KR101044332B1 - 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시그널 펩티드, 단백질 발현 확인용 표지(epitope), 외래 유전자 삽입 부위를 함유하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터, 이를 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환 미생물 및 상기 형질전환 미생물을 이용한 외래 단백질의 분비생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 기존의 시그널 펩티드로 분비되는 시스템에 비하여 외래 단백질의 분비 효율을 높일 수 있고, 단백질 발현 확인용 표지(epitope)를 결합하여 편리하게 외래 단백질의 발현을 확인할 수 있다.

β-lactamase(bla), agfA, ompW, stfA, signal peptide, His-epitope

Description

외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터{Recombinant Vector for Foreign Protein Expression and Secretion}

본 발명은 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시그널 펩티드, 단백질 발현 확인용 표지(epitope), 외래 유전자 삽입 부위를 함유하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터, 이를 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환 미생물 및 상기 형질전환 미생물을 이용한 외래 단백질의 분비생산방법에 관한 것이다.

기존의 병원성 세균에 대한 전통적인 백신들은 주로 사균백신(killed vaccine) 또는 subunit vaccine들이다. 그러나 이들 백신들의 제조 공정은 항원의 분리 정제에서부터 면역성을 증가시키는 과정들이 매우 까다로우며, 백신에 의한 부작용을 줄이기 위해 백신들을 안정하게 보관해야 한다. 게다가 이들 백신들은 주사기를 이용해 각 개체들을 면역시켜야하는 불편함이 있다. 이와 같은 불편함을 해소하기 위해 숙주세포 내에서 세균이 외래 단백질을 세균 외로 분비하는 방법에 의해 점막면역과 체액성면역을 위한 항체 생성을 유도하는 방법들이 도입되고 있다.

외래 단백질 분비생산방법은 Salmonella에서 여러 가지 방법으로 시도가 되 어져 오고 있다. 즉, 세포의 외부로 분비되는 편모나 섬모 등 기관들에 재조합 단백질을 형성하여 항원을 세포 외부로 보내는 방법을 사용하거나, 또는 시그널 펩티드로서 분비가 일어날 수 있는 체계를 이용하는 방법이 사용되고 있다. 기존에 사용되는 시그널 펩티드는 베타 락타마아제(β-lactamase) 유래의 것으로 이 단백질은 periplasmic space에 분비되는 것이고 세포외 분비 효율이 낮다는 문제가 있다(Infection and Immunity, 70(4), 1739-1749, 2002). 이러한 방법은 현재 분비 효율이 낮거나 안정하지 못하기 때문에 목적으로 하는 항원을 대량으로 또는 안정적으로 분비하지 못해 적절한 숙주 면역반응을 유발할 수 없다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 시그널 펩티드로 외래 단백질을 분비하는 시스템의 단점을 보완하여 분비 효율이 높은 외래 단백질의 분비생산방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 각종 시그널 펩티드 의존 재조합벡터가 외래 단백질의 분비 효율이 높다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은 시그널 펩티드, 단백질 발현 확인용 표지(epitope) 및 외래 유전자 삽입 부위를 함유하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양액에서 외래단백질을 수득하는 단계를 포함하는 외래 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 시그널 펩티드, 단백질 발현 확인용 표지(epitope) 및 외래 유전자 삽입 부위를 함유하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 시그널 펩티드는 OmpW 시그널 펩티드(ompW SS), StfA 시그널 펩티드(stfA SS), β-락타마제(β-lactamase) 시그널 펩티드(bla SS) 및 AgfA 시그널 펩티드(agfA SS)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 발현용 표지(epitope)는 His epitope, RGS-His epitope, T7 epitope 및 V5 epitope로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 외래 유전자 삽입 부위는 EcoRI, BamHI, SalI 및 HindIII 절단 부위를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 asd 유전자, 상기 asd 유전자의 업스트림에 asd 유전자와 반대 방향으로 위치한 trc 프로모터(Ptrc), 상기 trc 프로모터(Ptrc)의 다운스트림에 위치한 ompW 시그널 펩티드(ompW SS), 상기 ompW SS의 다운스트림에 위치한 His-epitope 유전자, 상기 His-epitope 유전자 다운스트림에 위치한 외래 유전자 삽입 부위, 상기 외래 유전자 삽입 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열 5ST1T2을 포함하는 pMMP62인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 asd 유전자, 상기 asd 유전자의 업스트림에 asd 유전자와 반대 방향으로 위치한 trc 프로모터(Ptrc), 상기 trc 프로모터(Ptrc)의 다운스트림에 위치한 stfA 시그널 펩티드(stfA SS), 상기 stfA SS의 다운스트림에 위치한 His-epitope 유전자, 상기 His-epitope 유전자 다운스트림에 위치한 외래 유전자 삽입 부위, 상기 외래 유전자 삽입 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열 5ST1T2를 포함하는 pMMP63인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 asd 유전자, 상기 asd 유전자의 업스트림에 asd 유전자와 반대 방향으로 위치한 trc 프로모터(Ptrc), 상기 trc 프로모터(Ptrc)의 다운스트림에 위치한 agfA 시그널 펩티드(agfA SS), 상기 agfA SS의 다운스트림에 위치한 His-epitope 유전자, 상기 His-epitope 유전자 다운스트림에 위치한 외래 유전자 삽입 부위, 상기 외래 유전자 삽입 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열 5ST1T2을 포함하는 pMMP65인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 외래 단백질은 항원, 효소, 폴리펩티드 및 호르몬으로 구성된 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 외래 단백질은 PspA인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 살모넬라균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 상기의 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양액에서 외래단백질을 웨스턴 블락으로 확인하는 단계를 포함하는 외래 단백질의 생산 분비 및 확인 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 외래 단백질은 항원, 효소, 폴리펩티드 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 agfA, ompW 및 stfA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 시그널 펩티드 유전자, His epitope 유전자 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합벡터, 상기 재조합벡터를 숙주세포에 도입하여 수득되는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하여, 외래 단백질을 발현ㆍ분비시키는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 분비생산방법을 제 공하는 효과가 있다.

본 발명에 따르면, 기존의 시그널 펩티드를 이용한 분비 시스템에 비하여 외래 단백질의 분비 효율을 높일 수 있고, 단백질 발현 확인용 표지(epitope)를 결합하여 편리하게 외래 단백질의 발현을 확인할 수 있으며, 본 발명을 통해 수득한 외래 단백질(항원)은 가축의 감염성 세균에 대한 백신으로 사용될 수 있다.

각종 장내세균 유래의 외래 단백질을 본 외래 단백질의 발현 체계에 적용한다면 다양한 병원성 장내세균에 대한 방어를 할 수 있는 다가 백신 체계로 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 재조합 기술을 이용하여 외래 단백질을 과량으로 분비하기 위한 외래 단백질의 분비생산방법에 관한 것이다. 대부분의 세균은 세포 외로 단백질을 분비할 때 타입-II sec 의존 체계에 의해 분비가 이루어지고 필수적으로 시그널 펩티드가 관여한다. 이 시그널 펩티드는 분비되는 단백질의 leader peptide sequence로서 단백질의 발현과 분비효율에 영향을 미친다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에 있어 기본 토대가 되는 벡터는 pYA3493 (Infection and Immunity, 70(4), 1739-1749, 2002)이다. pYA3493 벡터는 아스파테이트 세미-알데하이드 디하이드로게나아제(aspartate semi-aldehyde dehydrogenase, asd) 유전자를 가지고 있는데, 이는 세균의 세포벽 합성에서 필수적인 m-디아미노피메릭산(m-diaminopimellic acid, m-DAP)을 합성하기 위해 개시점에서 작용하는 효소를 합성한다.

따라서, 본 발명의 벡터가 서식하는 숙주는 asd 유전자가 결손되어 있고, 이 벡터에 존재하는 asd 유전자는 선택적인 마커로 사용할 수 있다. 또한, pYA3493 벡터는 외래 단백질을 클로닝하기 위한 EcoRI, BamHI, SalI 및 HindIII 절단 부위가 있고, 외래 단백질을 효과적으로 분비하기 위하여 외래 항원 클로닝 부위의 상류 영역에 β-락타마제(β-lactamase) 시그널 펩티드(bla SS; pMMP62), AgfA 시그널 펩티드(agfA SS; pMMP63), OmpW 시그널 펩티드(ompW SS; pMMP64), StfA 시그널 펩티드(stfA SS; pMMP65)가 존재하며, 또한, 이들 시그널 펩티드의 다운스트림에 6개의 His coding 잔기를 유지하며, Ptrc 프로모터에 의해 발현이 조절된다. 클로닝된 외래 단백질의 전사 종결은 5ST1T2 (5S rRNA transcription terminator T1T2)의 ρ-독립 전사 종결 서열에 의해 이루어진다.

β-락타마제(β-lactamase)는 타입 II Sec 의존 분비체계에 의해 SecB 비의존성으로 그람음성세균에서 periplasmic space로 분비되는 단백질이다. AgfA와 StfA는 핌브리아(fimbriae)의 주단백질들로 타입 IV Sec 의존 분비체계에 의해 외부로 분비되는 단백질이고, 각각은 분비 방식에 있어서 차이가 있는 것으로 보고 되어 있다. Agf 핌브리아는 아직 정확하게 밝혀지지 않은 방식에 의해 분비가 되는 반면에, Stf 핌브리아는 타입 II Sec 의존 방식에 유사한 방법으로 분비가 된다. OmpW는 타입 II Sec 의존 분비체계에 의해 SecB 의존성으로 외막단백질(outermembrane protein W)이다. 이상과 같이 각각 분비되는 영역이나 방식에 차이에 기인하여 시그널 펩티드가 선별되었다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경 우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 pMMP62, 63, 64, 65 벡터에 외래 단백질로서 pspA (Streptococcus pneumoniae surface protein A) 유전자 또는 다른 외래 단백질들을 클로닝하여 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합벡터를 제작한 다음, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 수득된 재조합 미생물을 배양하여 외래 단백질인 pspA 항원 및 다른 외래 단백질들의 분비생산 효율을 측정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

또한, 본 실시예에서는 시그널 펩티드로 OmpW 시그널 펩티드(ompW SS), StfA 시그널 펩티드(stfA SS), β-락타마제(β-lactamase) 시그널 펩티드(bla SS), AgfA 시그널 펩티드(agfA SS), 단백질 발현 확인용 표지(epitope)로 His (Histidine)- eptitope 및 외래 단백질로 PspA 만을 예시하였으나, 기타 다른 시그널 펩티드, 단백질 발현 확인용 표지(epitope) 및 외래 단백질에도 응용될 수 있음은 자명한 것이다.

실시예 1. ompW SS 와 His-epitope을 함유하는 벡터의 제작

ompW SS는 Salmonella typhimurium x3339(Gulig and Curtiss, Infect. Immun., 55:2891, 1987)를 주형으로 하고 각각 BspHI 및 EcoRI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 1 및 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하였다. His-epitope은 서열번호 2의 프라이머 서열 내 밑줄 친 부분과 같이 제작하였고, PCR을 통해 자동적으로 삽입되도록 하였다.

PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하였다.

[서열번호 1] 5'-TCATGAAAAAATTTACAGTGGCGG-3'

[서열번호 2] 5'-GAATTCATGGTGATGGTGATGATGTCCGGCTTCGTGCGCGAACG-3'

상기 증폭된 DNA 산물을 T-벡터(Promega)에 클로닝한 후, BspHI 및 EcoRI 제한효소로 절단하고, pYA3342 벡터(Infection and Immunity, 2002. 70 (4), 1739-1749)는 NcoⅠ 및 EcoRI 제한효소로 절단하여 번역 수준에서 접합하였다(pMMP62; 도 2). 그 결과, pYA3342 벡터에 접합된 유전자는 서열번호 3과 같았다. 서열번호 4는 pYA3342 벡터에 삽입된 ompW SS와 His-epitope의 아미노산 서열이다.

실시예 2. stfA SS 와 His-epitope을 함유하는 벡터의 제작

stfA SS는 Salmonella typhimurium x3339를 주형으로 하고 각각 BspHI 및 EcoRI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하였다. His-epitope은 서열번호 6의 프라이머 내 밑줄 친 부분과 같이 제작하였고, PCR을 통해 자동적으로 삽입되도록 하였다.

PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하였다.

[서열번호 5] 5'-TCATGAATACAGCAGTAAAAGC TG-3'

[서열번호 6] 5'-GAATTCATGGTGATGGTGATGATGACCGGTAAAAGTCACCGTAC-3'

상기 증폭된 DNA 산물을 T-벡터(Promega)에 클로닝한 후, BspHI 및 EcoRI 제한효소로 절단하고, pYA3342 벡터는 NcoⅠ 및 EcoRI 제한효소로 절단하여 번역 수준에서 접합하였다(pMMP63; 도 3). 그 결과, pYA3342 벡터에 접합된 유전자는 서열번호 7과 같았다. 서열번호 8은 pYA3342 벡터에 삽입된 stfA SS와 His-epitope의 아미노산 서열이다.

실시예 3. bla SS 와 His-epitope을 함유하는 벡터의 제작

bla SS(Kang, et al., Infection and Immunity, 70(4):1739, 2002)에 His-epitope을 부가하기 위해 플라스미드 pYA3493을 주형으로 하고 각각 BspHI 및 EcoRI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 9 및 10의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하였다.

His-epitope는 서열번호 10의 프라이머 서열 내 밑줄 친 부분과 같이 제작하였고 PCR을 통해 자동적으로 삽입하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하였다.

[서열번호 9] 5'-TCATGAGTATTCAACATTTCCGTG-3'

[서열번호 10] 5'-GAATTCATGGTGATGGTGATGATGTTCAGCATCTTTTACTTTCA-3'

상기 증폭된 DNA 산물을 T-벡터(Promega)에 클로닝한 후, BspHI 및 EcoRI 제한효소로 절단하고, pYA3342 벡터는 NcoⅠ 및 EcoRI 제한효소로 절단하여 번역 수준에서 접합하였다(pMMP64; 도 4). 그 결과, pYA3342 벡터에 접합된 유전자는 서열번호 11과 같았다. 서열번호 12는 pYA3342 벡터에 삽입된 bla SS와 His-epitope의 아미노산 서열이다.

실시예 4. agfA SS 와 His-epitope을 함유하는 벡터의 제작

agfA SS는 Salmonella typhimurium x3339를 주형으로 하고 각각 BspHI 및 EcoRI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하였다. His-epitope은 서열번호 14 안에 밑줄 친 부분과 같이 제작하였고, PCR을 통해 자동적으로 삽입하였다.

PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 30회 실시하였다.

[서열번호 13] 5'-TCATGAAACTTTTAAAAGTGGCAG-3'

[서열번호 14] 5'-GAATTCATGGTGATGGTGATGATGGCCGCCGTTATGATTACCGC-3'

상기 증폭된 DNA 산물을 T-벡터(Promega)에 클로닝한 후, BspHI 및 EcoRI 제한효소로 절단하고, pYA3342 벡터는 NcoⅠ 및 EcoRI 제한효소로 절단하여 번역 수준에서 접합하였다(pMMP65; 도 5). 그 결과, pYA3342 벡터에 접합된 유전자는 서열번호 15와 같았다. 서열번호 16은 pYA3342 벡터에 삽입된 agfA SS와 His-epitope의 아미노산 서열이다.

실시예 5. PspA 단백질을 이용한 발현의 확인

상기 실시예 1 내지 4에서 구축한 벡터의 시그널 펩티드와 His-epitope를 통해 외부 단백질의 발현을 알아보기 위해 pspA(Streptococcus pneumoniae surface protein A) 유전자를 제작된 벡터 pMMP62, 63, 64, 65에 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 라이게이션하였다.

상기 라이게이션된 산물은 asd 돌연변이주인 E. coli x6212(Infection and Immunity, 70(4), 1739-1749, 2002)에 형질전환하여 EcoRI과 HindIII로 절단한 후 삽입물을 확인하였다. 클로닝된 이들 재조합산물은 각각 pMMP66, 67, 68, 70으로 명명하였다.

상기 형질전환된 E. coli x6212에서의 PspA의 발현량을 측정하기 위해 western blot을 실시하였다. 1차 항체는 mouse에서 PspA에 대항해 발현된 항체(Ho Young Kang, et al., Infection and Immunity, 70(4): 1739, 2002)와 상업적으로 판매하고 있는 mouse에서 발현된 His-epitope 항체(Ig Therapy Co.)를 1차 항체로 사용하였다. 2차 항체는 염소에서 발현된 항 mouse IgG에 HRP(horseradish peroxidase)에 접합된 항체를 사용하였다(Stressgen Co.). 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, PspA 항체와 His-epitope 항체는 비슷한 정도의 수준으로 감지되어, 본 발현벡터를 통해 외부 단백질(PspA)의 발현이 안정적으로 일어나는 것을 알 수 있었다. 상기와 같이, 본 벡터에 클로닝된 외부항원들은 각각 개별적인 항체에 의해 확인을 하지 않고도, His-epitope 항체를 이용하여 손쉽게 발현을 확인할 수 있다. 또한, pYA3493에 pspA 유전자를 클로닝한 pYA3494(Infection and Immunity, 70(4), 1739-1749, 2002)와 비교시 pYA3493에 His-epitope이 부가된 pMMP68(pMMP64 유래)은 pYA3494와 비교시 유사한 정도로 PspA를 발현하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이하에서는 기존 체계인 pYA3494가 His-epitope을 보유하지 않기 때문에, pYA3494를 사용하지 않고, 내부 대조구로서 pMMP68을 사용하여 발현량을 비교하였다.

실시예 6. 시그널 펩티드에 따른 분비능력의 확인

상기 실시예 1 내지 5의 시그널 펩티드의 종류에 따른 외부 단백질 분비능력의 개선정도를 알아보기 위해, PspA 단백질을 이용해 확인해 보았다. 외부항원운반체계를 살모넬라 생백신 균주에서 적용 가능성을 알아보기 위해 pMMP66, 67, 68, 70을 S. typhimurium x8554 (asdA16)(Infection and Immunity, 70(4), 1739-1749, 2002)에 형질전환하였다. 상기 균주는 asd 유전자가 돌연변이 되어 외부에서 DAP이 제공되거나 asd 유전자를 발현할 수 있는 벡터가 형질전환될 때 생존할 수 있다.

총 PspA의 발현량을 알아보기 위해 S. typhimurium x8554에 각 벡터들을 형질전환하여 형질전환된 균주들을 LB 배지로 37℃에서 흡광도 600 ㎚에서 0.8로 배양한 후 배양액을 각 10 ㎕씩 분취하여 100℃, 5분간 끓인 후 전기영동을 실시하여 웨스튼 블락을 실시하였다. 분비능력을 확인하기 위해서는 위와 동일한 배양방법으로 배양한 배양액을 12,000 rpm, 5분간 원심분리한 상등액을 취하고, 이 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 완전히 제균하였다. 이 제균된 액에 최종 농도 10%가 되게 trichloroacetic acid (TCA)를 첨가한 후, 4℃에서 한 시간 동안 방치하였다. 방치된 액을 12,000 rpm, 15분간 원심분리한 침전액을 SDS loading buffer (침전액은 원액 대비 37.5배 농축)에 재현탁하여 6 ㎕ (원액으로 환산시 225 ㎕)를 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 loading하여 전기영동 후, 웨스튼 블락을 실시하였다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이 전체 PspA의 발현량은 Bla 시그널 펩티드를 1.00로 봤을 때, OmpW 시그널 펩티드가 존재할 경우 에 비해 3.47배로 가장 높은 발현을 보였고, AgfA 시그널 펩티드의 경우 2.59배 높은 발현, StfA 시그널 펩티드의 경우 1.40배의 높은 발현률을 보였다.

분비능력의 측정 결과, PspA의 분비량은 Bla 시그널 펩티드(β-lactamase 시그널 펩티드)를 1.00로 봤을 때, OmpW 시그널 펩티드가 β-lactamase 시그널 펩티드보다 2.86배로 가장 많이 분비되었고, AgfA 시그널 펩티드는 β-lactamase 시그널 펩티드와 비슷한 수준인 1.08배, StfA 시그널 펩티드은 0.13배의 분비율을 보였다.

상기와 같은 결과를 볼 때, 시그널 펩티드가 존재하는 경우에, leader sequence로서 그리고 시그널 펩티드 역할에 기인하여 외부단백질의 발현능력 및 분비능력이 증가하는 것을 알 수 있었고, 각각의 시그널 펩티드에 기인된 발현능력과 분비능력은 일치하지 않는 것을 알 수 있었다.

따라서 각 외부항원에 아미노산의 서열에 따라 발현능력에 차이가 각 시그널 펩티드에 기인되어 나타날 수 있기 때문에 발현량과 외부분비 목적에 따라 적절히 선별하여 벡터를 활용할 수 있을 것으로 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 각각의 시그널 펩티드 및 His-epitope 유전자를 함유하는 벡터를 제작하는 방법을 나타낸 개략도이다.

도 2는 ompW SS와 His-epitope을 함유하는 pMMP62의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 3은 stfA SS와 His-epitope을 함유하는 pMMP63의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 bla SS와 His-epitope을 함유하는 pMMP64의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 5는 agfA SS와 His-epitope을 함유하는 pMMP65의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 6은 각 벡터에 pspA 유전자를 클로닝하고 그 발현을 조사한 것으로, 왼쪽 그림은 PspA 항체를 이용하여 western blotting을 실시한 것이고, 오른쪽은 His-epitope 항체를 이용하여 western blotting을 실시한 것이다.

도 7은 각 시그널 펩티드의 존재에 따른 외부 단백질의 발현능력 및 분비능력을 비교한 것으로, 왼쪽은 발현된 모든 PspA를 western blotting을 통해 확인했고, 오른쪽은 분비된 PspA를 western blotting을 통해 확인했다. 양쪽 모두 His-epitope 항체를 이용하여 확인하였다.

<110> Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University <120> Recombinant Vector for Foreign Protein Expression and Secretion <130> P08-E277 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcatgaaaaa atttacagtg gcgg 24 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaattcatgg tgatggtgat gatgtccggc ttcgtgcgcg aacg 44 <210> 3 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ompW SS and His-epitope <400> 3 ccatgaaaaa atttacagtg gcggcactgg cgttaacaac tcttctctca ggcagcgcgt 60 tcgcgcacga agccggacat catcaccatc accatgaatt c 101 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ompW SS and His-epitope <400> 4 Met Lys Lys Phe Thr Val Ala Ala Leu Ala Leu Thr Thr Leu Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ala Phe Ala His Glu Ala Gly His His His His His His 20 25 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcatgaatac agcagtaaaa gctg 24 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gaattcatgg tgatggtgat gatgaccggt aaaagtcacc gtac 44 <210> 7 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stfA SS and His-epitope <400> 7 ccatgaatac agcagtaaaa gctgcggttg ctgccgcact ggttatgggt gtttccagct 60 ttgccaatgc tgcgggcagt aatactggta cggtgacttt taccggtcat catcaccatc 120 accatgaatt cg 132 <210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> stfA SS and His-epitope <400> 8 Met Asn Thr Ala Val Lys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Val Met Gly 1 5 10 15 Val Ser Ser Phe Ala Asn Ala Ala Gly Ser Asn Thr Gly Thr Val Thr 20 25 30 Phe Thr Gly His His His His His His 35 40 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcatgagtat tcaacatttc cgtg 24 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaattcatgg tgatggtgat gatgttcagc atcttttact ttca 44 <210> 11 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla SS and His-epitope <400> 11 ccatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 60 ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaacat catcaccatc 120 accatgaatt c 131 <210> 12 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bla SS and His-epitope <400> 12 Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala 1 5 10 15 Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys 20 25 30 Asp Ala Glu His His His His His His 35 40 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcatgaaact tttaaaagtg gcag 24 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gaattcatgg tgatggtgat gatggccgcc gttatgatta ccgc 44 <210> 15 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agfA SS and His-epitope <400> 15 ccatgaaact tttaaaagtg gcagcattcg cagcaatcgt agtttctggc agtgctctgg 60 ctggcgtcgt tccacaatgg ggcggcggcg gtaatcataa cggcggccat catcaccatc 120 accatgaatt c 131 <210> 16 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> agfA SS and His-epitope <400> 16 Met Lys Leu Leu Lys Val Ala Ala Phe Ala Ala Ile Val Val Ser Gly 1 5 10 15 Ser Ala Leu Ala Gly Val Val Pro Gln Trp Gly Gly Gly Gly Asn His 20 25 30 Asn Gly Gly His His His His His His 35 40

Claims (13)

1. 시그널 펩티드, 단백질 발현 확인용 표지(epitope) 및 외래 유전자 삽입 부위를 함유하되,

   상기 시그널 펩티드는 OmpW 시그널 펩티드(ompW SS), StfA 시그널 펩티드(stfA SS) 및 AgfA 시그널 펩티드(agfA SS)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,

   상기 재조합 벡터는 asd 유전자, 상기 asd 유전자의 업스트림에 asd 유전자와 반대 방향으로 위치한 trc 프로모터(Ptrc), 상기 trc 프로모터(Ptrc)의 다운스트림에 위치한 ompW 시그널 펩티드(ompW SS), 상기 ompW SS의 다운스트림에 위치한 His-epitope 유전자, 상기 His-epitope 유전자 다운스트림에 위치한 외래 유전자 삽입 부위, 상기 외래 유전자 삽입 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열 5ST1T2을 포함하는 pMMP62인 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터.
6. 제1항에 있어서,

   상기 재조합 벡터는 asd 유전자, 상기 asd 유전자의 업스트림에 asd 유전자와 반대 방향으로 위치한 trc 프로모터(Ptrc), 상기 trc 프로모터(Ptrc)의 다운스트림에 위치한 stfA 시그널 펩티드(stfA SS), 상기 stfA SS의 다운스트림에 위치한 His-epitope 유전자, 상기 His-epitope 유전자 다운스트림에 위치한 외래 유전자 삽입 부위, 상기 외래 유전자 삽입 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열 5ST1T2을 포함하는 pMMP63인 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터.
7. 제1항에 있어서,

   상기 재조합 벡터는 asd 유전자, 상기 asd 유전자의 업스트림에 asd 유전자와 반대 방향으로 위치한 trc 프로모터(Ptrc), 상기 trc 프로모터(Ptrc)의 다운스트림에 위치한 agfA 시그널 펩티드(agfA SS), 상기 agfA SS의 다운스트림에 위치한 His-epitope 유전자, 상기 His-epitope 유전자 다운스트림에 위치한 외래 유전자 삽입 부위, 상기 외래 유전자 삽입 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결서열 5ST1T2을 포함하는 pMMP65인 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터.
8. 삭제
9. 삭제
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