SE454596B - Plasmid, forfarande for dess framstellning, bakteriecell innehallande densamma, forfarande for transformering av bakterieceller samt forfarande for expression av ett protein - Google Patents

Description

454 596 genen kommit till uttryck _ var ringa;-och man erhöll långsamt tillväxande bakte- rier (se t.ex. Carbon, J., et al, (1977), Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Raven Press, New York, 355-378).

Det visade sig också att klonad musmito- kondrie-DNA transkriberades i E. coli från fel DNA- sträng (se t.ex. Brown, W.M., et al, (1976), Cell, 1, 517-530).

Strukturen hos plasmiderna enligt före- hggandeuppfinning är baserad på anordnandet avettinsätt- ningsställe, särskilt ett Hind III ställe, för ett valt eukaryotiskt DNA-fragment, varvid detta insätt- ningsställe är beläget intill en bakteriell promotor, t.ex. en trp-promotor, så att transkriptionen och över- sättningen av DNA-fragmentet ligger under promotorns kontroll. De enligt uppfinningen avsedda plasmiderna skall i regel även i den direkt efter insättningsstäl- let följande regionen förses med genen för tetracyk- linresistens; detta är ett lämpligt medel för att ef- ter insättandet av den valda DNA vid insättningsstäl- let få bekräftelse på den av promotorn kontrollerade transkriptionen och översättningen av den insatta DNA.

Det förhåller sig nämligen så att när transkriptionen och översättningen har skett, så bibehålles tetracyk- linresistensen.medan däremot i de flesta fall tetracyk- linresistensen förstörs när transkription och översätt- ning icke har utförts.

Uppfinningen avser sålunda en plasmid, som kännetecknas av att den har ett insättningsställe för ett eukaryotiskt DNA-fragment intill en bakteriell trp-promotor, trp-E-gen och trp-D-gen och nedströms ett prokaryotiskt ríbosombindnings- ställe, att den har ett trp-ínitiatorkodon av sådant slag att den bakteriella trp-promotorn kontrollerar transkription och att den har karakteristika enligt något av följande alternativ A) - G): translation av ett insatt DNA-fragment, och .-.i 454 596 A) denna A)-plasmid har en molekyllängd av 9866 bp; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Eco RI ställe 3709 bp från Sal I; ett andra Hind III ställe 31 bp från Eco RI; ett Hpa I ställe 305 bp från det andra Hind III; ett andra Hpa I ställe 3250 bp från det första Hpa I och 1950 bp från det första Hind III, varvid hos denna A)-plasmid trp~promotorn, E-genen och en del av D-genen ligger i den 1950 bp långa delen mellan det andra Hpa I stället och det första Hind III stället; genen för tetracyklinresistens följer direkt efter det första Hind III stället och genen för ampicillinresistens ligger i den 3709 bp långa delen mellan Sal I stället och Eco RI stället; denna A)-plasmid kallas pEH3; B) denna B)-plasmíd har en molekyllängd av 9866 bp; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III stället; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Eco RI ställe 3709 bp från Sal I; ett andra Hind III ställe 31 bp från Eco RI; ett Hpa I ställe 1950 bp från det andra Hind III stället; ett andra Hpa I ställe 3250 bp från det första Hpa I och 305 bp från det första Hind III, varvid hos denna B)-plasmid trp-promotorn, E-genen och en del av D-genen ligger i den 1950 bp långa delen mellan det andra Hind III stället och det första Hpa I stället; genen för tetracyklinresistens följer direkt efter det första Hind III stället och genen för ampicillinresistens ligger i den 3709 bp långa delen mellan Sal I stället och Eco RI stället; denna B)-plasmid kallas pEH4; C) denna C)-plasmid har en molekyllängd av 6750 bp; ett Hind III ställe; ett Bam HI ställe 346 bp fràn Hind III stäl- let; ett Sal I ställe 275 bp fràn Bam HI stället; ett Hpa I ställe 4230 bp från Sal I stället och 1950 bp från Hind III stället, varvid hos denna C)-plasmid trp-promotorn, E-genen och en del av D-genen ligger i den 1950 bp långa delen mellan Hpa I stället och Hind III stället; genen för ampicillin- resistens ligger i den 4800 bp långa delen mellan Hind III stället och Hpa I stället; denna C)-plasmid kallas pEH5; D) denna D)-plasmid har en molekyllängd av 4874 bp; ett Eco RI ställe; ett Hind III ställe 31 hp fràn Eco RI; ett Hpa I ställe 313 bp från Hind III; ett andra Hind III ställe 199 bp 454 596 från Hpa I; ett Bam I ställe 346 bp från det andra Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I och 752 bp från 'Eco RI; genen för tetracyklin- resistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I; genen för ampicillinresistens i Pst I ställets område och den klonade delen av trp-operonet omfattar området mellan promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I och det andra Hind III stället; denna D)-plasmid kallas pWT101; E) denna E)-plasmid har en molekyllängd av 4823 bp; ett Hpa I ställe; ett Hind III ställe 199 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I och 1045 bp från Hpa I; genen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I stället; genen för ampicillinresistens i Pst I ställets omrâde och den klonade delen av trp-operonet omfattar omrâdet mellan promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I och Hind III ställena;> denna E)-plasmíd kallas pWT111; F) denna F)-plasmid har en molekyllängd av 4837 bp; ett Hpa I ställe; ett Hind III ställe 206 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 353 bp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 bp fràn Sal I och 1045 bp från Hpa I; genen för tetracyklinresístens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I stället; genen för ampicillínresistens i Pst I ställets område och den klonade delen av trp-operonet omfattar området mellan promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I stället och Hind III stället; denna F)-plasmíd kallas pWT121 och dess läsramsfas är förskjuten med 1 bp i förhållande till pWT111; G) denna G)-plasmid har en molekyllängd av 4851 bp; ett Hpa I ställe; ett Hind III ställe 213 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 360 bp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I och 1045 bp från Hpa I; genen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I stället; genen för ampicillin- resistens i Pst I ställets område och den klonade delen av trp-operonet omfattar omrâdet mellan_promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I stället och Bind III stället; PTS 454 596 denna G)-plasmid kallas pWT131 och dess läsramsfas är förskju- ten med 2 bp i förhållande till pWT111.

En sådan plasmid kan framställas medelst ett för- farande, enligt vilket en bakteriell promotor klonas in i en isolerad plasmid, läget för ett avsett insättningsställe bestämmes, och detta insättningsställe, om det icke redan finns, anordnas i plasmiden.

En vektor kan framställas med användning av en dylik plasmidf genom att cellu- lär DNA omsättes med ett specifikt restriktionsenzym, det promotorn innehållande fragmentet isoleras och detta fragment klonas i en lämplig bakteriell plasmid.

Enligt en annan aspekt avser föreliggan- de uppfinning en sådan plasmid med däri insatt eukaryo- tiskt DNA-fragment vid insättningsstället.

Det eukaryotiska DNA-fragmentet kan in- sättas i den förberedda plasmiden i enlighet med kän- da metoder.

Som exempel kan nämnas att en av de en- ligt uppfinningen avsedda plasmiderna är den, vars karameristika anges schematiskt i fig. 1. Den har en molekyllängd uppgående till 6750 baspar (förkortat bp), ett Hind III ställe, ett Bam HI ställe 346 bp från Hind III stället, ett Sal I ställe 275 bp från Bam HI stället, ett Hpa I ställe 4230 bp från Sal I stället och 1950 bp från Hind III stället. Hos denna plasmid ligger trp-promotorn, E-genen och en del av D-genen i den 1950 bp långa del, som sträcker sig från Hpa I stäl- let till Hind III stället, medan genen för ampicillin- resistens ligger i den 4800 bp långa delen mellan Hind III stället och Hpa I stället.

Likaledes enbart i exemplifierande syfte kan anföras att denna plasmid som här kallas pEH5, kan framställas på följande sätt: (a) Isolering av Hind III trpE fragmentet 454 596 Detta fragment kan erhållas antingen ge- nom att en DNA från vilken som helst av de flesta E. coli stammar, t.ex. E. coli stam W3110, omsättes med 2 Hind III (EC3.1.23.21), eller genom att plasmiden pRH1/ trpE omsättes med Hind III. Själva pRH1 erhölls genom att E. coli plasmider pDS1118 och pML2 omsattes med Eco RI (EC3.1.4.32)vafp5 de så erhållna fragmenten ! ligerades, och selektion verkställdes för utväljande av ampicillin- och kanamycinresistens. Genom omsättning av pRHI med Hind III och ligeriåähäe Bind III omsatt DNA från E. coli Stan\W3110, med efterföljande transfor- mation till stam W3110 trp OEV1 och odling i frånvaro av tryptofan erhölls pRH1/trpE.

I (b) Kloning av Hind III trpE fragmentet Hind III trpE fragmentet, som erhållits pâ ovan beskrivet sätt,ligerades kovalent till ett fragment, som erhållits genom att plasmiden pBR322 be- handlats med restriktionsenzymet Hind III (Hind III restriction); se t.ex. Bolivar, F., et al, (1977), Gene, 2, 95-113l Den ligerade DNA användes för transformering av E- coli W3110 trp oEV1, och kolonier utvaldes med avseende på ampicillinresistens och tryptofankomplemen- tering. De erhållna plasmiderna visade sig vara av två typer, beroende på fràgmentens orientering under lige- ringen; dessa båda plasmider, som här kallas pEH3 och pEH4, illustreras i fig. 2 resp. fig. 3. Plasmiden pEH3 valdes på basis av sin tetracyklinresístens och användes för nästa stadium vid framställningen av de enligt föreliggande uppfinning avsedda plasmiderna.

Plasmiden pEH3 har följande karakteristika: Molekyllängd 9866 bp; ett Hind III stäl- le; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; och ett Eco RI ställe 3709 bp från Sal I; ett andra Hind III ställe 31 hp från Eco RI; ett Hpa I ställe 305 bp från det andra Bind III; ett andra Hpa I ställe 3250 hp från det första Hpa I stället och 1950 bp från det första Hind III stället. 454 596 Hos denna plasmid ligger trp-promotorn, E-genen och en del av D-genen i den 1950 bp långa delen mellan det É andra Hpa I stället och det första Bind III stället; genen för tetracyklinresistens ligger direkt i anslut- ning till det första Hind III stället, och genen för ampicillinresistens ligger i den 3709 bp långa delen mellan Sal I stället och Eco RI stället. ' (c) Eliminering av Bind III _ stället intill Eco RI stället hos E pEH3 pEH3 omsattes med Eco RI för bildning av linjära molekyler, som omsattes med exonukleas III (EC 3.1.4.27) och sedan med S1 nukleas (EC 3.1.4.-) för avlägsnande av de vid S'-änden uüstående svansarna och bildning av jäms avskurna ändar. Sedan ligerades de linjära molekylerna med T4-inducerat DNA-ligas (EC 6.5.1.1); den sålunda erhållna plasmiden användes för att transformera trp oEV1 stammen och underkastades se- lektion för utväljande av exemplar med trp-komp1emente- ring och ampicillinresistens. Pâ så sätt erhölls den plasmid enligt föreliggande uppfinning, som kallas pEH5 och åskâdliggöres i fig. 1.

Plasmiden pEH4 har följande karakteris- tika: Molekyllängd 9866 bp; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III stället; ett Sal I ställe 275 bp frán Bam I stället; ett Eco RI ställe 3709 bp från Sal I stället; ett andra Hind III ställe 31 bp från Eco RI stället; ett Hpa I ställe 1950 bp från det andra Hind III stället; ett andra Hpa I ställe 3250 bp fràn det första Hpa I stället och 305 bp från det första Hínd III stället. Hos denna plasmid ligger trp-promotorn, E-genen och en del av D-genen i den 1950 bp långa delen mellan det andra 454 596 Hind III stället och det första Hpa I stället; genen för tetracyklinresistens ligger direkt efter det förs- ta Hind III stället, och genen för ampicillinresistens ligger i den 3709 bp långa delen mellan Sal I stället och Eco RI stället. Denna plasmid kallas pEH4. Den kan framställas på liknande sätt som pEH3 med undantag av att selektionen verkställes på basis av tetracyklinkäns- lighet.

Såsom ovan omnämnts är det en speciell fördel hos föreliggande plasmider att de uppvisar ett väldefinierat ställe som är lämpligt för införandet av ett önskat eukaryotiskt DNA-fragment samt att plasmi- dernas struktur är sådan att den införda DNA-bitens transkription kontrolleras av den promotor, särskilt en trp-promotor, som hör till det definierade införings- stället, t.ek. Hind III stället hos den i fig. 1 visa- de plasmiden pEH5. Denna plasmid utgör därför en värde- full sista mellanprodukt, av vilken man kan framställa plasmider, hos vilka vid införings- eller insättnings- stället, t.ex. Hind III stället, genetisk information är insatt i form av på lämpligt sätt modifierad DNA - 10 15 20 25 30 35 40 454 596 9 så konstruerad att den ger en önskad polypeptidprodukt.

Generellt kan sägas att framställningen eller iordningställandet av den erforderliga DNA är ett känt förfarande, liksom även dess modifiering i _och för insättning, förfaringssätten vid insättningen samt de efterföljande processerna för proteinframställning. He- la denna metodik kan beskrivas summariskt och exempli- fieras på följande sätt: 1) Källa för DNA som skall insättas För insättning avsedd DNA kan erhållas enligt olika metoder. T.ex. kan oligonukleotider med olika längd syntetiseras enligt kända förfaranden (se t.ex. Hsiung et al. (1979), Nucleic Acids Research Q, 1371-1385).

Fleraoligonukleotiderkan sammanföras på grund av sina specifika basparningsegenskaper. På så sätt bildas då längre, av två strängar bestående mole- kyler. De däri ingående oligonukleotiderna kan ligeras med hjälp av enzymet DNA-ligas.

Alternativt kan DNA-molekyler med önskad genetisk specificitet syntetiseras genom användning av enzymet reverstranskriptas. Som mall användes då en RNA med den önskade specificiteten. Denna RNA kan isoleras ur celler i enlighet med kända metoder. 2) Framställning av den för insättning lämpliga DNA DNA kan modifieras enligt olika metoder i och för insättning i plasmiden. Exempelvis kan en en- ligt ovan framställd DNA förlängas vid 3'-änden av var- dera strängen medelst enzymet terminaltransferas (EC 2.7.7.31), så att ett homopolymert förlängningsstyc- ke, som är ensträngigt, erhålles. På liknande sätt kan 3'-änden av den med Hind III omsatta plasmiden förläng- as. Om den behandlade DNA:s förlängning är bildad av (dA)n och plasmidens förlängning är bildad av (dT)n, eller vice versa, eller om den behandlade DNA:s för- längning är bildad av (dG)n och plasmidens förlängning av (dC)n, eller vice versa, kan den för insättningen förberedda DNA och plasmiden hybridiseras medelst des- sa ensträngsförlängningar, så att cirkulära molekyler 10 15 20 25 30 35 40 454 596 10 erhålles i vilka den preparerade DNA är insatt vid plas- midens Hind III ställe. Sådana plasmider kan användas för transformering av E. coli celler, och kolonier av de transformerade cellerna kan utväljas genom selektion enligt kända förfaranden [se t.ex. Glover, D., New Tech- niques in Biophysics and Cell Biology, (Eds. Pain, R.H., och Smith, B.J.), Q, 125-145, (Wiley, New York, 1976).] Alternativt kan ändarna av den enligt ovan framställda DNA ligeras medelst enzymet DNA-ligas till korta två- strängsDNA-molekyler (Hind III påkopplingslänkar; kan erhållas från Collaborative Reserach, Waltham,.Mass., USA). Dessa molekyler innehåller den sekvens, som känns igen av restriktionsenzymet Hind III. När de efter lige- ringen omsättes med nämnda enzym, bildas Hind III ändar vid den behandlade DNA:s ändpartier. Den behandlade DNA 'kan sedan insättas i plasmiden, efter att på känt sätt ha omsatts med Hind III. _ 3) Framställning av peptiden Med hänsyn till dels ovanstående data, dels vad som är känt beträffande bakteriella promoto- rers verkningsmekanism, kan man dra följande slutsats: När operatorn är öppen, försïggâr den från promotorn ut- gående transkriptionen från trpE och trpD genom Hind III stället in i regioner av genomen, vilka ligger bortom Hind III stället. “förbiläsning" Efter en sådan ger sedan översättning- en av transkriptionsprodukten en s.k. "förbiläst" polypeptid (read-through polypeptidäl som är associerad till D-genen (med mindre än att ett stopp- kodon är inkorporerat i den insatta DNA). Den bildade polypeptiden kan identifieras enligt kända metoder, t.ex. genom.att plasmiden införes i en stam, som produ- cerar miniceller (se t.ex. Meagher, R.B. (1977), Cell, lg, 521-536), i vilka polypeptidprodukter av plasmidge- nomer lätt kan fastställas - eller genom att man anli- tar immunologiska förfaranden (se t.ex. Broome, S. och Gilbert, W.(1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, lá, 2746-2749.

Den som " förbiläsningsprodukt" erhållna polypeptiden kan renas enligt kända förfaranden, och den 10 15 20 25 30 35 40 454 596 11 önskade polypeptidprodukten kan bildas genom att poly- peptiden omsättes med specifika kemiska eller enzyma- tiska medel.

Plasmiden pEH5 enligt föreliggande upp- finning kan även användas som källa för DNA, och ut- gående från denna kan en ytterligare serie av plasmid- vektorer konstrueras, den s.k. "pWT“-serien.

Plasmiden pEH5 kan behandlas med restrik- tionsendonukleaset Hinf I (EC 3.1.23.22) för erhållan- de av ett ca 497 bp fragment, som innehåller hela tryp- tofanpromotorn, ledarsekvensen och de första sju amino- syrasekvenserna av trpE. Det så erhållna Hinf I fragmen- tet kan sedan klonas in i Hind III stället i den kända plasmiden pBR322. Denna kloning kan verkställas genom att fragmentets Hinf I ändar behandlas med DNA-polyme- ras I (EC 2.7.7.7) och de med DNA ifyllda Hinf I frag- menten omsättes med Hind III nåkopplingslänkar i när- varo av DNA-ligas och Hind III restriktionsendonukleas i följd efter varandra, varvid man erhåller fragmentet med adhesiva ändar, bildade medelst Hind III.

Hinf I fragmentet kan därefter klonas in i plasmiden pBR322 genom att denna plasmid underkastas restriktion med Hind III och sedan ligeras med Hinf I fragmentet.

Hinf I fragmentet kommer då att införas i plasmidens pBR322 Hind III ställe i antingen den ena eller den andra orienteringsriktningen, såsom beskri- vits ovan i samband med pEH3 och 4. Den ena sorten, där transkription av trp-promotorn sker i tet-genernas rikt- ning, utväljes medelst restriktionsenzymanalys av indi- viduella kloner. (Sekvensen av pBR322 är känd, se t.ex.

Sutcliffe, J.G., Cold Spring Harbor Symposium on Quan- titative Biology, (1978), ÄE11, 77-90. Sekvensen av trp-promotorn/operatorn är ävenledes känd, se t.ex.

Bennett, G.N., et al. (1978), J. Mol. Biol., 121, 113- 137, och Lee, F., et al. J. Mol. Biol., (1978), 121, 193-217.) Den erhållna plasmiden kallas här pWT101.

Dess struktur visas i fig. 4. Den har följande karakte- ristika: ' 454 596 10 15 20 25 30 35 40 12 Molekyllängd 4874 bp; ett Eco RI ställe; ett Hind III ställe 31 bp frân Eco RI stället; ett Hpa ställe 313 bp från Hind III stället; ett andra Hind III ställe 199 bp från Hpa I stället; ett Bam I ställe 346 bp från det andra Hind III stället; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I stället; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I stället och 752 bp från Eco RI stället; ge- nen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets region till ett ställe bortom Sal I stället; genen för ampicillinresistens i omrâdet för Pst I stäl- let och den klonade delen av trp-operonet omfattar re- gionen mellan promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I stället och det andra Hind III stället.

Tack vare det ovan àskâdliggjorda fram- ställningssättet har plasmiden pWT101 två Éind III ställen, ett vid vardera änden av det insatta Hinf I fragmentet från den ursprungliga pEH5.

För säkerställande av att den insatta DNA kommer att placeras intill tryptofanpromotorn är det nödvändigt att eliminera Hind III stället uppströms om tryptofanpromotorn. Detta kan åstadkommas genom rest- riktion av plasmiden pWT101 medelst restriktionsendonuk- leaset Eco RI, omsättning med exonukleaser III och S1, behandling med DNA-polymeras I (för ifyllning av ev. osymmetriska ändar, som kan ha bildats genom omsätt- ningen med Sl-nukleas) och ligering av de fria ändarna av plasmiden i och för bildning av ett derivat av pWT101, vilket här kallas pWT111. Detta derivat uppvisar endast ett Hind III ställe; detta Hind III ställe ligger ned- ströms om trp-promotorn.

Föreliggande uppfinning avser således även en plasmid pWT111, som är lämpad att mottaga in- satt DNA vid Hind III stället så, att denna DNA står under direkt inflytande av trp-promotorn. Transkrip- tion och översättning av den insatta DNA kan lätt be- kräftas, enär plasmiden nedströms om det insatta frag- mentet innehåller genen för tetracyklinresistens. Tran- skriptionen utmed den insatta DNA går således vidare genom tet-r genen, så att tetracyklinresistens erhål- les - medan tetracyklinresistens icke erhålles om ingen qi 10 15 20 25 30 35 40 454 596 13 transkription sker genom den insatta DNA.

I beroende av arten av det DNA-fragment, man önskar införa, blir det ev. nödvändigt att i plas- miden säkerställa inställning av korrekt avläsnings- fas, sammanpassande med avläsningsfasen hos den DNA, som skall insättas. Dubbelsträngad cDNA, som framställts ge- nom reverterad transkription från mRNA, brukar således i normala fall, om den är fullständig, innehålla en nuk- leotidsekvens som utgör en ledarregion, vilken föregår proteinbildningssekvensen. Av denna anledning kommer översättningen till proteinet såsom en integrerad del av en _füsíonspolypeptid i en plasmid, såsom t.ex. pWT111 (inklonad vid Hind III stället),att bli beroende av antalet nukleotider i ledarregionen; ofull- ständig reverterad transkription kan få till följd, att_ ledarsekvensen förkortas, med ty åtföljande ändring av läsramen. Ett mycket viktigt moment är därför konstrue- randet av expressionsplasmider, som är översättningsba- ra i alla tre läsramarna.

Hos plasmid pWT111 kan vid Hind III stäl- let insatt DNA endast i en enda läsram översättas till bildning av fusíonspolypeptid. (Detta gäller icke om den insatta DNA har eget funkfionellt ribosombind- ningsställe.) översättningen börjar med de första 7 aminosyrorna av trpE, varefter följer 2 aminosyror från Hind III pâkopplingslänkens DNA, och översättningen skulle sedan fortsätta in i den insatta sekvensen. Om denna sekvens icke skulle innehålla några stoppkodon, skulle översättningen upphöra vid det första stoppkodo- net i tetracyklinregionen.

Den nukleotidsekvens, som går förbi Hind III stället hos pBR322, visar att för pWT111 det första stoppkodonet är beläget 26 nukleoti- der nedströms om Hind III stället.

För ändring av läsramsfasen från Hind III stället hos pWT111 kan plasmiden underkastas restriktion med Hind III, 5'-förlängningsstyckena ifyllas medelst DNA-polymeras I, och ligering företas med DNA av Hind III påkopplingslänkar. Genom a) restriktion med Hind III för avlägsnande av överskott av pâkopplingslänkar \ I 10 15 20 I 25 30 35 40 454 596 14 och åstadkommande av adhesiva ändar, samt b) en ånyo fö- retagen ligering har man erhållit “pWT121“. vid denna procedur adderas 14 bp DNA och ändras läsramen från det nya Hind III stället med +1 nukleotid. (Det gamla stäl- let är nu ofullständigt.) Den tredje läsramen, dvs pWT111 plus 2 nukleotider, erhölls genom att sama serie av reaktio- ner upprepades hos pWT121. Den så erhållna plasmiden kallas "pWT131".

Strukturenav plasmiderna pWT111, pWT121 och pWT131 visas i bif. fig. 5.Strukturenkan definie- ras ytterligare pâ följande sätt: EWT111 Molekyllängd 4823 bp; ett Hpa I ställe; ett nina In' ställe 199 bp från apa I; ett Bam 1 stäl- le 346 hp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 hp från Sal I och 1045 bp från Hpa I; genen för tetracyklinresistens sträcker sig från området för Hpa I stället till bortom Sal I stäl- let; genen för ampicillinresistens i omrâdet för Pst I stället och den klonade delen av trp-operonet omfattar regionen mellan promotorn och den första delen av E-ge- nen mellan Hpa I stället och Hind III stället.

EWT121 Molekyllängd 4837 hp; ett Hpa I ställe: ett Hind III ställe 206 bp från Hpa I; ett Bam I stäl- le 353 bp från Hind III; i övrigt som pWT111. 2WT131 Molekyllängd 4851 bp; ett Hpa I ställe: ett Hind III ställe 213 bp från Hpa I; ett Bam I stäl- le 360 bp från Hind III; i övrigt som pWT111.

Sekvenserna omkring Hind III stället hos pWT111, 121 och 131 är följande: Bwri11 Hind III ställe 5' ATG,CAA,ACA,CAA,AAA,CCG,ACT,CCA,AGC,TTT,AAT,GCG,GT...3' 10 15 20' 25 30 35 40 w 454 596 2WT121 Bind III ställe 5' ATG,CAA,ACA,CAA,AAA,CCG,ACT,CCA,AGC,TCC,AAG,CTT,GGA,- GCT,TTA,ATG,C...3' EWT131 Hind III ställe 5' ... AAA,CCG,ACT,CCA,AGC,TCC,AAG,CTG,CAA,GCT,TGG,AGC,- TTG,GAG,CTT,TAA,TG...3' Fäfflenkelhets skull anges ovan endast den ena strängens sekvenser i respektive plasmid.

I áskådliggörande syfte kan nämnas att plasmidernas pWT111, 121 och 131 effektivitet som vekto- rer för insatt DNA framgår av resultat, som erhållits då man i pWT 121 (den plasmid som hade den korrekta fasen i detta fall) hade insatt en syntetisk hönspestvirus-gen (FPV-gen , FPV = hönspestvirus, Éowl Blague !irus); se t.ex; brittiska patentansökan 80 10777 samt Emtage, J.S. et al. (1980), Nature ååâ, 171-174.

Ovannämnda syntetiska FPV-gen kan inklonas i pWT121 på följande sätt: Plasmiden pWT121 underkastades restriktion med Hind III och behandlades med alkaliskt fosfatas (EC 3.1.3.1) för avlägsnande av 5'-fosfatgrupperna. Hind III påkopplingslänkar ligerades på ändarna av den syntetiska FPV-genen, som sedan behandlades med Hind III restrik- tionsendonukleas för bildning av Hínd III adhesiva ändar.

Den sålunda behandlade syntetiska FPV-genen och den med Hind III restriktionsbehandlade pWT121 ligerades sedan till bildning av plasmiden pWT121/PPV. Alternativt kan den syntetiska FPV-genen klonas i plasmid pBR322 och se- dan överföras till pWT121 på känt sätt.

Strukturen av plasmiden pWT121/FPV visas schematiskt i fig. 6. Den kan ytterligare definieras en- ligt följandezt Molekyllängd 6532 bp; ett Hind III ställe; ett sma I ställe 365 bp från nämnda nina 111, ett Eco RI ställe 910 bp från Sma I; ett andra Hind III ställe 460 bp från Eco RI; ett Bam HI ställe 353 bp från nämnda and- '4s4 596 10 15 20 25 30 35 40 16 ra Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam HI; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I: ett Hpa I ställe 1045 bp från Pst I och 206 bp från det första Hind III; den syntetiska FPV-genen befinner sig i den 1735 bp långa delen mellan det första Hind III stället och det andra Hind III stället; genen för tetracyklinresistens sträc- ker sig från det andra Hind III stället till ett ställe bortom Bam HI stället; genen för ampicillinresistens ligger i omrâdet för Pst I stället.

Beroende på FPV-genens orientering visa- de sig plasmiden vara antingen tetracyklinresistent (såsom illustrerats i fig. 6) eller också tetracyklin- känslig, nämligen då FPV-genen hade den motsatta orien- teringen.

Transformerade E. coli kolonier innehål- lande pWT121/FPV-plasmiderna med hemagglutinin-genen (HA-genen) i antingen den ena eller andra orientering- en undersöktes för sortering (screening) med avseende på FPV-HA antigen. Det visade sig att tetracyklinresis- tenta kolonier bildade FPV-HA antigen, vilket var ett bevis på att den syntetiska FPV-genen hade insatts kor- rekt. De kolonier, hos vilka FPV~genen var orienterad på det i fig. 6 angivna sättet, visade tetracyklinresis- tens; kolonierna med den motsatta orienteringen av FPV- genen var tetracyklinkänsliga. Hos de förstnämnda kolo- nierna låg HA-antigenens expression under trp-kontroll.

Expression av FPV-antigenen kan bekräftas på följande sätt: E.coli kolonier, vilka innehöll ovan be- skrivna tetracyklinresistenta pWT121/FPV-plasmid, un- dersöktes för sortering beträffande FPV-HA antigen med användning av en immunologisk metod i fast fas (se t.ex.

Broome, S. och Gilbert, W. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, lä, 2746-2749). I korthet kan förfaringssättet an- ges på följande sätt: Små kulturer av individuella ko- lonier odlades, skördades och lyserades med användning av lysozym och "Triton®X-100" (“Triton X-100" är isook- tylfenoxipolyetoxietanol, en icke-jonogen detergent.) Alla eventuella-HA-sekvenser, som kunde förefinnas, bands vid ett polystyrenrör, vilket belagts 10 15 20 25 30 35 40 non-_. 454 596 17 med ett IgG som var specifikt för FPV-HA. Det bundna antigenet märktes sedan specifikt med 1251-IgG med hög specifik aktivitet.

Immunreaktivitet upptäcktes i alla kolo- nier, som innehöll insatt FPV-HA gen; kolonierna som innehöll endast förälderplasmiden pWT121 visade ingen aktivitet, se nedanstående tabell.

Radioimmuntestning avseende FPV-HA i lysat av bakterier, som innehåller pWT121/FPV plasmider.

Koloni nr. HA-halt Fenotyg Insatt DNA 2 >2o Te” A 5 0 Tcr - s >2o 'rer A a _ o mer - 11 >2o . 'rer A 13 o Tar - 14 o Tar - 15 >2o mer A 16 >2o mer A Såsom ovan angivits upptäcktes immunreak- tivitet hos alla kolonier, som innehöll insatt material "A" (FPV-HA gen); de endast förälderplasmiden pWT121 in- nehållande kolonierna visade icke någon aktivitet.

När det gäller den s.k. pWT-serien av-ex- pressionsplasmider föreligger liksom vid pBR322 den möjligheten att dessa normalt med avseende på mobili- sering negativa plasmider, mob- plasmider, ändock kan mobiliseras under härför lämpliga betingelser. Med "mo- biliseras" avses här att de överföres från en bakterie till en annan. Trots att pBR322 icke innehåller den DNA, som kodar för Col El mobilitetsprotein(er), har man ny- ligen kunnat Visa (se t.ex. Twigg, A.J. och Sherratt, D.J. (1980) Nature ggâ, 216-218) att nämnda protein fak- tiskt kan inducera mobilitet genom transkomplementering, när det finns i samma cell på en kompatibel plasmid, t.ex.

Col K.

Mobilitetsproteinets eller -proteinernas 10 15 20 25 30 35 40 ., -J 454 596 bindningsstâlle på plasmid-DNA har visats vara det s.k. "nio"-stället eller "transfer origin” (se t.ex. Warren G.J. et al (1978), Nature 211, 259-261). Hos exempelvis pBR322 ligger detta ställe i det 622 bp långa Hae II B fragmentet. Mutationer i mobilitetsgenen är mob-. De kan emellertid komplementeras med mob+ Col El derivat eller därmed besläktade plasmider, vilket innebär att ett trans-aktivt protein är involverat. _ (Plasmider av typ Col El är icke-konju- gerande, men de mobiliseras när en könsfaktor, t.ex. en F'- eller R-faktor, införes i cellen. För att mobilise- ra en plasmid, som är nic+ men mob-, exempelvis pBR322, krävs därför närvaro av två andra plasmider, nämligen dels en könsfaktorplasmid och dels en kompatibel mob+ plasmid av typen Col El.) 18 Nic-stället är nödvändigt för mobilise- ring. Plasmider utan nic-ställe kan icke komplementeras.

Plasmiderna pBR322 och pWT-plasmiderna in- nehåller visserligen icke alla mobilitetsgenerna men de innehåller nic-stället och kan för den skull komplemen- teras för åstadkommande av mobilitet. För framställning av säkrare icke-mobila vektorer är det önskvärt att nic- stället avlägsnas. Detta kan åstadkommas exempelvis ge- nom deletion av Hae II fragmentet. ur Plasmiderna pwr 111, 121 och 131 kan' nic-stället avlägsnas på följande sätt: Man kan till en början studera Hae II. restriktionskartorna för nämnda plasmider. Dessa kartor synes ge vid handen, att man kan avlägsna endast två fragment (B och H) och därvid ändå bibehålla ampicillin- och tetracyklin-generna, tryptofanpromotorn och start- punkten för replikationen. Se ritningsfig. 13.

Fragmentet B har en längd av 622 bp, medan fragmentet H har en längd av 83 bp. Hos nic- plasmider (minus B och H) saknas således 705 bp. Härtill måste gi- vetvis hänsyn tas vid karakteriseringen av nic_ deriva- ten av de ovan angivna plasmiderna. Exempelvis kan näm- nas att i pWT111 (nic_) ligger Pst I stället på 2253 bp avstånd från Sal I stället. .

Nic- derivaten av pWT 111, 121 och 131 kal- 10 15 20 25 30 35 40 454 596 19 las pWT 211 resp. 221 resp. 231.

Första steget vid nic-ställets avlägs- nande enligt detta i åskådliggörande syfte beskrivna förfarande innebär en partiell omsättning (partiell nedbrytning) av plasmiden så, att varje molekyl spjäl- kas i genomsnitt 2 eller 3 gånger. Nedbrytningsproduk- terna ligeras sedan ånyo med användning av Th DNA li- gas, och den ligerade DNA transformeras in i E. coli K 12, t.ex. HB101. Transformanterna underkastas selek- tion på basis av ampicillin och tetracyklin med använd- ning av minimalagarplattor för inducering av trp-tran- skription och säkerställande av tetracyklinresistens.

De då erhållna kolonierna kommer attin- nehålla dels de åter till ringform överförda utgångs- plasmiderna, dels exemplar som saknar ett eller båda av Hae II fragmenten. Sistnämnda plasmider kan identi- fieras genom screening av individuella kolonier, för uppletande av sådana plasmider, som är mindre än för- älderplasmiden. Hos uppletade derivat som tros vara nic' kan denna egenskap bekräftas genom restriktions- enzymanalys av den renade plasmid-DNA.

Vid ovan i âskådliggörande syfte beskriv- na tillvägagångssätt med partiella restriktioner mås- te man sortera upp ett mycket stort antal kolonier, kan- ske flera hundra. Det är därför oftast bekvämare att i stället konstruera nic_ derivatet, såsom visas schema- tiskt i fig. 14.

Förfarandet kan i korthet beskrivas på följande sätt: pWT-plasmiderna underkastas restriktion med Pst I och Bam HI, och band innehållande trp p/o re- gionen isoleras från polyakrylamidgeler. Plasmiden pAT153 (nic_) restríktionsbehandlas med Pst I och Bam HI, och det 2531 bp bandet isoleras från en polyakryl- amidgel. De förstnämnda banden ligeras individuellt med det sistnämnda bandet, varvid man använder Tr DNA ligas.

Det ligerade materialet användes för transformation av E. coli HB 101. DNA från individuella kolonier kan iso- leras och dess struktur bekräftas genom restriktionsen- zymanalys, t.ex. genom att pAT153, pWT-serien och pWT 10 15 20 25 30 35 40 454 ses 20 (nic_) serien omsättes med Hae II.

Med andra ord kan nio- derivaten konstrue- ras genom att den region i pWT-plasmiderna, som avgrän- sas av Pst I och Bam HI och innehåller originstället för replikation samt nic-stället, ersättes med motsvarande region från pAT153, som är ett deletionsderivat av pBR322 och som saknar det 622 bp långa Hae II B frag- mentet jämte det intill liggande 83 bp långa Hae II H fragmentet. ' Uppfinningen illustreras ytterligare av följande beskrivning: Framställning av pEH3, PEH4 och pEH5 Kulturer av E. coli K12 stam HB101 (se t.ex. Boyer, H. et al. (1969) J Mol. Biol. ål, 459-472), innehållande plasmiden pBR322, odlades i antingen L-bul- jong eller i ett medium innehållande M9-salter, glukos och kasaminosyror (se t.ex. Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Appendix 1, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1972), 431-435). Då A600 var 0,6 till- sattes kloramfenikol till plasmidkulturerna till en slutlig koncentration av 150 um/ml, och inkubationen fortsattes i 16 timmar vid 37°C. DNA isolerades ur cellysaten genom centrifugering i CsCl/etidiumbromid- gradienter (se t.ex. Katz, L.et al. (1973), J. Bacte- riol. llí, 577-591; och Wensink, P.C. et al. (1974), Cell Ä, 315-325). DNA-banden avskildes genom punkte- ring från sidan med en 1 ml spruta och 16 G nål, under belysning med 366 nm ultraviolett/ljus, och etidiumbro- mid avlägsnades genom passage genom "Dowex® Ag50“ (surt katjonbytarharts).

Alla DNA-lösningarna dialyserades mot TE- buffert (10mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,5) för avlägsnande av överskjutande CsCl, varpå de koncentrerades genom ut- fällning med etanol och förvarades vid -70°C. Den er- hållna DNA-blandningen underkastades fullständig omsätt- ning med Hind III på följande sätt: 2 ug pBR322 inkuberades med 5 enheter Hind III i en buffert, innehållande 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM B-merkaptoetanol och 2mM ditiotreitol. Inkubationen utfördes vid 37oC . ___... muaau. .nu-...a-w-w-nu-.Q- - 10 15 20 25 30 35 40 454 596 21 under 90 minuter, i en 40 ul volym. Reaktionen avbröts sedan genom en 5 min. inkubation vid 65°C.

Isolering av Hind III trp E fragmentet 20 ug pRH1/trpE underkastades fullstän- dig omsättning med Hind III och elektrofores på 1% aga- rosgeler. Det band, som innehöll linjärttrpE, avlägsna- des. TrpE-fragmentet tillvaratogs från gelskivan genom elektrofores in i en dialysficka, med efterföljande ertraktion-medelst fenol och utfällning medelst etanol.

Ligering De preparat, som skulle inkuberas.med li- gas, innehöll 0,2 ng av trpE-fragmentet, 0,4 ug av den med Hind III restriktionsbehandlade pBR322 och 0,1 en- heter Tr polynukleotidligas per 20 ul reaktionsbuffert.

Reaktionsblandningen inkuberades 4 timmar vid 16°C.

Transformation 0,01 ng av den ligerade DNA användes för transformering av E. coli W3110 trp o E V 1 stammen.

Man utvalde rekombinanür, som var ampi- cillinresistenta och hade förmåga att komplementera dessa trpE- celler. Per ug plasmid-DNA erhölls 1,2 x 10" amp-r kolonier, som hade förmåga att växa i från- varo av tryptofan.

Femtio sådana kolonier utvaldes slump- vis och överfördes med hjälp av tandpetare på minimak agarplattor (se t.ex. Miller, J.H. loc. cit.), vilka innehöll 100 pg/ml ampicillin och 12,5 pg/ml tetracyk- lin. Av dessa 50 kolonier visade sig 31 växa efter in- kubation under en natt, vilket gav vid handen att ett tetracyklinresistensprotein fanns närvarande i denna population.

Plasmid-DNA isolerades ur representativa kolonier av de tetracyklinkänsliga och -resistenta grup- perna, och Hind III fragmentmönstren analyserades medelst gelelektrofones på 1% agarosgeler. Plasmid-DNA från alla de ampicillinresistenta trp+ klonerna innehöll förälder- pBR322-DNA med Mr 2,8 x 106 (4,361 kb) och E.coli Hind III trpE fragmentet med Mr 3,5 x 105 (5,350 kb). Man underkas- tade de bildade plasmiderna följande ytterligare förfa- ringssfeg i syfte att få en bekräftelse på deras struktur: 10 15 20 25 30 35 40 454 596 22 TrpE-fragmentets orientering En konsekvens av att Hind III omsättnings- produkter avpBR322ligeras med trpE-fragmentet'är att det- ta fragment då kan komma att insättas med endera av tvâ möjliga orienteringar. Orienteringen kan vara sådan att transkriptionen från_trp-promotorn går genom plasmidens tet-gen eller ocksa bort från tet-genen. Orienteringen av den tet-resistenta plasmiden (pEH3) och den tet-känsliga plasmiden (pEH4) bestämdes med ledning från existerande Hpa I ställen i trpE fragmentet och Bam HI ställen i pBR322 (se t.ex. Bennett, M.E. et al. (1976), Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 13, 2351-2355 och Bolivar, F. et al. loc. cit.). Pig. 7 visar resultaten som erhållits genom full- ständiga omsättningar av plasmiderna pBR322, pEH3 och pEH4 med antingen ett av enzymerna Hind III, Hpa I (EC3.1.23.23), Bam HI (EC3.1.23.6) eller en kombination av dessa enzymer.

(Fig. 7 är en vy av en agarosgel, som visar restriktionsendonufleasställenaför Hpa I, Hind III och Bam HI i pEH3 och pEH4 samt orienteringen av den klonade trpE- DNA i dessa plasmider.'De enskilda avdelningarna eller "ba- norna" (a) - (j) i gelen innehåller följande olika DNA, vilkas storlekar anges i kilobaspar (kb): (a) PM2 DNA, om- satt med Hind III i och för åstadkommande av (som referens tjänstgörande)storleksmarkeringar. Synliga band är band 1-6 med storlek 5,4, 2,35, 1,05, 0,475, 0,45 och 0,27 kb. (j) A c.I857,S7 DNA omsatt med Hind III för åstadkommande av (som referens tjänstgörande) storleksmarkeringar. De syn- lige banden är bena A-c; med storlek 21,79, 9,38, 6,30, 4,20, 2,38, 2,11 och 0,47 kb. (b) pBR322-DNA i form av superhelix (supercoiled). (c) pBR322 inkuberad med Hpa I. (d) pEH3 omsatt med Hind III. (e) pEH3 omsatt med Hind III och Hpa I. Bandens storlekar är här 4,3, 3,25, 1,95 och 0,30 kb. (f) pBR322 omsatt med Bam HI. (g) pEH3 omsatt med Bam HI. (h) pEH4 omsatt med Bam HI och Hpa I. De vid fullständig omsättning erhållna fragmenten har storlekar av 5,7, 3,25 och 0,67 kb. (i) pEfl3 omsatt med Bam HI och Hpa I. De vid fullständig omsättning erhållna fragmenten har storlekar av 4,3, 3,25 och 2,4 kb) Det finns inga Hpa I ställen i 'pBR322 (jfr banorna b och c) och inga Bam HI ställen i trpE (jfr banorna f och g). Vid restriktionsomsättning med en- 10 15 20 25 30 35 40 n »-~ n » a 23 454 see bart Hind III ger både pEH3 och pEH4 linjära pBR322 och trpE fragment (bana d). Vid tvåfaldig omsättning av pEH3 och pEH4 med Hind III och Hpa I erhålles likaledes identiska profiler (bana e). I detta fall återbildas linjär pBR322 (4,360 kb) tillsammans med tre andra fragment med 3250, 1950 resp. 305.bp. Eftersom pBR322 icke har några Hpa I mål- ställen (se t.ex. Bolivar, F. et al., loc. cit.) drar man den slutsatsen att det finns två Hpa I målställen i trpE-fragmentet. Det ena av dessa ställen har redan inrapporterats: Det ligger i promotorregionen (se t.ex.

Bennett, M.E. et al., loc. cit.). Det andra stället ligger ca 300 bp från ett av Hind III ställena.

Tvâfaldiga omsättningar utfördes med Bam HI och Hpa I för bestämning av trpE-fragmentets orientering och av det andra Hpa I ställets lägg. De då bildade fragmenten visas i bana (h) för pEH4 och i bana (i) för pEH3. Det är tydligt att dessa plasmider innehåller trpE-fragment i olika orienteringar. Stor- leken av det minsta fragmentet från pEH4 kan lättare uppskattas på grundval av de resultat, som framgår av fig. 8. Denna figur visar de små fragment, erhållna ge- nom restriktionsomsättning av pEH3, pEH4 och pBR322 med Sal I (EC 3.1.23.27), Bam HI, Hpa I, Eco RI och Hind III.

(Fig. 8 är en vy av en 5% akrylamidgel, som visar lågmolekylära DNA-fragment från pBR322, pEH3 och pEH4 efter omsättning med Hpa I, Bam HI, Bind III och Sal I. Banorna (a) - (i) innehåller följande olika DNA, med dessas storlekar angivna i baspar (bp): (a, i) PM2-DNA omsatt med Hind III för åstadkommande av stor- leksmarkeringar. Banden 1 - 7 anger storlekarna 5400, 2350, 1050, 475, 450, 270 och 110 bp. (b) pEH3 omsatt med Bam HI och Hpa I. (c) pEH4 omsatt med Bam HI och Hpa I. Det minsta bandet uppskattat som 640 bp. (d) pEH3 omsatt med Hind III och Hpa I. Det minsta bandet upp- skattat som 295 bp. (e) pBR322 omsatt med Bam HI och Sal I. Det minsta bandet uppskattat som 275 bp. (f) pBR322 omsatt med Hind III och Sal I. Det minsta ban- det uppskattat som 620 bp. (g) pBR322 omsatt med Bam HI och Hind III. Det minsta bandet uppskattat som 350 bp. (h) pBR322 omsatt med Eco RI och Bind III. Det minsta 10 15 20 25 30 35 40 454 596 24 bandet uppskattat som 25 bp.) Med ledning av ovanstående resultat har man konstruerat restriktionskartorna för pEH3 och pEH4, såsom de är illustrerade i fig. 2 och 3. Att det andra Hpa I stället ligger uppströms om trp-promotorn är en slutsats baserad på kända storlekar av trpE-proteinet antranilatsyntetas och trpD-genfragmentet som finns i Hind III trpE fragmentet. Antranilatsyntetas är ett 60.000 dalton protein (se t.ex. Ito, J. et al. (1969), J. Bacteriol. 21, 725-733) och innefattar ca 500 amino- syror, medan endast omkring 1/6 av trpD protein-genen (svarande mot ca 275 bp) specificeras av nämnda Hind III fragment (se t.ex. Hopkins, A.S. et al. (1976), J. Mol. Biol. 101, 549-569). Det behövs således en DNA- längd av ca 1800 bp för specificering av dessa polypep- tider¿ Dessutom finns 162 baser i ledarsekvensen vid 5'-änden av trp mRNA jämte ytterligare 11 baser från början av trp mRNA till Hpa I målstället i trp-promo- torn (se t.ex. Lee, F. et al. (1978), J. Mol. Biol. 121, 193-217). Denna totalsumma av 1948 bp mellan Hpa I och Hind III kan sägas stå i god överensstämmelse med värdet 1950 bp för avståndet mellan Hpa I och Hind III när det bestämts medelst gelanalys. Värdet 1948 bp är även i harmoni med den slutsatsen att det andra Hpa I stället ligger uppströms om trp-promotorn.

Tetracyklinkänslighetens kontroll från trp-promotorn Då det lilla Hpa I - Hind III fragmentet placeras uppströms om trp-promotorn blir det helt tyd- ligt att transkriptionen i den tetracyklinresistenta gruppen av plasmider (pEH3) går i riktning mot ("til1") tetracyklin-genen medan motsatsen gäller för den tetra- cyklinkänsliga plasmiden (pEH4). På grund härav kan man vänta sig, att hos pEH3 tetracyklin-genens expression kontrolleras från trp-promotorn och att alla slags in- satser in i Hind III stället av pBR322 medför förstörel- se av tetracyklinpromotorn.

Detta har testats genom undersökning av tetracyklinresistensen av E. coli innehållande pEH3 odlat i närvaro resp. frånvaro av tryptofan, dvs under 10 15 20 25 30 35 40 __. a _. -.----JÄ '454 596 25 betingelser, vid vilka antingen (i det ena fallet) trp- generna bör vara repressorblockerade eller också (i det andra fallet) repressionsverkan på trp-generna bör vara upphävd. Plasmiden pEH3 i stam W3110 trp o EV1 odlades på ett medium innehållande M9-salter, glukos, kasamino- syror och Sug/ml tetracyklin. Vid A500 uppgående till 0,05 tudelades kulturen och sattes 200 ng/ml till den ena halvan. Efter ytterligare 1 tim. inkubation utspäd- des cellerna och ströks ut pâ agarplattor, som innehöll ökande tetracyklinkoncentrationer. De celler, som odla- des 1 timme på 200 pg/ml tryptofan, odlades på minimal- agarplattor kompletterade med tryptofan.

Resultaten från denna försöksserie framgår av fig. 9.

(Fig. 9 visar den effektivitet, som erhål- les vid utstrykningen av trp o EV1 stammen och dess de- rivat på plattor med ökande kqncentrationer av tetracyk- lin. Kulturer av stammen trp o EV1, som innehöll de an- givna plasmiderna, odlades i definierade medier och be- handlades såsom beskrives nedan. Man bestämde % överlev- nad i förhållande till motsvarande platta utan tetracyk- lin. Plattor innehållande 80 - 400 kolonier användes för bestämningen av överlevandeprocenten. Ur figuren kunde utläsas att följande koncentrationer adtetracyk- lin hade förmåga att döda 50% av cellerna, bestämt me- delst kolonitestning (EOP 50%): 12 ug/ml i fallet plas- midfria celler; 4,5 pg/ml i fallet pBH4-haltiga celler; 23 pg/ml i fallet pl-:us-haltiga celler, som 1 förväg 'ln- kuberats med 200 pg/ml tryptofan; 56 ng/ml i fallet pEH3-haltiga celler odlade utan tryptofan.) Genom när- varo av tryptofan i mediet minskades den medelst pEH3 erhållna tetracyklinresistensen till ett 2,5 ggr lägre värde. Liknande experiment med pEH4 och med plasmidfri W3110 trp o EV1 (utan tetracyklin i det första odlings- mediet) visade, att dessa bakterier var känsliga för mycket låga tetracyklinkoncentratíoner.

Deletion av det hos pEH3 intill Eco RI stället belägna Hind III stället verkställdes på nedan beskrivet sätt, varvid plasmiden pEH5 bildades. 20 ug pEH3, framställt såsom beskrivits 10 15 20 25 30 35 40 454 596 26 .es-q s ovan, omsattes med Eco RI och gelfiltrerades på ”Sepha- dex® G-50" (gel av partiklar (beads) av tvärbunden dextran) i 50 mM NaCl/0,1% (vikt/volym) SDS, och den exkluderade DNA-toppen koncentrerades medelst etanol- utfällning samt löstes i vatten.

Den linjära med Eco RI omsatta pEB3 om- sattes vid 20°C med exonukleas III. Blandningen inne- höll 10 ug linjär plasmid, 60 mM Tris pH 8, 0,66 mM MgCl2, 4 mM ditiotreitol och 40 enheter exonukleas III i en total volym uppgående till 200 ul. Efter 5 och 10 min. uttog man portioner om 100 ul (5 pg), extraherade dem med fenol och kloroform samt utfällde sedan med etanol. 5 ng av med exonukieas III behandlad plasmid behandlades 15 min. vid 30°C med Sl-nukleas i en volym uppgående till 100 ul, i och för bildning av jäms avskurna ändar. Reaktionsmediet innehöll 150 mM NaCl, 25 mM natriumacetat pH 4,6, 0,1 mM ZnS04, DNA, och 2,5 enheter Sl-nukleas. Efter inkuberingen extra- herades blandningen med fenol och kloroform, varefter man utfällde med etanol. 3 ug av den med S1 omsatta DNA ligerades i en slutlig volym av 10 pl med 1 ul Tu DNA ligee (0,8 enheter) i 16 timmar vid 1s°c een seden i 24 timmar vid 4°C.

(Fig. 10 på bif. ritning är en vy av en 1% agarosgel som visar att Bind III och Hpa I ställena avlägsnats ur pEH3 (deletioner). Banorna (a) - (i) inne- håller följande olika DNA, med dessas storlekar angivna i kilobaspar (kb): (a, i) Ä cI857,S7 omsatt med Bind III, för åstadkommande av storleksmarkeringar. De i aga- rosen synliga banden har storlekarna 21,79, 9,38, 6,30 och 4,20 kb; (b) pEH3 omsatt med Hind III; (c) pEH3 om- satt med Sal I; (d) sammanslagna (pooled) kolonier om- satta med Hind III; (e) pEH5 omsatt med Hind III; (f) pEH505 omsatt med Hind III; (g) pEH5 omsatt med Hpa I; (h) pEH505 omsatt med Hpa I.) Framställning av plasmider av pWT-serien Bakterier och plasmider De använda bakteriestammarna var båda Escherichia coli K12 derivat; HB101 F- E59 låg EQ; lgg 10 15 20 25 30 35 40 454 596 27 y ägg rk' mk' gggg 1' E; A' a. :masse trpzfrsfmkï Medier och transformation Kulturerna odlades i ett medium innehål- lande M9-salter, glukos och kasaminosyror (se t.ex.

Miller, J.H., loc. cit.) för erhållande av plasmid-DNA- preparat och testning med avseende pâ tetracyklinkäns- lighet. Vid odlingen av plasmidhaltiga stammar tillsat- tes antibiotika i lämplig koncentration. Celler, som skulle användas för transformation, odlades i L-buljong.

Under hela testningsförsöken avseende tetracyklinkänslighet utbreddes cellerna på en M9, glu- kos och kasaminosyror innehållande minimalagar komplet- terad med tetracyklin (0 - 80 pg/ml), 38-indolakrylsyra (20 ug/ml) eller tryptofan (100 ug/ml) där detta var in- dikerat. _ Transformationsschemat var upprättat i enlighet med Glover (loc. cit.). Cellerna placerades på plattor med antingen näringsagar nr 2 kompletterad med ampicillin (100 ug/ml) eller minimalagar innehål- lande M9, glukos och kasaminosyror och kompletterad med ampicillin (100 pg/ml) eller tetracyklin (10 pg/ml).

Framställning av plasmid-DNA Plasmid-DNA bereddes antingen såsom be- skrivits ovan för pEH5 eller genom feno1/kloroformex- traktioner av klarade lysat, med efterföljande utfäll- ning av DNA medelst isopropanol samt till sist återsus- pendering i TE-buffert (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) _ Enzymreaktioner Omsättningar med restriktionsendonukleaser: Restriktionsomsättningarna av DNA utfördes i buffertsystem med antingen hög eller låg salthalt vid 37°C under 2 timmar; härvid varierade reaktionsmedievo~ lymen från 10 till 200 ul och varierade mängden tillsatt enzym från 1 till 20 enheter per ug plasmid-DNA. Omsätt- ningar med Bam HI, Eco RI, Hha I (EC 3.1.23.19), Hind III och Pst I (EC 3.1.23.31) utfördes i 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol, 100 ugYml gelatin. För omsâttningar med Hpa I var den enda skillnaden i fråga om reaktionsblandningen att de 50 mM 10 15 20 25 30 35 40 454 596 28 NaCl var ersatta med 5 mM NaCl. Hinf I fungerade lika bra i båda reaktionsblandningarna.

I de fall då restriktionsomsättningarna genomfördes med en plasmid-DNA, som icke hade fram- ställts (beretts) genom tillvägagångssättet med cesium- klorid/etidiumbromid, innehöll reaktionsblandningen även ribonukleas typ I-A (värmebehandlat 10 min. vid 95°C för avlägsnande av all ev. DNas-aktivitet) i en koncentra- tion av 50 ug/ml för avlägsnande av RNA, som vid rening- en skulle kunna utfällas tillsammans med den avsedda DNA. _ Alla reaktioner stoppades, när de skulle avbrytas, genom 5 min. upphettning vid 65°C.

Ligeringar: Ligeringar av kohesiva ändar utfördes med 10-20 ul volymer i 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol, 1 mM ATP, med användning av 0,01 - 0,02 enheter ligas per 0,5 - 3 ng DNA. Reaktionsbland- ningarna inkuberades under en natt vid 1S°C. För lige- ringar av jäms liggande ändar (ligeringar med stumt mot varandra lagda ändar) användes samma reaktionsblandning, men mängden ligas ökades till 0,2 - 0,6 enheter per 1 - _3 ng DNA och inkubetienstemperaturen höjdes till 2s°c.

Ifyllning av S'-förlängningar eller ut- skjutande 5'-ändar med användning av DNA-polymeras I: 0,5 - 3,5 ug DNA ifylldes, med tillhjälp av polymeraset, i 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgC12, 1 mn B-merkaptoetanol och 0,1 mn av vart och ett av fos- faterna dATP, dCTP, dGTP, dTTP i en volym uppgående till 50 ul, med användning av'0,25 - 1,5 enheter polymeras.

Blenaningen inkuberadee 10 min. vid 1o°c, varefter en portion av preparatet kunde användas direkt för ligering av jäms liggande ändar (ligering med stumt mot varandra lagda ändar) eller också det hela kunde underkastas först fenol/kloroformextraktion och sedan utfällning med använd- ning av etanol.

Pólynukleotid-kinasbehandling av DNA, som ingår i Hind III påkopplingslänkar: Dekamera Hind III påkopplingslänkar, 2,5 pg, kineebehenaleaee 1 so min. vid 37°c, varvid men en- 10 15 20 25 30 35 40 454 596 29 vände 10 enheter kinas i 25 mM Tris-HCl pH 7,8, 5 mM MgCl¿, 0,125 mM ATP, 25 ng/ml oxserumalbumin. Dessutom 32P-märktes 5'-ändarna genom tillsättning av 100 uCi Ey-32P]ATP (3000 Ci/mmol) till reaktionsblandningen.

För att avsluta reaktionen tillsattes SDS till en kon- centration av 0,1% (vikt/volym) och EDTA till en kon- centration av 10 mM; och hela preparatet kromatografe- rades på en 30 x 0,7 cm kolonn av "Sephadex® G-50" (SF), ekvilibrerad i 50 mM NaCl/0,1% (vikt/volym) SDS. De ex- kluderade fraktionerna sammanslogs, utfälldes med eta- nol och suspenderaåsånyo i vatten i en koncentration av 50 ug/ml.

Fosfatasbehandling av med Hind III rest- riktionsbehandlad pBR322 (fosfataset = bakteriellt alkaliskt fosfatas): 5 - 10 pg av till linjär form Överförd pBR322 i 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% (vikt/volym) SDS behandlades 60 min. vid 3700 med 5 ug bakteriellt alka- liskt fosfatas. Produkten extraherades sedan med fenol/ kloroform och dess DNA utfälldes med användning av eta- nol.

Nukleasbehandling av med Eco RI restrik- tionsbehandlad pWT101 (använda nukleaser = exonukleas III och S1): Samma betingelser användes som beskrivits för deletionen av Hind III stället i pEH3, med undantag av att portioner om 3,33 pg avlägsnades efter 1, 3 och 5 minuters omsättning med exonukleas III.

Framställning av gelprover utgående från helcellslysat: För erhållande av agarosgeler med helcells- lysat (whole cell lysis agarose gels) tog man ut ett rep- resentativt prov av plasmidhaltiga celler från en od- lingsplatta, med användning av en steril plasttrâdsögla.

Provet âtersuspenderades i 200 ul agaroselektroforesbuf- fert. Till detta preparat sattes 50 ul Ficoll-buffert (5% [vikt/vol.J SDS; 10% [vikt/vol.) Ficoll = sampoly- mer av sackaros och epiklorhydrin; 0,06% [vikt/vol.] bromfenolblått), och blandningen inkuberades 30 min. vid 65°C för lysering av cellerna, varefter den omvirvlades 10 15 20 25 30 35 40 454 596 30 i 1 minut. Ca 40 ul av ett sådant prov befanns vara tillräckligt för plasmididentifiering. RNA, som in- gick tillsammans med den avsedda DNA, kunde avlägs- nas genom att ribonukleas sattes antingen till det uttagna provet i en mängd motsvarande en.koncentra- tion av 50 ng/ml, med efterföljande 30 min. inkuba- tion vid 37°C, eller också sattes direkt till agaros- gelmatrixen, i en mängd motsvarande en koncentration av 1 ug/ml. Medelst båda metoderna elimineras det RNA- utstryk, som eljest skulle finnas på gelen. ' Gelelektrofores Man arbetade med 0,8 - 1,4 %-iga aga- rosgeler (20 x 15 x 0,5 cm) under konventionella be- tingelser. Gelerna underkastades elektrofores anting- en under en natt vid 40 volt eller under 3 timmar vid 120 volt, varefter de infärgades och fotograferades. 5 - 10 %-iga akrylamidgeler (20 x 15 x 0,15 cm) användes i och för identifiering av små rest- I riktionsfragment. Färgning och fotografering på samma sätt som vid agarosgelerna.

Isolering av tryptofanpromotor - opera- tor Hinf I fragmentet och påfästning av Hind III påkopplingslänk. 6 ug av pEH5 underkastades restriktion med Hinf I och elektrofores på en 5% (vikt/volym) ak- rylamidgel, varefter 497 bp sekvensen med Hinf I tryp- tofan promotor - operator och det tillsammans därmed migrerande pBR322-bandet skars ut ur gelen och deras DNA extraherades på känt sätt.

De med Hinf I bildade ändarna ifylldes sedan med hjälp av DNA-polymeras I, och Hind III pâ- kopplingslänkar fästes på dessa nu jäms liggande än- dar (ligering stumt ände mot ände), vilka pâkopplings- länkar tillfördes i en mängd av 50 länkfragment per Hinf I fragment (tack vare detta stora överskott mins- kas chanserna för självligering mellan Hind I fragmen- gten). Adhesiva ändar utbildades genom restriktionsbe- handling av blandningen med Hind III, den avsedda DNA utfälldes med etanol och återsuspenderades i 50 ul 50 mM NaCl, 0,1 % (vikt/volym) SDS, och det hela kromato- 10 15 20 25 30 35 40 454 596 31 graferades på en 50 x 0,7 cm kolonn av G 150 Sephadex® som i förväg ekvilibrerats med 50 mM NaCl, 0,1 % (viktl volym) SDS. De exkluderade toppfraktionerna sammanslogs och DNA utfälldes med etanol.

Konstruktion av pWT101 Hela den E. coli sekvens, som omfattar tryptofanpromotor-, operator- och ledarsekvensen jämte sekvensen för de första 7 aminosyrorna av trpE, finns på ett i pEHS ingående Hinf I fragment med en längd av ca 497 hp. Detta 497 bp långa Hinf I fragment klonades in i Hind III stället av pBR322 med hjälp av dekamer Hind III pâkopplingslänks-DNA. För detta ändamål måste Hinf I ändarna först ifyllas medelst DNA-polymeras I för att medge påfästning av påkopplingslänks-DNA. Frag- mentet ligerades sedan till pBR322, som behandlats med bakteriellt alkaliskt fosfatas och uppskL1rits med Hind III; och den erhållna blandningen användes för trans- formering av E. coli HB 101, med användning av en se- lektion på grundval av näringsämnesagar-ampicillin.

Från denna transformation erhölls sammanlagt 582 kolo- nier.

Vid kloning in i Hind III stället av pBR322 inaktiveras tetracyklinpromotorn; därigenom blir transformanten tetracyklinkänslig med mindre än att den klonade biten har sin egen promotor, som ger upphov till transkription rakt in i tetracyklin-generna. Eftersom Hinf I fragmentet innehåller tryptofanpromotor - opera- torregionen, bör sådana transformanter, som innehåller en plasmid med fragmentet inklonat i korrekt orientering - dvs så att transkription sker i riktning till tetracyk- linpromotorn - vara resistenta mot tetracyklin. För att testa detta valdes 48 kolonier slumpvis från ampicillin- transformationsplattorna och avsattes på minimalagar- plattor med M9 och kasaminosyror och med tetracyklin- tillsats (10 ug/ml). Elva st. av dessa kolonier befanns vara tetracyklinresistenta; detta är ett antal som kun- de väntas, enär vid närvaron av 2 fragment förelåg en 1:4 chans för erhållandet av den korrekta orienteringen.

Närvaron av insatt DNA bekräftades även- ledes genom att man tog ut kolonier från båda grupper 10 15 20 25 30 35 40 454 596 _, . .---_J 32 av plattor och testade dem mot ett pBR322-kontrollprov med användning av helcellsagarosgeler. Medelst dessa tillvägagångssätt isolerades ampicillinresistenta ko- lonier och mot ampicillin och tetracyklin resistenta kolonier, som innehöll plasmider med insatt DNA. Ur ett visst antal av dessa kolonier utvanns plasmid-DNA för analys medelst restriktionsendonukleaser.

Fig. 11 hänför sig till framställning och karakterisering av pWT101 och avser följande: (a) paus omsatt med Hinf I och Hpa I; (b) pEH5 omsatt med enbart Hinf I: (c) pWT101 omsatt med Hind III; (d) pWT101 omsatt med Hind III och Hpa I.

Konstruktion av pWT111 ëvlägsnande av det distalt till trypto- fanpromotorn belägna Hind III stället Det distala Hind III stället skars bort (deletion) genom spjälkning med Eco RI och efterföljan- deavlägsnandeav ifrågavarande DNA genom omsättning med exonukleas III och S1-nukleas. Ett behandlingssteg med DNA-polymeras I inkluderades likaledes före ligeringen, i och för ifyllning av alla eventuella osymmetriska än- dar, som kunde ha lämnats kvar efter omsättningen med S1-nukleas.

Omsättningstider: 1, 3 och S minuter.

De tre DNA-blandningar, som erhållits ef- ter restriktionsbehandling med Eco RI, omsättning med exonukleas III (1, 3 och 5 min.), ifyllning med använd- ning av DNA-polymeras I och ligering stumt ände mot än- de, användes för att transformera HB101 celler. Man fö- retog en dubbelantibiotikaselektion genom utstrykning på minimalagar med M9, kasaminosyror och tillsatt am- picillin och tetracyklin; genom denna dubbelselektion säkerställdes, att generna för B~laktamas och tetracyk- lin förblev intakta.

För ytterligare karakterisering av vad som bedömdes vara de sannolika deletionsprodukterna ut- valdes 2 transformanter från 1-minutfraktionen, 2 trans- formanter från 5-minutersfraktionen, och 4 transforman- ter från 3-minutersfraktionen. 10 15 20 25 30 35 40 454 596 33 Karakterisering av de som deletionspro- dukter erhållna plasmiderna.

Ingen av de 8 plasmiderna ger ett 512 bp fragment när den skäres upp med Hind III, och alla 8 migrerar till ett läge ovanför 4,36 kb fragmentet av med Hind III restriktionsbehandlad pWT101. Alla plasmiderna underkastades två omsättningar, nämligen med Hpa I och Pst I. Pâ så sätt har man således erhållit två fragment.

Det minsta av dessa båda fragment sträcker sig över det ifrågavarande omrâdet (regionen omkring Eco RI stället hos pWT101). Storlekarna av de fragment, som bildats i pWT10f, är 3777 och 1096 bp. En undersökning av fragmen- ten visar tydligt, att det sistnämnda fragmentet i samt- liga fall bär på en deletion, medan det förstnämnda frag- mentet har förblivit oförändrat, vilket var väntat. Mäng- den genom deletionen borttagen DNA varierar från 51 bp hos pWT111 (1 min. omsättning med exonukleas) till 361 bp hos pWT118 (5 min. omsättning med exonukleas). pWT111 är den plasmid, från vilken den minsta mängden DNA har avlägsnats genom deletion. Med hänsyn härtill och till den omständigheten, att pWT111 (enligt tetracyklineffektivitetsresultat, erhållna från prov på plattor) synes vara lika effektiv som pWT101 vid transkription från tryptofanpromotorn, har pWT111 valts som Hind III kloningsbärare för användning i och för änd- ring (förskjutning) av översättningsskedets läsramsfas.

Konstruktion av pWT121 För fasförskjutning från Bind III stället i pWT111 ifylldes den utstånde 5'-förlängnings-änden medelst DNA-polymeras I, ligerades på Hind III påkopp- lingslänks-DNA, underkastades restriktionsbehandling med Hind III för avlägsnande av överskott av pâkopp- lingslänkar och bildning av adhesiva ändar samt ligera- des ånyo. Pâ så sätt adderades 14 bp DNA till plasmiden och ändrades i läsramen från det nya Hind III stället med +1 nukleotid (det gamla stället är nu ofullständigt).

Konstruktion av pWT131 Den tredje läsramen, dvs pWT111 +2 nukleo- tider, erhölls genom att samma serie av reaktioner upp- repades med användning av denna fasförskjutna plasmid. 454 596 10 15 20 25 30 35 40 34 Dessa plasmider skulle liksom peptider, med initiering av polypeptidbildningén vid början av trpE och avslutning av polypeptidbildning- en vid stoppkodon (vilka är olika kodon i vart och ett av de olika fallen och) vilka föregår tetracyk- lin-generna. Men på grund av ändringarna i läsramen har alla polypeptiderna olika C-terminala aminosyra~ sekvenser medan däremot de N-terminala aminosyrasek- venserna är lika. pWT111 bilda små poly- Fig. 12 åskådliggör de ändringar, som uppkommit i fasändringarna från pWT111 till pwT131.

I fig. 12 anger (a) pWT111 omsatt med Hha I; (b) pWT121 omsatt med Hha I; (c) pWT131 omsatt med Hha I.

Framställning av pWT121/PPV och test- ' ning avseende genexpression av FPV-HA- antigen. 10 ug pWT121 underkastades fullständig omsättning med Hind III. De då erhållna 5'-terminala fosfaterna av vektorerna avlägsnades genom behandling med 20 ug bakteriellt alkaliskt fosfatas i 30 min. vid 37°C i ett 25 ul inkubationsmedium, innehållande 20 mM Tris-HCl pH 7,5 och 0,1% (vikt/volym) SDS. hering med fenol och utfällning med etanol ligerades 0,2 ug DNA till ca 40 ng FPV-HA-gen i ett 20 ul inku- bationsmedium, innehållande 50 mM Tris-HCl pH 7,5,'10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM ATP och 0,02 enheter Tu DNA ligas (New England Biolabs). Efter inku- bation under en natt vid 15°C utspäddes blandningarna till 100 ul med TCM (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2)och användes för transfektion av 200 ul CaCl2~behandlad E. coli K12 HB101, i enlighet med ett känt förfarande. Transformanter, som förefanns efter 16 tim. odling vid 37°C på L-agar plus 100 ug/ml kar- benicillin (Pyopen, a-karboxibensylpenicillin), des med avseende på tetracyklinresistens, varvid Efter extra- testa- de för detta ändamål avsattes på agarplattor innehållande M9- salter, glukos och kasaminosyror tetracyklin (10 ng/ml). plus karbenicillin och 10 15 20 25 30 35 40 454 596 35 Genexpressionstestning Flytande kulturer (5 ml) av individuel- la kolonier odlades i M9-medium som, när det var på- kallat, kompletterats med B-indolakrylsyra (20 ng/ml) eller tryptofan (100 ug/ml). Cellerna skördades genom centrifugering, suspenderades i 0,3 ml kall 25'% (viktl vol.) sackaros/50 mM Tris pH 8 och inkuberades med 0,1 ml lysozym (10 mg/ml). Man tillsatte med 5 min. inter- valler 0,1 ml 0,5M EDTA och sedan 0,5 ml iskyld Triton- lösning (Tritonlösning är 60 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8 och 0,1 % vol./vol. "Triton X-100"); detta lysat använ- des för antigentestning utan någon ytterligare behand- ling.

-HA-antigentest utfördes i odlingsrör av polystyren (Nunc nr 1410), med antikropps-sandwichtek- nik. Kanin-anti-FPV HA renades genom utfällning med ammoniumsulfat ooh DEAE-cellulosakromatografering före användningen samt underkastades märkning med 1251. Rö- ren belades under 10 minuter vid rumstemperatur med 50 ul 0,2M NaHCO3 pH 9, innehållande 60 ug/ml renat omärkt IgG, tvâttades med 3 x 1 ml portioner tvättbuffert och inkuberades sedan vid rumstemperatur antingen med kän- da mängder (0,5 - 5 ng) sönderbrutet FPV eller med bak- terielysaten. Efter 2 timmar tvättades rören med 4 x 1 ml portioner tvättbuffert samt inkuberades slutligen vid 4oC i 16 timmar med 50 ul tvättbuffert innehållan- de 200.000 cpm 1251-anti HA. Rören tvättades igen och underkastades räkning i en Packard Y-räknare. Mängden närvarande antigen uppskattades med ledning av stan- dardkurvor för sambandet mellan den bundna radioakti- viteten och den mängd PPV, som är närvarande.

Framställning av nic- derivat Restriktion av de tre fasförskjutna pWT- plasmiderna och pAT153 med både Bam HI och Pst I ger tvâ fragment från varje plasmid. Se fig. 14. pAT153 bildar fragment omfattande 1129 bp och 2529 bp. Det sistnämnda, stora fragmentet inne- håller originstället men har en deletion med avseende på nic stället.

Alla pWT-plasmiderna bildar samma 3233 10 15 20 25 30 35 40 454 596 36 bp fragment, innehållande originstället och nic stäl- let, men de bildar olika mindre fragment, som inne- håller trp-kontrollelementen; skillnaderna i dessa mindre fragment härrör från fasändringarna vid Hind III stället.

Plasmiderna underkastades restriktion med Pst I och Bam HI och elektrofores på en 3,5 % ak- rylamidgel. Ur akrylamiden utskars och tillvaratogs följande band från de olika plasmiderna: pAT153 2529 bp, pWT111 1590 bp, pWT121 1604 bp och pWT131 1618 bp. pAT153-bandet ligerades sedan ensamt för sig självt på de tre pWT-banden, och ligeringsblandningarna användes för att transformera E. coli HB101 celler, som utväl- jes genom selektion på näringsagar innehållande 100 ug/ml karbenicillin. Eftersom pAï153-fragmentet icke i sig självt kan överföra ampicillin- och tetracyklinre- sistens och eftersom inget origin finns i pWT-fragmen- ten säkerställes genom selektion på karbenicillin att de erhållna rekombinantmolekylerna innehåller dessa bå- da fragment. Plasmid-DNA utvanns ur ett antal av de ko- lonier, som visade tillväxt på transformationsplattor- na. Dessa preparat användes för att medelst restrik- tionsanalys bestyrka närvaron av de önskade plasmider- na.

Omsättningar utfördes med enzymer enligt följande: Omsättning med Pst I och Bam HI för bild- ning av de ligerade fragmenten. Se i detta sammanhang ritningsfig. 15, där banorna (b), (c) och (d) innehål- ler omsättningsprodukter av nio- derivat av pWT131 res- pektive 121 respektive 111. Bana (a) innehåller en om- sättningsprodukt av pwT131 och bana (e) innehåller en omsättningsprodukt av pAT153. Såsom framgår av denna gel har alla tre nio- trp-plasmider fått 2529 bp frag- mentet av pAT 153 men har samtidigt kvar de ursprungli- ga trp kontrollelementen.

Omsättning med Bind III för att påvisa att det trp p/o kontrollerade expressionsstället fort- farande är funktionellt: Se Pig. 16, där banorna (a), (b), (c) och (d) innehåller omsättningsprodukter av 454 596 37 pWT231 resp. 221 resp. 211 resp. 131. Alla tre nic- de- rivaten undergâr restriktion vid behandling med Hínd III och är mindre än pWT131 på grund av att de båda Hae II fragmenten saknas.

Omsättning med Hae II för att påvisa från- varon av Hae II B och H fragmenten från plasmidernas pBR322-region: Se fig. 17, där banorna (a) - (f) inne- håller omsättningsprodukter av pBR322 resp. pAT153 resp. pWT 231 resp. pWT 221 resp. pWT 211 resp. pWT 131. Hos alla fyra nio- plasmider (banorna b till e) saknas två Hae II fragment, nämligen de 622 bp Hae II B och 82 bp Hae II H fragmenten av pBR322. ' 'f z- -

Claims (8)

454 596 38 P a t e n t k r a v

1. Plasmid, k ä n n e t e c k n a d a v att den har ett insättningsställe för ett eukaryotiskt DNA-fragment intill en bakteriell trp-promotor, trp-E-gen och trp-D-gen och nedströms ett prokaryotiskt ribosombindningsställe, att den har ett trp-initiatorkodon av sådant slag att den bakteriella trp- -promotorn kontrollerar transkription .och translation av ett insatt DNA-fragment, och att den har karakteristika enligt något av följande alternativ A) - G): A) denna A)-plasmid har en molekyllängd av 9866 bp; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Eco RI ställe 3709 bp från Sal I; ett andra Hind III ställe 31 bp från Eco RI; ett Hpa I ställe 305 bp från det andra Hind III; ett andra Hpa I ställe 3250 bp från det första Hpa I och 1950 bp från det första Hind III, varvid hos denna A)-plasmid trp-promotorn, B-genen och en del av D-genen ligger i'den 1950 hp långa delen mellan det andra Hpa I stället och det första Bind III stället; genen för tet- racyklinresistens följer direkt efter det första Bind III stället och genen för ampicillinresistens ligger i den 3709 bp långa delen mellan Sal I stället och Eco RI stället; denna A)-plasmid kallas pEH3; B) denna B)-plasmid har en molekyllängd av 9866 bp; ett Bam I ställe 346 bp från Bind II] stäl- let; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Eco RI I ställe 3709 bp från Sal I; ett andra Hind III ställe 31 bp från Eco RI; ett Hpa I ställe 1950 bp från det andra Hind III stället; ett andra Hpa I ställe 3250 bp från det första Hpa I och 305 hp från det första Hind III, varvid hos denna B)-plasmid trp-promotorn, E-genen och en del av D-genen ligger i den 1950 bp långa delen mel- lan det andra Hind III stället och det första Hpa I stället; genen för tetracyklinresistens följer direkt efter det första Hind III stället och genen för ampi- g cillinresistens ligger i den 3709 bp långa delen mellan I Sal I stället och Eco RI stället; denna B)-plasmid kal- las pEH4; f f __.._.._:_.._............. 39 454 596 C) denna C)-plasmid har en molekyllängd av 6750 hp; ett Bind III ställe; ett Bam HI ställe 346 bp från Bind III stället; ett Sal I ställe 275 bp från Bam HI stället; ett Hpa I ställe 4230 bp från Sal I stället och 1950 bp från Bind III stället, varvid hos denna C)-plasmíd trp-promotorn, B-genen och en del av D- genen ligger i den 1950 bp långa delen mellan Hpa I stället och Hïnd III stället: genen för ampicillinre- sistens ligger i den 4800 bp långa delen mellan Hind III stället och Hpa I stället: denna C)-plasmid kallas pEH5; D) denna D)-plasmid har en molekyllängd av 4874 bp; ett Eco RI ställe; ett Bind III ställe 31 hp från Eco RI; ett Hpa I ställe 313 bp från Hind III; ett andra Hind III ställe 199 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 346 bp från det andra Hind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I och 752 bp från Eco RI; genen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I; genen för ampicillinresistens i Pst I ställets omrâde och den klonade delen av trp-operonet omfattar omrâdet mellan promotorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I och det andra Hínd III stället: denna D)-plasmid kallas pWT101; E) Üenna E)-plasmid har en molekyllängd av 4823 bp; ett Hpa I ställe; ett Bind III ställe 199 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 346 bp från Hind III: ett Sal I ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I och 1045 bp från Hpa I; genen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I stället; genen för am- picillinresistens i Pst I ställets område och den klo- nade delen av trp-operonet omfattar området mellan pro- motorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I och Bind III ställena: denna E)-plasmid kallas pWT111; F) denna F)-plasmid har en molekyllängd av 4837 bp; ett Hpa I ställe; ett Hind III ställe 206 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 353 bp från Hind III; ett Sal 1 ställe 275 bp från Bam I; ett Pst I ställe 454 596 40 2958 bp från Sal I och 1045 bp från Hpa I; genen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I stället; genen för am- picillinresistens i Pst I ställets område och den klo- nade delen av trp-operonet omfattar området mellan pro- motorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I stället och Bind III stället; denna F)-plasmid kallas pWT121 och dess läsramsfas är förskjuten med 1 bp i förhållande till pWT111; G) denna G)-plasmid har en molekyllängd av 4951 hp; ett apa 1 ställa; ett nina 111 ställe 213 bp från Hpa I; ett Bam I ställe 360 bp från Bind III; ett sal I ställe 275 bp från Bam I: ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I och 1045 bp från Hpa I: genen för tetracyklinresistens sträcker sig från Hpa I ställets område till en zon bortom Sal I stället; genen för am- picillinresistens i Pst I ställets omrâde och den klo- nade delen av trp-operonet omfattar området mellan pro- motorn och den första delen av E-genen mellan Hpa I stället och Hind III stället; denna G)-plasmid kallas pwT131 och dess läsramsfas är förskjuten med 2 hp i förhållande till pWT111.

2. nio- derivat av en plasmid enligt krav 1, företrädesvis erhållen antingen genom att nic-stället avlägsnas från en plasmid eller genom att en plasmid konstrueras på sådant sätt att nic-stäl- let icke ingår i densamma.

3. Förfarande för framställning av en plasmid enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av a) att man för framställning av pEH3 en- ligt mom. A) i krav 1 omsätter en vildtypsstam av E. coli med restriktionsendonukleaset Hind III, ligerar det så erhållna fragmentet till den linjära molekyl, som erhållits genom restriktion av plasmiden pBR322 med restriktionsendonukleaset Bind III, transformerar E coli W3110 trpoEV1 med den så erhållna plasmiden, och väl- jer ut de E. coli kolonier, som visar tetracyklinresis- tens och tryptofankomplementering, för att sålunda er- hålla plasmiden pEHÉ; 41 454 596 b) att man för framställning av pEH4 en- ligt mom. B) i krav 1 omsätter en vildtypsstam av E. coli med restriktionsendonukleaset Bind III, ligerar det så erhållna fragmentet till den linjära molekyl, som erhållits genom restriktion av plasmiden pBR322 med restriktionsendonukleaset Bind III, transformerar E coli W311O trpoEV1 med den så erhållna plasmiden, och väl- jer ut de E. coli kolonier, som visar tetracyklinkäns- lighet och tryptofankomplementering, för att sålunda er- hålla plasmiden pEH4; c) att man för framställning av pBH5 en- ligt mom. C) i krav 1 underkastar pBH3 restriktion med restriktionsendonukleaset Eco RI, omsätter den linjära molekylen med exonukleas III och S1-nukleas, behandlar med DNA-polymeras I. ligerar den linjära molekylen med DNA'1ï9BS«transformerar E coli W3110 trpoEV1 med den så er- hållna plasmiden och utför selektion med sikte på de kolonier, som visar tryptofankomplementering och ampi- cillinresistens, för att sålunda erhålla plasmiden pEH5; d) att man för framställning av pWT101 en- ligt mom. D) i krav 1 underkastar pEH5 restriktion med restriktionsendonukleaset Hinf I för erhållande av _ett fragment, innehållande den fullständiga tryptofan- promotorn, och klonar fragmentet in i plasmidens pBR322 Hind III ställe, varvid man behandlar fragmentets Hinf I ändar med DNA-polymeras I, behandlar fragmentet med Hind III påkopplingslänkar i närvaro av DNA-ligas, be- handlar den ligerade molekylen med Hind III restriktions- endonukleas till bildning av en linjär molekyl med adhe- siva, med Hind III erhållna ändar, ' ligerar denna linjära molekyl in i plasmidens pBR322 Hind III ställe, transformerar E. coli K12 HB101 med de så erhållna plasmiderna samt utväljer de E. coli kolo- nier, som visar ampicillinresistens, för att sålunda er- hålla plasmiden PWTTÛ1; 5 e) att man för framställning av pWT111 en- J ligt mom. E) i krav 1 underkastar pwT101 restriktion med restriktionsendonukleaset Eco RI, omsätter den linjära ___-.- ___ ,_ 42 454 596 molekylen med exonukleas III och S1-nukleas, behandlar med DNA-polymeras I, ligerar den linjära molekylen ånyo, transformerar E. coli K12 BB101 med de erhållna plasmi- derna samt utväljer de B. coli kolonier, som visar ampi- cillinresistens, för att sålunda erhålla plasmiden pWT111; f) att man för framställning av pWT121 en- ligt mom. F) i krav 1 underkastar pWT111 restriktion med restriktionsendonukleaset Bind III, behandlar den linjära molekylen med DNA-polymeras I, ligerar med Bind III länk-DNA,, utför restriktion med restriktionsendonukleaset Bind III, ligerar den linjära molekylen ånyo, transformerar E. coli K12 BB101 med de erhållna plasmiderna och väljer ut de E. coli kolonier, som visar ampicillinresistens, för att sålunda erhålla plasmiden §WT121; g) att man för framställning av pWT131 en- ligt mom. G) i krav 1 underkastar pWT121 restriktion med restriktionsendonukleaset Bind III, behandlar den linjä- ra molekylen med DNA-polymeras I, ligerar med Bind III länk-DNA, utför restriktion med restriktionsendonukleaset Bind III, ligerar den linjära molekylen ånyo, transformerar E. coli K12 BB101 med de erhållna plasmiderna och väljer ut de E. coli kolonier, som visar ampicillinresistens, för att sålunda erhålla plasmiden pWT131.

4. Plasmid enligt krav 1 eller 2. k ä n n e t e c k n a d a v att ett eukaryotiskt DNA-fragment är infört vid dess insättningsställe, var- vid plasmiden företrädesvis är en plasmid pWT121/PPV med följande karakteristika: Molekyllängd 6532 bp: ett Bind Ill stäl- le; ett Sma I ställe 365 bp från Bind III; ett Eco RI ställe 910 bp från Sma I; ett andra Bind III ställe 460 bp från Eco RI; ett Bam BI ställe 353 hp från det andra Bind III; ett Sal I ställe 275 bp från Bam BI; ett Pst I ställe 2958 bp från Sal I; ett Bpa I ställe 1045 bp från Pst I och 206 bp från det första Bind III; varvid PPV-hemagglutinin~genen ligger i den 1735 bp långa delen mellan det första Bind III stället och det _ andra Bind III stället; genen för tetracyklinresistens É sträcker sig från det andra Bind III ställetfill en zon 43 454 596 . . bortom Bam HI stället; och genen för ampicillinresis- tens ligger i Pst I ställets område.

5. Förfarande för framställning av en plasmid enligt krav 4,_ k ä n n e t e c k n a t a v f att ett eukaryotiskt DNA-fragment insättes vid insätt- ningsstället av en plasmid enligt krav 1 eller 2, varvid man företrädesvis framställer plasmiden pWT121/ I PPV genom att plasmiden pWT121 underkastas restriktion med restriktionsendonukleaset Bind III och den linjära molekylen eventuellt behandlas med alkaliskt fosfatas, Bind III-länkar ligeras till PPV-genens än- dar, FPV-genen sedan behandlas med restriktionsendo- § nukleaset Hind III och den behandlade FFV-genen ligeras till den linjära molekyl, som erhållits från pWT121 genom restriktion med Hind III.

6. Transformerad bakteriecell, k ä n n e t e c k n a d a v att en plasmid enligt krav 4 är införd i densamma.

7. Förfarande för transformation av en transformerbar bakteriecell, k ä n n e t e c k n a t a v att man i cellen inför en plasmid enligt krav 4.

8. Förfarande för expression av ett protein, k ä n - n e t e c k n a t a v att man odlar en cell enligt krav 6.