を含んでいる。

このため、本明細書で用いられる“タンパク質産生条件”−という用語は、いずれか−組の培養条件に限定されないことを意味する。

有利なことに、゛クローン化遺伝子は、プロティン八についてコードする遺伝子に以前適用されかつ参考のため本明細書に全体として組込まれる共同譲渡された米国特許第４，６１７，２６６号明細書（１９８６年）で記載された方法によりＢ、ズブチリスに移入される。これらの方法に従い、プロティンＧはＢ、ズブチリス中で合成することができる。

プロティンＧの機能的に活性な部分は、クローン化プロティンＧ遺伝子の修正形を有する大膳菌株から産生されたタンパク質のＩｇＧ結合活性を試験したところによると、反復構造として局在化されていた。好ましい態様において、本発明は、プロティンＧ（プロティンＧ変異体）の機能的に活性な部分の１以上についてコードするクローン化遺伝子及びプロティンＧの免疫グロブリン結合性を有するこのように産生されたタンパク質にも関する。プロティンＧの活性結合部位についてコードする遺伝子の同定及び単離に関する詳細は、下記例３で記載されている。プロティンＧ１分子当たり各々２及び３の活性部位についてコードする２つの遺伝子のＤＮＡ配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列は、第８及び９図で記載されている。この情報から、多数のプロティンＧ結合部位を含んだプロティンＧ変異体を産生ずることは現在可能である。所定のアミノ酸配列内で１〜２０又はそれ以上の活性部位についてコードし、そのため得られた物質に更に高い結合効力及び能力を付与しうる合成遺伝子は、公知の合成操作を用いて組立てられる。好ましいプロティンＧ変異体は１〜１０の活性結合部位を含み、更に好ましい物質は１〜５の活性結合部位を含んでいる。

本発明の範囲内には、プロティンＧの免疫グロブリン結合性を有し、更にアミノ酸又はそのアミノもしくはカルボキシル末端における付加アミノ酸の欠失又は置換をうけたプロティンＧ変異体も属する。

プロティンＧ変異体の好ましい形は、活性部位（Ｂｌ及びＢ２）より上流及び下流のコード配″列が欠失された遺伝子によってコードされている。このようなコード配列の欠失に関する詳細は、下記例で記載されている。

好ましい態様において、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質に関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子；又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列（最初の３０アミノ酸分泌シグナルはない）を有するクンバク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮ＭＲ異体：このクローン化遺伝子を含むベクから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体につ（１てコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンノくり質１；も関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体：このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンノくり質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を有するタンパク質にも関する：好ましくは、本発明はプロティンＧ変異体についてコードした下記ＤＮＡ配列を有するクローン化遺伝子：又はその縮重変異体；このクローン化遺伝子を含むベクター、これらのベクターで形質転換された宿主及びそれから発現された下記アミノ酸配列を冑するタンパク質にも関する： “縮重変異体°という用語は、塩基の置換をうけたが但し同一タンパク質についてコードするＤＮＡ配列を意味する。

プロティンＧ変異体遺伝子の追加的欠失及び構造修正が同様の方法で行われうろことは、当業者であれば認怠しうるであろう。様々な上流での欠失及び様々な下流での欠失が新規遺伝子構造を得るため異なる組合せでインビトロにおいて組換えうろことも、更に認識されるであろう。このような組換えは、Ｓｍａｌ　（ａｐｒプロモーターから上流）、Ｋｐｎｌ（ドメインＢ１についてコードする配列からすぐ上流）及びＨｉｎｄｍ（コード配列から下流）に関する独特な制限エンドヌクレアーゼ部位の使用によりＳｍａ　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉ断片及びＫｐｎｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取り合わせて促進することができる。

この方法で組立てられた新規組合せではＢドメインにっいてコードする配列を留めており、したがってプロティンＧのＩｇＧ結合活性を保留している。しかも、ａｐｒプロモーター及びシグナルコード配列を有するこれらプラスミドのＳｍａｌ−ＢａｍＨＩ断片は、Ｂ、ズブチリスにおいて外来タンパク質の合成及び分泌を促進する上で活性な他のプロモーター及びシグナルコード配列を有する類似断片によつて置き換えうろことが認識されるであろう。

タンパク質精製に関するいずれの適切な公知方法も、宿主細胞からプロティンＧを回収及び精製するために利用可能である。細胞は、もし必要であれば公知の化学的、物理的及び／又は酵素的手段で溶解される。次いでプロティンＧは、スジョクィストの米国特許第３，８５０゜７９８号明細書で記載されている固定免疫グロブリンへの吸着のような標準的操作、イオン交換もしくはゲルクロマトグラフィー、沈降（例えば、硫酸アンモニウム）、透析、濾過又はこれら方法の組合せを用いて細胞溶解物から精製される。

下記例は本発明を説明するために示されており、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。

例１ランスフィールドＧグループのストレプトコッカスを病院から入手し、１１の独立した単離株を臨床単離物がら得た。各株は、下記コロニー免疫アッセイ操作を用いてＩｇＧに結合しうる能力に関し試験した。ニトロセルロースシート及び（上層）酢酸セルロースシートで覆われたＬブロス寒天プレート（“免疫アッセイプレート”）上で株を画線培養した。細菌コロニーが酢酸セルロースシート上で見えるまでプレートを３７℃でインキユベートした。

次いで、；、トロセルロースシートをプレートから除去し、ＩｇＧ結合タンパク質を下記のような免疫化学操作によりシート上で検出した。シートを最初に牛血清アルブミン（ｐＨ８，０Ｏ）０．ＯＩＭトｌＪスＨｃ　ｌ及び０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む“トリス塩水”中３．　ＯＶ／Ｖ％）で処理し、次の工程でニトロセルロースに対する抗体の非特異的結合性を最少に抑制するためニトロセルロース部位を遮断した。次いで、シートを２３℃で１時間にわたり正常ウサギ血清（３，Ｏｖ／ｖ％牛血清アルブミン含有トリス塩水でｌ：１０００希釈）しがる後ペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（同様に希釈）で、最後に４−クロロ−１−ナフトール（０，６ｍｇ／　ｍｌ　）及び過酸化水素（メタノール０．２倍容量含有トリス塩水中０．０６　ｖ／ｖ％）で処理し、インキュベート工程間でシートをトリス塩水で洗浄した。ニトロセルロースシート上の青色スポットはＩｇＧ結合タンパク質の存在を示し、青色領域はＩｇＧ結合タンパク質を産生ずる微生物コロニーに相当する。

９つの株が陽性、即ち様々な程度であるがＩｇＧと結合することが判明した。次いで、いくつかの株を下記血球凝集アッセイによりＩ　ｇＧ３と結合しうる能力に関して試験した。ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）（ペンシルバニア州モールバーンのキャベル・ラボラトリーズ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）を本質的にアドラー（＾ｄｌｅｒ）及びアドラー〔メソッズ・イン・エンザイモロジー、第７０巻。

第４５５−４６６頁、１９８０年（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａｏｌｏｇｙ、７０：４５５−４６８（１９８０））：ｌで記載されたように免疫グロブリンで被覆した。ＲＢＣをリン酸緩衝液（ＮａＣ１８，４ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４１、Ｉｇ／ｆｆ及びＮａＨ２ＰＯ４０，２７ｇ／ｌを含有したＰＢＳ）で洗浄し、３７℃で１５分間ＰＢＳ中２、　５１℃ｇ／ｎ＋１のタンニン酸溶液で処理した。細胞を遠心により回収し、（ａ）全ヒト免疫グロブリンＧ〔ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製〕、（ｂ）ＩｇＧＢミエローマタンパク質のいずれか０．　２ｍｇ／ｍ＋含有ＰＢＳ又は（Ｃ）特表千３−５０１８０１　（１２）ＰＢＳ単独に再懸濁した。３７℃で３０分間インキュベニト後、ＲＢＣを遠心により回収し、ＰＢＳで洗浄した。

血球凝集アッセイのために、被１ＲＢｃ１％懸濁液５０μｇを試験細胞抽出液５０μｇと混合し、マルチウェル皿の円錐形ウェル中ＰＢＳで連続希釈した。非凝集ＲＢＣはウェルの底に沈降して小さなベレットを形成スるが、凝集ＲＢＣはウェルの壁に更に拡散した沈降物を形成する。

陽性グループＧストレプトコッカス株の各々は非分別ＩｇＧで被覆された赤血球と同様に効率的にＩｇＧ３被覆赤血球を凝集させたが、これはプロティンＧ産生株に関して予想される。逆に、プロティンＡを産生ずる株たるスタフィロコッカス・アウレウスのコワンＩ細胞は非分別１ｇＧで被覆された赤血球を凝集させたがζ但し予期されたようにＩ　ｇＧ３被覆細胞に対しては活性を示さなかった。

いずれの細胞も、ＰＢＳのみとインキュベートされた赤血球、即ち非被覆赤血球を凝集させなかった。

次いで、同様の血球凝集アッセイをストレプトコッカス単離物の培養物からの上澄分画及び細胞抽出物で行ったところ、単離物はＩｇＧ結合活性に関して異なる局在性を有するようであった。一部の株において活性は優勢的に細胞結合性であると思われ、一部においてはそれは培養物上澄において優勢的にみられ、一部の株では中間であった。ＩｇＧ結合活性に関して異なる局在性を有する３つの株が、プロティンＧ遺伝子をクローニングするだめのＤＮＡ１ｌとして選択された。

６株からの細胞を２０ｉＨＤ、Ｌ−１−レオニン含有トッドーヒニーイット（Ｔｏｃｌｄ−）１ｅｗｌｔｔ）ブロス〔バージニア州すッチモンドのフィッシャー −サイエンティフィック（Ｆｌｓｈｅｒ　５ｃｌｅｎｔ１口Ｃ）製）２５０ｍｌ中で培養した。培養４時間後、グリシンを培地中５％（ν／Ｖ）の最終濃度まで加えた。細胞密度が６００ｎｍで約０．５〜１．０の吸光度に達した５時間の培養後に、細胞を遠心により回収した。細胞ベレットをＰＢＳで洗浄し、しかる後液体窒素で凍結し、−７０℃で貯蔵した。解凍後、細胞を５ｍｇ／ｍ１ミュタノリシン（シグマ・ケミカル社製）２００μｇが添加された０、５Ｍスクロース含有Ｓ７培地〔バサンタ及びフリーズ、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー。

第１４４巻、第１１１９−１１２５頁、１９８０年（Ｖａｓａｎｔｈａ　ａｎｄ　Ｆｒｅｅｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ　’ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

１４４：１１１９−１１２５（１９８０））で記載）１０ｍｌで洗浄し、しかる後それに再懸濁した。３７℃で４５分間インキュベート後、得られた原形質体を遠心によりペレット化し、しかる後ｐＨ８，０の１１００ＩＩ　ＥＤＴＡ、１５０ｄＮａＣ１及び０．　５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼに含有溶液への再懸濁により浸透溶解させた。３７℃で５５分間インキュベート後、ａ−トルエンスルホニルフルオリド（フェニルメタンスルホニルフルオリド又はＰＭＳＦとも呼ばれる；例えばシグマ社製）を最終濃度２ＦＭまで加え、混合物を７０℃で１５分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活化させた。細胞溶解物をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：　ｌ）で３回抽出して更にタンパク質を除去し、同容量のインプロパツールを水相に加えてＤＮＡを沈降させた。沈降ＤＮＡをスプールに巻いて集め、しかる後７０％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。

ＤＮＡベレット（３株の各々から）をＯ，ＯＩＭＩ−リスＨＣｌ　（ｐＨ７，８）／ｌｄ　ＥＤＴＡｌｏ、、０５ＭＮａＣ１溶液０．５ｍｌに各々再懸濁した。

この単離染色体ＤＮＡの一部を、ｐＨ７，８の１１００ＩＩＩトリス−ＭＣＩ、１５０ａＭ　ＮａＣ１及び１０ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２含有緩衝液１００μΩ中の再懸濁ＤＮＡ２５μｇにＭｂｏ１２単位を加えることにより制限エンドヌクレアーゼＭｂｏｌ（市販）で部分的に消化した。反応混合物を３７℃で１３分間しかる後７０℃で１０分間インキュベートした。消化されたＤＮＡ４０．３５ボルト／口で１５時間０．８％アガロースゲル上で電気泳動に付した。

長さ約４〜９キロ塩基対＜ｋｂｐ）のＤＮＡ断片を含むゲルセクションをゲルから切出し、ＤＮＡの回収に役立つように粉砕した。同容量のＨ２０飽和フエノールを粉砕ゲル部分に加え、混合物を一７０℃で１時間かけて凍結した。予め解凍せずに、混合物をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｃｌｏｒｒ）小型遠心管中室温で１５分間遠心し、水相を同容量のフェノールで２回及び同容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：　２４　：　ｌ）で１回抽出した。

キャリアとして９５％エタノール２．５倍容量及びグリコーゲン３０μｇを加えることにより、ＤＮＡを水相から沈降させた。

染色体ＤＮＡ断片が挿入されたクローニングベクターは、第１図で示されたプラスミドｐＧＸ１０６６であった。このプラスミドは、クローン化されるＤＮＡ断片の挿入に有用な近接した制限エンドヌクレアーゼ認識部位のバンクを含んでいる。クローニング部位のバンクは、２つの転写ターミネータ−で近接されている一′プラスミドｐＧＸ１０６６で形質転換されたＧＸ１１７０株たる大腸菌株ＧＸ１１８６は、第３９９５５号としてＡＴＣＣに寄託された。プラスミドｐＧＸ１０６６のＤＮＡ３μｇを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　（市販；製造者の説明書に従い使用）で消化した。次いで、消化されたプラスミドＤＮＡを子牛腸アルカリホスファターゼ〔ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍ）から入手；製造者の説明書に従い使用〕１単位で３０分間３７℃で処理した。反応混合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：　２４　：　１）で抽出した後、キャリアとして２Ｍ酢酸ナトリウム０，１倍容量、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、９５特表千３− ５０１８０１　（１３）％エタノール２．５倍容量及びグリコーゲン１０μｇを加えることによりＤＮＡを沈降させた。次いで、ｐＧＸ１０６６ベクターＤＮＡ　ＣＢａｍＨＩ消化；ホスファターゼ処理）０．５μｇを前記で調製された部分的Ｍｂｏ！消化ストレプトコッカス染色体ＤＮＡ０．２μｇに結合させた。反応混合物１０μｇはＴ４　ＤＮＡリガーゼ（市販；製造者の説明書に従い使用）１単位を含有しており、４ ℃で２０時間インキュベートした。

標準的塩化カルシウム処理による形質転換用に適格な大腸菌５Ｋ２２６７　（コネチカット州二二一ヘーブンの（Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）から入手されるＦ−ｇａｌｔｈｉ　Ｔｌ　ｈｓｃｌＲ４ｅｎｄＡ　５ｂｃＢ１５）細胞を用意し、しかる後コンピテント細胞０．２５ｍ１を標準的形質転換操作において結合用混合物２０μｇと混合した〔レーダーバーブ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ）及びコーエン（Ｃｏｈｅｎ）　＋　ジャーナル・オブ・バクテリオロジー。

第１１９巻、第１０７２−１０７４頁、１９７４年〕。

次いで細胞を遠心によりベレット化し、Ｌブロス０．　３ｍｌに再懸濁した。次いで、細胞０．１ｍｌをニトロセルロースシート及び（上層）酢酸セルロースシートで覆われたアンピシリン１００μｇ　／　ｍｌ含有の３枚のしブロス寒天プレート（免疫アッセイプレート）上、の各々に置いた。

細菌コロニーが酢酸セルロースシート上で見えるまでプレートを３７℃でインキュベートした。

次いで、ニトロセルロースシートをプレートから除去し、ＩｇＧ結合タンパク質を上記の免疫化学操作によりシート上で検出した。シートを最初に牛血清アルブミン（トリス塩水中３．　Ｏｖ／ｖ％）で処理し、次の工程でニトロセルロースに対する抗体の非特異的結合性を最少に抑制するためニトロセルロース部位を遮断した。次いで、シートを２３℃で１時間にわたり３．０シ／Ｖ％牛血清アルブミン含有トリス塩水で１　：　１０００希釈された正常ウサギ血清しかる後ペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（同様に希釈）で、最後に４−クロロ− １−ナフトール（０，６ｍｇ／ｍ＋）及び過酸化水素（メタノール０．２倍容量含有トリス塩水中０，０６シｌν％）で処理し、インキュベート工程間においてトリス塩水で洗浄した。

１つの陽性コロニーを同定し、ストレプトコッカス株ＧＸ７８０９由来形質転換株含有プレート上においた（３つのストレプトコッカス株のうち１つからＤＮＡがクローニング用に単離された）。陽性コロニーを免疫アッセイプレート（上記のようにアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有）上で画線培養ｌ５、精製された形質転換株を得た。ニトロセルロースシートを上記のように処理したところ、少数の陽性コロニーのみが数百の陰性コロニーの中でみられた。原形質転換株は不安定であることがわかり、そのため再画線培養を繰返したところ、１つの陽性コロニーのみが数百の陰性コロニーの中でみられた。更に１回の再画線培養で、はとんど陽性コロニーを含むプレートを得た。原陽性形質転換株よりも明らかに安定な誘導株たる陽性コロニーの１つを単離し、大腸菌株ＧＸ７８２０と命名した。

大腸菌ＧＸ７８２０のサンプルはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受理番号第５３４６０号が付された。

原陽性コロニーに加えて、いずれのコロニーとｔ、関係のないいくつかの小さな但し強い陽性スポットが観察された。これらのスポットは、再画線培養において陽性継代株を生じなかった。

大腸菌ＧＸ７８２０からプラスミドＤＮＡを単離するため標準的操作を用いて、プラスミドＤＮＡを制限分析しかる後ゲル電気泳動で分析した。２タイプのプラスミドを含んだ株がみられた。１つのプラスミド（１）ＧＸ１０６６Ｘと命名）はｐＧＸ１０６６クローニングベクターと同様のサイズのようであり、−万能（ｐＧＸ４５３０と命名）は明らかに１１　ｋｂｐインサートを含んだｐＧＸ１０６６であった。次いで、コンピテント大腸菌５Ｋ２２６７細胞をＧＸ７８２０から単離されたプラスミドの混合物で再形質転換し、形質転換株をアンピシリン１００μｇ　／　ｍｌ含有免疫アッセイプレート上で選択した。２タイプの陽性形質転換株が得られた。

大部分は小さな強い陽性コロニーを形成したが、そのほとんどは繁殖しえなかった。少数は、更に正常なサイズでかつ更に容易な繁殖性である点からＧＸ７８２０に似ていた。これら結果の原因を明らかにするため、コンピテント大腸菌５Ｋ２２６７細胞を下記のようなゲル精製プラスミドでも形質転換した：形質転換Ａ：ｐＧＸ４５３０単独形質転換Ｂ　：　Ｉ）ＧＸ１０６６Ｘ単独形質転換Ｃ：　ｐＧＸ４５３０及びｐＧＸ１０６６Ｘの混合物結果は下記のとおりであった：形質転換Ａ：小さな強い陽性コロニーであって、そのほとんどは繁殖しえなかった。

形質転換Ｂ：゛形質転換株なし形質転換Ｃ：　（形質転換人の場合と同様に）多数の小さな強い陽性非繁殖性コロニーであったが、陽性株の約２０％はＧＸ７８２０に似ており、即ち正常なサイズ及び繁殖性を有していた。

いくつかの小さな強い陽性コロニーを上記再形質転換プレートから選択しく形質転換株は、ｐＧＸ１０６６Ｘ及びｐＧＸ４５３０の混合物を含んだＧＸ７８２０株から得られる非夛別プラスミド調製物による大腸菌の形質転換に基づいている）、再画線培養して繁殖性株を単離特表千３−５０１８０１　（１４）した。プラスミドＤＮＡを２つの株から単離したが、双方ともｐＧＸ１０６６Ｘヘルパープラスミドを失っていることがわかった。１つの株（大腸ＷＧＸ７８２３と命名）はプラスミドｐＧＸ４５３３を含んでいたが、その場合に約２　ｋｂｐの欠失がｐＧＸ４５３０でみられる１１ｋｂｐインサートにおいて生じていた。大腸ｆｆ１ＧＸ７８２３のサンプルはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジンに寄託され、受理番号第５．３４６１号が付された。第二の株（大腸菌ＧＸ７８２２と命名）はプラスミドｐＧＸ４５３２を含んでいたが、これはｐＧＸ４５３３における欠失部分の一端に非常に近い位置で原１１ｋｂｐインサート内に挿入された３　ｋｂｐの未同定ＤＮＡを更に獲得していた。

大腸菌株ＧＸ７８２３　（ｐＧＸ４５３３含有）及び大腸菌株ＧＸ７８’２０　（ｐＧＸ４５３０含を）をＬブロス＋アンピシリン中で培養した。細胞を遠心によりベレット化し、ｐＨ８，０の５０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び２ｍＭＰＭＳＦ含有緩衝液中リゾチーム０．　５１１Ｉｇ／ｌｎｌの存在下３７℃で３０分間インキュベートすることにより溶解させた。抽出物のサンプルをスタジア−（Ｓｔｕｄｉｅｒ）　［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第７９巻。

第２３７−２４８頁、１９７３年（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ、７９：２３７−２４８（１９７３））　）で記載された緩衝液中１００℃で５分間加熱することにより電気泳動用に調製し、サンプルを前掲のスタジアーで記載されたように１２．５％アクリルアミドＳＤＳゲル上で電気泳動に付し、タンパク質を分離した。標準電気泳動（ウェスターンプロット）技術を用いて、ゲルからニトロセルロース紙にタンパク質バンドを移した。次いで、ニトロセルロースをＢＳＡ、正常ウサギ血清、ペルオキシダーゼ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ及び４−クロロ−１−ナフトール＋Ｈ２Ｏ２で（連続）インキユベートした（前記免疫化学操作と同様のニトロセルロース処理）。双方の株は、５７．０００に主バンドを有する約９０，０００〜約３０，０００の分子量に相当する移動性をもった同様のＩｇＧ結合結合タンパクンバンドじることがわかった。

プラスミドｐＧＸ４５３３を制限分析に付したが、部分制限地図は第２図で示されている。一本線はベクター（ｐＧＸ１０６６）配列を表し、一方斜線部分はプラスミドベクター中に挿入されかつプロティンＧ遺伝子を含むＤＮＡを表す。

インサート中の１．　９ｋｂｐ　Ｈｉ　ｎ　ｄｍ断片をｐｃｘ１０６６に組込んでサブクローニングし、得られた組換えプラスミド（ｐＧＸ４５４７）を大腸菌に組込んで形質転換した。この形質転換株（大腸菌ＧＸ７８４１）から産生されたタンパク質のウニスターンプロットを前記のように行ったところ、５７，０００主バンドを含めて同様のＩｇＧ結合結合タンパクンバンド在していた。形質転換株を前記のように血球凝集アッセイでも分析した。

形質転換株の抽出物は１ｇＧ３（ヒトミエローマタンパク質）及び非分別ヒトＩｇＧで被覆されたタンニン酸処理（ｔａｎｎｅｄ）ヒツジ赤血球を凝集させたが、但し非被覆赤血球は凝集されなかった。プロティン八産生大腸菌株の抽出物は、Ｉ　ｇＧＢ被覆又は非被覆赤血球ではなく非分別赤血球１ｇＧで被覆された赤血球を凝集させた。プロティン人だけでなくプロティンＧも産生じないコントロール大腸菌株は、いずれの赤血球サンプルも凝集させなかった。

これらの結果は、大腸菌株ＧＸ７８４１、ＧＸ７８２０及びＧＸ７８２３がプロティンＧに特徴的な性質を有したＩｇＧ結合タンパク質を産生ずることを証明している。

例２ＤＮＡ及びアミノ酸配列データクローン化遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。この配列は、ＤＮＡ配列で特定されるアミノ酸配列と共に第３図で示されている。第３図のデータは、前記のようなりローン化プロティンＧ遺伝子を含んだ完全１．　９ｋｂｐＨｉｎｄｍ断片に関する。

遺伝コードの縮重のせいで遺伝子のヌクレオチド配列が実質的に様々であることは明らかであろう。例えば、一部又は全部の遺伝子は、第３図で示されたものと異なるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを得るため化学的に合成しうる。但しアミノ酸配列は、適切なコドン−アミノ酸割当が観察されるならば保存されるであろう。プロティンＧ遺伝子のヌクレオチド配列及びタンパク質のアミノ酸配列を確立したが、本発明の遺伝子は特定のヌクレオチド配列に限定されず、遺伝コードで許容されるようなそのすべてのバリエーションを含んでいる。

本発明のプロティンＧタンパク質は、第３図で示された当のアミノ酸配列を有するタンパク質に限定されない。

第３図で示された配列中で欠失もしくは置換をうけた又はタンパク質のアミノもしくはカルボキシル末端で更にアミノ酸を有するタンパク質も、タンパク質が前記のようなプロティンＧの望ましいＩｇＧ結合性を留めている限り本発明に含まれる。アミノ酸配列におけるこれらのバリエージジンは、例えば遺伝子の化学的合成又は公知のインビトロ変異誘発操作によって得られる。

下記略号が第３図で用いられている：Ａ−デオキシアデニルＴ−チミジルＧ目デオキシグアニルＣ−デオキシシトシルＧＬＹ−グリシンＡＬＡ−アラニンＶＡＬ−−バリンＬＥＵ−ロイシンＩ　ＬＥ−−イソロイシン５ＥＲ−セリンＴＨＲ譚トレオニンＰＨＥ繻フェニルアラニンＴＹＲ−チロシンＴＲＰ−トリプトファンＣＹＳ−システィンＭＥＴ−メチオニンＡＳＰ−アスパラギン酸ＧＬＵ−グルタミン酸ＬＭＳ−リジンＡＲＧ−アルギニンＨＩＳ〜ヒスチジンＰＲＯ−プロリンＧＬＮ−グルタミンＡＳＮ−アスパラギン例３クローン化プロティンＧ遺伝子の欠失及び修正形を有する大腸菌株から産生されるタンパク質のＩｇＧ結合活性を試験したところ、活性はアミノ酸残基２２８〜３５２の反復構造に局在化されていた（第８図）。Ｂ１及びＢ２領域のアミノ酸配列は、各々における５５の対応位置のうち４９で同一である。この反復構造は第４図で示されており、そこではそれが８１及びＢ２として示されている。

初めにストレプトコッカスＧＸ７８０９から単離されたプロティンＧの充全コード配列を含む第２図で示された１、９ｋｂｐ　Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩ［断片をバクテリオファージＭｌ　３ｍｐ９でサブクローニングした〔メッシング、Ｊ。

（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１０１巻、第２０頁、１９８３年〕。プラスミドｐＧＸ４５４７をバクテリオファージＭ１３ｍｐ９ＤＮＡの二本鎖標準複製形の場合と同様にエンドヌクレアーゼＢｉｎｄＤＩで消化した。後者は子牛アルカリホスファターゼ（１５μρ中２単位）でも処理したが、これはベクターの再環化を防ぐためＨｉｎｄＩＩＩでの消化中に存在させた。フェノール抽出及びエタノール沈降の後で２つの消化ＤＮＡＸｌ１製物を混合し、結合条件下でＤＮＡリガーゼと共にインキユベートした。結合ＤＮＡ調製物を用いて、大腸菌株ＧＸ１２１０　（Ｆ″ｔｒａＤ３６　ｐｒ。

Ａ＋Ｅｌ＋１ａＣＩ　ｑ／δ１ａｃＺｋｉ１５　δ−（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｕｐＥ　ｔｈｉ　ｚｉｇ：　：ＴｎｌＯｈｓｄＲ２）に移入した。プラークからの移入細胞をコロニー免疫アッセイによりプロティンＧ産生に関してスクリーニングした。陽性アッセイ応答を示した１つはｍＧＸ４５４７と命名されたが、これは第５図で図示される部分制限地図を有することが示された。

ｍＧＸ４５４７で感染された大腸菌から単離された二本鎮複製形ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔｌで消化した。フェノール抽出及びエタノール沈降の後で、消化ＤＮＡを希釈溶液（消化ＤＮＡ約５μｇ　／　ｍｌ　）中結合条件下でＤＮＡリガーゼと共にインキユベートした。次いで、再結合ＤＮＡ調製物を用いて大腸菌株ＧＸ１２１０に移入した。複製形ＤＮＡをいくつかのプラークの感染細胞から得、同様の感染細胞をコロニー免疫アッセイによりＩｇＧ結合タンパク質産生に関して試験した。いくつかのクローンは、第５及び６図で示された２１０ｂｐ及び４１５ｂｐ　Ｐｓｔｌ断片の双方を失っていることが制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩでのＲＦ　ＤＮＡ分析により判明した。これらのクローンは、コロニー免疫アッセイで示されるように活性１ｇＧ結合タンパク質を産生じなかった。これらのクローンから産生される端部切除タンパク質は、構造Ｂ１の一部のみを有して、Ｂ１から遠位の全アミノ酸配列を欠いていると予想される。

上記移入から得られたクローンの１つは、コロニー免疫アッセイによると陽性結果を示した。このクローンからのＲＦ　ＤＮＡに関する制限分析では、ファージＤＮＡが４１５ｂｐ　Ｐｓｔｌ断片を欠くが但し２１０ｂｐ断片を保持することを示した。更に、臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動上における２１０ｂｐＰｓｔｌ断片の相対的強度は、ＤＮＡが２１０ｂｐ断片の２つのコピーを有することを示唆した。ＤＮＡ配列決定では、このファージＤＮＡ　（ｍＧＸ７８８０）の構造が第６図で示されたとおりであることを確認した。このファージＤＮＡ上に含まれたプロティンＧ遺伝子でコードされるタンパク質は、Ｂ構造の２つの充全コピー、無修正Ｂ１配列しかる後Ｂ１及びＢ２のキメラを含むことが予想される。それはＢ２から遠位の全アミノ酸配列を欠くのであろう。この構造は、２１０ｂｐ断片を規定するＰｓｔ１部位が相同的配列に対応した位置でかつ同一のタンパク質読取り枠関係でＢ反復構造中に位置しているという事実に基づいている。ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析では、このＤＮＡを有する大腸菌がほぼ予想されるサイズのＩｇＧ結合活性タンパク質を産生ずることを示した〔ファンストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１６７巻、第８７０−８８０頁、１９８６年〕。

これらの結果は、Ｂ反復構造の存在がプロティンＯのＩｇＧ結合活性に関して必要かつ十分な条件であることを示している。したがって、Ｂ反復構造が分子中におけるＩｇＧ結合活性の座であると結論づけられた。

例４バチルス・ズブチリスにおけるプロティンＧ遺伝子の発現転写ターミネータ−に似た配列をもつ合成オリゴヌクレオチドを最初にｍＧＸ４５４７中に挿入した。オリゴヌクレオチド配列は下記のとおりであった：５°− ｐＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＴＣＣＣＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴ− ３゜それは自己相補的であって、二本鎖である場合にはエンドヌクレアーゼ５ａｌＩで産生されるものと同様の配列をもつ一本鎖末端を産生ずる。それをｍＧＸ４５４７に挿入するため、ファージＤＮＡをエンドヌクレアーゼ５ａｌｌで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈降させ、しかる後結合条件下で（７０℃で加熱しかつ２３℃まで徐々に冷却することにより変性された）合成オリゴヌクレオチド及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０に移入し、クローンを５ａ１１部位の欠失及びＥｃｏＲＶ部位の出現に関してスクリーニングしたが、後者に関する認識配列は合成オリゴヌクレオチド上に存在している。所望構造をもつ１つのクローンは、ｍＧＸ７８７２と命名された。

次いで、Ｂ２反復配列から遠位の配列をｍＧＸ７８７２から欠失させた。これは、オリゴヌクレオチドのインビトロ突然変異誘発により行われた。下記オリゴヌクレオチドが合成された：５　’−ｐＣＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＡＡＣＣ− ３゜この配列は、Ｂ２配列からすぐ近くのｍＧＸ４５４７中の配列と半分が及びプロティンＧのＣ末端についてコードしたものに近い配列と残り半分が相補的である。このオリゴヌクレオチドは、標準的方法を用いて、鋳型としてのｍＧＸ４５４７ＤＮＡと共に二本鎖ＲＦ　ＤＮＡのインビトロ合成に関するプライマーとして用いた。このＤＮＡを用いて、大腸菌ＧＸ１２１０に移入した。プラークは、所望の欠失配列と相補的な放射性元素標識オリゴヌクレオチド５°−（３２Ｐ）ＡＧＣＧＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣ−３°とハイブリッド形成しうるそれらが産生じたファージＤＮＡの能力に関してその場でスクリーニングした。所望構造をもつ１つのクローンを同定し、ｍＧＸ７８７７と命名した。

その構造はＤＮＡ配列分析で確認された。欠失は、第３図で示された配列のヌクレオチド１６５１−１８９６である。

プロティンＧコード配列を発現させかつ分泌ベクターに融合させるため、オリゴヌクレオチドのインビトロ突然変異誘発によりｍＧＸ７８７７中にＢａｍ、Ｈ１部位を作った。下記配列のプライマーオリゴヌクレオチドニ５°−ｐＧＧＴＡＴＣＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＧＣＴＧ＾＾ＴＣＡＡＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＣＧ −３゜を用いて、ｍＧＸ７８７７一本ｔ！ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａから二重ＤＮＡへの変換をインビトロで促進させた。このオリゴヌクレオチドはｍＧＸ　７８７７においてプロティンＧをコードする配列と相補的であったが、但しエンドヌクレアーゼＢａｍＨ１に関する認識配列たる更に６つのヌクレオチドＧＧＡＴＣＣを含んでいて、成熟プロティンＧ（分泌シグナル配列の除去産物）についてコードする配列の開始部分近くに挿入されている。得られた二本鎖ＤＮＡを用いて、大ｐＡ菌ＧＸ１２１０に移入した。プラークの感染細胞から回収されたＲＦ　ＤＭＡをＢａｍＨ１部位の存在に関してスクリーニングした。所望構造の１つは、ｍＧＸ８４０２と命名した。

ズブチリシンについてコードするバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｌｑｕｅｆａｃｌｅｎｓ）遺伝子から得られるプロモーター及び分泌シグナル配列（ａｐｒ）を含んだ分泌ベクターは、バサンタ及びトンプソン（ＴｈｏＩＩｐｓｏｎ）　［ジャーナル・オブ・バクテリオワジー。

第１６５巻、第８３７−８４２頁、１９８４年；１９８４年６月８日付で出願された米国特許出願第６コ８．９０２号明細書及び１９８５年３月２９日付で出願されたその一部継続出願第７１７，８００号明細書〕で記載されている。このベクターｐＧＸ２１３４は分泌シグナル配列についてコードする配列の末端近くにＢａｍＨ１部位を含んでいるが、それには異種遺伝子がＢ、ズブチリス中でのそれらの発現及び細胞からのタンパク質産物の分泌を促進するため融合させることができる。プロティンＧコード配列をこのベクターに融合させるため、ｐＧＸ２１３４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩＩで消化した。ｍＧＸ８４０２由来ＲＦ　ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｍａ　Ｉで消化した。フェノール抽出及びエタノール沈降の後で、消化ＤＮＡ調製物を混合し、結合条件下でＤＮＡリガーゼと共にインキュベートし、結合ＤＮＡを用いて標準的方法によりＢ、ズブチリスＧＸ８００８（ａｐｒ欠失、ｎｐｒ欠失、５ｐｏＯＡ６７７）原形質体を形質転換させた。形質転換株をクロラムフェニコール耐性に関して選択し、コロニー免疫アッセイでプロティンＧ産生に関しスクリーニングした。陽性形質転換株を同定し、ＧＸ８４０８　（ｐＧＸ４５８２）と命名した。

プラスミドｐＧＸ４５８２は、制限分析によると第７図で示された構造を有することがわかった。それは、プロティンＧコード配列をもつｍＧＸ８４０２のＢａｍＨＩ断片＋ｍＧＸ８４０２のコード配列から遠位の小さなりａｍＨＩ−Ｓｍａ　Ｉ断片のＢａｍＨＩ及びｐｖｕ１１部位間におけるｐＧＸ２１３４中への挿入によっておそらく形成されたのであろう。

ＧＸ８４０８株は、プロティンＧのＩｇＧ結合活性をもつタンパク質を産生ずることが示された。Ｂ２配列から遠位の配列が欠失したこの株は、プロティンＧ様物質の高分泌を示した。適切な培地〔ファンストック及び）特表千３−５０１８０１　（１７）イッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、　ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１６５＠、第７９６−８０４頁、１９８４年〕中で増殖させた後、培養物上澄及び細胞含有分画を回収し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に付した。電気泳動分離後、タンパク質バンドをニトロセルロースに移し、例１で記載されたように免疫化学的に染色した。ＩｇＧ結合活性のある物質は、培養物上澄及び細胞含有分画の双方でみられた。

例５例１で記載されたようにＧＸ７８０５と命名されたグループＧのストレプトコッカス臨床単離物から染色体ＤＮＡを単離した。ＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍで消化し、標準的条件下１％アガロースゲル中で電気泳動に付した。この目的におけるＨｉｎｄｍの有用性はｐＧＸ４５３３の制限分析により示され（第１及び２図）、それによってＢｉｎｄｌｌＩ部位が大腸菌中においてマルチコピープラスミド上で更に大きな断片の確立を妨げることに関与することが示された隣接下流配列からプロティンＧ遺伝子を分離していることが調べられた。電気泳動後、ＤＮＡ断片をサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ジャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー、第９８巻、第５０３頁、１９７５年で記載されたようにニトロセルロースに移した。プロティンＧコード配列を含んだ約２．４ｋｂｐバンドは、初めにストレプトコッカス株ＧＸ７８０９から単離された第２図で示される１、９ｋｂｐ　Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ断片からなる放射性同位元素標識プローブとのハイブリッド形成により位置決めされた。１゜９　ｋｂｐ断片プローブをアガロースゲル電気泳動で精製し、例１で記載されたようにゲルから溶離させ、しかる後本質的にリグビー（Ｒｌｇｂｙ）ら、ジャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー、第１１３巻。

第２３７頁、１９７７年で記載されたニックトランスレージジンにより３２Ｐで放射性同位元素標識した。Ｉ・イブリッド形成は、本質的にウオール（νａｈｌ）ら〔プロシーディング・オブ・ナシヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７６巻、第３６８３−３６８７頁。

１９７９年〕で記載されたように行った。ハイブリッド形成と非ハイブリッド形成プローブを除去するだめの洗浄との後で、放射性バンドはオートラジオグラフィーによると２．４ｋｂｐの長さに相当する位置に存在していた。

同様のＧＸ７８０５染色体ＤＮＡの更に大きなサンプル（６μΩ）をエンドヌクレアーゼＨｉｎｃ１ｍで消化し、断片を１％アガロースゲル電気泳動で分離した（０．３５ボルト／ｃｌＴｌで１６時間）。臭化エチジウムで染色後、長さ２〜３　ｋｂｐのバンド（エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｍ消化バクテリオファージλ ＤＮＡからなる標準と比較して位置づけられる）を含んだゲルの一部をＤＮＡの回収に役立つよう切出して粉砕した。ＤＮＡを例１で記載されたようなフェノール抽出後に回収した。

プラスミドベクターｐＧＸ１０６６ＤＮＡ　（１Ｍｇ）をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）による反応混合物の抽出後、４Ｍ　ＬｉＣ１０，１倍容量、１１０１ｕ　ＥＤＴＡ、グリコーゲンキャリア２０μｇ及び９５％エタノール２．５倍容量を加えることによりＤＮＡを沈降させた。消化ベクターＤＮＡ０．４ＭｇをＧＸ７８０５ＤＮＡの回収Ｈｉ　ｎ　ｄｍ断片（染色体ＤＮＡ６μｇから回収された物質の９０％）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ〔コネチカット州ニューヘーブンのインターナショナル・バイオチクノロシース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）　）と共に製造者の勧めによる結合条件下１５℃で１６時間にわたり２０μｇ中でインキュベートした。

大腸菌５Ｋ２２６７細胞を例１で記載されたように結合ＤＮＡ１５μｇで形質転換し、形質転換細胞をコロニー免疫アッセイブレート上におき、例１で記載されたように免疫グロブリン結合タンパク質の産生に関して試験した。陽性コロニーを同定した。この形質転換株から単離されたプラスミドＤＮＡは、２．４ｋｂｐのＤＮＡインサートを有するｐＧＸ１０６６からなることがわかった。

インサートを含むエンドヌクレアーゼＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌｌ＋断片をバクテリオファージＭ１３ｍｐ９ベクターでサブクローニングした。２．４ｋｂｐ　Ｈｉ　ｎ　ｄｍ断片のＤＮＡ配列を調べ、第９図で示している。

例６好ましい形のプロティンＧは、活性Ｂ反復配列から上流及び下流のコード配列（例３）が欠失された遺伝子によってコードされている。プロティンＧの免疫グロブリン結合活性を示すこのようなタンパク質は、タンパク質分解に対して高い安定性を有している。

Ａ、上流配列の欠失上流配列の欠失を行うため、プラスミドｐＧＸ４５８２（例４）は最初に制限エンドヌクレアーゼＫｐｎｌに関して唯一の開裂部位を有するように修正した（第１１図参照）。ｐＧＸ４５８２のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで消化したが、これは双方ともへ反復配列がら上流の２つの部位で切断する。フェノール抽出及びエタノール沈降の後、直鎖プラスミド断片をエンドヌクレアーゼＫｐｎＴに関する認識部位を有した配列５°Ｐ−ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＧの５゛− ホスホリル化自己相補性オリゴヌクレオチドの存在中結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼとの処理により再環化した。結合ＤＮＡを用いて大腸菌特表千３−５０１８０１　（１８）ＳＫ２２６７を形質転換し、唯一のＫｐｒ＋１部位を獲得した所望構造のプラスミドを含むアンピシリン耐性形質転換株を単離した。このプラスミドはｐＧＸ４５９０と命名した。

次いで、ｐＧＸ４５９ｏ上に保有された修正プロティンＧ遺伝子をバクテリオファージＮ１１３ベクターに移した。ｐＧＸ４５９０のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳｍａ　Ｉ及び５ａｉｌで消化したが、これらは完全プロティンＧコード遺伝子を含んだ断片を切出す。バタテリオファージＭ１３ｍｐ８の二本鎖ＲＦ　ＤＮＡもＳｍａ　Ｉ及び５ａｉｌで消化し、双方の消化ＤＮＡ調製物をフェノールで抽出し、エタノールで沈降させた。次いで、２つの調製物を混合し、結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換し、クローンを適切なサイズのインサート断片の存在に関してスクリーニングした。所望の断片を含むクローンを同定し、ｍＧＸ８４３４と命名した。

次いで、第二のＫｐｎ１部位をｍＧＸ８４３４上に保有されたプロティンＧコード配列中にオリゴヌクレオチド突然変異誘発技術によって作った。オリゴヌクレオチドは下記配列：５　’　−ＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧから合成したが、これはドメインＢ１についてコードするものに隣接したｍＧＸ８４３４上に保有される配列と相補的であるけれども、但しエンドヌクレアーゼＫｐｎｌに関する認識部位たる６ヌクレオチドのインサートを有している。鋳型としてファージｍＧＸ８４３４から単離された一本鎖標準ＤＮＡ及びプライマーとして上記オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＲＦ　ＤＮＡを標準的方法によりインビトロで合成した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換し、クローンを第二Ｋｐｎ１部位の存在に関してスクリーニングした。

所望構造のクローンを同定し、ｍＧＸ８４４１と命名した。

ｍＧＸ８４４１のＤＮＡは、両者間の配列欠失が第一部位より上流の配列と第二より下流の配列との枠内融合を生じるような方法で、双方とも上記のように作られた２つのＫｐｎ１部位を含んでいる。この欠失は、ｍＧＸ８４４１のＲＦ　ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫｐｎＩで消化し、所望のＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈降し、しかる後結合条件下で希釈溶液中７４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートして更に大きなＲＦ断片を再環化することにより行った。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換し、クローンを小さなＫｐｎｌ断片の欠失に関してスクリーニングした。所望構造のクローンをｍＧＸ８４４２と命名した。欠失部位におけるｍＧＸ８４４２の構造をＤＮＡ配列決定により確認した。それは、そのＮ末端からプロティンＧのアミノ酸残基Ａ１ａ３８までｐＧＸ４５８２でしかる後配列Ｇ１ｙＴｙｒＰｒｏでコードされ、ＫｐｎＩ認識配列しかる後ｐＧＸ４５８２の配列Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＴｈｒＡｓｐ　（ドメインＢ１の前）及びｐＧＸ４５８２のコード配列の残部でコードされた場合と同一であると予想されるタンパク質についてコードしている。

Ｂ、ズブチリスにおけるｍＧＸ８４４２のコード配列を確立するため、プラスミドｐ　ＧＸ４３７０をベクターとして用いた。このプラスミドはＰ、ブライアン（Ｐ、Ｂｒｙａｎ）らの米国特許出願第８２８，５４５号明細書（１９８６年２月１２日付出１１）で記載されたプラスミドｐＧＸ４３１２と類似しているが、但しそれはＢ、アミロリクエファシェンスのズブチリシンコード遺伝子から得られる配列を更に含んでいる。これらの配列は、プロモーター、翻訳開始配列及び分泌シグナル配列、しかる後ＢａｍＨＩ認識配列を含んでいる。それらは、例４で記載されたｐＧＸ２１３４から得られる。ベクターはＢ、ズブチリス及び大腸菌の双方において活性な複製源と双方の生物において選択可能なマーカー（Ｂ、ズブチリスにおけるカナマイシン耐性及び大腸菌におけるアンピシリン耐性）も含んでいる。プラスミドｐＧＸ４３７０ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ［［で消化し、フェノール抽出し、エタノール沈降させた。同様に、ｍＧＸ８４４２ＲＦ　ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｍで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈降させた。消化ＤＮＡ調製物を混合し、結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望構造のアンピシリン耐性形質転換株を制限分析により同定し、ｐＧＸ４５９５と命名した。次いで、プラスミドｐＧＸ４５９５ＤＮＡを用いてＢ、ズブチリスＧＸ８００８の原形質体を形質転換した。ＧＸ８４４６と命名されたカナマイシン耐性形質転換株は、前記例４で記載された場合と同様の分析によるとプロティンＧの免疫グロブリン結合活性があるタンパク質を産生ずることが示されたが、このタンパク質は細胞外媒体及び細胞溶解物分画の双方において検出することができる。

Ｂ、下流配列の欠失下流配列が様々に欠失された組立てのための出発点は、エンドヌクレアーゼＸｈｏ７に関する部位がオリゴヌクレオチド突然変異誘発によってドメインＢ２についてコードする配列の後に挿入されたｍＧＸ７８７２　（例４）の誘導体であった（第１２図参照）。この目的のため、オリゴヌクレオチドは下記配列：５　’−ＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＡＡＣＣから合成したが、これはドメインＢ２についてコードす特表千３−５０１８０１　（１９）るものからすぐ下流のｍＧＸ７８７２上におけるプロティンＧコード配列と相補的であるけれども、但しＸｈｏ１部位を作る３ヌクレオチドのインサートを有している。鋳型としてｍＧＸ７８７２から単離された一本鎖ＤＮＡ及びプライマーとしてこのオリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＲＦ　ＤＮＡを標準的方法によりインビト。で合成し、大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換するために用いた。クローンをＸｈｏＩ部位の存在に関してスクリーニングし、所望構造のクローンをｍＧＸ７８７５と命名した。ｍＧＸ７８７５における変更配列はＤＮＡ配列決定により確認され、所望どおりであることが示された。

次いで、前記ｍＧＸ８４３４中に挿入された第二ＫｐｎＩ部位と類似した位置で、ｍＧＸ７８７５中のドメインＢ１についてコードする配列近辺にＫｐｎ　Ｉ部位を挿入した。前記の場合（ｍＧＸ８４４１の組立てに関する）と同様のオリゴヌクレオチド及び方法を用いた。

所望構造のクローンを同定し、ｍＧＸ８４４７と命名した。

次いで、ｍＧ、Ｘ８４４７から得られる下流配列を用いて、ｐＧＸ４５９５中に存在する配列を置き換えた。この目的のため、ｍＧＸ８４４７のＲＦ　ＤＮＡ及びｐＧＸ４５９５のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫｐｎｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで別々に消化し、フェノール抽出し、エタノール沈降させた。消化ＤＮＡ調製物を混合し、結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。

結合ＤＮＡを用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望構造のプラスミドを有するアンピシリン耐性形質転換株を制限分析により同定し、ｐ、ＧＸ４５９６と命名した。このプラスミドはｐＧＸ４５９５に類似しているが、但しプロティンＧの活性部分についてコードする配列及び下流配列（Ｂｌより前のＫｐｎ１部位からＣ末端コード配列の後のＨｉｎｄｌＩ［部位まで）はｍＧＸ８４４７から得ている。

次いで、プラスミドｐＧＸ４５９６を下流配列を含めた様々な欠失に関する出発点として用いた。最初にｐ　Ｇ　Ｘ　４５９６　Ｄ　Ｎ　Ａを、ドメインＢ２についてコードする配列の下流末端近くにおいて、前記オリゴヌクレオチド突然変異誘発により作られた部位で切断するエンドヌクレアーゼＸｈｏｌとコード配列の末端から下流で切断するＨｉｎｄｍとで消化した。この消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲル上のプレバラテイブ電気泳動分別に付し、得られた２つの断片のうち大きな方をゲルから溶離し、回収した。下記構造の二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを組立てた：５°Ｐ−ＴＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＡ−５’　ＰｐＧＸ４５９６から得られる精製された大きなＸｈ。

１−Ｈｉｎｄｍ断片をこのアダプターの存在下で再環化ｌ、だが、その一本鎖末端は大きな断片の一本鎖末端と相補的である。これは、結合条件下Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼの存在中における断片及びアダプターと一緒のインキュベートにより行った。結合ＤＮＡを用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望構造のプラスミドを有するアンピシリン耐性形質転換株をアダプター配列中に存在するエンドヌクレアーゼｐｖｕ　Ｉ部位の存在に関するスクリーニングによって同定した。このプラスミドをｐＧＸ４５９７と命名した。それは、下記デザイン構造の端部切除プロティンＧ遺伝子を有している：、　、ＣＢ２）　）ＩｅｔＶａｌＴｈｒＧｌｕＶａｌＰｒｏＡｒｇＳｅｒＣｙｓＥＮＤ、　、　ＡＴＧＧＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＴ　、　。

この組立てにおいて合成アダプターでコードされるＣ末端Ｃｙｓ残基は、この遺伝子でコードされるプロティンＧ配列中において唯一である。関連業界の当業者であれば、固体マトリックス上にタンパク質を固定しうるか又は様々な化学的官能物質もしくは他のタンパク質をそれに付着させうるように考えられた部位のように、化学反応が生じうる好ましい部位をかかる唯一の残基が与えると認識するであろう。

第二の下流欠失は、反復Ｃ５から下流の配列を含んでいた。この組立てでは、第８図で示されたＤＮＡ配列の残基１８１５においてその配列から得られるエンドヌクレアーゼＸｍｎ１Ｍ位を用いた。プラスミドｐＧｘ４５９６は、合計４つのＸｍｎ　１部位を含んでいる。プロティンＧコード配列において所望の部位のみで開裂される分子を得るため、ｐＧＸ４５９６ＤＮＡ　（５μｇ／ｍｌ）を臭化エチジウム（４０μｇ／ｍｌ）の存在下３７℃で６０分間ＸｍｎＩ（１００単位／　ｍｌ　）による部分的消化に付した。これらの条件下において、消化は主に単一の開裂に制限され、その結果部位４つのうちいずれか１つでの開裂により生じる直鎖分子の混合群を与える。この消化ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：　２４　：　１）で抽出し、エタノールで沈降させ、臭化エチジウム及びＸｍｎ　Ｉ酵素の双方を除去した。次いで、混合直鎖ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩ［で消化した。Ｈｉｎｄｍ部位は、他のＸｍｎ１部位のいずれよりもプロティンＧコード配列中のＸｍｎ１部位の近くに位置している。したがって、Ｈｉｎｄｍでの混合Ｘｍｎ１直鎖群の消化により得られる最大のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｍｎｌ断片は、プロティンＧコード配列中Ｘｍｎ　１部位のみで切断されたｐＧＸ４５９６分子から得る。この断片を０．　７％アガロースゲル上のプレバラティブ電気泳動分別により精製した。最少移動性のバンドを切出し、ゲルから溶離させ、回収した。

下記構造の二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを組立てた：特表千３−５０１８０１　（２０）５°Ｐ−ＴＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＡＴＴＣＣＡ−５°Ｐこのオリゴヌクレオチドの一本鎖末端は、ＨｉｎｄＩ［Ｉ開裂で得たｐＧＸ４５９６断片の一本鎖末端と相補的である。精製断片を結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼとのインキュベートによりこのアダプターの存在下で再環化させた。結合ＤＮＡを用いて大ＢｍＳｇ２２６７を形質転換し、所望構造のプラスミドを有するアンピシリン耐性形質転換株を制限分析により同定した。このプラスミドをｐＧＸ４５９９と命名した。それは、下記デザイン構造の端部切除プロティンＧ遺伝子を有している：、　、［Ｃ５：］　ＡＩａＧｌｕＴｈｒＡｌａＧ］ｙＥＮＤ、　、　ＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＣＴＡＡＧＣＴＴ、　。

プラスミドｐＧＸ４５９７及びｐＧＸ４５９９を別々に用いて、Ｂ、ズブチリスＧＸ８００８の原形質体を形質転換させた。カナマイシン耐性形質転換株を選択し、ＧＸ８４５５　（ｐＧＸ４５９７）及びＧＸ８４５７（ｐ　ＧＸ４５９９）と命名した。双方の株が、プロティンＧの免疫グロブリン結合活性のあるタンパク質を合成することがわかったが、双方の場合においてこの、タンパク質は細胞外媒体及び細胞溶解物分画の双方で検出された。

例７様々な欠失のあるプロティンＧ遺伝子の誘導体を大腸菌内での有利な発現のために調節プロモーター系に融合させた。用いたプロモーターはインビトロ方法で組立てられたハイブリッドバクテリオファージスプロモーター（ＯＬＰＲ）であり、マツグ−−−（Ｍｃｋｅｎｎｅｙ）らの米国特許出願節５３４，９８２号明細書（１９８３年９月２３日付出願）で記載されている。このプロモーターはプラスミドｐＧＸ２６０６上に保有されており、これは下記位置でＢａｍ）部位と共にファージλｃｒｏ遺伝子の翻訳開始位置を含んでいる：翻訳ファージｍＧＸ７８７７　（例４）から得られる“Ｂドメイン”についてコードする配列を大腸菌発現ベクターｐＧＸ２６０６に融合させるため、ＢａｍＨ１部位をオリゴヌクレオチドのインビトロ突然変異誘発によりｍＧＸ７８７７ＤＮＡ中に正確な枠内で挿入した（第１４図参照）。下記オリゴヌクレオチドを合成した：このオリゴヌクレオチドの３列はドメインＡ２及び８１間の領域についてコードするｍＧＸ７８７７中の配列と相補的であるが、但しｐＧＸ２６０６中の発現シグナルとの後の融合のために正確な枠内でエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに関するＬＥ　識部位である６タクレオチドのインサートを含んでいる。

このオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、インビトロで一本鎖ｍＧＸ７８７７ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換した。得られた二本鎖ＤＮＡを用いて、大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換した。プラークの感染細胞から回収されたＲＦ　ＤＮＡをＢａｍＨＩの存在に関してスクリーニングした。所望構造のものをｍＧＸ７８９３と命名した。

ｍ　Ｇ　Ｘ　７８９　Ｂの二本ｊＪＩＲＦ　ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩ［で消化し、消化ＤＮＡをアガロースゲル（１％）電気泳動で分別した。プロティンＧのＢ１及びＢ２ドメインについてコードする配列を含む得られた２つの直鎮ＤＮＡバンドのうち小さな方をゲルから溶離させて回収した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ［［で消化し、長い方の直鎖断片をフェノール抽出及びエタノール沈降によって回収した。精製ｍＧＸ７８９３断片を回収されたｐＧＸ２６０６ＤＮＡと混合し、結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、３０℃でアンピシリン耐性に関して選択した。

形質転換株を例７で記載されたように４２℃でＩｇＧ結合結合タンパ炭質産生しスクリーニングした。１つの陽性形質転換株をＧＸ８４３６と命名したが、これは所望構造のプラスミドｐＧＸ４５９２を含むことがわかった。

ＤＮＡ配列決定で直接確認されたｐＧＸ４５９２のＮ末端コード配列は下記のとおりである：ＡＣＴ　ＧＡＣＡＣＴ　ＴＡＣ、、。

このプロティンＧ変異体についてコードする完全遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：適切な醗酵条件下において発現を４２℃で誘導し、３９℃で継続したところ、ＧＸ８４３６株はヒトＩｇＧとの結合活性のある予想されたサイズのタンパク質を産生ずることが示された。このタンパク質はプロティンＧ変異体タイプ１と命名された。この変異体のアミノ酸配列は下記のとおりである：例８様々な欠失のあるプロティンＧ遺伝子の誘導体を大腸菌内での有利な発現のために調節プロモーター系に融合させた。用いたプロモーターはインビトロ方法で組立てられたハイブリッドバクテリオファージスプロモーター（ＯＬ　Ｐ　Ｒ）であり、マツケ二一らの米国特許出願第５３４．９８２号明細書（１９８３年９月２３日付出願）で記載されている。このプロモーターはプラスミドｐＧＸ２６０６上に保有されており、これは下記位置でＢａｍＴ部位と共にファージλｃｒｏ遺伝子の翻訳開始位置を含んでいる：翻訳ベクターｐＧＸ２６０６のＢａｍＨ１部位でｐｃｘ４５９７及びｐＧＸ４５９９上に保有される遺伝子から得られる修正プロティンＧ遺伝子を融合させるため、ＢａｍＨＩ部位をこれらプラスミドの唯一のＫｐｎＩ部位でｐＧＸ４５９７及びｐＧＸ４５９９中に作った。この目的のため、下記構造の自己相補性オリゴヌクレオチドリンカーを合成した：５°Ｐ−ＧＣＡＴＣＣＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧ−５°Ｐこの二本鎖リンカ−の一本鎖末端はエンドヌクレアーゼＫｐｎｌでのプラスミド消化により得られる一本鎖末端と相補的であるが、但しリンカ−はエンドヌクレアーゼＢａｍＨＴに関する認識部位を含んでいる。

プラスミドｐＧＸ４５９７及びｐＧＸ４５９９のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫｐｎｌで別々に消化し、フェノール抽出し、エタノール沈降させた（第１３図参照）。次いで、消化ＤＮＡＭ製物を結合条件下でホスホリル化リンカ−オリゴヌクレオチド及びＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。ＤＮＡリガーゼを７０℃で３分間のインキュベートにより不活化し、しかる後エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで消化した。次いで、各消化ＤＮＡ１製物を１％アガロースゲル上でプレバラティブ電気泳動分別に付した。長さ４００〜７００ｂｐに相当する移動性の断片を切出し、ゲルから抽出し、回収した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮＡをエンドヌクレアーゼ３ａｍＨ，１及びＨｉｎｄｍで消化Ｌ、０．７％アガロースゲル上でプレバラティブ電気泳動に付し、小さなりａｍＨＩ−ＨｉｎｃｌｌＩＩ断片を除去した。大きな方のバンドを切出１５、溶離し、回収した。

回収されたｐＧＸ２６０６断片を回収ｐＧＸ４５９７及びｐＧＸ４５９９断片と別々に混合し、結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡ調製物を別々に用いて大腸菌ＧＸ１２０１（ｎａｄＡ：：ＴｎｌＯδ４　（ｃｈｌＤ−ｂｌｕ）（λｃ１８５７δＢａｍＨＩ））を形質転換しタカ、ファージλ溶原は熱不安定リプレッサータンパク質についてコードするｃ　１８５７遺伝子を有している。形質転換株を３０℃でアンピシリン耐性に関し選択し、例１で記載された免疫アッセイ操作のバリエーションによりスクリーニングした。細胞を標準栄養寒天プレートにおけるニトロセルロースフィルター上の酢酸セルロースフィルターで３０℃にて増殖させた。肉眼でみえるコロニーが出現した後、プレートを４２℃で４〜６時間インキュベー）Ｌ、ｌ、かる後ニトロセルロースフィルターを例１で記載されたように展開した。この方法で同定された陽性形質転換株は、制限分析によると所望構造のプラスミドを含むことがわかった。

ｐＧＸ４５９７Ｇ来配列を含むプラスミドをｐＧＸ５２０３と命名し、このプラスミドを含む大腸菌株をＧＸ８４６４と命名した。ｐＧＸ４５９９Ｇ来配列を含むプラスミドをｐＧＸ５２０４と命名し、このプラスミドを含む大腸菌株をＧＸ８４６５と命名した。

ｐＧＸ５２０３及びｐＧＸ５２０４で保有される修正プロティンＧ遺伝子に関してデザインされた構造は、Ｎ末端において同一である：ｆ）４ｅｔＡｓｐＰｒｏＴｙｒＰｒｏＬｅｕＰｒｏＬｙｓ、　、　、　ＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＴＴＡＣＣＴＡＡＧＡＴｈｒＡｓｐ　［Ｂ１）　、　、　。

ＣＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣ、、。

Ｃ末端配列は、ｐＧＸ４５９７及びｐ　ＧＸ４５９９の場合と各々同一であった（例６）。

ＧＸ８４６４及びＧＸ８４６５の双方は、プロティンＧの免疫グロブリン結合活性をもつタンパク質変異体を産生ずることが示された。加えて、双方の株は高い産生能を示し、細菌培養物１ｇ当たりで回収されるプロティンＧ様物質的２００　ｍｇを産生じた。このタンパク質の合成は３０℃で抑制され４２℃で誘導されることがわかり、その調節様式はｃ　１８５７遺伝子でコードされる熱不安定リプレッサーの存在中ハイブリッドファージスプロモーターＯＬ　Ｐ　Ｒのコントロール下に遺伝子があると予想された。

ＧＸ８４６５から産生されるプロティンＧ変異体（タイプ２）のアミノ酸配列は下記のとおりである：このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：ＡＣＴＴ白ｃＱＩ：ｉＱｃ　ＴＴＧＴＴＡＴＴＩＱＱ　Ｔ１３ＧＴＧＩＱＡｌ：ＩＣＩ’ｌ　ＴＴＧＡＱＡＧＧＣＧ　Ｇ３１ＱＣＱＱＣＴＱbＴＡＱＱＧＣＱＧＴＱＧＸ８４６４から産生されるプロティンＧ変異体（タイプ３）のアミノ酸配列は下記のとおりである：このプロティンＧ変異体（タイプ３）についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである一例９プラスミドｐＧＸ４５９９を用いて大＆ｈ菌ＧＭ２７２を形質転換したが、これはｄａｍメチラーゼを欠いた株である。１つのかかる形質転換株から得られたプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで消化した。

このＤＮＡにおけるｃｌａｍ誘導メチル化の非存在のせいで、消化により２つの断片を生じた。これらの断片をフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。

下記配列の合成自己相補性オリゴヌクレオチドアダプターを組立てた：５°−ＣＧＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧ−３゜３’−ＧＣＡＣＣＴＡＧＣＴＣＣＧＣ−５’この二本鎖オリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼＣ１ａｌで得られるものと相補的な一本鎖末端を有しており、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに関する認識配列を含んでいる。

５゛−ホスホリル化オリゴヌクレオチドアダプターを回収されたＩ）ＧＸ４５９９ＤＮＡ断片と混合した。混合物を結合条件下的１０μｇ　／　ｍｌのＤＮＡ５ｔ度でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合後、再環化ＤＮＡを用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、アンピシリン耐性に関して選択した。

２つの断片のうち１つのみが大腸菌内で活性な複製源及び選択可能なアンピシリン耐性マーカーを含んでおり、その結果この断片を含む再環化ＤＮＡのみが大腸菌を形質転換できる。形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析によってスクリーニングし、所望構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４１）を含む株を同定した。

プラスミドｐＧＸ５２４１及びｐＧＸ２６０６を双方ともエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化した。消化ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。２つの消化プラスミドをＤＮＡ約５０μｇ　／　ｎｅｔで結合緩衝液中において混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で結合させた。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、３０℃でアンピシリン耐性に関し選択し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリーニングした。所望構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４５）を含む株をＧＸ８８２２株と命名した。正確な構造はＤＮＡ配列決定で確認した。このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：ＧＸ８ｇ２２株はヒトＩｇＧと結合しうる能力をもつ予想されたサイズのタンパク質を産生ずることがわかった。このプロティンＧ変異体は、単一１ｇＧ結合配列Ｂ２　（ＧＸ７８０９プロティンＧから）、隣接プロリン豊富領域及び“Ｃ反復配列“を含んでいる。このプロティンＧ変異体タイプ５に関して予想されるアミノ酸配列は下記のとおりであるニプラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで消化し、長い直鎖断片を１％アガロースゲル上での電気泳動分別及びゲルから精製断片の溶離により単離した。プラスミドｐＧＸ４５８４　（、ストレプトコッカスＧＸ７８０５から単離されたプロティンＧ遺伝子を含む２．４ｋｂｐのＤＮＡインサート＋ベクターｐＧＸ１０６６からなる；例５参照）のＤＮＡをプロティンＧの＋ｇＧ結合ドメインについてコードする領域から得られる４２０ｂｐ断片の十分量が存在するような条件下でＰｓｔｌによる部分的消化に付した。この４２０ｂｐＰｓｔｌ断片をアガロースゲル（１，５％）電気亦動及びゲルからの’ｆ３Ｍにより単離した。

ｐＧＸ５２０４の長いＰｓｔｌ断片及びｐｃｘ４５８３からの４２０ｂｐＰｓｔ１部分的消化断片を混合ｔ、、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析でスクリーニングした。２つのタイプのプラスミドを同定した。１つ（ｐ　Ｇ　Ｘ５２４７）は、ｐＧＸ５２０４中に存在する２１０ｂｐ断片をｐＧＸ４５８Ｂの４２０ｂｐＰ　ｓ　ｔ　Ｉ断片に代えることによりプラスミドｐＧＸ５２０４から得られた。

ｐＧＸ５２４７を含む株をＧＸ８８２５と命名したが、予想されたサイズのＩｇＧ結合タンパク質を産生ずることが示された。このタンパク質の予想構造は下記のとおりである：このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子（タイプ６）のＤＮＡ配列は下記のとおりである：本配列は、ストレプトコッカスＧＸ７８０５力）ら得られるプロティンＧの場合と同一のアミノ酸配夕１ｊたる３つの“Ｂ反復配列“、隣接プロリン豊富領域及びプロティンＧの“Ｃ反復配列”を含んでいる。

上記形質転換株の中から単離されたプラスミド（ｐＧＸ５２４６）の第二タイプは、インサートのな０長いＰｓｔｌ断片の再環化によりｐＧＸ５２０４力１ら１＠た。したがって、このプラスミドにお（′１て（Ａ　ｐ　Ｇ　Ｘ５２０４の短い２１０ｂｐＰｓｔｌ断片刃（欠失して０る。

ｐＧＸ５２４６を含む株はＧＸ８８２４と命名した。

ＧＸ８８２４　（、タイプ１１）で産生されるタンノくり質の予想構造は以下で示されている：二のプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子（タイプ１１）のＤＮＡ配列は下記のとおりである：この配列は、ＧＸ７８０９プロティンＧの配列Ｂ１及びＢ２から得られる配列のキメラである単一の“Ｂ反復。

配列を含んでいる。

例１１プロティンＧ変異体タイプ７についてコードするプロティンＧ遺伝子の組立てプラスミドｐＧＸ４５９５を用いて大腸菌ＧＭ２７２を形質転換したが、これはｄａｍメチラーゼを欠いた株である。１つのかかる形質転換株から得られたプラスミ特表乎３−５０１８０１　（２４）ドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで消化した。

゛このＤＮＡにおけるｄａｍ誘導メチル化の非存在のせいで、消化により２つの断片を生じた。これらの断片をフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。

下記配列の合成自己相補性オリゴヌクレオチドアダプターを組立てた：５°−ＣＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧ−３゜３°−ＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＣ−５’この二本鎖オリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼＣｏａｌで得られるものと相補的な一本鎖末端を有しており、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１に関する認識配列を含んでいる。

５゛−ホスホリル化オリゴヌクレオチドアダプターを回収されたｐＧＸ４５９５ＤＮＡ断片と混合した。混合物を結合条件下的１０μｇ　／　ｍｌのＤＮＡ濃度でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合後、再環化ＤＮＡを用いて大Ｉｌ＋％菌５Ｋ２２６７を形質転換し、アンピシリン耐性に関して選択した。２つの断片のうち１つのみが大腸菌内で活性な複製源及び選択可能なアンピシリン耐性マーカーを含んでおり、その結果こ・の断片を含む再環化ＤＮＡのみが大腸菌を形質転換できる。形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析によってスクリーニングし、所望構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４０）を含む株を同定１５た。

プラスミドｐＧＸ５２４０及びｐＧＸ２６０６を双方ともエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍ及びＢａｍＨｌで消化した。消化ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。２つの消化プラスミドをＤＮＡ約５０μｇ　／　ｍｌで結合緩衝液中において混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で結合させた。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、３０℃でアンピシリン耐性に関し選択し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリーニングした。所望構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４４）を含む株をＧＸ８８２１株と命名した。正確な構造はＤＮＡ配列決定で確認した。このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：ＧＸ８８２１株はヒトＩｇＧと結合しうる能力をもつ予想されたサイズのタンパク質を産生ずることがわかった。このタンパク質の予想構造は下記のとおりである：この構造は、単一のＩｇＧ結合配列Ｂ２（ＧＸ７８０９プロティンＧから）及び天然タンパク質のＣ末端かう得られるいくつかのアミノ酸残基を含んでいる。

プラスミドｐＧＸ５２０４のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍで消化し、直鎖ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。下記配列の自己相補性合成りＮＡリンカ−を組立てた：５’−ＡＣＣＴＴＡにＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＡ−３′３°−ＡＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡ−５゜この二本鎖オリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼＢｉｎｄｍで得られるものと相補的な一本鎖末端及びエンドヌクレアーゼ３ｔｕｌに関する認識配列を有している。直鎖化ｐＧＸ５２０４ＤＮＡを結合緩衝液中で５゛−ホスホリル化オリゴヌクレオチドと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸１１ＧＸ１２０１を形質転換し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析により（Ｓ　ｔ　ｕ　１部位の存在に関して）スクリーニングした。所望プラスミド（ｐＧＸ５２５４）を含む形質転換株を同定した。

ｐＧＸ５２５４のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＮａｅＩで消化した。消化は不完全であることがわかり、そのため直鎖ＤＮＡをアガロースゲル（１％）電気泳動によって消化物から精製し、ゲルから溶離させ、回収した。

次いで、回収された直鎖分子をＳ　ｔ　１４１で消化し、長い直鎖断片をフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。これら酵素は双方ともプラント末端を残す。次いで、直鎖ＤＮＡを約コ０μｇ　／　ｍｌで結合緩衝液中Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒のインキュベートにより再環化させた。ＤＮＡ構造に関する所望の結果は下記のとおりである：ズコへにゴ１．。

枠内融合が形成されるが、その結果はｐＧＸ５２０４でコードされるタンパク質のＣ末端Ｇ　Ｉ　Ｙに代わりＣ末端でＰｒｏＳｅｒＣｙｓ配列を有していることである。

再環化ＤＮＡを用いて大腸ｍＧＸ１２０１を形質転換し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析により（ＮａｅＩ部位の欠失に関して）スクリーニングした。

所望構造（ｐＧＸ５２５５）の株をＧＸ８８３３株と命名した。この株は、Ｃｙｓ残基約１／分子をもつ予想されたサイズのＩｇＧ結合タンパク質を産生ずることが示された。ｐＧＸ５２５５のＣ末端コード領域の構造は、ＤＮＡ配列決定で直接確認された。

このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：この遺伝子から発現されるプロティンＧ変異体の予想アミノ酸配列は下記のとおりであるニブロチインＧ変異体タイプ９についてコードするプロティンＧ遺伝子の組立てプラスミドｐＧＸ５２０４のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌＩＩで消化し、直鎖ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。下記配列の二本鎖合成りＮＡクリンカを組立てた：この二本鎖オリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｍで得られるものと相補的な一本鎖末端及びエンドヌクレアーゼＨｐａｌ及びＰｖｕＩＩに関する認識配列を有している。直鎖化ｐＧＸ５２０４ＤＮＡを結合緩衝液中で５゛−ホスホリル化オリゴヌクレオチドと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートレニ。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析により（Ｐｖｕ■部位の存在に関して）スクリーニングした。リンカ−は、直鎮化プラスミドＤＮＡ１；２つの向きのいずれかで結合することができる。したがって、リンカ−（Ｐｖｕｎ部位）を獲得したプラスミドを含むいくつかの形質転換株を同定したが、その一部は望ましい向きでリンカ−を含むと予想された（例えば、ｐＧＸ５２６７）。

ｐＧＸ５２６７のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＨｐａ１で消化し、直鎖ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。次いで、直鎖ＤＮＡを約１０μｇ　／　ｍｌで結合緩衝液中１４ＤＮＡリガーゼと一緒のインキュベートにより再環化させた。ＤＮＡ構造に関して望まれる結果は下記のとおりである：膠　ご　込ゴー枠内融合が形成されるが、その結果はＧＸ５２０４コードタンパク質中に存在するＣ反復配列を欠失しかつＣ末端で５ｅｒＣｙｓ配列に置き換わっていることである。

これでタンパク質中に唯一のＣｙｓ残基を生じる。リンカ−が反対向きで存在する場合には、２つのＨｐａ１部色間の欠失でＰｖｕ１１部位及びＨｉｎｄｍ部位を除去することに留意せよ。

再環化ＤＮＡを用いて大腸ｍＧＸ１２０１を形質転換し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析により（プロティンＧコードε列を含むＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ■断片の短縮に関して）スクリーニングした。いくつかのかかる欠失プラスミドを同定した。いずれが望ましい向きでＤＮＡリンカ−を本源的に獲得したかについて調べるため、プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｖｕＩ［部位の存在に関してスクリーニングした。所望構造（ｐＧＸ５２６８）の株をＧＸ８８４６株と命名した。このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：この株から発現されるプロティンＧ変異体の予想アミノ酸配列は下記のとおりであるニプラスミドｐＧＸ４５９９を用いて大腸菌ＧＭ２７２を形質転換したが、これはｄａｍメチラーゼを欠いた株である。１つのかかる形質転換株から得られたプラスミドＤＮＡを十分量の完全鎖長直ｊＪ　Ｄ　Ｎ　Ａが形成される条件下において制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで部分的に消化した。ｐＧＸ４５９９中には２つのＣｌａｌ部位が存在する。このＤＮＡにおけるｄａｍ誘導メチル化の非存在のせいで、これらの部位は双方ともＣ１ａｌによる開裂に利用しうる。したがって、−回切断直鎖ＤＮＡには２つのタイプがある。この直鎖ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動分別及びゲルからの溶離しがる後エンドヌクレアーゼＸｈｏｌでの消化により精製した。こうして得られた最長断片を再度アガロースゲル電気泳動により＋ｌ′Ｆｉ製し、溶離させ、しがる後回収した。

下記配列の二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターを組立てた：５°−ＣＧＡＣＧＴＣＣＣ−３゜３°−ＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴ−５゜このオリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼＣ１ａＩ及びＸｈｏｌで各々得られるものと相補的な一本鎖末端並びにエンドヌクレアーゼＡａｔＵに関する認識配列を有している。

ｐＧＸ４５９９から精製されたＣ１ａｌ−ＸｈｏＩ断片を結合緩衝液中で５゛− ホスホリル化アダプターオリゴヌクレオチドと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキユベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α（Ｆ−、ｅｎｄＡｌ、ｈｓｄＲ１７，５ｕｐＥ４４゜ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡｌ、ｇｙｒＡ９６．ｒｅｌＡｌ。

６（ａｒｇＦ−１ａｃＺＹＡ）Ｕ１６９．ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺδＭ１５；ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製）を形質転換し、形質転換株をプラスミドＤＮＡの制限分析により（プロティンＧコード配列を含むＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍ断片のサイズ減少に関して）スクリーニングした。所望構造のプラスミド（ｐＧＸ５２６５）を含む株を同定した。

合成アダプターオリゴヌクレオチドにより直鎮分子のＣｏａｌ及びＸｈｏｌ末端を結合させて枠内融合させる：ζ、ａｍ　ＸｈＱ工ベクターｐＧＸ２６０６のＢａｍＨ１部位でｐｃｘ５２６５上に保有された修正プロティンＧ遺伝子を融合させるため、ＢａｍＨ１部位をそのプラスミドの唯一のＫｐｎ　１部位においてｐＧＸ５２６５上に作った。この目的のため、下記構造の自己相補性オリゴヌクレオチドリンカーを合成した：５°Ｐ−ＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＧＯＣＴＡＧＧ−５°Ｐこの二本鎖リンカ−の一本鎖末端はエンドヌクレアーゼＫｐｎｌでのプラスミドの消化により得られた一本鎖末端と相補的であって、リンカ−はエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに関する認識部位を含んでいる。

プラスミドｐＧＸ５２６５のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫｐｎｌで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈降させた。次いで、消化ＤＮＡ調製物を結合条件下でホスホリル化リンカ−オリゴヌクレオチド及びＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを７０℃で５分間のインキュベートにより不活化し、しかる後結合ＤＮＡＩ製物をエンドヌクレアーゼＢａｍＨ１及びＨ４ｎｄＩＩＩで消化した。次いで、消化ＤＮＡＥ製物を１．４％アガロースゲル上でプレバラティブ電気・泳動分別に付した。２つのＤＮＡ断片が臭化エチジウム染色ゲルで観察され、移動性の大きな方の断片を切出し、ゲルから抽出し、回収した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨ４ｎｄｍで消化し、大きな直鎖断片をフェノール抽出及びエタノール沈降により回収した。

回収されたｐＧＸ２６０６断片を回収ｐＧＸ５２６５断片と混合し、結合条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。結合ＤＮＡＩ製物を用いて、大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換した。形質転換株を３０℃でアンピシリン耐性に関し選択し、プラスミドＤＮＡの制限分析により（正確なサイズのＢａｍＨＩ− Ｈｉ　ｎｄｍ断片に関して）スクリーニングした。１つは、所望構造のプラスミドｐＧＸ５２６６を含むことがわかった。この株はＧＸ８８４４と命名した。

このプロティンＧ変異体についてコードする遺伝子のＤＮＡ配列は下記のとおりである：この株から発現されるプロティンＧ変異体の予想アミノ酸配列は下記のとおりである：英文テキスト第８１ａ、８１ｇ／ｌ、８１ｂ及び８１ｂ／１頁の抄訳寄託機関：　アメリカン６タイプ・カルチャー・コレクション住所：　１２３０１　パークローン、ドライブ、ロックビル、メリーランド、２０８５２、アメリカ合衆国微生物の表示　寄　託　日　受理番号大腸菌　ＧＸ７８２３　１９８６年２月１０日　ＡＴＣＣ５３４６１鳩菌　ＧＸ７８２０　１９８６年２月ユＯ日　ＡＴＣＣ５３４６０欧州特許取得がめられている指定締約国のために、寄託微生物の試料は、欧州特許の付与の告示の公表まで、あるいは当該出願が拒絶され又は取り下げられもしくは取り下げられたとみなされる日まで、該試料を請求した者への該試料の分与によってのみ入手可能とされる。

（ＥＰＣ蜆則２８　（４））。

浄書（内容に変更なし）＾＾ＧＣ丁ＴＴＧＧＴＧＧＡＧ＾＾＾ＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡ＾τＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＣ＾　５ＯＣＣＡＧ丁＾ＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴ了＾ＴＴＧＡＣＡＣＧＣＡＣＴＴＧＴＧＧＣＧＡＧＡＧＴ＾　１■Ｃ丁＾＾（：ＡＧＴＣＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＴ＾＾ＣＴＴＴ＾τＴＴＴＣＣＴＴ＾τ ＧＡＧＡＧＧＴ丁＾＾Ｇ＾＾　１父＾＾＾Ａ（：ＧＴ丁＾τＴ＾＾＾ＴＡＧＣＡＱ＾＾＾＾Ｇ＾＾τ＾ＴＴ＾τＧＡ（：ＴＧＡＣＧＴＴＡＧＧＡＧ丁丁　ンカＴＴＣＴＣＣＴ＾＾ＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧτ＾Ｃ＾＾＾＾＾ＧＡＧ＾＾ττＣＴＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴ＾　２５０＾＾＾Ｔ＾＾＾丁＾ＧＴＡＣＴＡＴＡＧＡＴＡＧ＾＾＾＾ＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴ＾＾＾＾＾ＧＴＣＴＴＱτＴτ　ｙカＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＡＡＡＡ丁ＣＡＴＴτ丁ＴＡＴＡ　３５０Ｃτ＾＾τＧ＾＾＾τ＾ＧＡＣ＾τ＾＾Ｇ’ Ｇ　ＣＴ＾＾＾ＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＧＧＡＧＡＴＴＴ　ベカ＾ＴττＧτ＾＾（ｉＧＡＴＴＣＣＴτ＾＾ＴＴＴＴＡＴＴ＾＾τＴＣ＾＾Ｃ＾＾＾＾＾ＴＴＧＡＴＡＧＡ＾＾Ａ　４５０ＡＴＴ＾＾＾τＧＧ＾＾ＴＣＣＴτＧ＾ τττ＾＾τＴＴＴＡＴＴ＾＾ＱＴＴＧ了＾τ＾＾τ＾＾＾＾＾ＧＴＧ　侃ＸＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＣＧＴＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴτＴＧＴＣＧＧＣＴＴＴＴ τＡＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧ　５５０浄書（内容に変更なし）浄書（７５；に変えなし）ＡＡＧＣＴＴＴＧＧτＧＧＡＧ＾＾ＡＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＣＡ　Ｓ。

ＩＧＢ＾Ｌ＾＾ＳＰＬευ丁ＨＲＡＬＡ＾Ｌ＾＾Ｌ＾ＶＡＬ＾Ｌ＾＾５ＰＴｌ−ＩＦＩＶＡＬＡＬＡＯＣＴ　ＧＡＴ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＧＣＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　８２６Ｆ／Ｇ、　８ＡＦＩＧ　８Ｂ浄ＩＦ（ＦＩＧに変更なし）〜　り　ψ　Ｑ　ロ　〜　Ｊａｒ　ψ　ロ　０　〜　５−　〜　１′−１＃　ψ 　ト　の　か　９　５　口　＝−＝姿　委　苔　誉　８　二　さ　２浄書（内容に変更なし）浄書（６容に変更なし）浄書（内存に変更なし）浄書（内存に変更なし）浄書（内存に変更なし）浄＠（，１′弓；に変３２なし）浄書（内容に彎ｆなし）臂ｄ舷ｌ内立Ｃ−々ンたＬ）１丁目＼ゝコＳ忙＋ス入−レＩ浄書（内各に変更なし）手続補正書（方式）％式％１　事件の表示ＰＵＴ／１１Ｓ　８Ｂ１０２０８４３　補正をする者事件との間係　特許出願人ジエネツクス、コーポレーション５　補正命令の日付発送日　平成　７年　７０月　９日６　補正の対象国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
２．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
３．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
４．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
５．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
６．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
７．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
８．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
９．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
１０．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
１１．プロテインＧ変異体についてコードする遺伝子であって、下記ＤＮＡ配列：【配列があります】又はその縮重変異体を含むことを特徴とする遺伝子。
１２．請求項１〜１１のいずれか一項に記載された遺伝子を含むベクター。
１３．請求項１２に記載されたベクターで形質転換された宿主。
１４．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
１５．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む′、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
１６．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
１７．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
１８．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
１９．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
２０．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
２１．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
２２．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
２３．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。
２４．下記アミノ酸配列：【配列があります】を含む、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するプロテインＧ変異体。