JPH03501322A - 発現ベクター及びそれらの構成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ベクター　びそれらの　法 本発明は、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のリポソームＲＮＡオペロン（ｒｒｎＢオ ペロン）のＰｔプロモーター及びＥ、コリのｌａｃオペロンからのいくつかの調 節配列から構成される新タイプのプロモーターを担持する新規の発現ベクターに 関する。本発明はさらに、上記の新規プロモーター及び新規ベクターを構成する ための方法にも関する。 すべてのタイプの情報を担持する起原の遺伝子が、広く知られているように、イ ンビトロＩＥＩＮＡ組換え手段により細菌細胞中に導入される。外来性ＤＮＡの 安定した維持及びそれをコードする情報の発現は、適切なキャリヤー分子、すな わち発現ベクターにより行なわれ得る。細菌中でタンパク質をコードする遺伝子 を発現する場合、まず細菌の酵素が、転写の間、ＤＮＡ鋳型上にｍＲＮＡコピー 及びその後、翻訳の間、ＲＮＡメツセージにコードされる情報を用いてポリペプ チド鎖を合成する。転写は、プロモーターと呼ばれるＤＮＡ領域で開始される。 ＲＮＡポリマラーゼがこのＤ　Ｎ　Ａ　領域を認識し、そして転写の開始の前、 それに結合する。インビトロＤＮＡ組換え方法は、単にこれらのタンパク質が比 較的高い量で生成され、すなわち転写及び翻訳が有効である場合、実際、経済的 に使用され得る。従って、プロモーターが“強く”あることがひじょうに重要で あり（他の必要な特徴の他に）、すなわち、適切に高いレベルの転写がそれらに 開始されるべきである。 異なった発現ベクターが、多くの種類のプロモーター、たとえばＩａｃ、　ｔｒ ｐ、　ｂｌａ、　１１ｐ＋　λＰ、Ｐｔプロモーター用により構成されて来た。 ｌａｃオペロンのプロモーターは、比較的弱いプロモーターであるが、その十分 に調節された機能のために実際、広く使用されて来た。いわゆる、異なった起原 のハイブリッドプロモーターが、たとえばヨーロッパ特許出願第８２３０２５３ ２．５（公開番号００６７５４０号）に記載されている。これらのプロモーター は、いわゆる−７５〜−１０の領域（十分に機能するプロモーターの最っとも重 要な領域である）が異なった起原のものであり、すなわち異なった起原の２種の プロモータ一部分が−３５〜−１０の領域の間の領域に一緒に連結されている事 実によって特徴づけられる。上記特許出願によれば、そのようなハイブリッドプ ロモーターの使用により構成された発現ベクターは、それらの機能が十分に調節 され、そして同時にそれらが有効な転写を可能にするので、産業目的のために卓 越している。 本発明の目的は、タンパク質収量を良好にするために、同時に十分に調節される 強いプロモーターを担持する発現ベクターを開発することであった。 本発明の研究の始めで、Ｌａｋａｃｓｏｖｉｃｂなど：Ｅ、コリｒＲＮＡ遺伝子 のプロモーターの新しい調節特徴（Ｊ、Ｂａｃｔ、１６９．２７２〜２７７）に 記載される発現ベクターを用いて実験が行なわれた。 これらのベクターの最良の機能ベクターは、次の通りに主な特徴を有するプロモ ーターを担持するニーそれらは、Ｅ、コリのリポソームオペロン（ｒｒｎＢ）の Ｐ２プロモーター由来の一部及びＥ、コリのｌａｃオペロンの調節配列に由来す る一部から構成され、−ｒｒｎＢ及びＩａｃオペロンに由来する前記２つの部分 は、−１０領域の下流で一緒に連結され、 −一３５及び−１０領域の両者はｒｒｎＢオペロンに起因し、ところがｒｒｎＢ 　Ｐｔにおける一１０領域の下流のＧＣに冨む領域は、抑制効果を示さないｌａ ｃオペロンに起因する類似する配列により置換され、その結果、それはプロモー ターの他の部分の強い機能に影響を及ぼさない。 これらのプロモーターは、２種の異なったプロモーターの異なった部分の組合せ により構成されているけれども、それらはハイブリッドプロモーターと呼ばれな い。なぜならば、−３５及び−１０領域の両者を官能化するだめの最っとも重要 な部分は、同じプロモーター、ｒｒｎＢ　Ｐ、に起因するからである。 これらのプロモーターは、発現をひじょうに良好にすることが見出された。さら に実験を行なえば、驚くべきには、４個の塩基対、すなわち上記で特徴化された プロモーターを担持するベクターにおける一１ＯＮ域の下流のＴＧＣＡを排除す れば、転写の強度が２倍になることが見出された。 この発見は、驚くべきには１以上の理由がある。一方では、プロモーターの強さ を決定することにいづれかの役割を演する上記４個の塩基対に対して当業界にお いてはいづれのヒントも存在せず、他方では、転写の強度の２倍化は、本来ひじ ように強いプロモーターの場合、ひじょうに有意な結果である。 上で言及されたことに基づいて、本発明は、Ｅ、コリのリポソームオペロン（ｒ ｒｎＢ）のＰ２プロモーター及びＥ、コリのｌａｃオペロンからのいくつかの調 節配列から構成されるプロモーターに関し、ここで前記異なった起原の２種の部 分は、プロモーターの一１０領域の下流で一緒に連結され、そしてそのＴＧＣＡ 配列は、−１０領域のすぐ下流で欠失される。 本発明は、さらに、上記言及されたプロモーターを含有するすべての発現ベクタ ー、これらのベクターにより形質転換されたＥ、コリ宿主細胞及び前記プロモー ター及び発現ベクターを構成するための方法にも関する。 本発明の発現ベクターの主要特徴及びそれらにより可能にされる遺伝子−発現の 主要特徴は、次の通りに結論づけられ得る： １、上記発現ベクターの主要特徴である新規タイプのプロモーター（６／２３　 （Ｎｓｉ　）と呼ばれる）は、宿主細胞の生理学的状態と無関係にひじょうに高 い一定の転写速度を開始せしめ、 −これは宿主細胞の合計の新規ＲＮＡ合成の９０％以上を意味し、そして −従って、細胞タンパク質の合計量の３０〜８０％はどの外来性遺伝子生成物の 蓄積が生じる。 Ｚ　転写の終結は、ｒｒｎＢオペロンから始まる二重の終結領域で生じる。 特表千３−５０１３２２　（３） ３、転写の生成物は、外来性コード領域の他にｒｒｎＢオペロンから始まるｒＲ ＮＡセグメントもまた含むハイブリッドｍＲＮＡ分子であり、そのメツセージの 安定性は高く、そしてこのｍＲＮＡ分子の半減期は平均のｍＲＮＡの半減期より も長い。 ４、転写の強度は、ｌａｃ調節領域における構築物を通して調節される。 ５、　前記新規のベクタ一種のいくつかのメンバーを用いて、外来性遺伝子生成 物が融合タンパク質として合成される。一方、これはその遺伝子生成物をより安 定にし、そして他方、その遺伝子生成物の存在は検出され得、そして遺伝子発現 のレベルは融合パートナ−（β−ガラクトシダーゼのα−ペプチド）の助けによ り容易に測定され得る。その外来性遺伝子はまた、非融合形で１ａｃＺの下流の これらのベクターに構築され得る。このタイプの構成は、細菌性オペロンのよう に機能し、そして外来性遺伝子生成物は個々のタンパク質として合成される。こ のタイプの構成において、外来性遺伝子はまた、Ｅ、コリのリポソーム結合部位 も含むべきである。このベクタ一種の他のメンバーにおいて、外来性遺伝子は、 リポソーム結合部位における構築物に対して最適な間隔を有する翻訳開始位置で あるその開始点で構築され得る。このタイプの構成において、外来性遺伝子のＡ ＴＧコドンは翻訳の正しい開始を確保する。構築されるべき外来性遺伝子がその 開始でＡＴＧコドンを有さない場合、それは、その中にＡＴＧ配列要素を有する 合成Ｃ１ａ　Ｉリンカ−の結合により助けられ得る。 自己のリポソーム結合部位を有する外来性遺伝子はまた、他の制限エンドヌクレ アーゼ認識部位を用いて、これらのベクター中に構築され得る。 ６、本発明のベクターにおいて機能する新規タイプのプロモーターを構成する場 合、リポソームプロモーターの下流の調節領域を欠失する。従って、生理学的条 件に対してひじょうに敏感であるリポソームプロモーター機能の特徴的な調節が 排除され、そしてプロモーターが生理学的条件に関係なく可能性ある最高の割合 で機能する。 ７、　転写は、元のリポソームオペロンにおけるシトシン塩基で開始される。ア デニン又はグアニンとのこの塩基の交換は、プロモーターの転写活性を有意に高 める。 ８、　前記プロモーターにｌａｃオペロンの調節領域を連結した。この配置は、 誘発条件下で最大の転写強度に影響を及ぼさず、そしてｌａｃオペロンの機能に 類似するプロモーター機能の調節を可能にし；そしてそれは、宿主細胞の代謝に 不都合に影響を及ぼすであろう一定のひじょうに高レベルの転写及び翻訳を妨げ る。 ９、　本発明の好ましい発現ベクターは、２８００〜４５００塩基対の大きさを 有し；耐アンピシリン性を付与する遺伝子を担持し；転写及び翻訳シグナルの間 に最適な空間を有し；既知の合計ＤＮＡ配列を有し；複製タイプＣｏｌ　Ｅｌを 有し；細胞当たり２０〜３０のコピー数を有しく但し、またハンガリー特許出願 Ｔ　／３５２８０の方法によって、前記ベクタ一種のいくつかのメンバーの高い コピー数変種が構成された）；外来性遺伝子が３種の読み枠と整合して構築され 得る、発現されるべき外来性遺伝子において構築するためのいくつかの異なった 制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することによってさらに特徴づけられる。 次の例に記載される新規の発現ベクターは、次の制限エンドヌクレアーゼ認識部 位：たとえばＰｖｕ　Ｕ　＋　Ｂｉｎｄ　Ｉ［Ｉ　＋　Ｃ１ａ　Ｉ　ｒＥｃｏＲ ｌ、　Ｂａｍ）１１＋　Ｂｇｌｌｌ、　Ｘｂａｌ、　ＨｐａＴを含む。 前記発現ベクターを構成するための本発明の方法は、°好都合には次の段階を含 んで成る（後で詳細に説明される）：１、　ベクターｐＢＲ３２２へのＥ、コリ のｒｒｎＢオペロンのクローニング段階。 λ　プラスミド中への前記オペロンのプロモーターの安定したサブクローニング ；構造遺伝子の主要部分の欠失；お互い隣接して転写開始領域（プロモーター） 及び終結領域（ターミネータ−）を配置する段階。 ３、　短くされたｒｒｎＢオペロンへのｌａｃオペロンの開始部分の連結。 ４、　適切な調節領域を有するプロモーター６／２３の構成段階。プロモーター ６／２３　［Ｎｓｉ　）を得るためのこのプロモーターの変性段階。 ５、外来性遺伝子の構築を可能にするベクターの適切な部分への異なった制限部 位の導入段階、異なった個々の発現ベクター構成の開発段階。 本発明はさらに詳細に次の例により示されるが、但しこれは本発明を制限するも のではない。 ■−上 の　ベタ　−　の １、ｒｒｎＢオペロンを担持するＥ、コリ又は形質導入Ｅ、コリバクテリオファ ージＤＮＡからの合計のＤＮＡ単離物Ｌｔ、Ｅ、コリからリポソームオペロンｒ ｒｎＢを単離する場合、出発物質として作用することができる。ｒｒｎＢオペロ ンを、形質導入ファージｒｉｂ’　１Ｂ　ＤＮＡにより開始するＫ１５ｓ、　Ａ 、など（Ｇｅｎｅ　４＋（１９７８）、　１３７〜１５２）の方法に従って、又 しまＥ、コ１ノの染色体ＤＮＡｔｍ製物を使用するＢｕｒｏｓ＋　Ｊ、など（Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。 の発現ベクターの構成における第１段階は、第１図に示されるプラスミドｐＢＢ ９（ＭＮＧ　００３００）の構成であった。このプラスミドは、ユニーク１３ａ ｅ＋ＨＩ制限部位でｐＢＲ３２２ベクタープラスミド（ＭＮＧ　００２９８）（ Ｓａｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、Ｇ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｓｙｍｐ。 Ｑｕａｎｎ、Ｂｉｏｌ、４３．　（１９７８）、　７７〜９Ｂ）を切断し、そし てｒｉｂ’　１８ＯＮＡの７．５ｋｂのＢａｔａＨＩ−Ｂａｗｌ　Ｉフラグメン トを連結することによって構成された。その得られた組換えプラスミド中のこの ７．５ｋｂの挿入体は、全ｒｒｎＢオペロン、Ｅ、コＩＪ起原のし）くつかの追 加の配列及びλファージからの約４００ｂｐの長さの自己列要素を担持する。　 ｒｒｎＢオペロンの調節領域ムこ２種のプロモーター（ｐ＋及びＰｇ）が存在し 、それぞれ１６５ｒＲＮＡ遺イ云子の上流１８０〜３００ｂｐに位置する（Ｃｓ ｏｒｄ５ｓ　Ｔｏｔｈ、　Ｅ、など、Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ヱ、（１９７９）、１３３５〜１３４２）　。 λ　強いリポソームプロモーターにより、ｒｒｎＢオペロン又はそのプロモータ ー領域を含む組換えプラスミド番よ、宿主細特表平３−５０１３：？２　（４） 胞の転写機構を過度に負担せし−め、そしてプラスミドの維持に不安定性を引き 起こすひじょうに高レベルの転写を開始する。この問題を回避するために、追加 の構成段階のために重要でないｐＢＢ９プラスミドのすべての部分をインビトロ で欠失せしめた。この段階においては、最初に）ｌｐａ　ｌ制限エンドヌクレア ーゼによりｐＢ８９　ＤＮＡを切断し、そしてその得られた線状分子を、異なっ た時間、ＢＡＬ　３１エンドヌクレアーゼにより処理した。その酵素ＢＡＬ　３ １は、二本鎖の線状ＤＮＡ分子の両端を徐々に短くする。ＢＡＬ　３１エキソヌ クレアーゼにより種々の程度に短（されたｐＢＢ９起原の線状ＤＮＡ分子を含む 前記得られたＤＮＡサンプルを、プラント末端の連結及び環状化の両者のために 最適である反応混合物中でＴ４ポリヌクレオチド　リガーゼにより連結し、そし てＥ、コリＨＢ　１０１細胞を、その連結混合物により形質転換せしめた。ユニ ークな形質転換コロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡをそれから調製した 。制限エンドヌクレアーゼ消化及びゲル電気泳動により、選択されたプラスミド 調製物における欠失の長さを決定した。合成された短いＲＮＡ分子が、ｒＲＮＡ 分子のために正常な真作経路に包含されるｒＲＮＡ様分子をなお産生する欠失性 ｒｒｎＢオペロンを得るために、成熟ｒＲＮＡ分子のために特徴的な５′及び３ ′末端をなお有する異なった欠失性ｒｒｎＢオペロンを有するプラスミドを選択 した。これらのプラスミドをｐＢＢ９Δと命名し、そしてそれらの１つをｐＢＢ ９Δ９（第２図）と命名した。ＤＮＡ配列分析に基づいて、このプラスミド中の 欠失性ｒｒｎＢオペロンは、オペロンの末端で、成熟１６Ｓ　ｒＲＮＡ分子の初 めの２６９ｂｐ及び全５ＳｒＲＮＡ遺伝子を含む。１６５　ｒＲＮＡ遺伝子の初 めの部分に位置し、そして２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の末端に隣接する、欠失の２ つの末端の周囲のヌクレオチド配列が、それぞれ第３図に示される。 次の段階は、できるだけ小さな、プラスミドにおける欠失性ｒｒｎＢオペロンを 有するようにプラスミドに追加の欠失を創造することであった。ｐＢＲ３２２ベ クターからのユニークＳａｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位でプラスミドｐＢ Ｂ９Δ９を切断することによってそのプラスミドを線状化した。　（ｒｒｎＢオ ペロンに２種の５ａｌｌ切断部位が存在するが、しかしそれらは前の段階では欠 失されなかった）、その得られた線状ＤＮＡ分子をＢＡＬ　３１エキソヌクレア ーゼにより消化し、約１６００ｂｐの長さの短縮形を得、ユニーク５ａ１１部位 と欠失性ｒｒｎＢオペロンの末端との間の距離は、プラスミドｐＢＢ９Δ９にお いて約５ｏｏｂｐである。　ｒｒｎＢオペロンの反対方向にその得られた欠失体 を長くし、そしてベクターＤＮＡのより非本質的な部分を欠失せしめ、その結果 、環状化の前、Ｐｖｕ　Ｕ制限エンドヌクレアーゼにより短くされた線状ＤＮＡ 分子をまた消化した。この酵素はＤＮＡを切断し、線状ＤＮＡ分子の２つの末端 をそのようにしてプラント末端にし、すなわち１つの末端はＰｖｕ　ＩＩにより 生成され、そしてＢＡＬ　３１消化による他端は、追加の変性なしに一緒に連結 され得る。ＤＮＡ連結、形質転換及び物理的マツピングによるコロニーの選択を これまでのようにして行なった。さらに構成作用のためにプラスミドｐＢ！３９ ｂ２Ｂ　（第４図）を選択し、ここでＳａｌ　Ｉ　ＢＡＬ　３ｌ−Ｐｖｕｎ消化 により創造される欠失体は２１７４ｂｐの長さであった。この欠失体の１端は、 成熟５ＳＲＮＡ配列の端の５１０ｂｐ下流に位置し、そして他端はｐＢＲ３２２ ベクターのＰｖｕ　Ｉｆ切断部位、すなわちｐＢＲ３２２の番号に従って塩基対 ２０６７に位置する。この２つの欠失体末端の周囲のヌクレオチド配列は、第３ 図に示される。 ｒｒｎＢオペロンのプロモーター領域の上流の領域を欠失するために第３の欠失 体をまた創造した。ＥｃｏＲＩ及びＦｓｐ　ＩＩｌ制限エンドヌクレアーゼ両者 はｒｒｎＢオペロンの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の上流の１つの認識部位を有する ）によりプラスミドｐＢＢ９ｂ２８を消化し、そして欠失性ｒｒｎＢオペロンの 大きな部分を含むベクター及びフラグメントを単離した。単離されたＥｃｏＲＩ −Ｆｓｐ　ＩＩフラグメントの付着端をＤＮＡポリマラーゼＩのフレノウフラグ メントによりフィルインし、そしてＴ４ポリヌクレオチドリガーゼにより連結す ることによってそれを環状化した。正しくフィルインされた末端を一緒に連結す る場合、ＥｃｏＲＩ及びＦｓｐ　ＩＩｌ制限エンドヌクレアーゼ認識配列の両者 が次のように再構成され： ＧＡＡＴＴＣＧＡ ＣＴＴＡＡＧＣＴＴ 従って、その得られたプラスミド（ｐ４０Ｂ−５，ＭＮＧ　００３０１）は、両 酵素により線状化され得る（第５図）。 次の段階において、プロモーターＰ、のプリブナウ配列の１００ｂｐ上流に位置 する認識部位をＦｓｐ　Ｉ［酵素により切断することによりプラスミドｐ４０８ −５を線状化し、そして制限されたＢＡＬ　３１消化を通用してプロモーターＰ 、に延襄する一連の欠失体を創造した（第５図）。連結及び形質転換の後、Ｂｓ ｐＲＩ　。 Ｍｓｐｌ及びＨｈａ　ｌ制限エンドヌクレアーゼによる制限マツピングにより及 びＤＮＡ配列分析により、単離されたプラスミドＤＮＡにおける欠失体の末端を 決定した。プラスミドｐ４１９−１０において、１９７ｂｐの長さの欠失はプロ モーターＰ、を排除し、そしてプロモーターＰ２の１００ｂｐ上流で終結した。 その欠失はまた、ベクターＤＮＡから耐アンピシリン遺伝子の上流で、１１０ｂ ｐの長さの配列を排除した。その欠失体末端の周囲のヌクレオチド配列は、第３ 図に示される。 ３、　次の段階において、この短くされたｒｒｎＢオペロンとｌａｃオペロンの 起点とを連結した。ｐＬＢＵ　３プラスミドＤＮＡから４１２ｂｐの長さの旧ｎ ｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＴフラグメントを単離した（Ｇｅｎｔｚ＋　Ｒ，、Ｌａｎｇ ｅｒ＋　Ａ、ｌ　Ｃｈａｎｇ、　Ａ、Ｃ，Ｙ、、　Ｃｏｂｅｎ、　Ｓ、Ｎ、及び Ｂｕｊａｒｄ、　Ｈ，、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓ ｔｒｏｎｇ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｉｓ　ｍａｄｅ　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　ｂｙ　ｔ ｈｅ　Ｄｏｗｎｓｔｒｅａ＋＊　Ｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ＲＮＡＴｅｒ ＋＋＋１ｎａｔｉｏｎ　Ｓｉｇｎａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ　７８＋　（１９８１）４９３６〜４０）。その単離されたフラグメン トは、ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄＩ［Ｉの方向に次の部分を含む：　ｌａｃプロモ ーターのプリブナウ配列の４ｂｐ上流に、ｌａｃオペロンからの部分に連結する 、未知の起原及び機能の１６０ｂｐのＤＮＡ、ｌａｃオペロンに起因する部分は 、ｌａｃプロモーターの一部（−１０領域）、全オペレータ、転写の開始部位、 ｍＲＮＡの５′端の近くのリポソーム結合部位、ＡＴＧ翻訳開始コドン及び、β −ガラクトシダーゼの初めの７０個のアミノ酸のためのコード領域を含む。二〇 Ｎ−末端ポリペプチド（α−ペプチドと呼ばれる）はβ−ガラクトシダーゼ活性 を有さないが、しかしそれ自体不活性である不完全なβ−ガラクトシダーゼ分子 の特定のタイプ（α−受容体突然変異体）と相互反応する場合、一部の活性を再 構成することができる。 プラスミドｐ４１９−１０を、プロモーターＰ２とターミネータＴ＋　との間で ５ｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断し、そして合成ＥｃｏＲＩリンカ− を、その得られた線状ＤＮＡ分子のプラント端に連結した。リンカー−プラスミ ド連結混合物を、ＥｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そしてプラ スミド環状化のために最適な条件下で再び連結した。形質転換の後、リンカ−を 挿入することによってＥｃｏＲＩ切断部位のために置換されるＳｔｕ　ｌ制限エ ンドヌクレアーゼ切断部位を欠くことにおいてのみプラスミドｐ４１９−１０と 異なるプラスミドｐ８０８−２を単離した（第６図）。ｐＬＢＵ７３の単離され たＨｉｎｄｌＩ［−ＥｃｏＲＩフラグメントを、旧１ｄ　■−ＥｃｏＲＩにより 消化されたｐ８０２−２プラスミドＤＮＡに連結し、そしてＥ、コリ細胞をその 連結混合物により形質転換せしめた。形質転換体のコロニーを、指示薬の染料を 含む固体培地上で増殖せしめ、そして２４〜３６時間後、薄青のコロニーが観察 され、その色は低レベルのα−ペプチド発現を示唆した。プラスミドＤＮＡをこ れらのコロニーから単離し、そしてそれらが前記２種のフラグメントの正しい連 結により創造されたプラスミドｐ８２７−１０（ＭＮＧ　００３０７）を担持す ることが物理的マツピングにより証明された（第６図）。 ４、次の段階においては、翻訳の効力を改良するために、ｒｒｎＢオペロンのプ ロモーターＰ２と翻訳開始点との間の欠失を行なった。プラスミドｐ８２７−１ ０をＥｃｏＲＩ消化により線状化し、そして異なった長さの配列（４００ｂｐま で）を、ＢＡＬ　３１エキソヌクレアーゼ消化により排除し、そしてその得られ た短くされたＤＮＡ分子をＤＮＡリガーゼにより再環状化した。指示プレート上 で濃い青色を示す形質転換体（α−ペプチドの集中的合成）を単離した。 その得られたプラスミドの１つ（ＰＥＲ−ＶＩ／２３）において、ｒｒｎＢ起原 の配列はプロモーターＰ２の−１０Ｓｆｉ域の２ｂｐ下流で終結し、そしてｌａ ｃ起原の転写及び翻訳調節領域（ｌａｃオペレーター、リポソーム結合部位、翻 訳開始点）を、それがｌａｃオペロンにおけるｌａｃプロモーターに連結される のと同じ空間でプロモーターＰ２に連結する。この構成は、それがｌａｃオペロ ンに存在する場合、翻訳のために及び翻訳の調節のために最適な条件を提供する 。このプラスミドは、細胞の生理学的条件に依存して、種々の程度、プロモータ ーの活性を阻害するプロモーターＰ２の一１０領域の下流に約２５ｂｐの長さの Ｇ−Ｃに冨む配列要素を含まない。プロモーターの活性の調節におけるこの配列 要素の役割は、この実験において認識された（Ｌｕｋ５ｃｓｏｖｉｃｈ、　’ｒ 、など、Ｊ、Ｂａｃｔ、１６９．　（１９８７）２７２−２７７）。 そのような構成されたプロモーター（後で６／２３と命名された）の転写開始部 位は、ｌａｃ起原の配列に位置し、そしてたぶんｌａｃオペロン（ＧＧＡＡＴＴ ）の配列と同じであろう、プラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３により行なわれるこの プロモーター構成体は、他の類領する構成体よりも高いα−ペプチド遺伝子発現 を付与し、ここでｒｒｎＢ及びｌａｃ起原の異なった部分が他の部位で一緒に連 結されている。α−ペプチド遺伝子発現のレベルは、いわゆるα−相補性反応（ Ｍｉｌｌｅｒ　：　Ｅｘｐｅｒｉ＋ａｅｎｔｓ　ｉｎ　ＭａｌｅｃｕｌａｒＧｅ ｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　１９７２）の助け により分光光度方法により容易に測定される。さらにプロモーター構成６／２３ の利点は、追加の変更をより容易にする、異なった起原の２つの部分の連結部位 で創造されるユニークＮ５ｉｌ制限エンドヌクレアーゼ切断部位である。そのよ うな変更の最っとも有用な１つは、Ｎｓｉ　Ｉ切断部位の内部の４個のヌクレオ チド（Ａ　ＴＧＣＡ　Ｔ）を欠失することであり：これは、Ｎ５ｉｌエンドヌク レアーゼによる切断の後、た七えばＴ、　ＤＮＡ−ポリマラーゼ処理によりなさ れ得る。Ｔ、　ＤＮＡ−ポリマラーゼは、Ｎ５ｉＩ切断付着端の４個の過剰ヌク レオチドを消化する。そのようにして処理されたプラスミド分子をＴ、　ＤＮＡ −リガーゼにより連結する場合、プロモーターＰ２の一１０領域が損なわれない まま存続し、ところが転写開始部位は少々の塩基対下流に変えられているプロモ ーター構成体が得られる。この理由は完全に理解されないので、この変更は、翻 訳効力又は調節特徴を変えないで、さらに転写効力を高める。これらのプラスミ ド及びプロモーター構成体は、それぞれｐＥＲ−Ｖｌ／２３　（Ｎ５ｉ）及び６ ／２３　（Ｎｓｉ　）、と命名されるであろう、第７図は、プロモーター６／２ ３及び６／２３　（Ｎｓｉ　）の配列を示す。 ５、　プラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３　［Ｎｓｉ　）及びｐＥＲ−Ｖｌ／２３は 、発現ベクターのためのほとんどの必要条件を満たす、しかしながら、それらの 有意な欠点的特徴は、外来性遺伝子における限定された構築の可能性である。こ れは、２つのユニーク制限エンドヌクレアーゼ切断部位によってのみ可能にされ る。 それらの部位とは、α−ペプチドのコード領域及びこのコード領域のすぐ後の領 域にそれぞれ位置するＰｖｕ　Ｉｆ及びＨｉｎｄｎＩである。追加の変更の目的 は、すべての３種の読み枠を整合して、通常多く使用される制限エンドヌクレア ーゼの助けにより外来性遺伝子の構築を可能にする種類のベクターを創造するこ とであった。このベクタ一種を構成する場合、追加の必要条件は、個々のタンパ ク質として及び融合タンパク質として（ここでそれは、Ｅ、コリの安定タンパク 質に融合される）、外来性遺伝子の発現を可能にすることであった。（この後者 の溶液は、発現されるべき外来性遺伝子の半減期が細菌細胞、たとえばヒトプロ インシュリンにおいてひじょうに短い場合に必要とされる。そのような場合、Ｅ 、コリ起源の融合タンパク質のＮ−末端部分は、分解から不安定な外来性タンパ ク質を保持することができる）。 上記必要条件を満たすベクタ一種（ｐＥＲ−Ｖｌ／２３と命名される）の構成が 、後で記載されるであろう。これらのｐＥＲ−ＶＩ／２３タイププラスミドの構 成の後、ｐＥＲ−Ｖｌ／２３　（Ｎｓｉ　）タイププラスミドが上記方法に従っ て創造された。遺伝子発現のレベルの増強は、すべての場合で経験された。 第１段階として、πＶＸミニプラスミド起原起源、Ｍａｎｉａｔｉｓなど＋ｌ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ　；　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　（１９８２）、３５３ペー ジ）の１０９塩基対の長さの旧ｎｄＩ［［−Ｈｌｎｄｌ［［ポリリンカーを、プ ラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３のユニークＨｉｎｄＩ［［切断部位に配列向を合わ してクローン化した。このポリリンカーは、２個の旧ｎｄＩ［［切断部位の他に 、Ｃ１ａ　Ｉ　＋　ＥｃｏＲＩ　＋Ｂａｗｌ　Ｉ　、　Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｂｇｌ 　ＩＩ及びＸｂａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む（第８図を参照の こと）。得られたプラスミドは、ｐＥＲ−Ｖｌ／２３　ＰＬＨ４及びｐＥＲ−Ｖ ｌ／２３　ＰＬＨ５と命名され、それらは第８図に示される配向で及び反対の配 向でそれぞれポリリンカーを含む。これらのプラスミド構成体及びそれらの誘導 体においては、融合タンパク質としてα−ペプチドと一緒に発現される外来性遺 伝子の組込みを可能にするポリリンカー領域にすべての３種の読み枠を整合して 位置する少なくとも１個のユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位が存在する。 異なった外来性遺伝子が、最大の保護を得るために異なった長さのβ−ガラクト シダーゼに融合されるべきであることは文献から知られている。従って、前記ベ クタ一種の複数のメンバを構成した。ｌａｃ　Ｚ遺伝子（Ｅ、コリにおいてβ− ガラクトシダーゼをコードする遺伝子）の７３３ｂｐの長さのＰｖｕ　ｌｌ−Ｃ １ａ　Ｉフラグメントを、プラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３　ＰＬＨ４のＰｖｕ　 ＩＩ　−Ｃ１ａ　１部位にクローン化した。このフラグメントは、β−ガラクト シダーゼの追加の２４４個のアミノ酸をコードする。その得られたプラスミドを 、ｐｍｅｄ／２３と命名した。 ｌａｃ　Ｚ遺伝子の１６２１ｂｐの長さのＰｖｕ　ＩＩ　ＥｃｏＲＶフラグメン トを、クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ　；プラ スミドｐＢＲ３２９に起因する、Ｇｅｎｅ　１７．　（１９３２）７９〜８９） をコードする遺伝子の１５０ｂｐの長さのＰｖｕ　Ｕ　−ＥｃｏＲＩフラグメン トにプラント末端で連結した（ＥｃｏＲＶ及びＰｖｕ　Ｕプラント末端も一緒に 連結した）、その得られた１７７１ｂｐの長さのＰｖｕ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩフ ラグメント（１つの長さの読み取り枠である）を、プラスミドｐＥＲ−ＶＩ／２ ３　ＰＬＨ４のＰｖｕ　１１−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。その得られた プラスミドを、ｐｔ、−αＩｎｔ／２３と命名した。プラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／ ２３　ＰＬＨ４，ｐＥＲ−ＶＩ／２３　ＰＬＢ　５及びｐＬ−αＩｎｔ／２３の 高いコピー数のプラスミドもまた、構成した（ハンガリ特許出Ｍ　Ｔ　／３５２ ８０を参照のこと）。 前記ベクタ一種のメンバの助けにより、外来性タンパク質は、融合タンパク質の 一部として、すなわち初めの７０個（ｐＥＲ−Ｖｌ／２３　ＰＬＨ４，ｐＥＲ− ＶＩ−２３ＰＬＨ５）、初めの２８０個（ｐｍｅｄ／２３）又は初めの３９０個 （ｐＬ−αＩｎｔ／２３）のアミノ酸（これらはＥ、コリ起源である）（β−ガ ラクトシダーゼ、ＣＡＴ）として発現され得る。第９図は、前記プラスミドの図 的な表現を示す。 上記ベクター構成体はまた、損なわれていない外来性遺伝子を非融合形で発現す ることも可能にする。これは、Ｅ、コリ起源（ｌａｃ　Ｚ又はｌａｃ　Ｚ＋ＣＡ Ｔ）のコード領域上の翻訳開始が、発現されるべき外来性遺伝子の出発コドンの すぐ前で停止し、そして／又は外来性遺伝子が強いＥ、コリ　リポソーム結合部 位を有するように外来性遺伝子を構築する場合に生じるであろう、この場合、そ の構成は、２種の遺伝子を含む細菌性オペロンに類似して作用する。しかしなが ら、２種の遺伝子を含むシステムにおいて、遺伝子発現の最適化はしばしば、達 成困難である（結果は不確かである）、従って、損われていない遺伝子の発現に 一般的に使用される上記ベクタ一種の新しいメンバーを開発すべきである。この 目的を達成するためには、ｌａｃ調節配列が残るように、プラスミドｐＥＲ−Ｖ ｌ／２３ＰＬＨ４からのα−ペプチドをコードする領域を欠失せしめ、そしてｌ ａｃ調節配列に対して最適な間隔でもって、プラスミド中に適切な制限エンドヌ クレアーゼ切断部位を構築することであった。この構成作用の第１段階は、プラ スミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３　ＰＬＨ４（第７図を参照のこと）の小さなＮｓｉ　 Ｉ　−Ａｌｕ　Ｉフラグメントを同じプラスミドのユニークＮｓｉ　Ｉ　−Ｐｖ ｕＩＩ部位中に部位−ン化することであった。第７図に見られるように、前記Ａ ｌｕ　Ｉ部位は、翻訳開始コドンのすぐ下流に存在し、そして同時に、二〇Ａｌ ｕ　Ｉ切断部位の左半分は半分のＰｖｕ　Ｕ切断部位であることもまた明らかで ある。従って、前記２つのフラグメントの連結が正しい場合、プラスミドｐＥＲ −ＶＩ／２３ＰＬＨ４のユニークＰｖｕ　ＩＩ切断部位が再生されるであろう。 得られたプラスミドは、ＰＥＲ−ＶＩ／２３　［−ＡＴＧ　：ｌと命名され、そ してこの構成体は、自身のＡＴＧ翻訳開始コドンを有する外来性遺伝子を発現す るために適切である。 このタイプの外来性遺伝子は、それらを平滑末端化した後、新しく構成されたＰ ｖｕ　ＩＩ切断部位中に構築され得る。外来性遺伝子の効果的な発現は、それが ＡＴＧコドンの上流で８よりも多くない塩基対（好ましくは４塩基対）を有する 場合に可能である。この場合、外来性遺伝子の翻訳開始コドンとｌａｃ起原起源 ポソーム結合部位との間の空間は最適であり又は最適に近い。 合成遺伝子の発現を容易にするために、プラスミドｐＥＲ−ＶＩ／２３　（−Ａ ＴＧ　）をさらに変性した０合成Ｃ１ａ　１リンカ−（Ｃ１ａ　Ｉ切断部位を含 む）を、前記ユニークなＰｖｕ　ＩＩ制限切断部位中に構築した。新しく構成さ れたＣ１ａ　１部位とプラスミドのポリリンカー領域におけるＣ１ａ　Ｉ部位と の間のフラグメントが欠失された。これは、Ｃ１ａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ によるプラスミドの切断の後、大きい方のフラグメントの再環化により行なわれ た。得られたプラスミドは、ｐＥＲ−Ｖｌ／２３（＋ＡＴＧ　）と命名された。 このプラスミドは、ＡＴＧ翻訳開始コドンを有さない外来性遺伝子（主に合成遺 伝子）の発現のためにひじょうに最適である。このような外来性遺伝子は、Ｃ１ ａ　Ｉリンカ−をその末端に連結した後、このプラスミドのＣ１ａ　１部位中に 構築され得る。この場合、すなわち挿入体の配向が正しい場合、外来性遺伝子の 翻訳は、Ｃ１ａ　Ｉリンカ−のＡＴＧ配列で開始するであろう、このＡＴＧコド ンとｌａｃ起原起源ポソーム結合部位との間の距離は、８ｂｐであり、これはＥ 、コリにおいて最適である。このベクターはまた、もちろん、自身のリポソーム 結合部位を有する外来性遺伝子の発現のためにもひじょうに最適である。そのよ うな遺伝子のクローニングは、プラスミドのポリリンカー領域に位置する制限エ ンドヌクレアーゼ切断部位（Ｃ１ａ　Ｉ　＋　ＥｃｏＲ１＋　Ｂａｗｌ　１　＋ Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｂｇｌ　Ｉｆ　、　Ｘｂａ　Ｉ　、　ＨｉｎｄＩ［［）により 容易にされる。第１０図は、プラスミ）’ｐＥＲ−ＶＩ／２３　（−ＡＴＧ　） 及びｐＥＲ−Ｖｌ／２３（＋ＡＴＧ　）の図的な表現を示す。 前記のように、個々の上記プラスミドからのユニークＮ５ｉＩ切断部位の内部４ 塩基対の欠失の後、上記方法に従って、ｐＥＲ−νＩ／２３　（−Ｎｓｉ　）を 構成した。 この出願の次の部分においては、ベクタ一種類ｐＥＲ−Ｖｌ／２３（−Ｎｓｉ　 ）　０）Ｌ’　＜っがのメンバーの利用の例が与えられる。 Ｈの　ベタ　−によ　・　れる　ｔな゛　−Ωに里 本発明の発現ベクタ一種が当業界からの知られているベクタ一種よりもより効果 的な遺伝子発現を付与することを証明するために直接的な比較が行なわれた。 出発材料として上記“′理想責コンセンサス）のプロモーター（ｔａｃプロモー ター）を含んで成る発現ベクターｐ■２２３−３を用いて、プラスミド構成を行 ない（Ｊ、Ｂｒｏｓｉｎｓ　；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ１ｏｇｉｃａｌｓ第２７−４９３５−０１により） 、そしてこれは全α−ペプチドコード領域において及び３′及び５′非翻訳領域 においてプラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３の配列と完全に同一のヌクレオチド配列 を有する。これらの２種のプラスミドは、同じ複製タイプ（Ｃｏｌ　１）のもの であり、従って、それらが異なった量のα−ペプチド又はその＋ｅＲＮＡを供給 する場合、それは、たぶん、それらが担持する２種のプロモーターの間の差異に よって引き起こされる。 この比較は、ｍＲＮＡの半減期又は翻訳効率、等によって影響を受けない、これ らの異なったプラスミドにより産生される２種のｗ＋ＲＮＡは同一である。 プラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３　（Ｎｓｉ　）により産生されるｍＲＮＡは、上 記２種のプラスミドにより産生されるｍＲＮＡよりも４塩基対短く、そして他の 点においては、完全に同一である。産生されたｍＲＮＡ及びα−ペプチドの量を 測定することによって前記３種のプラスミドを比較する場合、同じ順序：　ｐＥ Ｒ−Ｖｌ／２３（−Ｎｓｉ　）　；　ｐＥＲ−ＶＩ／２３　；　ｐｌ［Ｋ２２３ −３誘導体であることが見出され、ここでそれぞれのベクターは、次のベクター よりも１．５〜２．０倍、高い発現を付与する。 次の例においては、モデルとして本発明の発現ベクターを試験した。 五−主 −シないで　ベタ　−　の　番による Ｅ　コ１　での　ンバク　の 外来性遺伝子を構築しないで、α−ペプチド（プラスミドｐ　ｗｅｄ　Ｖｌ／２ ３　［−Ｎｓｉ　］及びｐＬ−ａ　Ｉｎｔ／２３　（Ｎｓｉ　）におけるβ−ガ ラクトシダーゼのＮ−末端部分）の発現のレベルを、その酵素浩性を測定するこ とによってのみならず、また産生されるタンパク質の量を５Ｄｓ−ポリアクリル アミドゲル−電気泳動により測定することによって決定することができる。適切 なｌａｃ　Ｉ　’宿主細胞において、α−ペプチド産生は、誘発なしには見られ 得ない、３７°ＣでＹＴＢ培地中で対数相で増殖する細胞培養物が０．１〜５ｍ ＨのＩＰＴＧの添加により誘発される場合、遺伝子発現がプロモーター６　／２ ３　Ｃ−Ｎｓｉ　）から開始し、そしてその発現されたタンパク質が合計の細胞 タンパク質の２０〜６０％まで細菌細胞に蓄積する。 ■−土 ゛　−の　の′　ベタ　−　いてＥ　コ１　での　ンパク　の 本発明の新規ベクタ一種が一般的な使用のものであり、そして小さな及び大きな タンパク質の発現のために適切である（大きなタンパク質の発現は一般的にＥ、 コリにおいて問題である）ことを示すために、次の実験を行なった。 １、　クローン化されたＥ、コリのｌａｃオペロンのＣ１ａ　Ｉ　−Ｐｓｔｌフ ラグメントを、プラスミドｐＬ−ａ　Ｉｎｔ／２３　（−Ｎｓｉ　）のＣ１ａ　 ｌ　−Ｐｓｔ　１部位中に構築した（Ｐｓｔ）の部分消化の適用により、１つの ＰｓｔＩ部位のみを切断した）、１ａｃＺ遺伝子の完全なコード配列を、この手 段で構築した。１ａｃＺ遺伝子、すなわち酵素β−ガラクトシダーゼの生成物は 、Ｅ、コリの最大のタンパク質の１つである（Ｍｓｖ　；　１３５０００）　、 適切な宿主株において、ＩＰＴＧによる誘発後、この酵素を、酵素的な活性形で 有意な程度（合計細胞タンパク質の１５〜３０％まで）過剰生成することが可能 である。 λ　本発明の発現ベクターはまた、２種の遺伝子を含んで成る細菌性オペロンと して機能することもできる。細菌起源の２種の異なった外来性遺伝子を用いてこ の機能を試験した。 初めのそのような遺伝子は、プラスミドｐＢＲ３２９から単離された上記クロラ ムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子であった。 ｐＢＲ３２９から単離されたＴａｑ　Ｉフラグメントを、プラスミドｐＥＲ−Ｖ Ｉ／２３　［−Ｎｓｉ　］　ＰＬｔｌ　４のＣ１ａ　Ｉ部位中にクローン化した 。この構成において、ＣＡＴ遺伝子は、それ自体のリポソーム結合部位を用いて 、プロモーター６／２３　（Ｎｓｉ　）から発現される。その翻訳工程は、α− ペプチド及びＣＡＴ遺伝子のために共通である１つの長いｍＲＮＡ分子上で生じ る。誘発された細胞の合計細胞タンパク質のポリアクリルアミドゲル−電気泳動 の後、２つの最っとも長いタンパク質バンドは、α−ペプチド及びＣＡＴ−タン パク質に相当することがわかった。このプラスミド構成体はまた、プラスミド発 現融合タンパク質に変えられる。この変法の第１段階は、ポリリンカー領域の下 流のＢｉｎｄｌＩ［切断部位を欠失することであった。これは、Ｘｂａ　Ｉの切 断後、ＢＡＬ　３１エキソヌクレアーゼ消化により及びその後、Ｔ４リガーゼに よる再環化により行なわれた。 その後、追加の欠失を、残存するユニーク旧ｎｄｎ［部位でのプラスミドの切断 、ＢＡＬ　３１消化及び再環化により行なった。得られたプラスミドはα−ペプ チド融合タンパク質としてＣＡＴ遺伝子を発現し、そしてこのタンパク質は二官 能価酵素（β−ガラクトシダーゼのα−相補性及びクロラムフェニコール上での アセチルトランスファー）である。適切な条件下で、この融合タンパク質の蓄積 は、合計細胞タンパク質の８０％に達するであろう、（上記両プラスミドは、誘 発のレベルに依存して、宿主細胞のためにクロラムフェニコール耐性をある程度 付与する）。 ３、細菌起源の他の過剰生成された外来性遺伝子は、バシラススファエリカス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）において変性メチラーゼ遺伝子（Ｂ ｓｐＲＩ変性メチラーゼ）をコードする遺伝子であった。この遺伝子の生成物は 、Ｅ、コリ細胞の代謝に強く影響を及ぼす（ＤＮＡ結合及びメチル化酵素である ）事実にもかかわらず、このタンパク質の蓄積は、本発明の発現ベクターを用い て、合計細胞タンパク質の２〜４％に達することができる。 例に記載される実験においては、次の材料及び方法が使用一般的な使用の実験薬 品は、次の会社からの高品質のものであった：　ＲＥＡＮＡＬ、　ＳＩＧＭＡ及 び？ＩＥＲＣＫ　。 比活性：１００〜１５０ＴＢｑ／ｍＭを有するＴ−”Ｐ−ＡＴＰ及びａ　−２２ ｐ　−ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　ｇＮ製物は、Ｈｕｎｇａｒｉａｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ 　ｏｆ　ｌ５ｏｔｏｐｅｓ（ＩＺＩＮＴＡ。 Ｂｕｄａｐｅｓｔ）から得られた。 制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　＋　）Ｉｐａ　Ｉ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、　 Ｐｖｕ　Ｉｆ　＋ＥｃｏＲＩ、　Ｂｓｐｌ、　ＨｉｎｄＩ［［、Ｐｓｔｌ、　Ｂ ｇｌＩ［＋　ＸｂａＩ、　ＦｓｐｌＩは、出版された方法０１ｅｔｈｏｄ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｅｄ　；　Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ。 Ｖ、Ｍｏ１ｄａｖ６　、第６５巻、８９〜１８０ページ）に従って、Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｎｇａｒｉａ ｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓで単離された。制限エンドヌクレ アーゼＣ１ａ　Ｉ　、　Ｓｔｕ　Ｉ　、　Ｈｈａ　Ｉは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓからであった。 ＢＡＬ　３１エンドヌクレアーゼ及びフレノウ−酵素（Ｅ、コリＤＮＡ−ポリマ ラーゼ■大フラグメント）は、Ｎｅｕ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから得； 細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）はＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎから得；膵臓 ＲＮ−ａｓｅ及びリゾチームはＲＥＡＮＡＬから得た。 Ｔ４誘発ポリヌクレオチドリガーゼは、Ｍｕｒｒａｙなとの方法に従って調製さ れた（Ｍｕｒｒａｙ＋　Ｎ、Ｅ、＋　Ｂｒｕｃｅ、　Ｓ、Ａ、ａｎｄ　Ｍｕｒｒ ａｙ。 Ｋ　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｌｉｇ ａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔａ、　Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、　１３２（１９７９）、　４９３〜５０５）。 珠及グプ旦スま上 Ｅ、コリ　ＨＢＩＯＩ（ｐｒｏ、１ｅｕ、　ｔｈｉ、　ｌａｃ、　ｓｔｒ＠、　 ｒ、　ｒａ、　ｅｎｄｏｌ＋ｒｅｃＡ　：　Ｂｏｙｅｒ＋　Ｈ，Ｗ、、　Ｒｏｕ ｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、　Ｄ　：　Ａ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ−ｔｉｏ ｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　＋ｍ ｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＤＮＡ　ｉｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ ｉｏｌ、　４Ｈ１９６９）、　４５９〜４７２　；　ＭＮＧ００２９１）。 Ｅ、コリ　ＥＤ８８００（ｓｕｐＥ、　５ｕｐＦ＋　ｈａｄｓ＋　ｍｅｔ、　１ ａｃＺＭ１５゜ｒｅｃＡ５６　：　Ｍｕｒｒａｙ、Ｎ、Ｅ、、Ｂｒａｍｍａｒ、 Ｗ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｕｒｒａｙ＋　Ｋ　：Ｌａｍｂｏｉｄ　ｐｈａｇｅｓ　ｔｈ ａｔ　ｓｉｍｐｌｉｆｙ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。 ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ＋　ｌ’ｌｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１５０（１９ ７７）、　５３〜６１　；ＭＮＧ　００２９１）。 ｒｉｆ’　１Ｂ（Ｋｉｒｓｃｂｂａｕｍ、　Ｊ、Ｂ、ａｎｄ　Ｋｏｎｒａｄ、　 Ｅ、Ｂ、ｌ５ｏｌａｔｉｏｎｏｆ　ａ　５ｐｅｉａｌｉｚｅｄ　ｌａｍｂｄａ　 ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｃａｒｒｙ−ｉｎｇ　 ｔｈｅ　ｂｅｔａ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｒｉｂ ｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｐｏｌｙｗｅｒａｓｅ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１１６（１９７３）　５１７〜５２６）。 ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、、　Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ、　Ｒ，Ｌ、、 　Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、Ｊ、。 Ｂｅｔｈａｃｈ、　Ｉ’ｌｌ　Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｉｌｌ、Ｌ、、　Ｂｏｙｅ ｒ、　Ｈ，Ｗ、、　Ｃｒｏｓａ、　Ｊ、ａｎｄＦａｌｋｏｅｍ、　Ｓ　＝　Ｃｏ ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎ ｅｗｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ、Ｇｅｎｅ　２．　（１９７７）＋　９ ５〜１１３　；　ＭＮＧ　００２９８）＊ｐＬＢＵ３（Ｇｅｎｔｚ、　Ｒ，、Ｌ ａｎｇｅｒ、　Ａ、、　Ｃｈａｎｙ、　Ａ、Ｃ，Ｙ、、　Ｃｏｈｅｎ。 Ｓ、Ｎ、ａｎｄ　Ｂｕｊａｒｄ、　Ｈ：　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｎａｌｙ ｓｉｓ　ｏｆ　ｓｔｒｏｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｉｓ　ｍａｄｅ　ｐｏｓｓｉ ｂｌｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｐｌａｃｅ！ｌ１ｅｎｔｏｆ　 ａ　ＲＮＡ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７Ｂ。 （１９８１）４９３６〜４０１）。 ｐＨｃ３１４（Ｂｏｒｏｓ、１．、　Ｐｏ５ｆａｆ、　Ｇｙ、ａｎｄ　Ｖｅｎｅ ｔｉａｎｅｒ、　Ｐ　：八ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　 ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ−ｎｕ＋ｎｂｅｒ　ｐｌａｓ＋＋＋ｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ。 １９８４、ハンガソー特許出願第３２１２／８３号；　ＭＮＧ　００９８０）。 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＭ１０７（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，な ど：　ＩｍｐｒｏｖｅｄＭ１３　ｐｈａｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ 　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ　：　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎ ｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１３ｍｐ１８　ａｎｄ　ｐＵｃ１９　Ｖｅｃｔｏｒｓ 、Ｇｅｎｅ　３３　；（１９８５）、１０３〜１１９）。 Ｅ、コリ株を、１１当たり　Ｂａｃｔｏ−）リブトン１０ｇ、　Ｂａｃｔ。 酵母抽出物５ｇ及びＮａｃｌ　５ｇを含む富化液体培地中で増殖せしめた。固体 培地を、上記液体培地に１！当たり１５ｇのＢａｃｔｏ−寒天を添加することに よって製造した。α−ペプチド発現を評価するのに適切な指示薬プレートは、次 のものを含んで成る： カザミノ酸　２０ｇ ＮａｚＨＰＯａ　６　ｇ ＫＩｈＰＯａ　３　ｇ Ｂａｃｔｏ−寒天　１５ｇ Ｘ−ガル （ジメチル−ホルムアミド溶液中において）２０■ＭｇＣｊ！　ｚ　２ｍＭ ＣａＣｊ２　ｇ　０．１ｗＭ ａｇｏ　１　ｆ。 β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含んで成るプラスミドを担持する株を、 １００■／ｄのアンピシリンを含む培地中で増殖した。 プラスミドＤＮＡの単離は、そのプラスミドを担持する細菌株を１００ｘｒ／ｊ ！ｉ！のアンピシリンを含む培地中で増殖し、そしてプラスミドＤＮＡを単純化 するためにＯＤ＆。、、、＝０．７〜０．８で培地に１７０ｘ／１１ｄｔのクロ ラムフェニコールを添加することによって行なわれた。実験室規模でのプラスミ ドの単離は、Ｃｌｅｗｅｌｌ及びＨｅ１ｉｎｓｋ　；の方法（Ｃ１ｅｅｖｅ１１ ．　Ｄ、Ｂ、ａｎｄＨｅｌｉｎｓｋｉ、　Ｄ、Ｒ：　５ｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ　 ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐ−１ｅｘ　ｉｎ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　：　ｐｕｒｉｆｅｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｎｄ ｕｃｅｄｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｔｏ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｄ ＮＡ　ｆｏｒａ＋、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６２（１９６９）、　１１５９〜１１６６）に従って行なわれ た。得られた透明な溶解物をさらに、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５１００Ｏ（Ｐｈａ ｒｓａｃｉａ）クロマトグラフィーにより又は塩化セシウム／臭化エチジウムグ ラジェントにおける超遠心分離により精製した０分析規模のプラスミド単離（１ ，０〜１．５　ｄの細菌培養物から）を、ｌ５ｈ−Ｈｏｒｏｖｉ　ｔｚにより改 良されたＢｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏｌｙの酢酸カリウム法により行なった（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｌ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋　Ｅ、Ｆ、ａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ ＋　Ｊ、Ｉ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　ＨａｒｂｏｒＬａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２）　＊制限エンドヌ クレアーゼによるＤＮＡサンプルの切断を、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ａｂｓにより提案された条件に従って行なった。 付着性ＤＮＡ末端を、次のようにして平滑末端化した：ＤＮＡを、制限切断の後 、エタノールにより沈殿せしめ、そして５０Ｉｌ１Ｍのトリス−ＨＣｆ　（ｐＨ ＝７．４）　、７ｍＭのＭｇＣｌ　ｚ、１ｍＭのジチオトレイトール、Ｑ、１ｍ ＭのｄＡＴＰ、　０．１　ｍＷのｄＣＴＰ。 ０．１ｍＭのｄＧＴＰ及び０．１１ＲＭのＴＴＰを含む緩衝液中に１０〜２０ｍ まで再溶解した（ＤＮＡの濃度は２００〜２５０ｘ／ｄ！であった）。この反応 混合物を、ＤＮＡポリマラーゼ■クレノウフラグメント１〜２単位を添加した後 、３７°Ｃで１５分間インキュベートした。 付着性ＤＮＡ末端を、０．５〜１．ＯＲのＤＮＡ　、　６６＋ｓＭのトリス−Ｈ Ｃｊ！　（ｐＨ−７，６）　、５ｍＭのＭｇＣｊ！ｚ　、５ｍＭのジチオトレイ トール、１ｍＭのＡＴＰ及び１単位のＴ４誘発ポリヌクレオチドリガーゼを含む 反応混合物（３０〜４０ｍ）中で連結せしめた。 その連結混合物を、１４°Ｃで２〜３時間インキュベートした（Ｍａｒｉａｔｉ ｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ　 ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂ、＋　Ｎｅ５ｍ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２）　ｓ平滑末端化されたＤＮ Ａフラグメントを、３０〜４０ｇ／ｄのＤＮＡ、２５１ＩＭのトリス−ＨＣｌ　 （ｐＨ＝　７．４　）　、５ｍＭのＭｇｃｚ、　、５ｍＭのジチオトレイトール 、０．２５ｍＭのスペルミジン、１謡ＨのＡＴＰ　。 １０ｇ／Ｍ１のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　％タイプＶ）を含む混合物中において連結 した。’ｒａｆｆ１発ポリヌクレオチドリガーゼ４〜６単位を添加した後、その 反応混合物を、１４℃で８〜１２時間イ時間インキトベート ＤＮＡサンプルのアガロース（Ｓｉｇａ＋ａ、タイプ■）ゲル−電気泳動を、０ ．８〜２．０％のアガローススラブゲルを用いて、Ｂｅｌｌｉｎｇなど（１９７ ４）の方法に従って水平電気泳動タンク中で行なった。ＤＮＡサンプルのポリア クリルアミドゲル−電気泳動を、４及び８％の１肋の厚さのスラブゲルを用いて 、Ｍａｎｉａｔｉｓなどの方法０１ａｎｉａｔｉｓ、　１．、　Ｊｅｆｆｒｅｙ 　Ａ、ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅＳａｎｄｅ＋　Ｈ：　Ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ　 ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ｄｏｕｂｌｅａｎｄ　ｓｉｎ ｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙａｃ ｒｙｌａａｉｄｅ　ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　、！ｉ＋　（１９７５）３７８７〜３７９４）　？Ｔこ従って垂直装 置中で行なった。 アガロース及びポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡフラグメントの単離を、Ｄ ＥＡＥ紙を用いて、Ｗｉｎｂｅｒｙ、　Ｇ、及びＨａ＋ｕ＋ａｒｓｋｊ；ｌｄ、 　Ｍ、の方法（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ＤＥＡＥ−Ｐａｐｅｒ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ 　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒ ｕｓ　ｔｙｐｅ　１６ＤＮＡ＋　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、旦。 （１９８０）　２５３）に従って行なった。 ＤＮＡフラグメントのＢＡＬ　３１エンドヌクレアーゼ消化を、１１００ａ／ｄ のＤＮＡ　、６００ｍＭのＮａｃ　１２．１２ｅ＋ＭのＣａＣ１ｚ　、２０５Ｍ のトリス−ＨＣｊ！　（ｐＨ＝　８．０　）　、１．０　ｍＭのＥＤＴＡを含む 反応混合物中において３０℃で行なった。 必要とされる短縮の程度に依存して、０．４〜１．２単位の酵素を、１．ＯＲの ＤＮＡを含む混合物に添加した。試験反応を、種々のインキュベーション時間の 後、サンプルのゲル電気泳動により実際の短縮割合を決定するために、所定の酵 素調製物と共にそれぞれ所定のＤＮＡフラグメントに行なった。酵素反応を、フ ェノールにより反応混合物を抽出することによって停止せしめ、そしてエタノー ル精製の後、ＤＮＡ末端を、３′末端をラベルするために適切な条件下でタレノ ウポリマラーゼにより平滑末端化した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｒ、、　Ｆｒ１ｔ ｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ。 ａｎｄ　５ａｎｂｒｏｏｋ、　Ｊ　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋ 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１ ９８２）。 コンピテントＥ、コリ細胞を、Ｍａｎｄｅｌ及び旧ｇａのＣａＣｌ２法に従って ＨＢ　１０１．　Ｃ６００，ＩＭ　１０７及びＥＤ８Ｂ００株から製造した（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　５ａｎｂｒｏｏ ｋ＋、　Ｊ　：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ−＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２）。 ＤＮＡフラグメントの５′末端の脱リン酸化、ｒ　−”Ｐ−ＡＴＰを用いてのポ リヌクレオチドキナーゼによる末端ラベル化及びヌクレオチド配列の分析を、Ｍ ａｘａｓ、　Ａ、及びＧｔｌｂｅｒＬ　Ｗ−の方法に従って行なった（Ｓｅｑｕ ｅｎｃｉｎｇ　ｅｎｄ−１ａｂｅｌｌｅｄ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈｈａｓｅｓｐｅｃ ｉｆｉｃ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ 、６５＋　（１９８０）４９９〜５６０）。 本発明のベクター構成に使用される他の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ。 Ｔ　−＋　Ｆ　ｒ　ｉｔ　ｓ　ｃ　ｈ　ｔ　Ｅ　−Ｆ−及び５ａｅａｂｒｏｏｋ 、　Ｊ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１ ９８２）の実験マニュアルに示される手段に従った。 型皿■に里 星上園 プラスミドｐＢ８９の構造 ｐＢＲ３２２起原の部分は、二重線で描かれ、そしてｒｉｆ’　１Ｂ起原の部分 は濃い線で示されている。最っとも重要な遺伝子及び調節領域は、円内に示され ている。制限エンドヌクレアーゼ切断部位は矢印で示される。 略語： ａｍｐ’　：耐アンピシリン性を付与するβ−ラクタマーゼのための遺伝子； ｔｅｔ’　：耐テトラサイクリン性を付与するための遺伝子（ＢａＩＩｌｌ　Ｉ 部位中に挿入されるＤＮＡフラグメントにより、耐テトラサイクリン遺伝子は不 活性化された）；λ：形質導入ファージｒｉｆ’　１８からのフラグメントにお けるλ起原の部分； ５　Ｓ　；１６Ｓ；２３Ｓ　：オペロンｒｒｎＢの異なった成熟ＲＮＡ分子のた めの遺伝子； Ｐ、；Ｐｚ　：オペロンｒｒｎＢのプロモーター；Ｔ、；Ｔ、：オペロンｒｒｎ Ｂのターミネータ−；Ｐ　：ＰｓｔＩ　；Ｅ　：ＥｃｏＲＩ　；Ｈ：ＨｉｎｄＩ ＩＩ　；Ｂ　：ＢａｍＨＩ　；Ｓ　：　５ａｌＩ　；Ｈｐ：ＨｐｕＩ　；Ｐｖ： ＰｖｕＩｌ　；　Ｆ　：ＦｓｐＩＩ。 １１皿 プラスミドｐＢＢ９Δ９の構造 斜線部分は、ＢＡＬ　３１エキソヌクレアーゼ消化によりプラスミドｐＢ８９か ら欠失された部分である。略語は第１図における通りである。 玉主区 プラスミドｐＥＲ−ＶＩ／２３における異なった起原の２種の部分の連結点の囲 りのヌクレオチド配列。 」し口＆ プラスミドｐＢＢ９−　ｂ　２８の構造名称及び略語は、第１及び２図における 通りである。斜線部は、プラスミドｐＢＢ９から欠失された部分である。 １−凹 プラスミドｐ４０８−５の構造 名称は上記の通りである。 第１図 ｐＥＲタイプのプラスミドを得るためにオペロンｒｒｎＢ及びｌａｃの部分を一 緒にする構築 プラスミドｐ４１９−１０からのｐＥＲタイプのプラスミド及びプラスミドｐＩ ＢＵ３のフラグメント”　Ｂ　”　（ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　）の構 成が、詳細に示される。略語：　Ａｐｌ　：耐アンピシリンのための遺伝子；Ｒ ｏ　：複製起点；Ｔ１及びＴ２　：オペロンｒｒｎＢのターミネータ−；Ｐ２　 ：オペロンｒｒｎＢの１つのプロモーター；１６Ｓ及び５Ｓ：オペロンｒｒｎＢ の残存する部分。“Ｇａ　ｔｅｓ″は欠失を意味する。上部左のパネルは、プラ スミド種ｐＥＲを表わし、このメンバーは、ＢＡＬ　３１欠失の長さにおいて単 にお互い異なる。（Δ印のまわりの複数のｇａ　ｔｅｓ″は、異なった長さの欠 失を意味する。） 里１０ プラスミドｐＥＲ−ＶＩ／２３及びｐＥＲ−ＶＩ／２３　ＣＮｓｉ　）　ニおけ るプロモーターのヌクレオチド配列 それぞれａ）プラスミドｐＥＲ−Ｖｌ／２３及びｂ）プラスミドｐＥＲ−Ｕ／２ ３　（Ｎｓｉ　）におけるｒｒｎＢ及びｌａｃオペロンに起原の連結部分。 名　称：・・・・・　：　ｒｒｎＢ　Ｐｚの上流のＡＴに冨むプレープロモータ ー領域 −−−〜−：　ｒｒｎＢ起原の起源であるプロモーター６／２３の一３５領域 ＝・・・・　：　ｒｒｎＢ起原の起源であるプロモーター６／２３の一１０領域 ｘｘ：転写開始部位 −Ｊｖｗ：　ｌａｃ起原起源ポソーム結合部位。 ブロック体で書かれている配列の部分は、オペロンｒｒｎＢからであり、そして イタリンク体で書かれている他の部分はｌａｃ起原起源のである。ｌａｃオペロ ンのオペレーター遺伝子及びα−ペプチドの初めの数個のアミノ酸は、この配列 に示されている。 星１区 ＰＬＨＪタイプのプラスミドに存在するような配向でのπＶＸ起原起源ｉｎｄ　 ｍ　−Ｈｌｎｄ　ｍポリリンカーのヌクレオチド配列。 １及び川口 新規発現ベクタ一種の図的な表示 アンピシリン耐性のための遺伝子（Ａｐ”）　、複製起点（ＯＲＩ）、プロモー ター６／２３／　（Ｎｓｉ　）　（Ｐ）　、リポソーム結合部位（ＳＤ）及び２ 個の終結領域（Ｔ＋　、Ｔ２）が、プラスミド分子を示す円上に示されている。 波状の線により示される部分は、プラスミド種の個々のメンバーに特有である。 この分子のこの部分の詳細な表示は、次のようないくつかの略語を包含する：工 ：β−ガラクトシダーゼの種々の部分をコードする配列１ＣＡＴ：クロラムフェ ニコール−アセチル−トランスフェラーゼをコードする配列。クローニングのた めに適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位もまた、示されている（ＰｖｕＩＩ 、　ＨｉｎｄＩｎ、　Ｃ１ａｌ、　ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨｌ、　Ｐｓｔｌ、　 Ｂｇｌｌｌ＋Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｈｐａ　Ｉ）。（ＥｃｏＲＶ　／　Ｐｖｕ　ＩＩ 　）は、−緒に構築された２種の制限部位を意味し、そしていづれか１つの酵素 により再切断され得ない。 正氏豆れ太四珠 株／プラスミドの記号　寄託番号　寄託の日ｐＢ８９　ＭＮＧ　００３００　３ １．１０．１９８４゜ｐ４０８−５　ＭＮＧ　００３０１　３１．１０．１９８ ４゜ｐ８２７−１０　ＭＮＧ　００３０７　３１．１０．１９８４゜Ｅ、コリ　 ＨＢＩＯＩ　ＭＮＧ　００２９０　２５．０７．１９８４゜ｐＥＲ−νＩ／２３ 　Ｎｓｉ　ＮＣＡＩＭ　Ｂ／Ｐ　００１０１６　１８．０６．１９８７゜ｐＥＲ −ＶＩ／２３　ｐＬＨ４ＮＣＡＩＭ　Ｂ／Ｐ　００１０１４　１８．０６．１９ ８７゜ｐＥＲ−ＶＩ／２３　ｐＬＨ５ＮＣＡＩＭ　Ｂ／Ｐ　００１０１５　１８ ．０６．１９８７゜Ｆｉｇ、１ ＣＡＣＡＴｒＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＣＡ　ＣＴＧＡ　ＣＡ　ＣＧ　Ｇ Ａ　Ａ　ＣＡＡ　ＣＧＧＦｉｇ、４ Ｆｉｇ、５ 第６図 ｐＥＲＶＸ７２３ Ａｌｕ　！ ＡＡ：Ｔ（ＭＡＧＣＧ（ＡＴＡＡＣＡＡ！グｒｃＡｃＡｃＡｃｃＡＡＡｃＡｃｃ ｒｙｃＡｃｃＸＸ　−−−−一睦一−−−−−＋＋−−１ｏＣオペレーターーー 　馳ｔＴｈｒ 半分の　Ｐｖｕ　Ｉｆ ｐＥＲＶＩ／２３　［−Ｎｓｉ］ ＡＡ７７（：ＪＧＡにＣＯＣ；Ａ７ＡＡＣＡＡグＴＴＣＡＣＡＣＡにＣＡＡＡＣ ＡＧＣグＡＴＣＡＣＣ新規発現ベクタ一種の２的な表示 第７０図 国際調査報告 ＰＣｌ、、ＩＩＪ　ＥＬＳ１０００６１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．領域−３５及び−１０以外で、領域−１０から下流でＥ、コリのリボソーム ＲＮＮオペロン（ｒｒｎ）のプロモータ−Ｐ２及びＥ、コリのＩａｃオペロンの いくつかの調節配列を一緒に連結することによって構成されるプロモーターであ って、領域−１０のすぐ下流でＴＧＣＡ配列成分の欠失を特徴とするプロモータ ー。
2. ２．下記ヌクレオチド配列： 【配列があります】 領域　−３５　　　　領域−１０（１つｒｒｎＢ起原の部分　のＴヌクレオチ 　　　　　　　　　　ドがない） 【配列があります】 ｌａｃ起原の部分 を有するプロモーター。
3. ３．請求の範囲１又は２記載のいづれかのプロモーターを担持することを特徴と する発現ベクター。
4. ４．請求の範囲１又は２記載のいづれかのプロモーターを担持し、さらにＩａｃ オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、β−ガラクトシダーゼのＮ −末端アミノ酸をコードする配列、種々の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、転 写ターミネーター、耐アンピシリンをコードする遺伝子及びＥ、コリ中で機能す る複製起点を担持することを特徴とする発現ベクター。
5. ５．第９及び１０図に示されるような発現ベクター。
6. ６．請求の範囲３〜５のいづれか１項記載の発現ベクターにより形質転換された Ｅ、コリ細胞。
7. ７．請求の範囲１又は２のいづれか１項記載のプロモーターの構成方法であって 、適切なベクターに構築されるＥ、コリのリボソームＲＮＡオペロン（ｒｒｎオ ペロン）のほとんどの部分を欠失し、ｒｒｎ及び　ＩａＣオペロン起原の配列の 連結点で新規のＮｓｉＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を創造するために、領 域−３５及び−１０以外で、それらの領域の下流で、プロモーターＰ２含有のｒ ｒｎオペロンの残存部分とＩａｃオペロンの初めの部分とを一緒に連結し、そし て新しく創造されたＮｓｉＩ切断部位から内部のＴＧＣＴ配列成分を欠失せしめ ることを特徴とする方法。
8. ８．請求の範囲３〜５のいづれか１項記載の発現ベクターの構成方法であって、 適切なベクターに構築されるＥ、コリのリボソームＲＮＡオペロン（ｒｒｎオペ ロン）のほとんどの部分を欠失し、ｒｒｎ及びＩａＣオペロン起原の配列の連結 点で新規のＮｓｉＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を創造するために、領域− ３５及び−１０以外で、それらの領域の下流で、プロモーターＰ２含有のｒｒｎ オペロンの残存部分とＩａｃオペロンの初めの部分とを一緒に連結し、新しく創 造されたＮｓｉＩ切断部位から内部のＴＧＣＴ配列成分を欠失し、そしてこれら の新しく創造された調節配列間に発現されるべき構造遺伝子を構築することを特 徴とする方法。
9. ９．前記発現ベクターの構成のために、成熟ＲＮＡ分子をコードする配列に欠失 端を含むｒｒｎオペロンを用いることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法 。
10. １０．ベクター分子としてプラスミドｐＢＲ３２２を用いることを特徴とする請 求の範囲第８又は９項記載の方法。
11. １１．Ｅ、コリ宿主細胞中にタンパク質を過剰産生するための方法であって、請 求の範囲第３〜５項のいづれか１項記載の発現ベクターを使用することを特徴と する方法。