DE69233336T2

DE69233336T2 - Vektor

Info

Publication number: DE69233336T2
Application number: DE69233336T
Authority: DE
Inventors: Peter Thomas Macclesfield Barth
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2012-02-22
Also published as: IE920587A1; EP0502637A2; NO920751L; GB2253852B; NZ241703A; EP0502637A3; JP3522292B2; AU1114692A; JPH0556790A; EP0502637B1; GB9203731D0; US5840521A; FI920835A; GB2253852A; FI920835A0; NO920751D0; DE69233336D1; AU659130B2; IL101058A0; CA2061721A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, der ein induzierbares Selektionsgen enthält, einen den Vektor enthaltenden Wirt sowie Verfahren zur Herstellung des Vektors und des Wirts.
Die Mehrzahl bakterieller Klonierungs- und Expressionsvektoren enthält einen Antibiotikaresistenzmarker als einfaches Mittel zur Aufrechterhaltung der Selektion auf das Plasmid in dem gewählten Wirtsbakterium. Dabei handelt es sich im allgemeinen um Ampicillin, und zwar aufgrund der Tatsache, daß einer der ursprünglich konstruierten Klonierungsvektoren, pBR322, eine Ampicillinresistenzdeterminante trägt (Bolivar et al., 1977, Gene 2: 95–113). Eines der Derivate dieses Plasmids ist pAT153 (Twigg und Sherratt, 1980, Nature 283: 216–218). Der Ampicillinresistenzmarker wird, wie die Mehrzahl plasmidcodierter Resistenzen, konstitutiv kontrolliert.
Zwar wurde in Klonierungsvektoren zur Herstellung von Polypeptiden bereits eine Reihe von Selektionssystemen eingesetzt, doch besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten Selektionssystemen.
Erfindungsgemäß wird ein Vektor bereitgestellt, der ein induzierbares Selektionsgen sowie eine Sequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, umfaßt.
Der Begriff "Vektor", wie er hier verwendet wird, wird in seinem weitesten Sinne verwendet und umfaßt in seiner Bedeutung alle Replikons, die dazu in der Lage sind, rekombinantes DNA-Material von einer Zelle in eine andere zu überführen. Die folgende Erfindung umfaßt zur Integration in einen Wirt geeignete Vektoren sowie Vektoren, wie z. B. Plasmide, die zur Konstruktion von Vektoren zur Übertragung rekombinanter DNA in Wirte geeignet sind.
Das induzierbare "Selektionsgen" (oder der Selektionsmarker) enthält im allgemeinen ein Gen, das die Selektion erleichtert und induzierbar ist. Dabei kann das induzierbare Selektionsgen ein erstes Gen, das für eine die Selektion erleichternde Substanz codiert, und ein zweites Gen, das die Expression dieser Substanz kontrolliert, sodaß die Expression nur unter definierten Bedingungen stattfindet, umfassen. So kann beispielsweise das erste Gen ein Gen, das für eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleihende Substanz codiert, und das zweite Gen ein Gen, das für einen Repressor codiert, umfassen. In Gegenwart des Antibiotikums wird das System induziert, und die Expression des ersten Gens findet statt, sodaß eine Antibiotikaresistenz verliehen und somit die Selektion rekombinanter Vektoren, die das Selektionsgen tragen, gestattet wird. In Abwesenheit des Antibiotikums erfolgt eine Repression, sodaß die Expression des ersten Gens nicht stattfindet und die Substanz, die die Antibiotikaresistenz im Vektor verleiht, nicht produziert wird.
Beispielsweise handelt es sich bei einem geeigneten induzierbaren Selektionsgen insbesondere um ein Gen, das die tetA- und tetR-Gene enthält. Bei dem tetA-Gen handelt es sich um das Gen, das für eine Resistenz gegenüber Tetracyclin verleihende Substanz codiert, während das tetR-Gen für ein Repressorprotein codiert, das in der Lage ist, die Expression des tetA-Gens zu verhindern. Das System wird in Gegenwart von Tetracyclin induziert, sodaß in dessen Gegenwart das tetA-Gen exprimiert und somit in Vektoren, die das Selektionsgen tragen, Tetracyclinresistenz verliehen wird. In Abwesenheit von Tetracyclin wird das tetA-Gen durch das tetR-Gen reprimiert, sodaß keine tetA- Expression statfindet und kein Produkt dieses Gens erzeugt wird.
Somit wird in einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Vektor bereitgestellt, der ein die tetA- und tetR-Gene umfassendes induzierbares Selektionsgen sowie eine Sequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, umfaßt.
Der Vektor kann zusätzlich zu den oben erwähnten Sequenzen weitere, für bestimmte Anwendungen geeignete DNA-Sequenzen, wie z. B. entsprechende Kontrollsequenzen, enthalten. So kann der Vektor beispielsweise einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle und eine Transkriptionsterminatorsequenz enthalten. Der Vektor enthält im allgemeinen einen Replikationsursprung, beispielsweise den aus dem Plasmid pAT153 stammenden Replikationsursprung.
Als Promotor besonders geeignet ist beispielsweise der Tryptophan (trp)-Promotor. Andere Promotoren können verwendet werden. So enthält beispielsweise in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Vektor den T7A3-Promotor (SEQ ID NO 42), wobei in diesem Fall der Vektor gegebenenfalls auch einen Operator, wie z. B. laco (vor allem die verkürzte laco-Sequenz der SEQ ID NO 43) enthalten. Die in SEQ ID NO 42 gezeigte T7A3-Promotorsequenz ist bis zur Base vor dem Start der mRNA dargestellt, sodaß sich bei Verwendung mit der laco-Sequenz die laco-Sequenz aus SEQ ID NO 43 von +1 (Start der mRNA) erstreckt.
Ein Transkriptionsterminator ist beispielsweise insbesondere ein Derivat der im Gen 32 des Bakteriophagen T4 gefundenen Transkriptionsterminatorsequenz.
Eine Sequenz, die dem Vektor Stabilität verleiht, kann ebenfalls vorhanden sein. Ein Beispiel für eine solche Sequenz ist die cer-Sequenz (siehe z. B. Cell, 36, 1097–1103, 1984).
Der Vektor kann eine multiple Clonierungssequenz enthalten, um die Einführung von Ribosomen-Bindungssequenzen und Genen für heterologe Polypeptide usw. zu erleichtern.
Das heterologe Polypeptid kann ein Polypeptid umfassen, das pharmakologische Eigenschaften besitzt und somit von medizinischem Nutzen ist. Ein besonderes Beispiel eines solchen Polypeptids ist Ricin A, das bei der Herstellung von Immunotoxinen verwendet werden kann. Ein weiteres Beispiel ist ein als G-CSF bekanntes Polypeptid oder ein Analog davon.
Der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) wurde in der Literatur von Wallet K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 82, S. 1526–1530 und ebenso in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 169,566 und der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132 beschrieben. Es konnte gezeigt werden, daß G-CSF die Granulozytenproduktion in vivo stimuliert und dabei mit minimalen Nebenwirkungen funktioniert. Daher sieht man für das menschliche G-CSF eine Verwendungsmöglichkeit bei der Behandlung der Neutropänie im Zusammenhang mit Chemotherapie, Strahlentherapie, Strahlenunfall oder autologer Knochenmarkstransplantation. Zudem könnte G-CSF eine Verwendung bei der Stimulierung der Knochenmarkssuppression im Zusammenhang mit AIDS, bei der Behandlung von myelodysplastischen Syndromen, die durch Granulozytenfunktionsanomalien charakterisiert sind, und als Hilfsmittel bei der Behandlung schwerer Infektionen finden.
Der Begriff "menschlicher G-CSF", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen G-CSF, bei denen sich herausstellt, daß sie in der Natur vorkommen, und umfaßt die beiden Polypeptide mit der in SEQ. ID No 41 aufgeführten Aminosäuresequenz. Diese beiden Polypeptide unterscheiden sich lediglich dahingehend, daß in einem Polypeptid zwischen den Positionen 35 und 36 eine Tripeptid-Insertion Val-Ser-Glu vorhanden ist, wohingegen sie im anderen Polypeptid fehlt. Die in der folgenden Beschreibung durchgehend verwendete Numerierung beruht auf dem natürlich vorkommenden Polypeptid ohne die Val-Ser-Glu-Insertion.
Zu den G-CSF-Analogen gehören Polypeptide, die sich von dem der natürlich vorkommenden G-CSF hinsichtlich der Identität oder Lokalisierung eines oder mehrerer Aminosäurereste unterscheiden. So können solche Analoge beispielsweise Substitutionen oder terminale oder innenliegende Additionen oder Deletionen solcher Reste enthalten. Solchen Analogen wäre die Eigenschaft natürlicher G-CSF, die Granulozytenproduktion stimulieren zu können, gemeinsam.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein replizierbares Expressionsvehikel, das einen Vektor mit der oben angegebenen Bedeutung umfaßt, bereit.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein replizierbares plasmidisches Expressionsvehikel bereitgestellt, das ein tetA- und tetR-Gene umfassendes induzierbares Selektionsgen sowie eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, umfaßt.
Das Expressionsvehikel kann, wie oben angedeutet, eine Sequenz enthalten, die dem Expressionsvehikel Stabilität verleihen kann, wie z. B. die cer-Sequenz.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der ein replizierbares plasmidisches Expressionsvehikel umfaßt, das einen Promotor, die cer-Sequenz, einen Trans kriptionsterminator, wie man ihn am Ende des Gens 32 des Bakteriophagen T4 findet, einen Replikationsursprung sowie eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, umfaßt.
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren einen Wirt, der einen erfindungsgemäßen Vektor enthält, kultiviert, sodaß das Polypeptid exprimiert wird.
Das Verfahren kann in Abwesenheit des bei der Selektion verwendeten Produkts durchgeführt werden. So kann beispielsweise, falls das Selektionssystem die tetA- und tetR-Gene umfaßt, das Verfahren in Abwesenheit von Tetracyclin durchgeführt werden.
Das oben erwähnte Verfahren kann unter Verwendung einer entsprechenden Wirtszelle, wie z. B. Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellen, ausgeführt werden. Zu den geeigneten Wirten gehören beispielsweise insbesondere Bakterienzellen, z. B. E. coli.
Es ist ersichtlich, daß in dem Fall, daß der gewünschte Metabolit nicht mit einer sinnvollen Geschwindigkeit aus dem Wirt exportiert wird, der letztere kultiviert und in Form der intakten Zelle geerntet und das gewünschte Polypeptid durch nachfolgende Extraktion der Zellen, beispielsweise nach Trennung von dem für das Wachstum der Wirtszelle notwendige Nährstoffe enthaltenden Medium, gewonnen werden. In dem Fall, daß der Metabolit aus der Wirtszelle in die umgebende Kulturlösung exportiert wird, kann das Polypeptid durch Extraktion in der üblichen Weise gewonnen werden.
Erfindungsgemäß wird ebenso ein Wirt bereitgestellt, der zur Expression eines heterologen Polypeptids in der Lage ist und einen Vektor (wie z. B. ein replizierbares plasmidisches Expressionsvehikel) mit der hier angegebenen Bedeutung enthält.
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Wirt bereitgestellt, der mit einem replizierbaren plasmidischen Expressionsvehikel transformiert ist, welches ein die tetA- und tetR-Gene umfassendes induzierbares Selektionsgen sowie eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, umfaßt.
Gemäß einem weiteren Merkmal der folgenden Erfindung wird ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Wirts mit der oben angegebenen Bedeutung bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren einen Wirt transformiert, indem ein Vektor (wie z. B. ein replizierbares plasmidisches Expressionsvehikel) mit der oben angegebenen Bedeutung darin inseriert wird.
Geeignete Verfahren zur Einführung von genetischem Fremdmaterial in einen Wirt sind aus der Literatur bekannt. Zu solchen Verfahren zählen die Bildung eines replizierbaren Expressionsvehikels, das einen Vektor und das genetische Fremdmaterial umfaßt, sowie die Einführung des Vehikels in den Wirt. Die Einführung des Vehikels in den Wirt läßt sich dadurch erleichtern, daß der Wirt einer entsprechenden Behandlung ausgesetzt wird, beispielsweise im Fall von E. coli durch Behandlung mit Calciumchloridlösung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors mit der hier angegebenen Bedeutung bereit, wobei man in dem Verfahren eine Sequenz, die für das gewünschte Polypeptid codiert, in einen Vektor (mit der hier angegebenen Bedeutung) an einer entsprechenden Insertionsstelle inseriert, sodaß man einen Vektor (zweckmäßigerweise in Form eines replizierbaren plasmidischen Expressionsvehikels) erhält, der die Synthese des Polypeptids kontrollieren kann.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der ein induzierbares Selektionsgen umfaßt. Dabei kann das Selektionsgen die oben angegebene Bedeutung besitzen; beispielsweise kann es die tetA- und tetR-Gene umfassen.
In dem Vektor der vorliegenden Erfindung wird ein induzierbares Selektionsgen verwendet. Dies stellte sich als besonders vorteilhaft heraus, da das Produkt dieses Gens (tetA in der bevorzugten Ausführungsform) nur während der Konstruktions- und Testphasen der gentechnischen Manipulation exprimiert wird. Falls das nachfolgende, das klonierte Gen tragende Plasmid stabil in seinem Bakterienwirt gehalten wird, wird keine Selektion mehr benötigt. Daher benötigen die zur Expression des klonierten Genprodukts gewachsenen Kulturen keine Zugabe des Selektionswirkstoffs und exprimieren demzufolge nicht das Produkt des Selektionsgens. In den meisten Vektoren ist ein solches Produkt unvermeidbar, da sie konstitutiv exprimierte Selektionsgene tragen. Solche unerwünschten Produkte sind nachteilig, da sie Stoffwechselenergie von dem klonierten Genprodukt abziehen und unerwünschte Verunreinigungen produzieren können. Insbesondere wird durch die erfindungsgemäßen Vektoren die Verwendung von Penizillinen als Selektionsmarker vermieden. Dies ist aufgrund der weitverbreiteten allergischen Reaktionen auf Penizillin oder seiner Abbauprodukte in. der Bevölkerung besonders vorteilhaft. Das Vorhandensein einer durch das Plasmid codierten β-Laktamase würde den einfachen Nachweis jeglicher solcher kontaminierender β-Laktame als aktive Antibiotika verhindern.
Die Verwendung der tetA/tetR-Gene als Selektionssystem stellte sich als besonders vorteilhaft heraus, da die dieses Selektionssystem enthaltenden Vektoren im allgemeinen unerwartet stabil sind. Diese Stabilität hilft dabei, die Expressionsniveaus aufrechtzuerhalten und die Anreicherung von Polypeptiden, wie z. B. Ricin A, zu verbessern.
Die Stabilität der erfindungsgemäßen Vektoren wird durch pICI0042, das das tetA/tetR-Selektionsgen trägt, veranschaulicht. Es stellte sich unerwarteterweise heraus, daß dieses Plasmid gegenüber seinem Mutterplasmid pAT153 stabiler ist, selbst ohne das Vorhandensein der cer-Sequenz. Dies ist ein unerwarteter, jedoch sehr willkommener Vorteil der Konstruktion dieses Plasmids.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen allerdings nur beispielhaft weiter beschrieben, wobei:
in 1 Transkriptionsterminatorsequenzen dargestellt sind;
in 2 die Herstellung von pTB344 dargestellt ist;
in 3 die Herstellung von pICI0042 dargestellt ist;
4 eine Plasmidkarte von pICI0042 darstellt;
in 5 Fragmente, die bei der Herstellung von Plasmiden verwendet werden, beschrieben sind;
6 eine Plasmidkarte von pICI1079 darstellt;
7 eine Plasmidkarte von pLB015 darstellt;
8 eine Plasmidkarte von pCGG1 darstellt;
In 9 die Sequenz von [Ser^17,27]G-CSF beschrieben ist;
in 10 die Sequenz von h-GCSF beschrieben ist;
11 eine Plasmidkarte von pCG54 darstellt;
in 12 die Konstruktion von pICI0020 dargestellt ist;
in 13 die Konstruktion von pICI1078 dargestellt ist;
in 14 die Konstruktion von pICI1102 dargestellt ist;
in 15 ein mit Coomassie gefärbtes SDS-Gel von E. coli Lysaten dargestellt ist, wobei es sich bei Spur A um pICI1102; bei B um pICI0020 und bei C um Molekulargewichtsmarker handelt.
in 16 ist ein Gelprofil von pICI1102 dargestellt, wobei der Spitzenwert R Ricin A repräsentiert;
17 stellt einen Western-Blot von durch pICI1102 produziertem Ricin A dar, wobei es sich bei Spur 1 um Molekulargewichtsmarker; bei 2 und 3 um nichtricinproduzierende Klone; bei 4 um pICI1102; und bei 5 um pICI0020 (Kontrollplasmid – keine Ricin-A-Sequenz); handelt;
18 stellt eine Teilsequenz von pICI1102 dar; und
in 19 ist die Konstruktion von pICI1187 dargestellt.
Die Sequenzen, auf die hier verwiesen wird, sind in dem den Beispielen folgenden "Sequenzprotokoll" aufgeführt, wobei die Sequenzen im herkömmlichen 5'- nach- 3'-Sinn angegeben sind.
PUFFER FÜR RESTRIKTIONSENZYME

Stabilität: stabil bei –20°C

Pufferzusammensetzung

Die obigen Puffer sind von Boehringer Mannheim erhältlich. Im Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese – Beispiel 7

Puffer 1	100 mM Tris HCl pH 8,0 100 mM NaCl 20 mM MgCl₂
Puffer 2	10 mM Tris HCl pH 8,0 20 mM NaCl 1 mM EDTA
Puffer 3	12 mM TrisH Cl pH 7,7 30 mM NaCl 10 mM MgCl₂ 8 mM 2-Mercaptoethanol
Puffer 4	60 mM Tris HCl pH 8,0 90 mM NaCl 6 mM MgCl₂ 10 mM DTT

Nukleotidmix 1 jeweils 250 μM dATP, dGTP, dCTP = S (Phosphorthioatderivat von dCTP), dTTP und 1 mM ATP Nukleotidmix 2 jeweils 250 μM dATP, dGTP, dCTP, dTTP und 350 μM ATP
M9-Minimalmedium
Zusätze/75 ml
Spurenelementlösung (Trace Element Solution, TES)

Die TES hat die folgende Zusammensetzung:

	mg/10 ml entionisiertes Wasser
AlCl₃·6H₂O	2,0
CoCl₂·6H₂O	0,8
KCR(SO₄)₂·12H₂O	0,2
CuCl₂·2H₂O	0,2
H₃BO₃	0,1
KI	2,0
MnSO₄·H₂O	2,0
NiSO₄·6H₂O	0,09
Na₂MoO₄·2H₂O	0,4
ZnSO₄·7H₂O	0,4

Geneclean (TM)
Der Kit enthält 1) 6 M Natriumiodid 2) eine konzentrierte Lösung von Natriumchlorid, Tris und EDTA zur Herstellung einer Natriumchlorid/Ethanol/Wasser-Waschlösung; 3) Glassmilk (TM) – ein 1,5-ml-Fläschchen mit 1,25 ml einer Suspension einer Siliziumdioxidmatrix in Wasser.
Hierbei handelt es sich um eine Technik zur DNA-Reinigung, die auf dem Verfahren von Vogelstein und Gillespie, veröffentlicht in Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) Bd. 76, S. 615, beruht.
Als Alternative läßt sich ein beliebiges der in "Molecular Cloning – a Laboratory Manual", Second Edition, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschriebenen Verfahren verwenden.
Random Label Kit – Produkt Nr. 27-9250 von Pharmacia
Die Vorgehensweise ist in "Molecular Cloning – a Laboratory Manual", Second Edition, Sambrook, Fritsch und Maniatis, S. 10.13–10.17 (erschienen bei Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschrieben.
Sequenase (TM)
Chemisch modifizierte T7-DNA-Polymerase
Auf Basis des von Tabor und Richardson in "Proceedings of the National Academy of Sciences USA" (1987) Bd. 84, S. 4767–4771 veröffentlichten Verfahrens.
T4-DNA-Ligase
Beschrieben in "Molecular Cloning – a Laboratory Manual", Second Edition, Sambrook, Fritsch und Maniatis, 5.60–5.64 (erschienen bei Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) und ebenso von Weiss B. et al., J Biol. Chem., Band 243, S. 4543 (1968).
E. coli-Stämme
Die E. coli-Stämme HB101 und CGSC 6300 (hierin auch mit MSD522 bezeichnet) sind frei erhältlich. So können sie beispielsweise von dem E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA bezogen werden. Zudem kann E. coli-HB101 zusätzlich beispielsweise von BRL, vertrieben durch GIBCO Limited Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, UB8 2YG, Middlesex, England oder GIBCO Laboratories, Life Technologies Inc., 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA, bezogen werden. Der Genotyp des Stamms HB101 ist im oben erwähnten "Molecular Cloning – a Laboratory Manual", als Sup E44 hsd S20 (r_B ^–m_B ^–) rec A 13 ara-14 F^–leu 6 thi-1 proA2 lac Y1 gal K2 rps L20 xyl^–5 mtl^–1 beschrieben. Der Genotyp von MSD 522 (CGSC 6300) ist in Beispiel 3 aufgeführt.
Die im folgenden angegebenen nichtlimitierenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung.
BEISPIEL 1
Herstellung von Plasmiden mit trp-Promotor/tetA/tetR-Genen.
(a) Herstellung von pICI0042
Viele Plasmidvektoren beruhen auf einem der orginalen Klonierungsvektoren: pBR322 (Bolivar et al., 1977, Gene 2: 95–113). So ist das nichtmobilisierbare Plasmid pAT153 davon abgeleitet (Twigg und Sherratt, 1980, Nature 283: 216–218). Beide Plasmide enthalten die Ampicillinresistenzdeterminate TEM-β-Laktamase.
In Plasmid pICI0042 kommt eine reprimierte Tetracyclinresistenzdeterminante zum Einsatz, wie sie auf dem natürlich vorkommenden Plasmid RP4 angetroffen wird. Durch dieses Repressionssystem wird die Expression des tetA-Gens in Abwesenheit von Tetracyclin abgeschaltet, wohingegen die meisten wirkstoffresistenten Mechanismen eine konstitutive Expression aufweisen.
Der tet-Locus wurde erstmals von Barth und Grinter (J. Mol. Biol. 113: 455–474, 1977) auf RP4 kartiert. Dabei zeigte sich, daß er aus den unmittelbar nebeneinanderliegenden Genen tetA, dem Resistenzstrukturgen, und tetR, dem Repressorgen, besteht, wobei dieser Bereich sequenziert wurde (Klock et al., J. Bacteriol: 161: 326–332, 1985). Diese Gene sind auf nebeneinanderliegenden BglII-SmaI- und SmaI-SmaI-Fragmenten lokalisiert. Die BglII-Stelle kommt in RP4 einmal vor, wohingegen fünf SmaI-Stellen vorhanden sind (Lanka, Lurz und Furste, Plasmid 10: 303–307, 1983).
(i) Klonierung der tetA- + tetR-Gene
Das Plasmid RP4 ist gut dokumentiert (Datta et al., J. Bacteriol 108: 1244, 1971) und ist frei erhältlich. Weiterhin wurde das Plasmid RP4 bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NW9 5HT unter den Zugangsnummern 50078 und 50437 hinterlegt. RP4 von N. Datta (National Collection of Type Cultures) wurde hier verwendet. Die dieses Plasmid enthaltenden E. coli-Stämme wurden in Selektionsbouillon angezogen und die Plasmid-DNA mittels des an ein größeres Volumen angepaßten Verfahrens von Holmes und Quigley (Holmes und Quigley, Anal. Biochem 114: 193–197, 1981) isoliert. Sie wurde durch 2,5 M Ammoniumacetat deproteiniert und wiederum mit Isopropanol ausgefällt. Diese Plasmid-DNA wurde dann nach den vom Zulieferer empfohlenen Bedingungen mit dem Restriktionsenzym BglII behandelt und vollständig geschnitten. Danach wurde sie mit XmaI unter Verwendung von verdünntem Enzym und kurzen Inkubationszeiten teilweise geschnitten. Bei XmaI handelt es sich um ein Isoschizomer von SmaI, das jedoch an seinen geschnittenen Stellen kohäsive Enden aus 4 Nukleotiden produziert.
Das Vektorplasmid pUC8 (Yanisch-Perron, Vieira und Messing, Gene 33: 103–119, 1985) wurde in ähnlicher Weise präpariert und mit BamHI und XmaI vollständig geschnitten. Die RP4-Fragmente wurden durch 16 stündige Ligation mit T4-Ligase bei 12°C in diesen Vektor kloniert. Dieses Konstrukt wurde zur Transformation von E. coli C600, die mittels des Calciumchloridverfahrens kompetent gemacht worden waren (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), verwendet. Die Kulturen wurden danach auf ein Medium ausplattiert, mit dem auf Tetracyclinresistenz selektioniert wurde.
E. coli C600 ist aus zahlreichen Quellen, einschließlich für Kultursammlungen, wie z. B. dem E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA unter der Zugangsnummer GCSC 3004, frei erhältlich. Der Genotyp von E. coli C600 ist K12 thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 tonA21 λ^– supE44.
Mehrere Kolonien mit dieser Resistenz wurden auf den erwarteten Phenotyp (Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, jedoch keine auf RP4 selbst hinweisende Kanamycinresistenz) überprüft. Kolonien mit den korrekten Resistenzen wurden danach einer Klonanalyse unterzogen, indem Plasmid-DNA isoliert wurde (Verfahren nach Holmes und Quigley). Diese Präparationen wurden mit EcoRI und HindIII geschnitten und über Gelelektrophorese analysiert. Dadurch wurde die Größe der klonierten Insertion festgelegt, für die sich ein Wert von 2,45 kb ergab, der für das BglII-XmaI-XmaI-Fragment aus RP4 vorhergesagt worden war. Ein dieses Fragment mit den tetA- und tetR-Genen tragender Klon wurde mit pTB344 bezeichnet (2).
(ii) Entfernung des tet-Gens aus pAT153
Es war notwendig, das tet-Gen aus dem Vektorplasmid pAT153 zu entfernen, bevor die tetA + tetR-Kassette aus RP4 inseriert wurde, um eine Genverdopplung zu vermeiden, die eine Quelle für genetische Instabilität darstellen kann. Ebenso kann das tet-Gen durch das nichtentsprechende tetR nicht effektiv supprimiert werden. Die Entfernung wurde durchgeführt, indem die pAT153-Plasmid-DNA isoliert und mit EcoRI und AvaI geschnitten wurde. Zwischen diese Stellen wurden synthetische Oligonukleotide mit der folgenden Sequenz (SEQ IN No. 40):–
kloniert. Diese passen zu den EcoRI- und AvaI-kohäsiven Enden und enthalten zusätzlich SphI-, BamHI- und ClaI-Stellen. Nach der Transformation und Selektion wurden die Kolonien auf den Verlust der Tetracyclinresistenzdeterminante getestet. Die Plasmid-DNA aus einem Klon wurde sequenziert, um zu bestätigen, daß die vorhergesagte Sequenz korrekt war. Dieses Plasmid wurde mit pICI0019 bezeichnet (3).
(iii) Insertion der tetA- + tetR-Gene
Das tetA- und das tetR-Gen wurden aus pTB344 auf einem Fragment von EcoRI bis PstI isoliert. Der pUC8-Vektor wurde durch Schneiden mit SspI zerstört, da er die gleiche Selektionsdeterminante (Ampicillinresistenz) wie pICI0019 trägt. Die pICI0019-Plasmid-DNA wurde mit EcoRI und PstI geschnitten und danach mit dem die tet-Gene tragenden 2,45 kb großen Fragment ligiert. Dieses Konstrukt wurde zur Transformation von E. coli C600 verwendet, wobei die Kultur unter Selektion auf Tetracyclin-resistente Kolonien ausplattiert wurde. Die Insertion der tet-Gene war so vorgesehen, daß dadurch das bla-Gen in pCH19 größtenteils ersetzt wird, womit es seine Ampicillinresistenzdeterminate verlieren sollte. Der Verlust der Ampicillinresistenz der Transformanten wurde bestätigt. Einige wenige Klone wurden dann zur Isolierung von Plasmid-DNA verwendet, die dann einer Restriktionsanalyse unterzogen wurde. Dadurch wurde die vorgesehene Struktur des konstruierten Plasmids bestätigt. Dieses wurde mit pTB351 bezeichnet (3).
(iv) Insertion der cer-Sequenz
Das natürlich vorkommende Plasmid ColEI wird im Gegensatz zu seinen Derivaten pBR322 und pAT153 mit hoher Stabilität im E. coli beibehalten. Summers und Sherrat (Cell, 36: 1097–1103, 1984) zeigten, daß dies daran lag, daß den Derivaten eine kurze (283 bp große), cer genannte Sequenz, die im Ausgangsplasmid vorliegt, fehlt. Diese Sequenz enthält ein stellenspezifisches System zur Auflösung von Plasmid-Multimeren, durch das die Anhäufung von durch die homologe Rekombination gebildeten Plasmidmultimeren verhindert wird. Solche Multimeren besitzen eine negative Wirkung auf den Teilungsvorgang, der normalerweise eine stabile Weitergabe der Tochterplasmide während der Bakterienzellteilung sicherstellt.
Die cer-Sequenz (Summers, D et al. MGG, 201, S. 334–338, 1985) wurde aus dem Plasmid pKS492 (von D. Sherratt zur Verfügung gestellt) durch Schneiden mit BamHI und TaqI als ein 289 bp großes Fragment isoliert. Das Plasmid pTB351 wurde als DNA aus einem E. coli-dam-Stamm isoliert, um zu verhindern, daß seine ClaI-Stelle durch das dam⁺-Methylierungssystem blockiert wird. Diese DNA wurde mit BamHI und ClaI, geschnitten (wobei beide Stellen auf dem synthetischen Oligonukleotid für diese Klonierung eingeführt wurden). Das cer-Fragment wurde mit dem geschnittenen Vektor ligiert und danach zur Transformation von E. coli C600 verwendet, wobei auf Tetracyclinresistenz selektioniert wurde. Transformantenkolonien wurden dann einer Klonanalyse mittels AvaI-Restriktion und Gelelektrophorese unterzogen. Das Vorhandensein einer zusätzlichen DNA-Bande von etwa 300 bp deutete auf den Einbau des cer-Fragments hin. Weitere Restriktionsanalysen wurden dazu verwendet, die korrekte Struktur der erhaltenen Plasmide zu bestätigen. Eines von diesen wurde mit pICI0042 bezeichnet (3 und 4).
(v) Tests an pICI0042
Das Plasmid wurde vollständig unter Verwendung des Geräts DuPont Genesis 2000 sequenziert (3 und 4).
Die Induzierbarkeit der Tetracyclinresistenz wurde überprüft. Zunächst wurde dabei die minimale Hemmkonzentration (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) von Tetracyclin für (pICI0042)C600 gemessen, indem eine Kultur dieses Stamms mit 0,5 μg/ml Tetracyclin induziert wurde. Nach der Anzucht wurde diese Kultur in einer Verdünnungsreihe verdünnt und auf Bouillonmedium mit Tetracyclinkonzentrationen von 0 bis 500 μg/ml so ausplattiert, daß etwa 100 Kolonien pro Platte erhalten wurden. Es stellte sich heraus, daß die MIC bei etwa 200 μg/ml lag. Danach wurde eine Kultur von (pICI0042)C600 bis zur frühen Log-Phase in Luriabouillon-Medium in Abwesenheit von Tetracyclin angezogen. Diese Kultur wurde zum Animpfen paralleler Kulturen in Bouillon mit und ohne Tetracyclininduktion verwendet. Diese Kulturen wurden mit Luftzufuhr 90 Minuten bei 37°C angezogen, um so eine induzierte Expression zu gestatten. Verdünnungsreihen dieser Kulturen wurden dann auf reiches Medium mit und ohne 100 μg/ml Tetracyclin ausplattiert. Die erhaltenen Kolonien zeigten, daß die Lebensfähigkeit der nichtinduzierten Kultur 1600fach niedriger war als die der induzierten Kultur auf dem Tetracyclinmedium. Dadurch wird bestätigt, daß das tetA + tetR-Induktionsystem in pICI0042 zufriedenstellend arbeitet.
Die Stabilität der Beibehaltung von pTB351 und pICI0042 in E. coli C600 wurde überprüft, und zwar um diese Plasmide mit ihrem Ausgangsplasmid pAT153 zu vergleichen und die Wirkung der cer-Sequenz in pICI0042 festzuhalten. Die Kulturen wurden ohne Selektion angezogen und Proben auf das Vorhandensein des Plasmids nach 50, 100 und 150 Generationen Wachstum überprüft. Dabei wurde über den gesamten Zeitraum bei keinem der beiden Stämme ein Plasmidverlust festgestellt. Somit scheint pTB351 selbst ohne eine cer-Sequenz an Stabilität gegenüber seinem Ausgangsplasmid pAT153 gewonnen zu haben. Dies kann eine Folge der Deletion seines tet-Gens sein. Natürlich vorkommende Plasmide weisen immer eine Tetracyclinresistenz unter induzierbarer Kontrolle auf, sodaß das konstitutive tet-Gen in pAT153 in Abwesenheit von Tetracyclin der Selektion entgegenwirken könnte. Dies könnte daran liegen, daß der Tetracyclinresistenzmechanismus als eine Cytoplasmamembran-Exportpumpe wirkt. Dabei könnte sie, wenn sie nicht benötigt wird, der Zelle durch Beschädigung der Membranstruktur, den Export gewünschter Stoffwechselprodukte oder die Verschwendung von Stoffwechselenergie Schaden zufügen. Das Vorhandensein der cer-Sequenz in pICI0042 sollte zur Stabilität der Beibehaltung des Plasmids beitragen, selbst unter den der Selektion entgegenwirkenden Bedingungen der Verwendung zur Expression eines rekombinanten Gens auf hohem Niveau.
(b) Herstellung des Plasmids pCH101
Das Plasmid pCH101 entspricht pICI0020 (siehe Beispiel 5c), mit der Ausnahme, daß das EcoRI-SalI-Fragment (siehe 5a) durch ein aus der SEQ ID No 34 (siehe auch 5b) und der Sequenz des Interferon-α₂-Gens, wie sie von Edge M. D. et al., Nucleic Acids Research 1983, Bd. 11, S. 6419–6435 beschrieben ist, bestehendes Fragment ersetzt ist. Diesbezüglich liegt das 3'-terminale ATG-Codon der SEQ ID No 34 unmittelbar vor dem TGT-Codon, das für Cystein (Aminosäure 1) in der Interferon-α₂-Sequenz aus der oben erwähnten Literaturangabe Edge M. D. et al., Nucleic Acids Research codiert. Die 5'-Nukleotidsequenz GATCCATG sowie die komplementäre 3'-Nukleotidsequenz GTAC werden somit aus der Nukleotidsequenz der oben erwähnten Literaturangabe weggelassen.
(c) Insertion einer Expressionskassette in pICI0042
Eine aus dem trp-Promotor, einer Ribosomenbindungsstelle und dem Interferon-α₂-Gen bestehende Expressionskassette wurde aus dem Plasmid pCH101 (siehe b oben) auf einem Restriktionsfragment von EcoRI bis SphI isoliert. Dieses wurde in den in ähnlicher Weise mit EcoRI und SphI geschnittenen Produktionsvektor (pICI0042) (siehe oben) ligiert. Diese DNA wurde zur Transformation einer kompetenten Kultur von E. coli C600 verwendet, wobei Tetracyclin-resistente Kolonien isoliert wurden. Einige von diesen wurden mittels DNA-Klonanalyse auf den Erhalt der auf der Expressionskassette liegenden SstI-Restriktionsstelle getestet. In dieser Hinsicht positive Klone wurden durch Restriktionskartierung weiter getestet, um zu überprüfen, ob das erwartete Konstrukt korrekt war. Sie wurden ebenfalls auf die übertragene Fähigkeit zur Produktion von Interferon-α₂-Protein, wie sie auf einem mit Coomassie Blue angefärbten SDS-Polyacrylamidgel analysiert wurde, überprüft. Einer der auf diese Weise bestätigten Klone wurde mit pLB005 bezeichnet.
(d) Insertion des T4-Transkriptionsterminators in pTB244
Die T4-Transkriptionsterminatorsequenz wurde in Form eines Fragments von SalI bis HindIII (Länge: 67 Basenpaare) (siehe SEQ ID No. 33 und 1b) in die multiple Klonierungsstelle eines Zwischenvektors pTB244 (beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 237,269) zwischen dessen SalI- und HindIII-Stellen inseriert. Eine Klonanalyse wurde zur Bestätigung der Struktur dieses Konstrukts (pTB244-T4 ter) verwendet. Aus diesem Vektor wurde dann ein Fragment von SstI bis SphI, das den größten Teil der multiplen Klonierungsstelle sowie den T4-Terminator enthält, isoliert. Dieses Fragment wurde in das in ähnlicher Weise mit SstI und SphI geschnittene pLB005 inseriert, wodurch das Interferon-α₂-Gen substituiert wurde, eine Kassette bestehend aus dem trp-Promotor, der multiplen Klonierungsstelle und dem T4-Terminator jedoch übrig blieb. Dieses Konstrukt wurde mittels Klonanalyse bestätigt und das Plasmid mit pLB013 bezeichnet.
(e) Substitution der multiplen Klonierungsstelle
Die multiple Klonierungsstelle in pLB013 ist für diesen Vektor in mehrfacher Hinsicht nicht ideal: Die SalI-, BamHI- und SmaI-Stellen sind nicht einzigartig, sondern kommen an anderer Stelle auf dem Plasmid vor. Dieses Fragment wurde daher durch Schneiden mit SstI und XbaI (beide einzigartig) ausgeschnitten, und synthetische Oligonukleotide mit der Sequenz der SEQ ID No. 35:
wurden an seiner Stelle inseriert. Klone wurden auf den Erhalt der neuen Restriktionsstellen hin analysiert und dann durch Sequenzieren bestätigt. Eines dieser Plasmide wurde mit pLB014 bezeichnet. Die auf diese Weise inserierten neuen Klonierungsstellen sind: NdeI, KpnI, BglII, XhoI und ScaI, wobei sich daran die zuvor vorhandenen XbaI- und SalI-Stellen anschließen.
(f) Weitere Modifikation
Es wurde festgestellt, daß die unmittelbar nebeneinanderliegenden SstI- und NdeI-Stellen in pLB014 von diesen beiden Restriktionsenzymen weder gleichzeitig noch nacheinander geschnitten werden konnten, folglich aufgrund ihrer engen Nachbarschaft. Daher wurde eine zusätzliche Sequenz zwischen diese Stellen inseriert. Dies erfolgte durch Schneiden von pLB014 mit SstI und KpnI und nachfolgende Insertion des synthetischen Oligonukleotids der SEQ ID No. 36:
Die Klone wurden auf den Erhalt einer zusätzlichen PvuII- oder PstI-Stelle analysiert und danach durch Sequenzieren bestätigt. Eines dieser Plasmide wurde mit pLB015 (= pICI0080) (siehe 7) bezeichnet. Dieses Plasmid wird im Gegensatz zu pLB014 von SstI und NdeI effizient geschnitten. Dies dient dazu, einen Ort für die Insertion verschiedener Ribosomenbindungsstellensequenzen mit der korrekten Positionierung hinsichtlich des stromaufwärts befindlichen trp-Promotors zur Verfügung zu stellen, wobei NdeI zur Bereitstellung des ATG-Startcodons des zu exprimierenden Gens vorgesehen ist.
BEISPIEL 2
Herstellung von menschlichem [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65-G-CSF unter Verwendung eines trp-Promotor enthaltenden Vektors
a) Das Plasmid pICI1239 (beschrieben in Beispiel 7) wurde, wie zuvor beschrieben, mit EcoRI und SalI in Puffer H verdaut. Das kleine, den trp-Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und das Gen für [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende EcoRI-SalI-Fragment wurde aus einem 0,7%-Agarosegel unter Verwendung von Geneclean(TM) isoliert. Aus pICI0080 (siehe Beispiel 1f) wurde durch Verdauung mit EcoRI und XhoI in Puffer H ein Vektorfragment hergestellt und das große EcoRI-XhoI-Fragment auf einem 0,7%-Agarosegel unter Verwendung von Geneclean(TM) isoliert. Das kleine EcoRI-SalI-Fragment wurde in das EcoRI-XhoI-Vektorfragment ligiert, wobei ein molarer Überschuß der Insertion gegenüber dem Vektor von 2 : 1, wie zuvor beschrieben, verwendet wurde, und das Ligationsgemisch zur Transformation des E. coli-Stamms MSD 522 verwendet. Transformanten wurden auf das Wachstum auf L-Agarplatten mit Tetracyclin (15 μg/ml) selektioniert. Drei Kolonien wurden ausgewählt und in M9-Minimalmedium (75 ml) mit Zusätzen und Tetracyclin (15 μg/ml) 20 Stunden auf einem Reziprokschüttler bei 37°C angezogen. Die Proteinanhäufung wurde durch Scannen von mit Coomassie Blue angefärbten SDS-PAGE-Gelen von Lysaten ganzer Zellen gemessen. Alle drei Klone exprimierten [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]hu-G-CSF. Die Plasmid-DNA aus einer der Kolonien wurde mit PICI1327 bezeichnet und die Sequenz des Promotors und des Gens mittels Standard-Dideoxysequenzierverfahren, wie zuvor beschrieben, bestätigt.
b) Fermentation
pICI1327 wurde in den E. coli-Stamm MSD 522 transformiert, und die erhaltenen Rekombinanten wurden gereinigt und als Glyzerinkulturen bei –80°C gehalten.
Ein Aliquot der Kultur wurde der Stammkultur entnommen und auf Tetracyclin-Agarplatten zur Trennung von Einzelkolonien nach Übernachtwachstum bei 37°C ausgestrichen. Eine gewünschte Einzelkolonie wurde entfernt und in 10 ml Tetracyclin-Bouillon resuspendiert, und 3 250-ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 75 ml Tetracyclin-Bouillon wurden unmittelbar danach mit jeweils 100 μl angeimpft. Nach 16 h Wachstum bei 37°C auf einem Reziprokschüttler wurden die Kolbeninhalte vereinigt und zur Animpfung eines Fermenters mit 20 l Wachstumsmedium verwendet.
Zusammensetzung des Wachstumsmediums
Die Fermentationen wurden dann bei einer Temperatur von 37°C und einem durch automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxidlösung gesteuerten pH-Wert von pH 6,7 durchgeführt. Der Spannungssollwert für gelösten Sauerstoff (dOT-Wert) lag bei 50% Luftsättigung und wurde zunächst durch automatische Anpassung der Fermenterrührergeschwindigkeit gesteuert. Die Luftzufuhr zum Vermenter von anfänglich 20 l/Min., was 1 Volumen pro Volumen pro Minute (VVM) entspricht, wurde auf 50 l/Min. (2,5 VVM) erhöht, als die Fermenterrührergeschwindigkeit 80–90% ihres Maximums erreichte. Da die Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit (oxygen transfer rate, OTR) der Fermenter bei einer höheren Zelldichte als der einer OD₅₅₀ von 50 unter den beschriebenen Bedingungen entsprechenden Zelldichte nicht mit der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit (oxygen uptake rate, OUR) der Bakterien Schritt halten konnte, wurde der dOT-Wert im Fermenter bei höheren Zelldichten als der angegebenen bei 50% Luftsättigung gehalten, indem die Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit der Bakterien eingeschränkt wurde. Dies wurde dadurch erreicht, daß das Medium so formuliert wurde, daß es bei einer OD₅₅₀ von 50 zu einem Kohlenstoffmangelmedium wurde, und dann die limitierende Kohlenstoffquelle zusammen mit Ammoniumsulfat und Hefeextrakt mit einer die Bakterienwachstumsrate limitierenden Geschwindigkeit zugefüttert wurde.
Die Fermentationen wurden über 18 h durchgeführt, wobei zur Messung der optischen Dichte (OD₅₅₀), des Zelltrockengewichts und der Anreicherung von menschlichem [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]-G-CSF in den Zellen Proben entnommen wurden. Die Anreicherung des menschlichen [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]-G-CSF wurde mittels Scanning von Coomassie Blue gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Lysaten ganzer Zellen der Bakterienproben gemessen, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Nach Erreichen einer OD₅₅₀ von 35 (8,5 h) wurde Caseinhydrolysat-Lösung (100 g/l Oxzoid L41) mit einer Geschwindigkeit von 0,75 g/l/h in die Fermenter gepumpt.
Nach Erreichen einer OD₅₅₀ von etwa 50 war der Vorrat der Kohlenstoffquelle im Fermentationsansatz erschöpft, was zu einem rapiden Anstieg des dOt-Werts von 50% Luftsättigung führte. An diesem Punkt wurde eine Nährlösung mit Glyzerin (470 g/l), Hefeextrakt (118 g/l) und Ammoniumsulfat (118 g/l) mit einer solchen Geschwindkeit in die Fermenter gepumpt, daß dadurch der dOT-Wert auf 50% Luftsättigung zurückkehrte und auf diesem Wert gehalten wurde, wobei der Fermenter mit ca. 70–80% seines Maximums gerührt wurde. Die Caseinhydrolysat-Zufütterung wurde dabei durchgehend bei 0,75 g/l/h gehalten. Nach ungefähr 18 h, als eine mikroskopische Untersuchung der Kultur das Vorhandensein großer Einschlußkörperchen (inclusion bodies) in einer Mehrzahl der Zellen zeigte, wurden die Bakterien in einer Sorval-RC3B-Zentrifuge (7000 g, 30 Min., 4°C) geerntet und eingefroren bei minus 80°C gelagert.
BEISPIEL 3
Herstellung von menschlichem [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]-G-CSF mit einem den T7A3-Promotor enthaltenden Vektor
a) Ein einen T7A3-Promotor, eine trp-Leader-Ribosomenbindungsstellensequenz sowie ein Gen für [Ser^17,27]hu G-CSF enthaltendes EcoRI-SalI-Fragment wurde in M13mp18 subkloniert, wie in Teil d) des Beispiels 5 beschrieben. Die Sequenz des EcoRI-SalI-Fragments ist in SEQ ID No 32 und 9 aufgeführt, wobei SEQ ID No 32 aus der EcoRI-Restriktionsstelle (Nukleotide 1–6), der A3-Promotorsequenz des Bakteriophagen T7 (Nukleotid 7–52), der trp-Leader-Ribosomenbindungsstellensequenz (Nukleotide 53–78) sowie dem Translationsstartcodon (Nukleotide 79–81) besteht. In 9 ist die in der SalI-Restriktionsstelle endende Nukleotidsequenz von menschlichem [Ser^17,27]-G-CSF aufgeführt. Dabei ist ersichtlich, daß das 3'-terminale ATG-Codon der SEQ ID No 32 unmittelbar vor dem ACT-Codon, das für Threonin (Aminosäure 1) in 9 codiert, liegt. Die 5'-Nukleotidsequenz AATTCAGT fehlt somit im EcoRI-SalI-Fragment. Das EcoRI-SalI-Fragment läßt sich auch durch Ausschneiden aus pICI1295 (siehe Beispiel 8) herstellen. Eine stellengerichtete Mutagenese wurde an Einzelstrang-DNA, wie in der in Beispiel 7 beschriebenen Vorschrift beschrieben, durchgeführt, wobei zur Umwandlung des Codons für Gln in Position 11 zu Arg das Oligonukleotid SEQ ID No 28 verwendet wurde. Doppelsträngige RF-DNA wurde aus einem Plaque mit dem Gln¹¹ → Arg¹¹-Austausch, wie in Beispiel 6 beschrieben, präpariert, mit der Ausnahme, daß die Inkubation im Schritt B3 3 Stunden statt 5 Stunden dauerte, und mit EcoRI (wie zuvor beschrieben) und SnaBI (10 Einheiten, 1 × M Puffer, BCL, 30 μl, 2 Stunden, 37°C) verdaut. Das erhaltene, 144 bp lange, T7A3-Promotor, die trp-Leader- Ribosomenbindungsstellensequenz und das Genfragment mit dem Arg¹¹-Codon enthaltende EcoRI-SnaBI-Fragment wurde isoliert und mit einem mit EcoRI-SnaBI geschnittenen Vektor aus pICI1327 (der die Codons für Ser⁶⁰ und Ser⁶⁵ enthält und im Beispiel 2 beschrieben ist) ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD522 verwendet, und Transformanten wurden auf Wachstum auf L-Agarplatten mit Tetracylin (15 μg/mg) selektioniert. Die Plasmid-DNA aus einer Kolonie mit der erwarteten T7A3-Promotor- sowie der [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]hu-G-CSF-Gensequenz wurde durch Sequenzieren der DNA aus dem isolierten Plasmid identifiziert und mit pICI1386 bezeichnet.
Die Fermentation wurde nach zwei unten angegebenen alternativen Verfahren (b) und (c) durchgeführt. Dabei wurde das Verfahren (b) bei 37°C durchgeführt, wobei nach 16 Stunden Fermentation, wie beschrieben, eine Mikrobiomasse von 35 g/l vorlag und die geschätzte Anhäufung von menschlichem [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]-G-CSF 7 g/l Fermentationsbrühe betrug. Das Verfahren (c) wurde bei 30°C durchgeführt, wobei die Fermentation aufgrund der niedrigeren Fermentationstemperatur entsprechend langsamer ablief. Im Hinblick auf Verfahren (c) betrug die mikrobielle Biomasse nach 35 Stunden 55 g/l und die geschätzte Anhäufung des menschlichen [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]-G-CSF 15 g/l Fermentationsbrühe.
b) Der vom E. coli Genetic Stock Centre erhaltene E. coli-Stamm (Genotyp F^–, λ^–, lac+) wurde mit dem Plasmid pICI1386 transformiert. Der erhaltene Stamm CGSC 6300 (pICI1386) wurde gereinigt und in Form von Glyzerin-Stammkulturen bei –80°C aufbewahrt. Der Stammkultur wurde ein Aliquot entnommen und auf L-Tetracyclin-Agarplatten ausgestrichen, um nach Wachstum über Nacht (16 h) bei 37°C von einander getrennte Einzelkolonien zu erhalten.

Eine Einzelkolonie von CGSC 6300 (pICI1386) wurde aufgenommen und in 10 ml L-Tetracyclinbouillon resuspendiert, und unmittelbar danach wurden 20 jeweils 75 ml L-Tetracyclinbouillon enthaltende 250-ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 μl eingeimpft. Nach 16 h Wachstum bei 37°C auf einem Reziprokschüttler wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und zur Animpfung eines Fermenters mit 20 Litern modifiziertem LCM50-Wachstumsmedium eingesetzt. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums ist in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1: Zusammensetzung des Wachstumsmediums

Modifiziertes LCM50-Wachstumsmedium (A)	Mit destilliertem Wasser angesetzt (g/l)
KH₂PO₄	3,0
Na₂HPO₄	6,0
NaCl	0,5
Caseinhydrolysat (Oxoid L41)	2,0
(NH₄)₂SO₄	10,0
Hefeextrakt (Difco)	20,0
Glyzerin	35,0
MgSO₄·7H₂O	0,5
CaCl₂·2H₂O	0,03
Thiamin	0,008
FeSO₄/Zitronensäure	0,04/0,02
Spurenelementlösung (TES)	(0,5 ml l^–1)
Tetracyclin	(10 mg l^–1)

Die Fermentation erfolgte danach bei einer Temperatur von 37°C und einem durch automatische Zugabe einer 6 M Natriumhydroxidlösung kontrollierten pH-Wert von 6,7. Der Spannungssollwert für gelösten Sauerstoff (dOT-Wert) lag bei 50% Luftsättigung und wurde zunächst durch automatische Anpassung der Fermenterrührergeschwindigkeit gesteuert. Die Luftzufuhr zum Fermenter von anfänglich 20 l/Min., was 1,0 Volumen pro Volumen pro Minute (VVM) entspricht, wurde manuell auf 45 l/Min. erhöht, sobald die Rührergeschwindigkeit des Fermenters ihr Maximum erreicht hatte (1000 UpM). Die Fermentation wurde über 16 h durchgeführt, wobei während dieser Zeit Proben zur Messung der optischen Dichte der Kultur (OD₅₅₀), der Biomassenkonzentration, der Gesamtkonzentration von mikrobiellem Protein und der Anhäufung von menschlichem [Arg¹¹, Ser^17,27,60,65]-G-CSF in den Bakterienzellen entnommen wurden. Die Anhäufung wurde mittels Scanning von mit Coomassie Blue angefärbten SDS-PAGE-Gelen von Lysaten ganzer Zellen der Bakterienproben gemessen, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist. Die Gesamtmenge an mikrobiellem Protein wurde nach dem Verfahren von Lowry abgeschätzt. 4,5 h nach dem Animpfen wurde eine Hefeextraktlösung (225 g/l) mit 1,7 g/l/h in den Fermenter gepumpt. Sobald die im Wachstumsmedium vorhandene Kohlenstoffquelle (Glyzerin) erschöpft war, stieg der dOT-Wert von 50% Luftsättigung rasch an. An diesem Punkt wurde eine Nährlösung mit Glyzerin (714 g/l) und Ammoniumsulfat (143 g/l) zugepumpt.
Da die bakterielle Sauerstoff-Sulfat-Geschwindigkeit (OUR) die maximale Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit des Fermenters (OTR) unmittelbar vor Erschöpfung der Kohlenstoffquelle im Wachstumsmediumansatz erreichte, wurde die zugefütterte Nährlösung in den Fermenter mit einer Geschwindigkeit gepumpt, durch die die bakterielle OUR auf ungefähr 80–90% der maximalen OTR der Fermenter beschränkt wurde. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde manuell so eingestellt, daß der dOT-Wert unter den beschriebenen Bedingungen auf einen Wert von 50% Luftsättigung zurückgeführt und dann darauf gehalten wurde.
c) Der in (b) beschriebene Fermentationsprozeß wurde wiederholt, jedoch für 35 Stunden bei einer Temperatur von 30°C. Mit Ausnahme der Fermentationstemperatur von 30°C waren die Medium- und Fermentationsbedingungen mit den in (b) beschriebenen identisch.
BEISPIEL 4
Herstellung des Plasmids pAG88
a) Herstellung eines synthetischen Gens für menschlichen G-CSF
Eine DNA-Sequenz (10), die die Aminosäuresequenz des Polypeptids aus 10 (menschlicher G-CSF) codiert, wurde gemäß den folgenden Gesichtspunkten konstruiert:

1) Einzelsträngige kohäsive Termini, um die Ligation an geeigneten Stellen in einem Plasmid zu gestatten.
2) Eine Reihe von Restriktionsendonucleasesequenzen über das gesamte Gen verteilt, um die nachfolgende gentechnische Manipulation zu erleichtern.
3) Translationsterminationscodon.
4) Als Codons am 5'-Ende des codierenden Bereichs wurden normalerweise A/T-reiche Codons gewählt. Andere Codons wurden normalerweise entsprechend den für die Expression in E. coli bevorzugten Codons gewählt.

Das Gen wurde aus den im folgenden dargestellten 18 Oligonukleotiden mit der Bezeichnung SEQ ID No. 1 – SEQ ID No. 18 zusammengesetzt.
Herstellung der Oligonukleotide
Die im folgenden dargestellten Oligonukleotidsequenzen wurden in einem DNA-Syntheseautomaten 380A von Applied Biosystems aus 5'-Dimethoxytrityl-basengeschützten Nukleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen und an "Controlled-Pore-Glass"-Träger gebundenen geschützten Nukleosiden in einem 0,2-Mikromol-Maßstab gemäß den von Applied Biosystems Inc. mitgelieferten Vorschriften hergestellt.
Als Alternative können die Oligonukleotidsequenzen mit manuellen Verfahren, wie sie von Atkinson und Smith in 'Oligonukleotide Synthesis, a Practical Approach' (M. T. Gait, Editor, IRL Press, Oxford, Washington DC, Seiten 35–81) beschrieben sind, hergestellt werden.
Im einzelnen wurde die Herstellung der Oligonukleotidsequenzen unter Verwendung des DNA-Syntheseautomaten 380A von Applied Biosystems wie folgt durchgeführt:
Die Oligonukleotide wurden nach Abspaltung vom festen Träger und Entfernung aller Schutzgruppen jeweils in Wasser (1 ml) gelöst. Zu den Oligonukleotidlösungen (400 μl) wurde jeweils eine Lösung aus 3 M Natriumacetat (pH 5,6; 40 μl) und Ethanol (1 ml) gegeben, und die Ansätze wurden 20 Stunden bei –70°C gelagert. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 13.000 UpM) gesammelt und die Pellets mit Ethanol : Wasser (7 : 3) (200 μl) gewaschen, danach kurz im Vakuum getrocknet und in Wasser (15 μl) und 10 μl eines Formamids/Farbstoff-Gemischs (10 mM NaOH, 0,5 mM EDTA, 0,01% Bromphenolblau, 0,01% Xylolcyanol, 80% Formamid) gelöst.
Die Oligonukleotide wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-Borat (pH 8,3) mit 8,3 M Harnstoff gereinigt. Oligonukleotide mit der korrekten Länge wurden mittels "UV Shadowing" (Narang et al., 1979 in Methods in Enzymology Bd. 68, 90–98) identifiziert – normalerweise die stärkste Bande –, aus dem Gel ausgeschnitten und in 5 mM Tris-Borat (pH 8,3) 3–4 Stunden bei 300 mV elektroeluiert. Die wäßrigen Lösungen wurden auf etwa 200 μl durch Behandlung mit n- Butanol (Mischen, Zentrifugieren und Entfernen der oberen organischen Schicht) eingeengt. Die gereinigten Oligonukleotide wurden 20 Stunden bei –70°C aus einer 0,3 M Natriumacetatlösung durch Zugabe von Ethanol (2,5 Volumen) gefällt.
Zusammenbau des Gens
Die Oligonukleotide SEQ ID No 2 – SEQ ID No 17 (jeweils 400 pM) [wie unten definiert] wurden mit T4-Polynukleotidkinase (3,6 Einheiten) 2 Stunden bei 37°C in 25 μl einer Lösung mit ATP (800 pM mit 25 pM Gamma-³²P-ATP), 100 μM Spermidin, 20 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) und 0,1 mM EDTA phosphoryliert. Die Lösungen wurden zur Beendigung der Reaktionen 5 Minuten bei 100°C erhitzt, danach paarweise, wie in Tabelle 1 gezeigt, unter Erhalt der Duplexe A bis I gemischt (Oligonukleotide SEQ ID No 1 und SEQ ID No 18 (400 mM in 25 μl) wurden jeweils unphosphoryliert eingesetzt). Nach Zugabe von 0,3 M Natriumacetat (pH 5,6, 200 μl) und Ethanol (850 μl) wurden die Duplexe 20 Stunden bei –20°C gefällt. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und danach in Wasser (50 μl) gelöst. Die Oligonukleotidpaare wurden in einer Annealing-Reaktion zusammengelagert, indem die Lösungen zunächst 2 Minuten bei 100°C im kochenden Wasserbad erhitzt wurden. Man ließ danach das Bad langsam auf 40°C abkühlen (in etwa 4 Stunden). Die Lösungen mit 3 Duplexpaaren wurden unter Erhalt der Gruppen I bis III wie gezeigt kombiniert (siehe Tabelle 1), dann lyophilisiert und in 30 μl einer Lösung mit T4-Lösung DNA-Ligase (1 Einheit; BRL), 50 mM Tris (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 5% (w/v) PEG 8000, 1 mm ATP, 1 mm DTT. (BRL, Focus Bd. 8 Nr. 1 Winter 1986) gelöst, und die DNA wurde 5 Minuten bei 30°C und anschließend 20 Stunden bei 16°C ligiert. Danach wurden 3 M Natriumacetat (20 μl) und Wasser (150 μl) zugegeben, und das Produkt wurde durch Zugabe von Ethanol (750 μl) und Abkühlen auf –20°C 20 Stunden gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit Ethanol (1 ml) gewaschen, danach in Wasser (15 μl) und Formamid/Farbstoff-Gemisch (10 μl) gelöst und auf einem 10%igen Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-Borat (pH 8,3), 1 mM EDTA und 8,3 M Harnstoff gereinigt. Banden der Stränge mit den entsprechenden Längen (173–186 Basen) wurden mittels Autoradiographie identifiziert und gemeinsam durch Elektroelution aus einem einzigen Gelstück isoliert wie oben für einzelne Oligonukleotidsequenzen beschrieben. Die DNA-Stränge wurden einem Annealing unterzogen, indem zunächst eine wäßrige Lösung (50 μl) 2 Minuten bei 100°C erhitzt wurde und man diese dann über 4 Stunden auf 40°C abkühlen ließ.
Die Gruppen I, II und III wurden im wesentlichen wie für die Gruppenherstellung beschrieben zusammenligiert, wobei als Produkt die in 10 gezeigte Gensequenz erhalten wurde. Nach Fällung wurde das Gen mit T4-Polynukleotidkinase, wie zuvor für einzelne Oligonukleotide beschrieben, phosphoryliert und danach in Wasser (20 μl) gelöst.
TABELLE 1
b) Klonierung des synthetischen Gens für menschlichen G-CSF
Das oben beschriebene synthetische Gen wurde in den Plasmidvektor pSTP1 (Windass et al., Nucleic Acids Research, 1983, Bd. 10, S. 6639) kloniert.
Für die Vektorherstellung wurden 10 μg STP1 in Wasser (37,5 μl) und 10 × Restriktionspuffer B (4,5 μl) (BCL) gelöst. Danach wurde die Restriktionsendonuclease SalI (3 μl) (BCL, 8 Einheiten/μl) zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei 37°C inkubiert, bis das linearisierte Plasmid gegenüber den superhelikalen Formen und den Formen mit Einzelstrangbrüchen ("nicked"-Formen) überwog. Die DNA wurde 30 Minuten bei 4°C mit Ethanol gefällt, mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und danach in Wasser (39,5 μl), 10 × Puffer H (4,5 μl) (BCL) gelöst. Danach wurde die Restriktionsendonuclease EcoRI (1 μl) (BCL, 90 Einheiten/μl) zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei 37°C inkubiert, bis das große EcoRI-SalI-Fragment überwog. Die DNA wurde 20 Stunden bei –20°C gefällt, mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und danach in Wasser (20 μl) gelöst.
Das große EcoRI – SalI-Fragment wurde auf einem 1%igen präparativen Agarosegel gereinigt und, wie zuvor beschrieben, elektroeluiert und gefällt und danach in Wasser (20 μl) gelöst. Zur Ligation des synthetischen Gens wurde ein Gemisch aus Vektor-DNA (2 μl der EcoRI – SalI-Fragment-Lösung), synthetischem Gen (5 μl der zuvor beschriebenen wäßrigen Lösung, 5 × Ligasepuffer (6 μl – 250 mM Tris pH 7,6 50 mM MgCl₂, 25% W/V PEG8000, 5 MM ATP, 5 mM DTT exBRL), Wasser (15 μl) und T4-DNA-Ligase (2 μl, 1 U/μl) 4 Stunden bei 16°C inkubiert. Das DNA-Reaktionsgemisch wurde direkt zur Transformation des E. coli-Stammes HB101 eingesetzt (entweder 1 μl des reinen Ligationsgemischs oder 2 μl Ligationsgemisch, 5 × verdünnt mit Wasser). Das DNA-Gemisch (1 bzw. 2 μl) wurde zu kompetenten E. coli-HB101-Zellen (20 μl, BRL) auf Eis gegeben und der Ansatz 45 Min. auf Eis inkubiert und danach 45 Sekunden einem Hitzeschock bei 42°C unterzogen. Nach 2 Min. auf Eis wurden 100 μl SOC-Puffer (Bactotrypton 2%; Hefeextrakt 0,5%; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mm; MgCl₂, MgSO₄ 20 mm (jeweils 10 mm); Glukose 20 mm) zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Aliquots der Suspensionen wurden auf L-Platten mit 50 μl/ml Ampicillin ausplattiert. Die Transformanten wurden einem Screening auf das Vorhandensein des klonierten synthetischen Gens mittels Koloniehybridisierungsanalyse unter Verwendung von in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von Maniatis et al., (Cold Spring Harbor) und in der GB-Patentanmeldung Nr. 8502605 beschriebenen Standardverfahren unterworfen. Insgesamt 100 Kolonien wurden auf Filter (Schleicher und Schnell) ausgestrichen, 20 Stunden bei 37°C angezogen, lysiert und gebacken. Der Filter wurde 20 Stunden bei 65°C mit einer aus der Oligonukleotidsequenz SEQ ID No 1 unter Verwendung eines Kits zur Zufallsmarkierung (Pharmacia) hergestellten radioaktiven Sonde hybridisiert. Fünf Kolonien 1–5, die ein positives Hybridisierungssignal ergaben, wurden in L-Bouillon im kleinen Maßstab (100 ml) 20 Stunden bei 37°C kultiviert, und Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugation in einem Caesiumchloridgradienten, im wesentlichen wie in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von Maniatis et al., (Cold Spring Harbor) beschrieben, präpariert.
Die DNA wurde mit dem Standard-Dideoxy-Kettenabbruchverfahren, wie von Sanger et al., in Proc. Nat. Acad Sci. USA 74, 5463–5467 (1977) beschrieben, unter Verwendung eines Sequenase (Trade Mark)-Kits (United States Biochemical Corporation) sequenziert. Die Oligonukleotide SEQ ID No 19 bis SEQ ID No 23 (wie unten definiert, siehe auch Tabelle 2) wurden als Sequenzierprimer verwendet.
TABELLE 2
Die Plasmid-DNA aus Klon 5 enthielt die in 10 gezeigte DNA-Sequenz. Das Plasmid wurde mit pAG88 bezeichnet und zur Transformation kompetenter Zellen der folgenden E. coli-Stämme, nämlich HB101 und CGSC 63000 (im folgenden auch mit MSD 522 bezeichnet), durch Standardverfahren verwendet.
BEISPIEL 5
Herstellung einer M13mp18-Matrize mit dem menschlichen [Ser^17,27]-G-CSF-Gen
Die Vorgehensweise für die Schritte a) und b) in Beispiel 4 wurde mit den folgenden Modifikationen wiederholt:
Die SEQ ID Nr. 1, 2, 3 und 4 (wie unten definiert) werden durch die Oligonukleotide SEQ ID Nr. 24, 25, 26 bzw. 27 (wie unten definiert) ersetzt.
c) Klonierung des Gens für menschlichen [Ser^17,27]-G-CSF in einen Expressionsvektor
Das oben beschriebene Gen (siehe 9 und SEQ ID No. 31) wurde in den Plasmidvektor pICI0020 kloniert. Bei diesem Vektor handelt es sich um ein auf pAT153 beruhendes Plasmid, bei dem der 651 bp große EcoRI – AccI-Bereich durch ein 167 bp großes EcoRI – ClaI-Fragment (SEQ ID No. 30) ersetzt ist, das aus:

(1) einem synthetischen E. coli-trp-Promotor und einer trp-leader-Ribosomenbindungsstelle,
(2) einem Translationsinitiationscodon,
(3) einer von M13mp18 abgeleiteten Mehrfach-Restriktionsemzymerkennungssequenz, die Stellen für KpnI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und HindIII enthält,
(4) einer synthetischen Transkriptionsterminationssequenz besteht.

Die DNA-Sequenz dieses Bereichs ist in 5a gezeigt.
Der Expressionsvektor pICI0020 wurde vollständig mit KpnI (BCL) in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid verdaut. Die DNA wurde mit Ethanol bei –20°C aus einer Lösung mit 0,3 M Natriumacetat gefällt, wonach die klebrigen 3'-Enden durch 10 minütige Behandlung mit T4-DNA-Polymerase bei 37°C wie folgt entfernt wurden:
DNA (1 μg) in Wasser (16 μl)
10 × T4-Polymerase-Puffer (2 μl)
0,33 M Tris-Acetat pH 7,9
0,1 M Magnesiumacetat
0,66 M Kaliumacetat
5 mM Dithiothreitol
1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA PENTAX Fraktion V)
2 mM dNTP-Gemisch (1 μl)
T4-DNA-Polymerase (1 μl; 2,5 Einheiten/μl BCL)
Nach Zugabe von Wasser (80 μl) wurde das Gemisch mit Phenol/Chloroform (100 μl) und danach mit Chloroform (100 μl) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol (250 μl) nach Zugabe von 3 M Natriumacetat (10 μl) bei –20°C gefällt und danach mit SalI (BCL) in 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) vollständig verdaut. Der Vektor mit stumpfem Kpn-Ende sowie SalI-Ende wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt und unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) nach der vom Hersteller (Bio 101, USA) empfohlenen Vorgehensweise isoliert.
Das synthetische Gen wurde aus den pSTP1-Vektoren wie folgt isoliert. Die Vektoren wurden mit ScaI und SalI (beide von BCL) in 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) verdaut. Das 530 bp große Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt und unter Verwendung von Genclean (Handelname) nach der vom Hersteller (Bio 101) empfohlenen Vorgehensweise isoliert.
Zur Ligation wurde ein Gemisch aus dem ScaI – SalI-Genfragment (50 ng) und dem pICI0020-Vektorfragment (100 ng) in 20 μl einer Lösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% w/v PEG 8000 und T4-DNA-Ligase (2 Einheiten; BRL) 20 Stunden bei 16°C inkubiert. Das erhaltene Gemisch wurde zur Transformation kompetenter E. coli-HB101-Zellen (wie von BRL geliefert) wie hierin beschrieben verwendet. Die Transformanten wurden auf L-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin auf Wachstum selektioniert und einem Screening auf das Vorhandensein des Gens mittels Koloniehybridisierung mit einer ³²P-markierten Sonde (SEQ ID No 24), wie hier beschrieben, unterzogen. Von 6 positiv hybridisierenden Kolonien wurde Plasmid-DNA präpariert, durch Zentrifugieren in einem Caesiumchloridgradienten gereinigt und die Sequenz durch Dideoxysequenzierung, wie hier beschrieben, bestätigt.
Das Plasmid mit diesem Gen wurde mit pICI 1080 bezeichnet.
d) Subklonierung einer Expressionskassette mit einem Gen für [Ser^17,27)G-CSF in M13mp18
Die folgende Subklonierung wurde durchgeführt, um einen Startpunkt für die Herstellung der in den Beispielen 3–8 ausführlich dargestellten G-CSF-Derivate zu schaffen.
Plasmid-DNR auf pICI1080 (gereinigt über Caesiumchlorid-Dichtezentrifugation) wurde gemäß den Angaben des Herstellers mit EcoRI und SalI (BCL) vollständig verdaut. Das kleine, den trp-Promotor und das [Ser^17,27]G-CSF-Gen enthaltende EcoRI-SalI-Fragment wurde aus einem 0,7%gen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) isoliert. Dieses Fragment wurde dann in einen mit EcoRI-SalI geschnittenen M13mp18-Vektor (DNA von Amersham International; Enzyme von BCL) kloniert. Die Fragmente wurden in 5 × BRL-Ligationspuffer mit BRL-T4-DNA-Ligase (zuvor beschrieben) zusammen ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transfektion kompetenter E. coli-TG1-Zellen (die nach dem Calciumchloridverfahren von Mandel und Higa, beschrieben in Molecular Cloning – A Laboratory Manual – Maniatis et al., Cold Spring Harbor, kompetent gemacht worden waren) verwendet. Die transfizierten Zellen wurden in TY-Topagar mit 2% X-Gal in DMF und 200 μl E. coli-TG1-Zellen in der Log-Phase suspendiert und auf 2 × TY-Agarplatten (TY-Topagar – 8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 3,75 g Bactoagar in 500 μl sterilem H₂O; TY-Platten – 8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 7,5 g Bactoagar in 500 ml sterilem H₂O) ausplattiert.
Vier weiße Plaques wurden in 4 × 2-ml-Aliquots von 1% E. coli-TG1-Zellen in TY-Bouillon (8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl in 500 ml sterilem H₂O) überführt und 6 Stunden bei 37°C kultiviert. Die 2-ml-Kulturen wurden jeweils in 0,5-ml- und 1,5-ml-Aliquots geteilt. Die Bakterien wurden aus der Lösung durch Zentrifugieren in einer Eppendorf (Handelname)-Mikrozentrifuge abgetrennt und die Überstände in sterile Eppendorf (Handelname)-Röhrchen überführt. Die 0,5-ml-Aliquots wurden als Phagen-Stammlösungen bei –20°C gelagert. Die 1,5-ml-Aliquots wurden zur Herstellung einzelsträngiger DNA nach dem Verfahren im M13-Sequenzierhandbuch von Amersham International (siehe unten) verwendet. Diese DNA-Proben wurden dann unter Verwendung der Oligonukleotide SEQ ID No 22, SEQ ID No 23 und des M13-Universal-Sequenzierprimers sequenziert. Die Reaktionen wurden mit dem Sequenase-Kit (Handelsname) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Alle 4 Klone besaßen die korrekte DNA-Sequenz für [Ser^17,27]G-CSF.
Einzelstrang-DNA-Präparation im Großmaßstab
Für Einzelstrang-DNA-Präparationen zwischen 200 und 500 μg DNA/ml wurde das Verfahren in "Oligonukleotide Directed Mutagenesis" von Amerham International verwendet. Eine ausführliche Vorschrift wird wie folgt ausgeführt:
EINZELSTRANG-DNA-PRÄP. IM GROßMAßSTAB
A. Herstellung einer 1-ml-Phagen-Stammlösung

1. E. coli-TG1-Einzelkolonie von einer Glukose/Minimalmedium-Platte picken. Über Nacht in 10 ml 2 × TY-Medium unter Schütteln bei 37°C wachsen lassen. 10 μl bis 20 ml frisches Medium zugeben und 3 Stunden bei 37°C schütteln.
2. 1 ml 2 × TY-Medium in einem sterilen 10-ml-Kulturröhrchen mit 100 μl der 3-Stunden-Kultur aus Schritt 1 animpfen.
3. Die 1-ml-Kultur mit einem rekombinanten Plaque animpfen.
4. 4 Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubieren. Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
5. 5 Minuten bei Umgebungstemperatur zentrifugieren. Überstand in ein frisches Röhrchen gießen.

Über Nacht bei 4°C lagern. E. coli-TG1-Übernachtkultur für die nächste Stufe ansetzen.
B. Anzucht der 100-ml-Phagenkultur

1. 100 ml 2 × TY-Medium mit 1 ml TG1-Übernachtkultur animpfen und unter Schütteln bei 37°C bis zu einer O.D₅₀₀ von 0,3 inkubieren.
2. Den 1-ml-Phagenüberstand aus A5 (oben) in die 100-ml-Kultur geben.
3. 5 Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubieren. Überführung in Zentrifugenröhrchen.
4. 30 Minuten bei 4°C und 5000 × g zentrifugieren.
5. Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführen. Darauf achten, daß dabei keine Zellen mitgeschleppt werden (Bakterienpellet für die RF-DNA-Präparation aufbewahren).
6. 0,2 Volumen 20% w/v PEG-6000 in 2,5 M NaCl zum Überstand geben. Gut mischen und danach 1 Stunde bei 4°C stehenlassen.
7. 20 Minuten bei 5000 × g und 4°C zentrifugieren, Überstand verwerfen.
8. 5 Minuten bei 5000 × g zentrifugieren und verbliebenes PEG/NaCl mit einer ausgezogenen Pasteurpipette vollständig entfernen.
9. Viruspellet in 500 μl Wasser (doppelt destilliert) resuspendieren und in ein Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) überführen.
10. 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zur Abtrennung noch verbliebener Zellen zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
11. 200 μl 20% PEG 12,5 M NaCl zum Überstand geben, gut mischen und danach 15 Minuten bei Umgebungstemperatur stehenlassen.
12. 5 Minuten zentrifugieren, Überstand verwerfen.
13. 2 Minuten zentrifugieren, sorgfältig alle Spuren von PEG/NaCl mit einer ausgezogenen Pasteurpipette entfernen.
14. Das Viruspellet in 500 μl doppelt destilliertem Wasser resuspendieren.
15. 200 μl mit 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA gesättigtes Phenol zugeben, kurz am Vortex-Gerät mischen.
16. Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehenlassen.
17. 3 Minuten zentrifugieren.
18. Überstand in frisches Röhrchen überführen.
19. Schritte 15–18 wiederholen.
20. 500 μl Chloroform zugeben und wäßrige Phase zweimal extrahieren.
21. 50 μl 3 M Natriumacetat und 1 ml absoluten Ethanol zugeben. Mischen.
22. 20 Minuten in ein Bad aus Trockeneis und Ethanol stellen.
23. 15 Minuten zentrifugieren.
24. Pellets jeweils mit 1 ml –20°C kaltem Ethanol waschen. Abgießen.
25. Pellet im Vacuum trocknen und in 50 μl doppelt destilliertem Wasser aufnehmen. Durch diese Verfahrensweise erhält man 100–200 μg Einzelstrang-DNA.

BEISPIEL 6
Herstellung von pICI 1107
Die in Beispiel 5 beschriebene Vorgehensweise wurde mit Ausnahme des folgenden wiederholt:
Der Duplex I wurde mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und 2 Stunden bei 37°C mit MstII (10 Einheiten) in 1 × Puffer H (BCL; 30 μl) verdaut.
Nach der Fällung mit Ethanol wurde das 143 bp große EcoRI-MstII-Fragment auf einem 10%igen Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff gereinigt, durch Elektroelution aus einem Gelstück isoliert, wonach die DNA-Stränge einem Annealing unterzogen wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Das oben beschriebene synthetische EcoRI-MstII-Fragment wurde in den in Beispiel 4 beschriebenen Plasmidvektor pAG88 kloniert. Zur Herstellung des Vektors wurde pAG88 (10 μg) mit MstII (20 Einheiten; BCL) in 1 × Puffer H (BCL; 100 μl) 2 Stunden bei 37°C verdaut. Die DNA wurde mit Ethanol aus 0,3 M Natriumacetat bei –20°C gefällt und danach mit EcoRI (20 Einheiten; BCL) in 1 × Puffer H (BCL; 100 μl) 2 Stunden bei 37°C verdaut. Nach der Ethanolfällung wurde das große EcoRI-MstII-Fragment auf einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) wie vom Hersteller (Bio 101, USA) beschrieben gereinigt. Das synthetische Fragment enthaltende Kolonien wurden durch Screening mit einer vom Oligonukleotid (SEQ ID No 1) hergestellten radioaktiven Sonde und die korrekte Sequenz mittels DNA-Sequenzierung, wie in Beispiel 5 (oben) beschrieben, bestätigt. Das das Gen für [Ser^17,27]G-CSF enthaltende Plasmid wurde mit pICI1107 bezeichnet.
BEISPIEL 7
Herstellung des Plasmids pICI 1239
Die unten beschriebene Vorgehensweise für stellengerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18 mit dem in Beispiel 5 bzw. 6 (oben) beschriebenen Gen für [Ser^17,27]G-CSF eingesetzt. Die verwendeten mutagenen Oligonukleotide sind mit SEQ ID No 28 und SEQ ID No 29 (wie unten definiert) bezeichnet.
Das Triplet ACG in SEQ ID No 28 dient zur Umwandlung von Gln in Position 11 zu Arg, und das erste bzw. letzte AGA-Triplet in SEQ ID No 29 dient jeweils zur Umwandlung von Pro in Positionen 65 bzw. 60 zu Ser. Die Mutagenese wurde wie unten beschrieben unter Verwendung von SEQ ID No 29 in einer Einzelprimingmutagenese durchgeführt. Dabei wurde ein einziger Plaque erhalten, der die Pro-60-Ser- bzw. Pro-65-Ser-Austausche enthält. Aus diesem Plaque wurde, wie in der unten beschriebenen Vorgehensweise zu Mutagenese beschrieben, Einzelstrang-DNR hergestellt. Diese DNA wurde als mutagene Matrize in einer Einzelprimermutagenese unter Verwendung von SEQ ID No 28 als mutagenen Primer verwendet. Dies ergab > 100 Plaques, von denen 3 einem Screening mittels DNA-Sequenzierung, wie zuvor beschrieben, unterzogen wurden. Bei allen 3 war der gesamte Satz an Austauschen vorhanden. Von einem der Plaques wurde doppelsträngige RF-DNA hergestellt, indem der Vorschrift für die Präparation von Einzelstrang-DNA im Großmaßstab (Schritt d in Beispiel 5) bis Schritt B5 gefolgt wurde. Die RF-DNA wurde aus dem Bakterienpellet nach der Vorschrift für die alkalische Lyse von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research (1979) 7, 1513–1523) extrahiert und durch Caesiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt, wie in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Publication) beschrieben. Die gereinigte RF-DNA wurde mit EcoRI und SalI im Puffer H, wie zuvor beschrieben, verdaut und das den trp-Promotor, die Ribosomenbindungsstelle, das Translationsstartcodon und das Gen für [Ser^17,27]G-CSF enthaltende, 619 bp große Fragment aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Das Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase (BRL) sowie Ligasepuffer im wesentlichen wie zuvor beschrieben in einen mit EcoRI/SalI verdauten pICI0020-Vektor ligiert, wobei ein molarer Überschuß an Insertion gegenüber Vektor von 2 : 1 verwendet wurde. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation des E. coli-Stamms HB101 verwendet. Die Selektion von Transformanten erfolgte durch Wachstum auf L-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin. Die Kolonien wurden einem Screening auf das Vorhandensein der inserierten DNA mittels Restriktionsanalyse von nach dem Verfahren von Birnboim und Doly, wie es in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Publication) beschrieben ist, präparierter Plasmid-DNA unterzogen. Die Plasmid-DNA aus einer die erwartete, 619 bp große EcoRI-SalI-Insertion enthaltenden Kolonie wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD522 verwendet und mit pICI1239 bezeichnet.
Vorschrift für die stellengerichtete Mutagenese
Es wurde das Phosphorothioatverfahren von Eckstein und Mitarbeitern verwendet:

Taylor, J W et al., Nucleic Acids Research (1985) Bd. S. 8749–8764
Taylor, J W et al., Nucleic Acids Research (1985) Bd. S. 8765–8785
Nakamaye, K et al., Nucleic Acids Research (1986) Bd. S. 9679–9698
Sayers, J R et al., Nucleic Acids Research (1988) Bd. S. 791–802

Die Vorgehensweise kann unter Verwendung eines von Amersham International vertriebenen Kits erfolgen. Das Verfahren ist im folgenden in groben Zügen dargestellt, wobei es hinsichtlich der Verwendung von mehr als einem mutagenen Oligonukleotid und der Inkubationstemperatur für Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 30 Basen Änderungen gegenüber dem ursprünglichen Verfahren enthält.
1. Annealing der Oligonukleotidenmutante an die Einzelstrang-DNA-Matrize
(Bei gleichzeitiger Verwendung von zwei mutagenen Oligonukleotiden wurden jeweils 2,5 μl (1,6 pmol/1 μl) phosphoryliertes Oligonukleotid zu 5 μl Einzelstrang-DNA-Matrize (1 μg/μl) in 3,5 μl Puffer 1 und 3,5 μl Wasser gegeben. Bei Verwendung von 3 mutagenen Oligonukleotiden wurden jeweils 2,5 μl (1,6 pmol/μl) phosphoryliertes Oligonukleotid zu 5 μl Einzelstrang- DNA (1 μg/μl in 3,5 μl Puffer 1 und 1 μl Wasser) gegeben. Die obigen Komponenten wurden in einem verdeckelten Röhrchen 3 Minuten in ein 70°C warmes Wasserbad, wenn das Oligonukleotid eine Länge von < 30 Basen aufwies, bzw. 3 Minuten in ein kochendes Wasserbad, falls das Oligonukleotid eine Länge von > 30 Basen aufwies, gestellt. Danach wurde das Röhrchen 30 Minuten in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt.
2. Synthese und Ligation des mutierten DNA-Strangs
Zum Annealing-Ansatz gab man
Die obigen Komponenten wurden in ein 16°C warmes Wasserbad gestellt und über Nacht stehengelassen.
3. Enfernung der (nichtmutierten) Einzelstrang-DNA unter Verwendung von Einweg-Zentrifugationsfiltereinheiten
Die folgenden Komponenten wurden zu dem Ansatz aus Schritt 2 gegeben:
Die 250-μl-Probe wurde in die obere Hälfte der Filtereinheit gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer SORVALL-RT6000B-Tischzentrifuge mit einem SORVALL-H1000B-Ausschwingrotor bei 1500 UpM zentrifugiert. Dabei passiert die Probe zwei Nitrocellulose-Membranen, die die Einzelstrang-DNA binden, wobei die Doppelstrang-DNA durch das Filter hindurch in das darunter befindliche Sammelröhrchen läuft.
100 μl 500 mM NaCl wurden zugegeben, wonach nochmals 10 Minuten zentrifugiert wurde, um noch vorhandene RF-DNA auszuwaschen.
Die folgenden Komponenten wurden zu dem Filtrat gegeben:
Das Gemisch wurde 20 Minuten in ein Bad aus Trockeneis und Ethanol gestellt und danach 15 Minuten in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 10 μl Puffer 2 resuspendiert.
4. "Nicking" des nichtmutierten Strangs mit Nci I
Zu diesem Reaktionsansatz aus Schritt 3 wurden 65 μl Puffer 3 sowie 8 Einheiten Nci I (1 μl) gegeben. Das Gemisch wurde 90 Minuten in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt.
5. Verdauung des nichtmutierten Strangs mit Exonuclease III
Zu dem Reaktionsansatz aus Schritt 4 gab man
Das Gemisch wurde in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert, wobei 50 Einheiten Exonuclease III ungefähr 3000 Basen in 30 Minuten verdauen. Danach wurde das Gemisch zur Inaktivierung der Enzyme 15 Minuten in ein 70°C warmes Wasserbad gestellt.
6. Repolymerisierung und Ligation der "gapped"-DNA
Zu dem Reaktionsansatz aus Schritt 5 gab man
Das Gemisch wurde 3 Stunden in ein 16°C warmes Bad gestellt.
7. Transformation kompetenter E. coli-TG1-Wirtszellen mit der DNA
300 μl frisch hergestellter kompetenter E. coli-TG1- Zellen (hergestellt nach dem Verfahren von Mandel und Higa) wurden mit 20 μl des Reaktionsansatzes aus Schritt 6 transformiert (Doppelansatz).
Die Transformanten wurden auf einem Rasen aus TG1-Zellen in der Log-Phase in TY-Topagar auf TY-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Der E. coli-Stamm TG1 kann leicht beispielsweise vom E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA und von Amersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont, Amersham, Buckinghamshire HP7 9NA, England als Teil ihres "in vitro" Mutagenesissystem, Oligonukleotide directed "kits" bezogen werden (Produkt-Nr. RPN 1523).
BEISPIEL 8
Herstellung des Plasmids pICI 1295 (auch mit pCG300 bezeichnet)
(a) Herstellung von pCG54 aus pICI1079
pICI1079 ist ein Ampicillin-resistentes, von pAT153 abgeleitetes Plasmid, das zwischen den EcoRI- und StylI-Restriktionsstellen die folgenden Elemente enthält:
Die DNA-Sequenz dieses Transkriptionsterminators ist in 1(b) sowie in SEQ ID No. 37 gezeigt.
pICI1079 ist in 6 dargestellt.
pICI1079 wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Schottland, UK (NCIMB-Nr. 40370, Hinterlegungsdatum 19. Februar 1991) hinterlegt.
pCG54 wurde konstruiert, um einen Expressionsvektor zur Verfügung zu stellen, der die gleichen Promotor-, Ribosomenbindungsstelle- und Transkriptionsterminatorsequenzen wie oben, d. h. λp_L, RBS7 und T4, enthält, dem jedoch die für die Herstellung eines spezifischen Proteins codierende Gensequenz fehlt. Durch ein solches Konstrukt wäre die Möglichkeit eines Expressionsbasisvektors gegeben, der die wesentlichen Elemente enthält, die die Transkription und Translation zur Herstellung eines beliebigen interessierenden Proteins gestatten und die in diesen Vektor durch nachfolgende Klonierungsereignisse eingeführt werden könnten.
Die Konstruktion des Vektors wurde durch Restriktionsendonucleasespaltung von pICI1079 an seinen jeweiligen EcoRI- und SalI-Stellen gestartet. Durch diesen Spaltungsschritt wurde ein Vektorfragment, das das pICI1079-Rückgrat zusammen mit den Genen für die Plasmidreplikation und die antibiotischen Resistenzfunktionen und zusätzlich die T4-Transkriptions-Terminatorsequenz enthielt, freigesetzt. Das Fragment wurde durch Agarosegelreinigungsschritte isoliert, wobei für die abschließende Reinigung des DNA-Fragments Geneclean eingesetzt wurde.
In dieses Vektorfragment wurde dann ein zweites, kleineres DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,2 Kb eingeführt. Dieses zweite Fragment läßt sich beispielsweise durch DNA-Synthese oder durch stellengerichtete bzw. PCR-Mutagenese des kleinen, aus pICI1079 wie oben beschrieben erhaltenen EcoRI-SalI-Restriktionsfragments erhalten. Dieses zweite Fragment enthielt genau die gleichen Promotor- und Ribosomenbindungsstellensequenzen, wie sie ursprünglich in pICI1079 vorlagen, und hatte darüberhinaus EcoRI- und SalI-Stellen an seinen 5'- bzw. 3'-Enden zur Verfügung, sodaß dadurch kompatible Enden für die Ligation mit dem pICI1079-Fragment bereitgestellt wurden. Eine Ligationsreaktion in Gegenwart des Gibco-BRL-Enzyms T4-DNA-Ligase und ihres entsprechenden Puffers führte zur Bildung des Konstrukts pCG54.
Dieses Konstrukt enthaltende Klone wurden ursprünglich nach Transformation eines Aliquots des Ligationsansatzes in kompetente E. coli-Zellen des Strangs HB101 isoliert.
Das erhaltene Konstrukt pCG54 hatte eine Größe von 3,682 Kb und enthielt wesentliche Merkmale, wie sie auf der in 11 dargestellten Karte umrissen sind.
(b) Herstellung von pCG61 aus pCG54 (auch mit pICI54 bezeichnet)
Synthetische Oligonukleotidsequenzen wurden so entworfen, daß sie sowohl die natürliche Sequenz für den T7A3-Promotor als auch eine Sequenz, die einen wirksamen Translationsstartbereich, um die korrekte Prozessierung einer beliebigen, unmittelbar daneben klonierten Polypeptidgensequenz zu ermöglichen, bereitstellen würde, umfassen. Eine geeignete Kandidatensequenz für diesen letzteren Bereich wurde als RBS1, die trp-Ribosomenbindungssequenz, identifiziert. Daher wurden zwei als SEQ ID No 38 und SEQ ID No 39 identifizierte komplementäre Oligonukleotide zur Erzeugung eines doppelsträngigen DNA-Linkers, der den T7A3-Promotor sowie RBS1-Sequenzen umfaßt, synthetisiert.
Die Oligonukleotide wurden als 84mere nach der Standardvorschrift unter Verwendung eines ABI-Gensytheseautomaten hergestellt. Dabei wurden sie so konstruiert, daß die synthetischen Fragmente in der Doppelstrangform Restriktionsendonucleasestellen EcoRI und KpnI an den 5'- bzw. 3'-Enden aufweisen würden. Aufgrund ihrer Länge konnten die Oligomere nicht mittels HPLC gereinigt werden, und die Reinigung wurde daher mittels einer Acrylamidgelelektrophorese mit einem 10% Acrylamid/7 M Harnstoff-Gel ausgeführt.
Vor der Reinigung wurden die Oligomere zunächst auf einem Gel zur Größenbestimmung überprüft, um sicherzustellen, daß sie nicht nur die korrekte Größe aufwiesen, sondern daß die hergestellten Proben auch die benötigten Oligomere als ihren größten Anteil enthielten und nicht etwa einen hohen Anteil an Verunreinigungen mit kleinen sekundären Oligonukleotiden, die als Nebenprodukt der Synthese entstehen.
Die Acrylamidgele wurden nach Standardverfahren hergestellt, wobei als Katalysatoren für die Gelpolymerisation Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin verwendet wurden.
Die Größenüberprüfung der Oligonukleotide erforderte, daß sie nach der Elektrophorese sichtbar gemacht werden konnten. Es war daher notwendig, die Proben mit ³²P radioaktiv zu markieren. Dadurch war es möglich, die Probenqualität nach der Elektrophorese in Form einer Autoradiographie zu beurteilen.
Die Oligonukleotidproben wurden in Rohform unphosphoryliert geliefert. Diese Tatsache wurde für Radioaktivitätsmarkierungszwecke dahingehend ausgenutzt, daß die Proben unter Verwendung des Enzyms T4-Polynukleotidkinase durch Phosphorylieren an den 5'-Enden "heiß" markiert werden konnten.
Nach der Synthese lagen die Oligomere in unphosphorylierter Form vor, sodaß nach der Reinigung jedes Oligomer jeweils einzeln einer Phosphorylierungsreaktion unterzogen wurde, bei der ATP zur Phosphorylierung jeweils des 5'-Endes der Moleküle in Gegenwart von T4-Polynukleotidkinase verwendet wurde (siehe Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, S. 5,68–5,71). Nachdem die beiden komplementären Oligonukleotide phosphoryliert worden waren, wurden sie in einer Annealing-Reaktion unter Ausbildung des doppelsträngigen DNA-Duplex, der den T7A3 Promotor und die RBS1-Sequenz enthielt, zusammengelagert.
Das Vektormolekül pCG54 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und KpnI gespalten. Durch die Restriktionsverdauung werden ein 2,3 kb großes Vektorfragment sowie ein den λ_PL-Promotor und die RBS1-Sequenz enthaltendes 1,1 kb großes Fragment erzeugt. Dieser Klonierungsschritt ist dafür vorgesehen, die λ_PL-RBS1-Sequenz durch das synthetische Fragment von EcoRI bis KpnI, das die T7A3-RBS1-Sequenz umfaßt, zu ersetzen. Das durch die Verdauung von pCG54 erhaltene 2,3 kb große Vektorfragment wurde nach der üblichen Vorschrift unter Verwendung der Agarosegelelektrophorese und der Geneclean-Methodik zur Entfernung von DNA aus Agarosefragmenten gereinigt.
Das 84 bp große, synthetische EcoRI-KpnI-Fragment wurde in das oben hergestellte Vektormolekül ligiert und die ligierte DNA zur Transformation von E. coli-HB101-Zellen verwendet. Die Selektion positiver rekombinanter Klone erfolgte über Ampicillinresistenz. Nach der Transformation wurde eine Reihe von das rekombinante Plasmid enthaltenden Kolonien zu Screeningzwecken ausgewählt.
Das in den Vektor während der Klonierung eingebaute synthetische Fragment besaß eine solche Größe (84-mer), die die Restriktionsanalyse rekombinanter Plasmid-DNA-Proben als einfaches Screening-Verfahren ungeeignet machte. Insertionen von so geringer Größe sind nicht leicht in der Agarosegelelektrophorese zu erkennen. Das Fragment selbst enthält keine interne Restriktionsendonuclease-Spaltstelle, die zur Feststellung seines Vorhandenseins verwendet werden könnte. Ein erstes Screening von rekombinanten Klonen wurde daher mit dem Verfahren der Koloniehybridisierung durchgeführt (siehe Grunstein und Hogness Proc. Natl. Acad. Sci 72, 3961 (1975)). Immobilisierte Plasmid-DNA aus den rekombinanten Klonen enthaltende Nitrocellulosefilter wurden gegen eine durch radioaktive Zufallsmarkierung der in der Annealing-Reaktion zusammengelagerten synthetischen Oligonukleotide SEQ ID No 38 und SEQ ID No 39 hergestellte Sonde hybridisiert. Die DNA wurde mit α³²P-dCTP und 2stündige Inkubation mit Klenow-Polymerase bei 37°C markiert. Für die Plasmid-DNA-Präparation wurden rekombinante Kolonien, die eine positive Hybridisierungsreaktion erzeugten, ausgewählt. In allen Fällen wurde Plasmid-DNA jeweils mit einem Verfahren in größerem Maßstab, das zur Gewährleistung der Reinheit eine CsCl-Gradientendichtezentrifugation einschloß, siehe "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" 2. Auflage, Sambrook Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) S. 1,42–1,52, präpariert. Die DNA-Präparation mit einem solchen Verfahren gewährleistet ein Material von hoher Qualität, das zur Verwendung in nachfolgenden Klonierungsmanipulationen sowie der Sequenzanalyse geeignet ist.
Die gesamte, aus rekombinanten Klonen isolierte Plasmid-DNA wurde einem sekundären Screening mittels Sequenzanalyse unterzogen, um sicherzustellen, daß die Oligonukleotidsequenz an den Klonierungsverbindungsstellen sowie die Sequenz des T7A3-RBS1-Fragments selbst absolut korrekt war. Bei der verwendeten Sequenziervorschrift handelte es sich um die der Sequenase und bei dem zur Verwendung ausgewählten Sequenzierprimer beispielsweise um pBR322 UP (pBR322 Universal-Primer). Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung der Dideoxy-Kettenabbruch-Sequenziertechnik nach Sanger.
Klone mit der korrekten Sequenz wurden als neues Expressionskonstrukt pCG61 bezeichnet und enthielten den T7A3-Promotor, die RBS1-Sequenz und die T4-Terminatorsequenz (siehe 8).
BEISPIEL 9 – HERSTELLUNG VON RICIN A
Im folgenden wird die Verwendung des Plasmids pICI0042 bei der Herstellung von Ricin A veranschaulicht. Dabei wurde eine für das Ricin A kodierende DNA-Sequenz in das Plasmid pICI0042 so inseriert, daß sie unter der Kontrolle des trp-Promotors stand. DNA-Sequenzen für Ricin A sind beispielsweise beschrieben in EP 145,111 ; Lamb, I. F. et al., Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265–270 und O'Hare, M. et al., FEBS Letts., 1987, 216, 73–78. Im folgenden wird die Herstellung mehrerer Zwischenstufen bei der Herleitung des jeweiligen zur Herstellung von rekombinantem Ricin A verwendeten Vektors beschrieben.
9.1 Synthetische Oligonukleotide
Zur Einführung spezifischer DNA-Sequenzänderungen des Ricingens wurden synthetische Oligonukleotide verwendet. Alle nachfolgend beschriebenen Oligonukleotide wurden in einem DNA-Syntheseautomaten 380A von Applied Biosystems aus 5'-Dimethoxytrityl-basengeschützten Nukleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen und an "Controlled-Pore-Glass"-Träger gebundenen geschützten Nukleosiden gemäß den von Applied Biosystems Inc. mitgelieferten Vorschriften im 0,2-Mikromol-Maßstab hergestellt.
Die Oligonukleotide wurden nach Abspaltung vom festen Träger und Entfernung aller Schutzgruppen jeweils in Wasser (1 ml) gelöst, wobei zur Konzentrationsbestimmung die Absorption bei 260 nm gemessen wurde.
9.2 Enzyme
Bei den unten beschriebenen Manipulationen wurden verschiedene Restriktionsendonucleasen und DNA-modifizierende Enzyme verwendet. Diese wurden von einer Reihe von Zulieferern (Amersham International, Bethesda Research Laboratories, Boehringer Mannheim oder New England Biolabs) bezogen und in bezug auf die Reaktionsbedingungen gemäß den Angaben der Hersteller verwendet.
9.3 Konstruktion der pICI-Expressionsvektoren
9.3 a) pICI0020
Wie in Beispiel 5(c) erwähnt, handelt es sich bei dem Plasmidvektor pICI0020 um einen auf pAT153 basierenden Plasmidvektor, bei dem der 651 bp große EcoRI-AccI-Bereich durch ein 167 bp großes EcoRI-ClaI-Fragment ersetzt ist, das aus:

(1) einem synthetischen E. coli-trp-Promotor und einer trp-leader-Ribosomenbindungsstelle,
(2) einem Translationsstartcodon,
(3) einer aus M13mp18 stammenden Erkennungssequenz für mehrere Restriktionsenzyme mit Stellen für KpnI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und HindIII,
(4) einer synthetischen Transkriptionsterminationssequenz besteht.

Die Konstruktion eines Plasmidvektors mit einer synthetischen trp-Promotorsequenz ist veröffentlicht (Windass et al., Nuc. Acids. Res. 10, S. 6639–6657, 1982). Ein Promotorfragment wurde aus solch einem Vektor nach Verdauung mit den Enzymen EcoRI und HpaI sowie Reinigung der entsprechenden Bande aus einem Agarosegel durch Elektroelution isoliert (in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Maniatis, Fritsch und Sambrook, erschienen bei CSH laboratory, 2. Auflage 1989 und nachfolgend mit "Maniatis" bezeichnet).
Es wurde ein Paar komplementärer synthetischer Oligonukleotide hergestellt, die an das HpaI-Ende des Promotorfragments ligieren sollten, wodurch die natürliche trp-leader-Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsstartcodon sowie eine 3'-KpnI-Klonierungsstelle bereitgestellt wurde. Diese Oligonukleotide wurden in äquimolaren Konzentrationen gemischt und, um das Annealing zu gestatten, auf 100°C erhitzt und danach langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
Das Promotorfragment und die durch das Annealing aneinander gefügten Oligonukleotide wurden dann ligiert und die entsprechende Bande durch Elektroelution aus einem Polyacrylamidgel isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit einem Derivat des M13mp18-Vektors ligiert, das die in die HindIII-Stelle klonierte trp-Attenuator-Sequenz (aus synthetischen Oligonukleotiden gebildet) enthielt und durch das eine zusätzliche ClaI-Restriktionsstelle 3' zum Attenuator eingeführt wurde. Die ligierte DNA wurde dann in den mit Hilfe der CaCl₂-Methode (Maniatis, Kapitel 1, S. 82) kompetent gemachten E. coli-Stamm JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, S. 103, 1985) transfiziert. Nach dem Ausplattieren sowie der Inkubation der Platten wurden die Plaques einem Screening nach dem Verfahren von Benton und Davies (Maniatis, Kapitel 4, S. 41) unter Verwendung einer ³²P-markierten Sonde, die durch Nick-Translation des zuvor isolierten EcoRI-HpaI-Promotorfragments erzeugt worden war, unterzogen. Von positiv hybridisierenden Plaques wurde Einzelstrang-DNA mit Hilfe eines Standardverfahrens (Maniatis, Kapitel 4, S. 29) präpariert und unter Verwendung des M13-Universalprimers und des Dideoxy-Kettenabbruchverfahrens nach Sanger, wie es in Form eines Kits von einer Reihe von Zulieferfirmen angeboten wird, z. B. Sequenase (United States Bioscience) sequenziert.
RF-DNA wurde aus einem Isolat, in dem die Promotor/Ribosomenbindungsstelle/Attenuator-Sequenz bestätigt worden war, präpariert. Diese DNA wurde mit EcoRI und ClaI verdaut und das entsprechende Fragment danach aus einem Polyacrylamidgel wie oben isoliert. Das Plasmid pAT153 wurde mit den Enzymen EcoRI und AccI verdaut und mit dem isolierten Promotorfragment ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente E. coli HB101 (Bethesda Research Laboratories) transformiert, und danach wurde auf ampicillinresistente Kolonien selektioniert.
Von mehreren Klonen wurde die Plasmid-DNA präpariert und die DNA-Sequenz aus dem Bereich zwischen der EcoRI- und der ClaI-Stelle abgeleitet. Ein Klon, bei dem der korrekte Promotor/Attenuatorbereich bestätigt wurde, wurde mit pICI0020 bezeichnet.
Diese Konstruktion ist in 12 dargestellt.
9.3 b) pICI1079
Wie in Beispiel 8(a) erwähnt, handelt es sich bei dem Plasmidvektor pICI1079 um ein ampicillinresistentes, von pAT153 abgeleitetes Plasmid, das zwischen den EcoRI- und StylI-Restriktionsstellen die folgenden Elemente enthält:

(i) ein CI857-Gen aus dem Phagen X;
(ii) einen λP_L-Promotor;
(iii) eine synthetische Ribosomenbindungsstelle;
(iv) eine synthetische Interferon-α₂ Gensequenz;
(v) eine synthetische Transkriptionsterminatorsequenz, abgeleitet vom Phagen T4, zwischen den SalI- und StyI-Restriktionsstellen. Die DNA-Sequenz dieses Transkriptionsterminators ist in 1(b) gezeigt. pICI1079 ist in 6 dargestellt.

pICI1079 wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machaer Drive, Aberdeen, Schottland hinterlegt. Das Hinterlegungsdatum war der 19. Februar 1991, die Nummer ist NCIMB 40370.
Dieses Plasmid wurde dazu verwendet, eine Quelle für den T4-Transkriptionsterminator zur Erzeugung des Ricin A exprimierenden Klons pICI1185 (siehe 9.5.d, unten) bereitzustellen. Der Ausgangspunkt zur Erzeugung dieses Plasmids war pICI1043. pICI1043 ist ein auf pICI0020 (siehe 9.3.a, oben) beruhendes Plasmid, bei dem zwischen der EcoRI- und der SalI-Stelle eine Expressionskassette mit einem λP_L-Promotor und dem Interferon-α₂-Gen (Edge et al., Nuc. Acids Res. 11, S. 6419–6435, 1983) liegt.
Zur Erzeugung des Transkriptionsterminators aus dem Gen 32 des Bakteriophagen T4 mit kohäsiven 5'-SalI- und 3'-SphI-Enden wurde ein komplementäres Paar von Oligonukleotiden synthetisiert. Dieses Fragment wurde mit einem aus pICI1043, das vollständig mit SalI und SphI verdaut worden war, isoliertem Plasmidfragment ligiert. Die so produzierte Plasmidzwischenstufe (pICI1078) enthielt sowohl die T4-Terminator- als auch die trp-Attenuator-Sequenzen in Tandemstellung.
Danach wurde ein zweites Paar komplementärer Oligonukleotide verwendet, um die trp-Attenuator-Sequenz (sowie den verbliebenen Teil des Tetracyclin-Resistenzgens) durch Insertion zwischen die SphI- und die StyI-Stelle von pICI1078 zu ersetzen. In dieses synthetische Fragment wurde eine nur einmal vorkommende BamHI-Stelle eingeführt.
Diese Manipulationen sind in 13 dargestellt.
9.4 Erzeugung eines Ricin A exprimierenden Klons
9.4 a) Herstellung von pUC8RA-Plasmid-DNA
Es wurde ein Klon (pUC8RA) erzeugt, der die für Ricin A codierende DNA enthält. Dieser Klon enthält die A-Ketten-cDNA von der Base Nummer -74 in der Leader-Sequenz bis zur BamHI-Stelle in der B-Kette (Base Nummer 857), gemäß der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Lamb, I. F., Roberts, L. M., Lord, J. M. Eur. J. Biochem, 1985, 148, S. 265–270) im Plasmid pUC8 (Vieira, J. und Messing, J., Gene, 19, S. 259, 1982). Darüberhinaus wurde stellengerichtete Mutagenese verwendet, um ein Translationsterminationscodon unmittelbar 3' vom letzten Codon des reifen Ricin A zu erzeugen (wie in O'Hare, M. et al., FEBS Letts, 1987, 216, S. 73–78 berichtet). Der gesamte, die A-Kette codierende Bereich ist in einem BamHI-Fragment aus diesem Klon enthalten.
Von den Erfindern der pUC8RA-Plasmid-DNA wurde eine kleine Menge davon erhalten. Für weitere Stammlösungen wurde eine Verdünnung dieser DNA zur Transformation in kompetente E. coli-DH5α-Zellen (Bethesda Research Laboratories) verwendet und ein ampicillinresistenter Transformant ausgewählt. Aus diesem Klon wurde Plasmid-DNA nach einem modifizierten Birnboim-Doly-Verfahren präpariert (Maniatis, Kapitel 1, S. 25). Proben dieser DNA wurden getrennt mit BamHI und BanI verdaut und nach Elektrophorese auf einem Agarosegel mit entsprechenden Verdaus der ursprünglichen DNA-Probe verglichen. Dabei wurden keine Unterschiede im Restriktionsmuster beobachtet, und die beiden DNA-Proben wurden auf dieser Grundlage als identisch angesehen.
9.4 b) Subklonierung in M13
BamHI-Verdaus der pUC8RA-Plasmid-DNA sowie der RF (replikative Form)-DNA aus dem M13-Phagenstamm K19 (Anglian Biotechnology) wurden unter Standardbedingungen einer "Schrotschuß" ["shotgun")-Ligation unterzogen (Maniatis, Kapitel 1, S. 68). Kontrolligationen wurden ebenfalls durchgeführt. Die ligierten DNAs wurden zur Transformation des E. coli-Stamms TG1 (Gibson, 1984/Anglian), der mittels der CaCl₂-Methode kompetent gemacht worden war (Maniatis, Kapitel 1, S. 82), verwendet.
Die Transformationsfrequenzen deuteten auf eine effiziente Ligation hin, wobei in der Nachkommenschaft rekombinante Phagen erwartet wurden. Rekombinante Phagen sollten aufgrund der Unterbrechung des lacZ (β-Galactosidase)-Gens klare Plaques auf Platten mit IPTG + X-gal (BRL) produzieren. Aufgrund der Umwandlung des X-gal durch β-Galactosidase produzieren Wildtyp-Phagen blaue Plaques.
Für die Einzelstrang-DNA-Präparation wurden mehrere klare Plaques gepickt. Die direkte Elektrophorese lysierter Phagensuspensionen deutete darauf hin, daß ein Phagenklon eine ziemlich große Insertion enthielt, die durch Sequenzierung als die für die Ricin-A-Kette codierende Sequenz bestätigt wurde. Dabei wurden nur 182 Basen der für das reife Ricin A codierenden Sequenz bestätigt, doch wurde dies als ausreichender Beweis für das Vorhandensein des gesamten Ricin A-Gens gewertet. Dieser Klon wurde mit M13K19RA bezeichnet.
9.4 c) Mutagenese von M13K19RA
Zur Erzeugung einer mit pICI-Expressionsvektoren kompatiblen KpnI-Stelle am Start des reifen Ricin A werden die folgenden Änderungen (unterstrichen) benötigt:
wobei ein eine KpnI-Stelle überlappendes ATG-Codon erhalten wird. Ein Ricin A erhaltendes KpnI-Fragment läßt sich aus der Mutante herausschneiden und in die ICI-Expressionsvektorreihe inserieren. Dabei werden zwei N-terminale Aminosäuremodifikationen durchgeführt (ile-phe zu met-val).
Die von M13K19RA präparierte Einzelstrang-DNA stellte jeweils die Matrize für den Mutageneseschritt bei jeder Mutationsstrategie dar. Dabei wurde ein einziges Oligonukleotid (DTR16), das bei dieser Strategie alle Mutationsänderungen einführt, synthetisiert.
Für die Einführung spezifischer DNA-Sequenzänderungen mittels stellengerichteter Mutagenese existieren mehrere Protokolle. Die unten angeführten Vorgehensweisen ergaben sich unter Verwendung des Verfahrens von Eckstein et al., (Nuc. Acid Res., 1985, 13, S. 8749–8764 und 1986, 14, S. 9679–9698), wie es in Kit-Form (Amersham International) bereitgestellt und gemäß den Herstellerangaben verwendet wurde.
Das Prinzip dieses Verfahrens besteht im Priming der Einzelstrang-DNA-Matrize mit dem mutagenen Oligonukleotid und der Synthese des komplementären Strangs, in dem dRTPαS anstelle von dATP eingebaut wird. Durch Verwendung dieses Nukleotids werden Phosphorthioatbindungen gebildet, die von bestimmten Restriktionsenzymen (z. B. NciI) nicht gespalten werden. Nach Synthese des zweiten Strangs wird NciI für das Nicking des Ausgangsstrangs eingesetzt und Exonuclease III zugegeben, um hinter den Mutationspunkt zurückzuverdauen. DNA-Polymerase I gestattet dann die Rücksynthese des Ausgangsstrangs. Dementsprechend wirkt das mutagene Oligonukleotid als Matrize für die Rücksynthese, wobei die Mutation vor der Transformation in beide Stränge eingeführt wird. Dabei werden Mutationshäufigkeiten von bis zu 96% der gesamten Nachkommenschaft angegeben, und das Screening erfolgt einfach durch zufallsmäßiges Picken von Plaques zur Sequenzanalyse.
In unseren Experimenten enthielten 4 von 4 gepickten Plaques die korrekte Mutation.
Nach Wahl einer Mutante (MRA16) wurde RF-DNA präpariert und auf das Vorhandensein des neuerzeugten Restriktionsfragments, d. h. KpnI, überprüft.
9.4 d) Clonierung, Expression und erste Charakterisierung
Die pICI-Reihe von Expressionsvektoren (siehe Abschnitt 5) kann DNA-Fragmente akzeptieren, die in eine unmittelbar neben dem Trp-Promotor liegende, nur einmal vorkommende KpnI-Restriktionstelle kloniert wurden. Die KpnI-Stelle überlappt das Translationsstartcodon (ATG), das 8 bp stromabwärts von der Shine-Dalgarno-Stelle (AGGA) des Promotors liegt.
Nach Verifizierung der MRA16-Sequenz wurde eine Verdauung mit KpnI im Großmaßstab (^~5 μg RF-DNA) durchgeführt und das entsprechende, für Ricin A codierende DNA-Fragment aus einem Agarosegel (Nu-Sieve GTG agarose, FMC Bio-products) isoliert, indem ein ausgeschnittenes Gelstückchen gemäß der Vorschrift des Herstellers mit Phenol extrahiert wurde.
pICI0020 (siehe 9.3a) wurde mit KpnI verdaut und danach mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP – Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Die letztere Behandlung verhindert die Rezirkularisierung des Vektors nach der Ligation, die zu einem höheren Anteil an Ausgangsvektoren in der Transformationsnachkommenschaft führen würde.
Die Ligationen wurden für die verschiedenen Strategien mit Verhältnissen von Plasmidvektor zu isoliertem Fragment von 8 : 1 (w/w) bis 1 : 3 angesetzt. Dabei wurden Kontrolligationen zum Testen der Wirksamkeit der Phosphatasebehandlung, der Ligaseaktivität usw. mit eingeschlossen. Die Ligationsbedingungen entsprachen der Quelle für die verwendete T4-DNA-Ligase (New England Biolabs oder Amersham). Die Reaktionen wurden im allgemeinen über Nacht bei 15°C inkubiert.
Fünfzig Prozent jedes Ligationsansatzes (5 μl) wurden mit 1 × TNE (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) auf 100 μl verdünnt und danach mit 200 μl kompetenten E. coli DS410 versetzt. Nach einer Standardtransformationsvorschrift (Maniatis, Kapitel 1, S. 74) wurden die Zellen auf L-Agar plus Streptomycin (25 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) aufplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. E. coli DS410 besitzt ein chromosomales Streptomycin-Resistenzgen.
Nach der Inkubation wurden die Transformationsplatten untersucht. Im allgemeinen waren bei den Ligationen 5 bis 10 mal mehr Kolonien zu sehen als bei den Kontrollen ohne Ligase. In einigen Fällen gab es nur geringe Unterschiede in der Anzahl an in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Ligase produzierten Kolonien, was auf eine unvollständige Verdauung des Vektors oder eine schwache Ligaseaktivität hindeutet.
Transformanten wurden zusammen mit den entsprechenden Kontrollen auf auf L-Agarplatten plazierte Nitrocellulosefilter zum Hybridisationsscreening (auf Basis des Verfahrens von Grunstein und Hogness, wie in Maniatis, Kapitel 1, S. 98 beschrieben) überführt. Nach der Inkubation wurden die Kolonien mit 10% SDS und 1 M NaOH in situ lysiert, mit 1 M Tris (pH 7,5) neutralisiert und 2 Stunden im Vakuum bei 80°C getrocknet.
Hybridisierungssonden wurden durch ³²p-Markierung der Mutationsoligonukleotide unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase erzeugt. Die Filter wurden bei Raumtemperatur mit den Sonden inkubiert und danach zur Entfernung unspezifisch gebundener "counts" vor der Autoradiographie stufenweise bis zu 55–65°C gewaschen. Eine spezifische Hybridisierung zeigte putative, Ricin-A-DNA enthaltende Klone an.
Von den positiv hybridisierenden Klonen wurden DNA-Präparationen im Kleinmaßstab (nach dem Verfahren von Holmes und Quigley bzw. Birnboim-Doly, wie in Maniatis, Kapitel 1, S. 25 angegeben) hergestellt. Die DNAs wurden mit den jeweiligen Restriktionsenzymen, z. B. KpnI und EcoRI/BglII, verdaut und mittels Elektrophorese auf Agarosegelen analysiert. Vektor-DNAs und mutierte RF-DNAs wurden mit denselben Enzymen geschnitten, um die für die korrekten Klone erwarteten Fragmentgrößen anzuzeigen.
Für eine ausführlichere Restriktionsanalyse, z. B. ClaI, HindIII, BamHI, EcoRI/BglII, KpnI und ScaI wurden für jeden Klon Plasmid-DNA-Präparationen im größeren Maßstab (Birnboim-Doly) verwendet. Auf Agarosegelen zeigten diese Verdaus die Größe des inserierten Fragments, einen Hinweis auf seine Orientierung sowie den Erwerb einiger einmal vorkommender Enzymstellen der Ricin-A-Kette.
9.4 e) Expressionsuntersuchungen
Die durch Hybridisations- und Restriktionsscreening positiv identifizierten Klone wurden mittels SDS-PAGE-Analyse von Gesamtzelllysaten auf die Expression von Ricin A getestet. Dabei waren die Standardbedingungen für die Expressionsuntersuchungen wie folgt:

1) Animpfen von 10 ml L-Bouillon + Antibiotikum (Antibiotika) mit einer Einzelkolonie und Wachstum bei 37°C über Nacht unter leichtem Schütteln.
2) Abnehmen von 750 μl der L-Bouillon-Übernachtkultur und Pelletieren der Zellen in eine Mikrozentrifuge (1 Min. bei 6500 UpM).
3) Resuspendieren der Pellets in 300 μl M9-Medium (Maniatis, Appendix A.3) + 0,02% Casein-Hydrolysat + 0,2% Glukose + 50 μg/ml Thiamin und Animpfen von 10 ml dieses Mediums damit.
4) Inkubieren für 7 Stunden oder über Nacht bei 37°C unter leichtem Schütteln.
5) Nach Inkubation Messen der OD₅₄₀, Pelletieren der Zellen und Resuspendieren in Laemmli-Probenpuffer (Maniatis, Kapitel 18, S. 53) bis zu OD₅₄₀ = 10 pro ml. 15 Minuten kochen.
6) 20 μl des Gesamtzelllysats auf ein SDS-Polyacrylamidgel laden, Elektrophorese durchführen, Anfärben mit Coomassie Blue, Entfärben und sichtbar machen.

Von den mit SDS-PAGE untersuchten Klonen zeigte nur 1 eine zusätzliche Bande mit einem entsprechenden Molekulargewicht von ~29 KD (entspricht dem für nichtglykosyliertes, reifes Ricin A geschätzten Molekulargewicht). Gel-Scans deuten darauf hin, daß das Expressionsniveau im Bereich von 5–10% Gesamtzellprotein liegt. Dieser Klon wurde mit pICI1102 bezeichnet.
Die Konstruktion von pICI1102 ist in 14 dargelegt. Die Ergebnisse der Expressionsuntersuchungen sind in 15 und 16 gezeigt.
9.4 f) Western-Transfers und Immunnachweis von rekombinantem Ricin A
Die ursprünglich durch Coomassie-Blue-Anfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen gezeigte Authentizität des rekombinanten Ricin-A-Kette-Proteins wurde durch Western-Blot-Technik bestätigt. Die Protinbanden wurden auf Nitrocellulosefilter übertragen und unter Verwendung eines für Ricin A spezifischen Antikörpers und anschließend mit Peroxidase markierten Antiglobulinen nachgewiesen.
Man ließ 15%-SDS-PAGE-Gele über Nacht bei 8 mA laufen und equilibrierte dann wenigstens 30 Minuten in Transferpuffer.
Die Proteinbanden auf den Gelen wurden dann auf Nitrocellulosemembranen (Hybond-D, Amersham) elektrophoretisch in einem Transblot-Gerät von Bio-Rad 3 Stunden bei 70 V übertragen. Die Filter ließen sich nach dem Trocknen in verschlossenen Plastiktaschen bei –20°C aufbewahren.
Bei Ricin A.1 handelte es sich um einen in Kaninchen gezogenen polyklonalen Antikörper gegen ein synthetisches Ricin-A-Peptidfragment. Voruntersuchungen zeigten eine gute Affinität für Ricin A, jedoch beträchtliche Kreuzreaktivität mit vielen E. coli-Proteinen. Um den durch diese Kreuzreaktivität verursachten hohen Hintergrund zu überwinden, wurde der Antikörper mit einem E. coli-Lysat vorinkubiert.
So wurde eine 10-ml-L-Bouillon-Übernachtkultur des E. coli-Stamms DS410 zur Pelletierung der Zellen 10 Minuten bei 4000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml Bakterienpuffer resuspendiert und mit jeweils 4–6 μ in 6 × 10-Sekunden-Intervallen beschallt, wobei dazwischen jeweils 30 Sekunden auf Eis gekühlt wurde.
0,5 ml der beschallten Lösung wurden dann mit 0,5 ml Ricin-A.1-Antiserum gemischt und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zelltrümmer wurden 5 Minuten durch Zentrifugieren bei 13.000 UpM sedimentiert und der Überstand bei –20°C gelagert.
Die Nitrocellulosefilter von den Western-Transfers wurden durch Übernachtinkubation bei Raumtemperatur in 5% BSA-PBS/Tween blockiert. (PBS Tween = 5 ml Tween 20 pro 1 Liter PBS),
3 × 3 Minuten in PBS/Tween gewaschen,
2 Stunden (oder über Nacht) bei Raumtemperatur mit einer 1 : 4000-Verdünnung von "blockiertem" Ricin-A.1-Antikörper in 0,5% BSA-PBS/Tween inkubiert,
3 × 3 Minuten in PBS/Tween gewaschen,
1 Stunde mit einer 1 : 1000-Verdünnung eines Ziege-Anti-Kaninchen-Antiserums in 0,5% BSA-PBS/Tween bei Raumtemperatur inkubiert,
3 × 3 Minuten in PBS/Tween gewaschen,
1 Stunde mit einer 1 : 5000-Verdünnung eines Kaninchen-Peroxidase-Anti-Peroxidase-Antiserums in 0,5% BSA/PBS/Tween bei Raumtemperatur inkubiert,
3 × 3 Minuten in PBS/Tween gewaschen,
durch Eintauchen in eine Lösung aus 4-Chlornaphthol (60 mg) in 20 ml Methanol, die mit PBS auf 120 ml aufgefüllt wurde und 12 μl Wasserstoffperoxid enthielt, entwickelt. Die Membran wurde aus der Lösung entfernt, sobald Banden sichtbar wurden, dann getrocknet und fotographiert.
Eine typische Western-Blot-Analyse ist in 17 gezeigt.
9.4 g) Biologischer Assay für rekombinantes Ricin-A-Protein
Das Ziel bestand hier darin, Bedingungen zu schaffen, unter denen während der Reinigung von Ricin-A-Kette aus E. coli-Zellen erzeugte Proben in einem zellfreien invitro-Proteinsynthese-Assay auf biologische Aktivität getestet werden konnten.
Retikulozytenlysate aus Kaninchen wurden gemäß dem Verfahren von Allen und Schweet (J. Biol. Chem. (1962), 237, 760–767) hergestellt. Der Assay zeigt die Hemmung der Proteinsynthese in einem zellfreien System durch mangelnden Einbau von ¹⁹C-markiertem Leucin in neu synthetisiertes Protein.
9.4 g.i) Die Assay-Vorschrift
Stamm Lösung: 1 mM Aminosäure-Mix minus Leucin.
Eine alle L-Aminosäuren außer Leucin mit einer Konzentration von jeweils 1 mM enthaltende Lösung (mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt und bei –70°C gelagert).
Lsg. A

40 mM Magnesiumacetat
2 M Ammoniumacetat
0,2 M Tris (pH 7,4 mit HCl, gelagert bei 4°C)

Lsg. B

ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml
GTP (Sigma G8752) 24.4 mg/ml

Assay-Mix: 1 ml Aminosäuregemisch

1 ml Lsg. A
0,1 ml Lsg. B
103 mg Creatinphosphat
1 mg Creatinkinase
510 μl H₂O
600 μl (60 μCi) L-¹⁴C-Leucin (New England Nuclear, NEC-279E)

Reaktionsansatz: Testprobe 25 μl

Assaymix 12,5 μl
Kaninchen-Retikulozytenlysat 25 μl
Die Leerkontrolle bestand aus einer Lösung von 2 mg/ml BSA in PBS
Alle Assays wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt.

12,5 μl Assay-Mix in sterile Glasröhrchen gefüllt,
25 μl BSA in PBS jeweils in die ersten vier Röhrchen als Leerwerte gegeben,
25 μl Testproben in die restlichen Röhrchen gegeben,
1 ml 0,1 M KOH in die ersten beiden Röhrchen gegeben (Hintergrund-Leerwert),
Röhrchen in einem Wasserbad auf 28°C equilibriert,
25 μl Kaninchen-Retikulozytenlysat (das man von der Temperatur von Flüssigstickstoff auftauen ließ) wurden jeweils in 20-Sekunden-Abständen in jedes Röhrchen gegeben. Nach 12minütiger Inkubation des ersten Röhrchens wurde jeweils 1 ml 0, 1 M KOH wiederum in 20-Sekunden-Abständen in jedes Röhrchen gegeben, sodaß alle Röhrchen 12 Minuten inkubiert werden konnten. Man gab jeweils 20% Wasserstoffperoxid und danach jeweils 1 ml 20% TCA in jedes Röhrchen.
Die Röhrchen wurden gemischt und mindestens 1 Stunde bzw. über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Niederschläge wurden auf 2,5-cm-GFC-Scheibchen filtriert, mit 3 × 4 ml 5% TCA gewaschen, in Szintillationsfläschchen überführt und mit 10 ml Szintillatorflüssigkeit (Ready-Solv. MP, Beckman) versetzt. Nach 1 Stunde wurden die Fläschchen geschüttelt und gezählt.
9.4 g.ii) Einrichten der Technik zur Verwendung mit E. coli-Lysaten
10 ml L-Bouillon-Übernachtkulturen wurden bei 37°C angezogen. 400 μl-Aliquots wurden bei 13.000 UpM 30 Sekunden pelletiert und der größte Teil des Überstands dekantiert.
Die Pellets wurden 2 Runden von schnellen Einfrieren in Trockeneis/EtOH und anschließendem Auftauen bei 37°C unterzogen. Danach wurden 12 μl 25% Saccharose in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und anschließend 4 μl einer 10 mg/ml-Lysozymlösung zugegeben.
Nach 15minütiger Inkubation auf Eis wurden 8 μl 0,25 M EDTA zugegeben und die Inkubation noch weitere 15 Minuten fortgesetzt. Die Lyse wurde osmotisch durch Verdünnen der Proben auf 400 μl mit Wasser durchgeführt. Diese Vorgehensweise führte zu Anzahlen lebensfähiger Zellen von 80–100 pro ml.
Bei Zugabe eines 25-μl-Aliquots dieses Lysats zum Assay-Reaktionsansatz betrug das Niveau des Einbaus von ¹⁴C-Leucin in neu synthetisiertes Protein ~10% des Leerwerts ohne Lysat. Dies stellte ein ähnliches Hemmniveau wie das durch 8 ng/ml Ricin A produzierte dar. Danach wurden Verdünnungen des E. coli-Lysats hergestellt und der Assay wiederholt. Das Ergebnis zeigt eindeutig, daß mindestens eine 16fache Verdünnung notwendig war, um die Wirkung des Lysats zu reduzieren, sodaß sie der der Leerkontrolle entsprach.
Um so sicher wie möglich zu sein, daß die Lyse von E. coli und E. coli-Lysate nicht die Ricin-A-Toxizität gefährdeten, wurden 2 Kontroll-Assays durchgeführt. Bei dem ersten wurde aus Pflanzen stammendes Ricin-A zu einem 16fach verdünnten E. coli-Zellpellet gegeben, sodaß sich nach der Zellyse eine Endkonzentration von 8 mg/ml im Assay-Mix ergab. Beide Kontrollen zeigten keinen negativen Einfluß der Lysate oder des Lyseverfahrens auf die Hemmwirkung von Ricin A.
Diese Techniken wurden zur Verifizierung der Synthese von biologisch aktivem, rekombinantem Ricin A aus pICI1102 und den unten beschriebenen Klonen verwendet.
9.4 h) DNA-Sequenzanalyse
Für die Analyse von pICI1102 wurde die Plasmid-DNA-Sequenzierung verwendet. Bei der gewählten Vorschrift handelte es sich um eine modifizierte Vorschrift von Zagursky et al. (Gene Analysis Techniques Bd. 2, Nr. 5), bei der doppelsträngige Plasmid-DNA vor dem Primer-Annealing einer alkalischen Denaturierung unterzogen wird und die Sequenzierung nach einem Standardverfahren erfolgt, wie z. B. dem von mehreren Zulieferfirmen angebotenen Verfahren in Kit-Form, z. B. Sequenase (United States Bioscience). Durch Verwendung eines Oligonukleotids für das Priming am 3'-Ende der β-Lactamase und mehrerer interner A-Kette-Primer war eine Sequenzierung beider Stränge des Promotors und des Ricin-A-Gens möglich.
Die ersten Sequenzdaten zeigten ein unerwartetes Ergebnis, nämlich daß ein zusätzliches KpnI-Fragment zwischen dem Promotor und der für Ricin A codierenden Sequenz vorhanden war, d. h.:
Das zusätzliche KpnI-Fragment stammte von M13K19RA und enthält Restriktionsenzymstellen plus den aus pUC8RA klonierten Teil der Ricin-Leader-Sequenz. Der 5'-Bereich der Ricin-A-Kette enthält die während der Mutagenese eingeführten Basenaustausche.
Eine Untersuchung dieser Sequenz zeigt, daß das erste Translationsstartcodon (ATG) nicht im gleichen Leseraster wie der für Ricin A codierende Bereich liegt. Ebenso liegt vor dem Ricin-A-Startcodon ein Terminationscodon (TAG) im gleichen Raster, und es ist auch eine putative Schein-Dalgarno-Sequenz (AGGA) vorhanden, durch die die Translation vom zweiten ATG neu gestartet werden könnte.
Nachfolgende Untersuchungen zeigten, daß überraschenderweise durch dieses zusätzliche DNA-Fragment ein günstiger Vorteil in bezug auf das Niveau der Anhäufung der Ricin-A-Kette in E. coli im Vergleich mit Klonen, aus denen es herausgeschnitten worden war, vermittelt wurde.
Die vollständige DNA-Sequenz des in pICI1102 enthaltenen Ricin-A-Gens ist in 18 angegeben.
9.5 Erzeugung nachfolgender, Ricin-A exprimierender Klone
9.5 a) Mutation des Ricin-A-Klons pICI1102 zur Ermöglichung der Subklonierung
Die Subklonierung der beiden KpnI-Fragmente aus dem zufällig erzeugten pICI1120 in der korrekten Orientierung für die Expression von Ricin A wäre schwierig. Dementsprechend wurde von uns vorgesehen, die interne KpnI-Erkennungsstelle durch Substitution einer einzigen Base (A nach T) zu verändern. Dies würde die Spaltung durch KpnI an dieser Stelle verhindern und die Subklonierung eines einzigen KpnI-Fragments in die /RBS-Vektorreihe gestatten. Durch Austauschen des Adenins der KpnI-Erkennungsstelle (GGTACC) gegen Thymin (d. h. GGTTCC) bleibt der erste Rest des Ricin A unverändert (GTA/GTT = Val).
d. h.:
Das zur Erzeugung dieses Austauschs synthetisierte Oligonukleotid besitzt die Sequenz:
wobei die unterstrichene Base den Mutationsaustausch darstellt.
Wir planten, das mutierte Ricin-A-Fragment in einer Reihe von trp-Expressionsvektoren für vergleichende Expressionsuntersuchungen zu klonieren. Die Klonierung in pICI0020 ermöglicht einen Vergleich mit pICI1102 zur Bestimmung der eventuell vorhandenen Wirkungen des Einzelbasenaustauschs auf die Expression.
9.5 b) Mutagenese
Die Matrize für die Mutagenese war MRA16, bei dem es sich um den M13-Klon handelt, der die beiden in pICI1102 vorhandenen KpnI-Fragmente enthält. Nach der Mutagenese wurden die gewünschten Mutationen tragenden Isolate mittels Zufallsprobennahme und Bestimmung der DNA-Sequenz über den Bereich, an den das mutagene Oligonukleotid sich spezifisch bindet, identifiziert.
Eine mutierte Matrize erhielt die Bezeichnung MRA22. Diese wurde weiter analysiert, indem die DNA-Sequenz der gesamten für Ricin A codierenden Sequenz bestimmt wurde, um die Abwesenheit nichtspezifischer Mutationen zu verifizieren.
9.5 c) Subklonierung
Die mutierten Einzelstrang-DNAs wurden zur Transformation kompetenter E. coli-TG1-Zellen verwendet, um so Einzelplaques zu erzeugen. Es wurden dann einzelne Plaques gepickt, und die replikative DNA-Form (RF-DNA, Doppelstrang) als Bande in Caesiumchlorid/Ethidiumbromid-Auftriebdichtegradienten gereinigt. Die gereinigte RF-DNA wurde vollständig mit KpnI verdaut. Die Klonierung wurde durch "Shotgun"-Ligation der verdauten RF-DNA mit dem entsprechenden KpnI-geschnittenen und phosphatase-behandelten Expressionsvektor oder durch spezifische Ligation des Ricin-A-Fragments nach seiner Reinigung aus einem Agarosegel erreicht. Die ligierte DNA wurde in E. coli-TG1 oder – HB101 transformiert.
Ricin-A enthaltende Klone wurden durch Hybridisations screening unter Verwendung einer mit ³²P-markierten Ricin-A-Sonde, die durch Hexanukleotid-Zufallspriming eines von einem anderen, Ricin A enthaltenden Klon (pICI1121) isolierten KpnI-Fragments hergestellt worden war, identifiziert. Positive Hybridisierung zeigende Kolonien wurden einem weiteren Screening mittels Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA unter Verwendung eines KpnI-Einzelverdaus und eines EcoRI/BglII-Doppelverdaus unterzogen. Durch KpnI wird die Größe des inserierten Fragments identifiziert und durch EcoRI/BglII die Orientierung des Fragments bestimmt.
Klone, für die das Vorhandensein des Ricin-A-Fragments in der für die Expression korrekten Orientierung bestätigt wurde, wurden einer Klonselektionsanzucht sowie einer Analyse mit SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Anfärbung und Western-Blot der Gele in Doppelbestimmung unterworfen. Das Niveau der Anhäufung von Ricin A in diesen Klonen entsprach dem für pICI1102 nachgewiesenen Niveau.
Ein Isolat wurde ausgewählt und mit pICI1131 bezeichnet.
9.5 d) Verwendung eines alternativen Transkriptionsterminatorelements
In diesen Experimenten wurde das Fragment mit dem trp-Promotor und Ricin A aus pICI1131 durch Verdauung mit den Enzymen EcoRI und SalI ausgeschnitten. Das letztere Enzym schneidet zwischen dem 3'-Terminus der für Ricin A codierenden Sequenz und dem trpA-Transkriptionsterminator. Das erhaltene Fragment wurde aus einem Agarosegel (2% NuSieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) ausgeschnitten und durch Extraktionen mit Phenol und Chloroform und anschließende Ethanolfällung gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit dem mit EcoRI und SalI geschnittenen pICI1079 ligiert. Dieses letztere Plasmid enthält den T₄-Terminator zwischen einmal vorkommenden SalI- und SphI-Stellen.
Die ligierte DNA wurde zur Transformation kompetenter E. coli-HB101 (BRL) verwendet, und Hybridisationsscreening wurde zum Nachweis des Vorhandenseins der Ricin-A-DNA wie in den vorhergehenden Experimenten eingesetzt. Positiv hybridisierende Klone wurden für die Plasmid-DNA-Präparation gewählt, wonach eine Restriktionsanalyse mit EcoRI und SalI zusammen erfolgte, um das Vorhandensein eines Fragments mit der entsprechende Größe zu zeigen.
Ein Isolat mit der korrekten Konstruktion wurde identifiziert und mit pICI1185 bezeichnet.
9.5 e) Erzeugung eines induzierbaren Tetracyclin-Selektionsvektors
Der Klon pICI1185 wurde zur Herstellung eines weiteren Konstrukts durch Subklonierung der Expressionskassette in einen weiteren Vektor, pICI0042, verwendet. Dabei wurde Plasmid-DNA aus pICI1185 präpariert und mit EcoRI und SphI zusammen verdaut, um eine Expressionskassette mit dem trp-Promotor/RBS1/Ricin-A-(MRA22-)Fragment/T₄-Terminator auszuschneiden. Dieses Fragment wurde nach dem in 9.4 d dargestellten Verfahren isoliert und mit dem mit EcoRI und SphI geschnittenen pICI0042 ligiert.
Die ligierte DNA wurde zur Transformation von E. coli-HB101 verwendet. HB101-Transformationen wurden auf L-Agar + Tetracyclin ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert, und anschließend wurden Kolonien einem Screening durch Hybridisierung mit einer ³²P-markierten Ricin-A-DNA-Sonde unterzogen.
In beiden Fällen wurden positiv identifizierte Kolonien durch Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA unter Verwendung von EcoRI/SphI- und EcoRI/BglII-Verdau bestätigt. Drei Isolate wurden identifiziert, d. h. pICI1187.1-3.
In 19 ist die Konstruktion von pICI1185 und pICI1187 dargestellt.
9.5 f) Klonselektion
Die isolierten Klone wurden zur Transformation von E. coli 71.18 verwendet und Einzelkolonien für die Klonselektionsuntersuchungen gepickt. Die erhaltenen Ganzzellysate wurden einer Elektrophorese auf SDS-PAGE-Gelen in Doppelbestimmung unterzogen, wobei ein Gel mit Coomassie Blue angefärbt und das andere für eine Western-Blot-Analyse verwendet wurde.
Aufgrund des Vorhandenseins eines mitwandernden Proteins von E. coli 71.18 lieferte das angefärbte Gel nur minimale Daten für die Ricin-A-Expression. Das Western-Blot-Expriment zeigte eindeutig eine Ricin-A-Expression im Vergleich mit positiven und negativen Kontrollproben an. Ein Isolat wurde in den unten beschriebenen Fermentationen eingesetzt.
FERMENTATION DER RICIN-A-KETTE
Das Plasmid pICI1187 wurde in den E. coli-Stamm MSD68 transformiert, und die erhaltene Rekombinante (MSD1051) wurde gereinigt und als Glyzerinkulturen bei –80°C aufbewahrt.
Ein Aliquot der Kultur wurde der Stammkultur entnommen und auf L-Tetracyclin-Agarplatten zur Trennung von Einzelkolonien nach Übernachtwachstum bei 37°C ausgestrichen. Eine Einzelkolonie von MSD 1051 wurde entnommen und in 10 ml L-Tetracyclin-Bouillon resuspendiert, und 10 250-ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 75 ml L-Tetracyclin-Bouillon wurden unmittelbar danach mit jeweils 100 μl angeimpft. Nach 16 H Wachstum bei 37°C auf einem Reziprokschüttler wurden die Kolbeninhalte vereinigt und zur Animpfung eines Fermenters mit 20 l modifiziertem LCM50-Wachstumsmedium verwendet.
Zusammensetzung von modifiziertem LCM50
Die Fermentationen wurden dann bei einer Temperatur von 37°C und einem durch automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxidlösung gesteuerten pH-Wert von pH 6,7 durchgeführt. Der Spannungssollwert für gelösten Sauerstoff (dOT-Wert) lag bei 50% Luftsättigung und wurde durch automatische Anpassung der Fermenterrührergeschwindigkeit gesteuert. Die Luftzufuhr zum Fermenter von anfänglich 20 l/Min., was 1 Volumen pro Volumen pro Minute (VVM) entspricht, wurde auf 45 l/Min. bei Erreichen von 80–90% der maximalen Fermenterrührergeschwindigkeit erhöht.
Während der gesamten Fermentationsdauer wurden Proben zur Messung der optischen Dichte (OD₅₅₀), des Zelltrockengewichts und der Ricin-A-Kette-Anhäufung in den Zellen entnommen. Die Ricin-A-Kette-Anhäufung wurde mittels Scanning von mit Coomassie Blue angefärbten SDS-PAGE-Gelen von Ganzzellysaten der Bakterienproben gemessen, wie im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
4 ½ h nach dem Animpfen wurde eine Lösung (225 g/l) von Hefeextrakt (Difco) mit einer Geschwindigkeit von 1,7 g/l/h in die Fermenter gepumpt.
Nach 12 h und Erreichen einer OC₅₅₀ von ungefähr 50 und bevor Sauerstoffmangel in der Fermentation einsetzte, wurden die Bakterien in einer Sorval-RC3B-Zentrifuge (700 g, 30 Min., 4°) geerntet und das angehäufte Protein aus den Bakterien gewonnen.
Anmerkung
E. coli DS410 (hierin auch mit MSD68 bezeichnet) ist allgemein bekannt (Dougan und Sherratt, Molecular and General Genetics, Bd. 151, S. 151–160, 1977) und besitzt den veröffentlichten Genotyp F^– ara azi ton A lac Y min A min B rps L mal A xyl mtl thi. Dieser Stamm ist der Öffentlichkeit frei zugänglich und wurde zudem von den Anmeldern am 7. Juni 1985 gemäß dem Budapester Vertrag bei der National Collections Of Industrial & Marine Bacteria Ltd, Aberdeen, Schottland unter der Hinterlegungsnummer 12100 hinterlegt.
Die Zellen wurden aus der Fermentationsbrühe mit einem "continuous disc stack intermittent discharge"-Separator [Kontinuierlicher Scheibenstapel-Separator mit periodischer Ableitung] gesammelt. Die Brühe (50 l von einer 2 × 25 l-Fermentation) wurde dabei zunächst von den Fermentern in einem 50 l-Rolltank überführt und dann zu einen aus einer Reihe von Haltetanks, die mit dem Separator und einem Homogenisator verbunden waren, bestehenden abgeschlossenen System transportiert.
Der Rolltank wurde mit diesem System verbunden und die Brühe mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 l/h durch den Zentrifugationsseparator gepumpt. Die Abflußgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß der Zentrifugenüberstand bei Sichtung durch ein in der Überstandsabflußleitung befindliches Sichtfenster klar war. Der Überstand wurde in einem Abtötungstank mit 0,201 einer keimabtötenden 0,1 M Natriumhydroxidlösung gesammelt und danach verworfen. Die Zellen wurden in 40 l Puffer A (50 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 5 mM Benzamidin, 2 mM Dithiothreitol, pH 6,3 mit 5 N Natriumhydroxid) resuspendiert und im Feststoffaufnahmegefäß auf 8°C vorgekühlt. Die suspendierten Zellen wurden dann über den Homogenisator, der auf einen Arbeitsdruck von 600 bar eingestellt war, in den Rolltank zurückgeführt. Das erhaltene Homogenisat (60 l) wurde auf < 20°C gekühlt und bezüglich Polythenimin durch Zugabe von 2,5 l einer 10%igen (v/v) Lösung auf 0,5% eingestellt. Man ließ die Suspension 10 Min. ausflocken, bevor sie über den Zentrifugationsseparator in den Haltetank übertragen wurde. Der klare Überstand wurde dann durch Reinigung durch einen Tiefenfilter und einen positiv geladenen 0,2 μ-Membranfilter hindurch sterilisiert.
Der sterile geklärte Überstand wurde unter Verwendung einer Querstromfiltrationsvorrichtung mit spiralenförmiger Tusche auf ein Volumen von 12 l eingeengt und die Lösung durch Zugabe von 2,9 kg fester Ammoniumsulfatkristalle auf 40% Sättigung gebracht. Man ließ die Lösung über Nacht unter leichtem Rührem bei 15°C ausflocken und zentrifugierte sie dann mit der Durchflußzentrifuge. Die abgeschiedene Aufschlämmung wurde bei 70°C gelagert, bis sie für die weitere Verarbeitung benötigt wurde.
Der Ammoniumsulfatniederschlag wurde in Gegenwart von 14 l Puffer B (50 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreitol, pH 6,3 mit 5 N Natriumhydroxid) aufgetaut. Nach 30 Min. wurde die Suspension durch Zentrifugation geklärt und durch Diafiltration gegen 70 l Puffer B entsalzt, und die Leitfähigkeit wurde dahingehend überprüft, daß sie auf einen Wert unterhalb von 3 mS/cm reduziert worden war. Die entsalzte Lösung wurde durch Zentrifugation weiter geklärt und sofort verarbeitet.
Die entsalzte Lösung wurde langsam in einen Batch-Chromatographie-Tank mit 2 kg DEAE-Cellulose, die mit 60 l Puffer B equilibriert worden war, gegeben. Nach 6,5stündigem Rühren wurde die Lösung mit ungebundenem R-Ricin vom Tanksumpf durch eine 10-cm-Säule (Durchmesser: 11,3 cm) aus gepackter und equilibrierter DEAE-Cellulose mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/Min. gepumpt. Der Großteil des R-Ricin A wurde nicht gebunden und in einem Edelstahlgefäß gesammelt.
Die R-Ricin-A-Lösung wurde mit 1 M Orthophosphonsäure auf pH 5,5 eingestellt und auf eine 10-cm-Säule (Durchmesser: 10 cm) aus Carbosymethyl-Agarose, die mit 10 l Puffer C (25 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreitol, pH 5,5 mit 5 N Natriumhydroxid) equilibriert worden war, aufgetragen. Das an diese Säule gebundene R-Ricin A wurde nach Waschen mit 10 l Puffer C mit Puffer D (25 mM Natriumdihydrogenorthophosphat, 5 mM Ethyldiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreitol, 100 mM Natriumchlorid, pH 5,5 mit 5 N Natriumhydroxid) eluiert. Das reine R-Ricin A eluierte in Form eines einzigen Spitzenwerts, der gesammelt und als sterile Lösung bei 4°C gelagert wurde, bis diese für die weitere Verarbeitung benötigt wurde. Unter diesen Bedingungen ist R-Ricin A bis zu 2 Monaten stabil.
SEQUENZPROTOKOLL
Im folgenden sind die Sequenzen, auf die in der Anmeldung Bezug genommen wird, aufgeführt. Die Sequenzen sind im herkömmlichen 5'-nach-3'-Sinn dargestellt.

Claims

Vektor, enthaltend einen aus den tetA- und tetR-Genen bestehenden induzierbaren Selektionsmarker, einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Transkriptionsterminationssequenz, die cer-Sequenz sowie eine für ein heterologes Polypeptid codierende DNA-Sequenz.
Vektor nach Anspruch 1, wobei der Transkriptionsterminator so wie am Terminus von Gen 32 des Bakteriophagen T4 vorgefunden vorliegt.
Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Promotor ausgewählt ist aus dem trp-Promotor und dem T7A3-Promotor.
Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das heterologe Polypeptid ausgewählt ist aus Ricin A, G-CSF und G-CSF-Analogen mit der Fähigkeit zur Stimulierung der Granulozytenproduktion.
Bakterienwirt, der zur Expression eines heterologen Polypeptids fähig ist und einen Vektor nach einem der Ansprüche 1–4 enthält.
Bakterienwirt nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Bakterienwirt um E. coli handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Bakterienwirts mit der in Anspruch 5 angegebenen Bedeutung, bei dem ein Bakterienwirt durch Insertion eines Vektors nach einem der Ansprüche 1–4 darein transformiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, bei dem ein Bakterienwirt mit der in Anspruch 5 angegebenen Bedeutung kultiviert wird, so daß Polypeptid exprimiert und dieses Polypeptid aus der Bakterienwirtszellkultur gewonnen wird.
Verwendung eines aus den tetA- und tetR-Genen bestehenden induzierbaren Selektionsmarkers sowie der cer-Sequenz bei der Konstruktion eines Vektors zur Expression eines heterologen Polypeptids in Abwesenheit eines Selektionsmittels.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das heterologe Polypeptid ausgewählt ist aus Ricin A, G-CSF und G-CSF-Analogen mit der Fähigkeit zur Stimulierung der Granulozytenproduktion.