DE3934454A1

DE3934454A1 - Regulierbare expressionsvektoren fuer bacillus

Info

Publication number: DE3934454A1
Application number: DE19893934454
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof Dr Hillen; Manfred Geissendoerfer
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1989-10-14
Filing date: 1989-10-14
Publication date: 1991-04-18

Description

Die Erfindung betrifft neue regulierbare Expressions vektoren, die geeignet sind, um in mit diesen Vektoren transformierten Wirtszellen der Gattung Bacillus eine Überexpression von Proteinen zu induzieren, wobei regu latorische Elemente von adaptierten Genregionen des Tetracyclin- und des Xylose-Operons verwendet werden.

Die Bereitstellung von Expressionsvektoren, mit deren Hilfe Proteine in Mikroorganismen überproduziert und somit einfacher und in hohen Ausbeuten isoliert werden können, ist eine der wichtigsten Anforderungen, die an die Gentechnologie gestellt werden. Da eine gesteigerte Produktion von Proteinen für die Wirtszelle eine Streß situation darstellt und zuweilen sogar toxisch ist, muß versucht werden, die Expression der Fremdproteine während der Wachstumsphase der Zellen zunächst zu repri mieren, um sie dann zu einem späteren geeigneten Zeit punkt wieder zu dereprimieren. Dazu bedarf es einer effektiven Regulation der Gene auf Transkriptions- und/oder Translationsebene.

Für Escherichia coli-Bakterien sind eine Reihe von zum Teil hoch effektiven regulierbaren Promotoren bzw. Regu lationssystemen bekannt, die sowohl chemisch als auch durch Temperaturshift induziert werden können. Allen voran sei hier der P_L-Promotor der Bakteriophagen Lambda genannt, der z. B. in der EP-OS 00 41 767 beschrieben wird.

Eine Übertragung der für E. coli entwickelten zahlreichen Expressionsvektoren bzw. -systeme auf Gram-positive Bak terien der Gattung Bacillus verhindern aber oft stark diskrepante regulatorische Sequenzen. Aufgrund seiner Apathogenität und seiner Fähigkeit Proteine in das Kul turmedium zu sekretieren, erlangt Bacillus aber im zu nehmenden Maße Bedeutung für die industrielle gentech nologische Herstellung pharmazeutisch oder anderweitig verwertbarer Proteine bzw. Enzyme.

Entsprechend Regulationssysteme für Bacillus sind bislang nur wenige und zum Teil nur für spezielle Anwen dungen entwickelt worden. So stellen beispielsweise Yansura und Henner (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81 (1984), S. 439) den Lac-Repressor aus E. coli unter die Kontrolle eines Bacillus-Promotors und erzielen eine induzierbare Interferon-Expression. Mit Hilfe von anderen Vektoren, die auf dem α-Amylase-Promotor und Signalsequenzen aus Bacillus basieren, lassen sich z. B. β-Lactamase (z. B. Ohmura et al., J. Biochem. 95 (1984), S. 87), Protein A (Fahnenstock und Fisher, J. Bacteriol. 165 (1985), S. 796) oder h-Interferon (Palva et al., Gene 22 (1983), S. 229) in Bacillus exprimieren und in das Medium sekretieren.

Leider sind die diesen wenigen bekannten Bacillus-Systemen zugrundeliegenden Expressionsvektoren oft nicht allgemein einsetzbar, oder sie weisen eine für technische Maßstäbe noch ungenügende Effizienz bezüglich Regulierbarkeit und Proteinausbeute auf.

Es bestand somit das Bedürfnis und die Aufgabe, die Palette an neuen gut regulierbaren Expressionsvektoren bzw. -systemen für Bacillus zu erweitern. Diese Vektoren sollen einerseits eine ausreichende Überproduktion von Protein effektiv induzieren, andererseits sollen sie aber auch während der Wachstumsphase der Wirtszellen effektiv reprimiert sein, d. h. die Expression von Fremdprotein muß möglich vollständig unterdrückt werden.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann, wenn zur Transformation in Bacillus-Wirten geeignete Expressionsvektoren konstruiert werden, die adaptierte regulatorische Gensequenzen des aus E. coli stammenden Tetracyclin-Operons und des aus Bacillus stammenden Xylose-Operons enthalten. Besonders effektive Plasmide in bezug auf ihre Dichtigkeit, d. h. der Fähigkeit zur wirksamen Reprimierung der Expression von Protein in der Wachstumsphase, erhält man, wenn in Richtung des das Protein codierenden Strukturgens zwei tet-Operator- Sequenzen eingesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung sind somit regulierbare Expres sionsvektoren, geeignet zur Transformation von Wirtszellen der Gattung Bacillus, enthaltend eine Regulationseinheit und ein beliebiges exprimierbares Sturkturgen, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationseinheit

a) das Tetracyclin Repressor-Gen (tetR),
b) eine an Bacillus adapierte tetR-Promotorsequenz,
c) eine adapierte Xylose-Isomerase-Promotorsequenz (xylP) und
d) mindestens eine tet-Operatorsequenz (tetO) zwischen den Konsensussequenzen von XylP

enthält und die Expression des Strukturgens durch die xylP-Sequenz kontrolliert wird.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche Expres sionsvektoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Regulationseinheit zwei tetO-Sequenzen in Richtung der xylP-Sequenz enthält.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Expressions vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie Plasmide

- mit der Bezeichnung pWH353 und der Hinterlegungsnummer DSM 5555 sowie
- mit der Bezeichnung pHW354 und der Hinterlegungsnummer DSM 5556

sind.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch Transformation und Kultivierung von Zellen der Gattung Bacillus in einem Nährmedium und Isolierung der zur Expression gebrachten Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit Expressionsvektoren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert.

Gegenstand der Erfindung ist letztlich die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zur Überexpression von Proteinen in Wirtszellen der Gattung Bacillus.

Soweit nicht ausdrücklich vermerkt, handelt es sich bei den der Erfindung zugrundeliegenden, unten genannten Metho den um vielbeschriebene Standardverfahren der Gentechnolo gie. Einige von ihnen sind beispielsweise in der EP-OS 02 14 548, EP-OS 02 85 949, EP-OS 02 90 768 oder in der EP-OS 03 07 730 näher erläutert. Eine umfassende Methoden beschreibung ist bei Maniatis et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor, New York (1982)) zu finden. Diese im weiteren in der Regel nicht mehr aus führlich geschilderten Methoden umfassen im wesentlichen: Isolierung von Plasmid-, Phagen- und chromosomaler DNA, Schneiden von DNA-Sequenzen mit bekannten Restriktions nukleasen, Ligation von DNA-Fragmenten zu größeren Ein heiten, Präparation und Isolierung von Plasmiden, radio aktive Markierung, Hybridisierung, Trennung und Nachweis von DNA, Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotiden, DNA- und Aminosäuresequenzierungen, Transformation und Kultivierung von Wirtszellen und Expression und Isolierung von Proteinen.

Soweit nicht anderweitig vermerkt, sind die im Text ge nannten Stämme von Mikroorganismen exemplarisch und können in der Regel durch andere Stämme der gleichen oder ver schiedenen Art ausgetauscht werden. Die zur Ausführung der Erfindung verwendbaren (Ausgangs-)Mikroorganismen sind, soweit sie nicht neu und Gegenstand der vorliegen den Erfindung sind, in der Regel bereits der Öffentlich keit allgemein zugänglich. Sie sind entweder im Handel erhältlich oder bei hierfür autorisierten Hinterlegungs stellen nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.

Der vorliegenden Erfindung dienen als Wirtszellen sowie als Quelle von Signal- bzw. Regulationssequenzen Bakte rien der Gattungen Escherichia und Bacillus und hierbei insbesondere die Arten E. coli und B. subtilis. Bei spiele von verwendbaren Stämen sind E. coli RR1 (z. B. ATCC 31343), B. subtilis BR151 (z. B. ATCC 33677) oder B. subtilis W23 (z. B. ATCC 23059).

Die im Text genannten-Ausgangs-Plasmide bzw. Ausgangs- Vektoren sind durchweg bekannt. Ihre Konstruktion aus isolierten oder synthetisierten DNA-Sequenzen mittels üblicher Standardmethoden ist, sofern im Text nicht näher erläutert, aus den zitierten Literaturstellen zu entnehmen. Prinzipiell können Vektorkonstruktionen mit bekannten DNA-Sequenzen auch durch Nukleotidsynthesen erhalten werden.

Die bevorzugten neuen, erfindungsgemäßen Vektoren sind die Expressionsplasmide mit den Bezeichnungen pWH353 und pWH354 und den Hinterlegungsnummern DSM 5555 und DSM 5556.

Im folgenden sind in einer Übersicht die im erfindungs gemäßen Verfahren konstruierten Vektoren bzw. Plasmide zusammengestellt:

- pWH300: aus pCPP3, BamHI, aufgefüllt;
- pWH331: pWH 300+Polylinker aus pIC20R in EcoRI insertiert;
- pWH332: pWH331, AliI/TaqI-Fragment der Kontroll region der Tn10 kodierten Tetracyclin resistenz in BamHI insertiert, tetA-cat- Fusion;
- pWH333: pWH332, Insertion von tetR aus pWH305
- pWH341: wie pWH331, aber andere Orientierung des Polylinkers;
- pWH343: pWH341, Insertion einer synthetischen tet-Kontrollregion (Oligonukleotid MGX, s. Text);
- pWH346: wie pWH343, Insertion des tetR-Gens aus pWH333;
- pWH350: pWH346, XbaI, BamHI, Oligonukleotid MGXXX (synth. Promotor für tetR) insertiert;
- pWH352: pWH341, XhoI, aufgefüllt, ClaI, ClaI/SmaI- Fragment (MGXXX+tetR-Gen) aus pWH350 insertiert;
- pWH353: pWH352, XhoI, HindIII, Oligonukleotid MGXL (adaptierter xyl-Promotor) insertiert;
- pWH354: pWH353, HindIII, Oligonukleotid mit Sequenz des tetO₁-Operators insertiert;
- pWH355: pWH353, SmaI, PvuII/EcoRI-Fragment aus pWH1256 insertiert, Mutarotase-Gen;
- pWH359: pWH353, SmaI, ClaI/XbaI-Fragment aus pUk54trp201-1 insertiert, pro-Urokinase-Gen.

Die Erfindung wird bevorzugt wie folgt durchgeführt.

Konstruktion des Vektors pWH300

Ausgangsvektor ist das bekannte, vielseitig verwendbare Plasmid pCPP3. Seine Herstellung bzw. Konstruktion ist bei Band et al. (Gene 26 (1983), S. 313) ausführlich beschrieben. pCPP3 enthält unter anderem das cat-Gen sowie jeweils einen Replikationsursprung für E. coli (pBR322) und für B. subtilis (pUB110). Die Vielseitigkeit des Vektors kann nun z. B. durch Insertion des Polylinkers aus pIC20R (Marsh et al., Gene 32 (1984), S. 481) in die EcoRI-Stelle vor dem cat-Gen noch erhöht werden. Vektor konstruktion und die Sequenz des Polylinkers sind in Fig. 1 dargelegt. Um die im Polylinker vorhandene BamHI- Erkennungsstelle für Klonierungen nutzen zu können, wird vorzugsweise die im Vektor bereits vorhandene BamHI-Stelle eliminiert. Dazu wird in an sich bekannter Weise pCPP3 mit BamHI restringiert, die überstehenden 5′-Enden der DNA mit Klenow-DNA-Polymerase und den entsprechenden Nukleotiden aufgefüllt und der durch Phenolisieren auf gereinigte Reaktionsansatz z. B. mit T4-Ligase religiert. Der so entstandene neue Vektor pWH300 kann z. B. durch Transformation von E. coli RR1 kloniert werden.

Konstruktion der Vektoren pWH331 und pWH341

Daraufhin werden pWH300 und pIC20R (zur Gewinnung des Polylinker-Fragmentes) mit EcoRI in üblicher Weise restringiert. Das pWH300-Fragment wird beispielsweise in an sich bekannter Weise durch Polyethylenglykol-Fäl lung aufgereinigt und die DNA anschließend mittels z. B. alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Das Hydrolyse produkt der pIC20R-Verdauung wird z. B. auf einem Poly acrylamidgel aufgetrennt und das 88 bp lange Fragment isoliert. Die so aufgereinigten DNA-Fragmente werden anschließend nach Standardmethoden ligiert. Man erhält die beiden neuen Plasmide pWH331 und pWH341 (Fig. 1), die in transformierten E. coli-Zellen, z. B. E. coli RR1, kloniert werden können. Plasmid pWH331 unterscheidet sich von pWH341 durch die unterschiedliche Orientierung des Polylinkers: in pWH331 liegt die ClaI-Stelle, in pWH341 dagegen die KnpI-Stelle proximal zum cat-Gen (Fig. 1).

Zweckmäßigerweise wird die Bestimmung der Insertion und der Orientierung durch Doppelverdauung mit z. B. ClaI/NcoI durchgeführt. Überraschenderweise wird die dem cat-Gen proximale EcoRI-Stelle in pWH331 während der Klonierung des Polylinkers nicht rekonstruiert. Die Sequenz in diesem Bereich lautet 5′-GATGCGGA-3′ anstelle von 5′-GATGAATTCGGA-3′ bei Rekonstruktion der EcoRI-Schnittstelle. Diese Eliminierung erweist sich erfindungsgemäß als vor teilhaft, da die nun singuläre EcoRI-Stelle in pWH331 für weitere Klonierungsschritte verwendet werden kann.

Konstruktion des Vektors pWH332

In dem neuen Plasmid pWH331 wird nun die Kontrollregion der Tn10 kodierten Tetracyclinresistenz aus E. coli in an sich bekannter Weise insertiert. Die DNA-Sequenz der Tn10 tetRegulationsregion ist bekannt (z. B. Bertrand et al., Gene 23 (1983), S. 149) und ist Bestandteil z. B. des Plasmids pRT29 (Jorgensen u. Reznikoff, J. Bacteriol. 138 (1979), S. 705). Sie ist als 138 bp langes AluI/TaqI- Fragment in Fig. 1 wiedergegeben. Das Fragment enthält zwei tet-Operatoren O₁ und O₂ und drei tet-Promotoren A, R₁ und R₂. Dieses Fragment wird mit dem BamHI hydro lysierten, linearisierten Plasmid pWH331 nach Standard methoden ligiert. Man erhält das neue Plasmid pWH332 (Fig. 3a). Die Insertion und Orientierung wird vorzugsweise durch Restriktionsverdauung mit z. B. XbaI bzw. XbaI/AccI und XbaI/XmnI bestimmt. Die tetA-cat-Fusion ist eine Transkriptionsfusion. Die Sequenzen der Fusionsstellen sind in Fig. 3b wiedergegeben. Plasmid pWH332 kann bei spielsweise wieder in E. coli RR1 kloniert werden.

Konstruktion des Vektors pWH333

Um die Effektivität der Regulation des TetP_A-Promotors zu ermitteln, wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßigerweise das Gen des regulatorischen Proteins in pWH332 insertiert. Man erhält so das Plasmid pWH333 (Fig. 4). Das Plasmid pWH333 enthält die tet-Kontroll region inklusive das tet-Repressorgen, wobei das cat-Gen von tetP_A transkribiert wird. Die Konstruktion von pWH333 erfolgt vorzugsweise durch Ligation der drei Komponenten in üblicher Weise:

- ein aus pWH332 isoliertes 101 bp langes DNA-Fragment, enthaltend die tet-Operatoren und -Promotoren,
- ein aus dem Plasmid pWH305 isoliertes 674 bp langes DNA-Fragment, enthaltend das tet-Repressorgen und
- das Plasmid pWH331.

Zur Isolierung des 101 bp langen DNA-Fragmentes wird pWH332 vorzugsweise mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut, das Hydrolyseprodukt z. B. auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt, das 101 bp lange DNA-Frag ment eluiert und beispielsweise auf einer Cellulose DE-52 chromatographiert. Das Plasmid pWH305 und seine Konstruk tion ist bei Oehmichen et al. (EMBO J. 3 (1984), S. 539) sowie in der EP-OS 03 07 730 hinreichend beschrieben. Die Präparation des 674 bp langen Fragmentes, daß das tet-Repressorgen enthält, erfolgt vorzugsweise durch Hydrolyse von pWH305 mit XbaI und HpaI und Aufreinigung bzw. Isolierung wie für das 101 bp-Fragment beschrieben.

Der Vektor pWH331 wird vorzugsweise mit SmaI und BamHI hydrolysiert und das Hydrolyseprodukt beispielsweise durch eine Polyethylenglykol-Fällung aufgereinigt. Nach erfolgter Ligation in an sich bekannter Weise kann z. B. E. coli RR1 mit pWH332 transformiert werden. Die Klone lassen sich vorzugsweise mit einer BamHI/NcoI Doppelver dauung charakterisieren.

Konstruktion des Vektors pWH343

Da die in pWH 331 insertierte tet-Kontrollregion aus dem Transposon 10 aus E. coli stammt, ist es notwendig, für die Herstellung von Bacillus-Expressionsvektoren die Kontrollregion entsprechend für Bacillus zu adaptieren. Aus diesem Grund wird erfindungsgemäß ein 88 bp langes Obligonukleotid, welches alle Sequenzen der tet-Kontroll region enthält, synthetisiert (Fig. 5). Die Herstellung des hybridisierten Oligonukleotids MGX ist in Beispiel 1 beschrieben. Plasmid pWH341 wird nun vorzugsweise mit BamHI und XbaI restringiert und die DNA nach Standard verfahren aufgereinigt. Anschließend werden das neu sythetisierte Oligonukleotid MGX und der mit BamHI und XbaI restringierte Vektor pWH341 in an sich bekannter Weise ligiert. Man erhält den neuen Vektor pWH343 (Fig. 6), mit dem beispielsweise E. coli RR1 transformiert werden kann. Die Größe der Insertion und die Rekonstruktion der BamHI-Stelle kann z. B. durch eine BamHI/BglII-Doppel verdauung nachgewiesen werden. Plasmid pWH343 enthält somit eine an Bacillus adaptierte tet-Kontrollregion. Ebenso wie die Plasmide pWH332 bzw. pWH333 stellt es eine tetA-cat-Fusion dar.

Konstruktion des Vektors pWH346

Um zu einer kompletten Tet-Regulationseinheit zu gelangen, muß daß tetR-Repressorgen unter die Kontrolle der adap tierten tet-Promotoren in pWH343 gestellt werden. Das tetR-Gen kann beispielsweise aus dem Vektor pWH333 durch Restringierung mit XbaI und BstEII in an sich bekannter Weise isoliert werden. Das 658 bp lange DNA-Fragment wird zweckmäßigerweise nach Auftrennung auf einem üblichen Polyacrylamidgel eluiert und auf einer Cellulose DE-52 chromatographiert. In einem weiteren Schritt wird nun pWH343 mit XbaI und EcoRV restringiert. Auf diese Weise wird ein 48 bp langes Fragment aus dem Polylinker aus pIC20R (Fig. 1) entfernt, wodurch singuläre Schnittstellen erzielt werden. Das so restringierte Plasmid pWH343 wird anschließend in an sich bekannter Weise mit dem das tetR-Gen enthaltenden XbaI/BstEII-Fragment aus pWH333 ligiert. Man erhält so den neuen Vektor pWH346 (Fig. 7), der z. B. wieder in E. coli RR1 kloniert werden kann. Erfindungsgemäß kann die Expression durch zusätzliche Insertion des xyl-Promotors erhöht werden. Der Promotor des xyl-Operons z. B. aus Bacillus subtilis W23 gehört zu den stärksten bekannten Bacillus-Promotoren (Gärtner et al., J. Bacteriol. 170 (1988), S. 3102; Osburne u. Craig, Microbiol. 132 (1986), S. 565). Erfindungsgemäß wird die Regulierbarkeit des xyl-Promotors durch den Tet- Repressor durch Plazierung eines tet-Operators zwischen den beiden Erkennungsregionen der RNA-Polymerase (-10 und -35-Region) bewerkstelligt. Um eine eventuelle Redu zierung der Stärke des xyl-Promotors durch Insertion des tet-Operators zu kompensieren, werden erfindungsgemäß die Sequenzen des Promotors in der genannten Region adap tiert. Ebenso wird die tetR-Promotorregion adapiert.

Die Adaption des xyl-Promotors gelingt durch Synthese und Insertion eines entsprechend veränderten, an der Sequenz des xyl-Promotors orientierten Oligonukleotids (MGXL). Das 64 bp lange Oligonukleotid (MGXXX) enthält den Tet-Operator O₁ im Bereich zwischen -35 und -10 und ist in Fig. 8 dargestellt. Die Adaption der tetR-Promotor region gelingt durch Herstellung und Insertion eines syn thetischen tetR-Promotors. Dieser ist ebenfalls in Fig. 8 dargestellt. Auch er enthält zwischen -10 und -35 einen tet-Operator, wodurch das tetR-Gen unter autogener Kon trolle steht. Die ursprüngliche tet-Kontrollregion des Vektors pWH343, dargestellt durch MGX (Fig. 5 und 7) wird somit letztlich durch MGXXX und MGXL des Vektors pWH353 ersetzt (Fig. 8). Synthese und Hybridisierung der Oligo nukleotide erfolgen analoge Beispiel 1 bzw. nach Standard methoden.

Konstruktion des Vektors pWH350

Plasmid pWH346 wird vorzugsweise mit BamHI und XbaI restringiert. Dadurch wird ein Fragment, daß das Oligo nukleotid MGX enthält, herausgeschnitten. Hydrolysierter Vektor und das neu synthetisierte Oligonukleotid MGXXX werden daraufhin nach Standardmethoden ligiert. Man erhält den neuen Vektor pWH350, mit dem z. B. E. coli RR1 wie üblich transformiert werden kann. In pWH350 steht das tetR-Gen unter Kontrolle des synthetischen, auf MGXXX lokalisierten tetR-Promotors (Fig. 9).

Konstruktion des Vektors pWH352

Das DNA-Fragment, das die Fusion des tetR-Gens an den synthetischen Promotor auf MGXXX enthält, wird beispiels weise aus pWH350 isoliert. Dazu wird in an sich bekannter Weise pWH350 mit SmaI und ClaI restringiert und das Hydro lysegemisch auf einem Agarosegel aufgetrennt. Das 759 bp lange Fragment, enthaltend MGXXX und das tetR-Gen, sowie der mit XhoI restringierte Vektor pWH341 werden nun ligiert. Man erhält Plasmid pWH352 (Fig. 9). Die Re konstruktion der für die folgende Klonierung des Oligo nukleotides MGXL wichtigen XhoI-Erkennungsstelle kann beispielsweise durch eine XhoI/ClaI-Doppelverdauung und Auftrennung der Hydrolyseprodukte auf einem Agarosegel verifiziert werden. Die Klonierung von pWH352 kann wie üblich z. B. in E. coli RR1 erfolgen.

Konstruktion des Vektors pWH353

Nun wird pWH352 vorzugsweise mit XhoI und HindIII restrin giert. Restringierter Vektor und das Oligonukleotid MGXL, auf dem der adaptierte xyl-Promotor plaziert ist, werden nun ligiert. Man erhält den neuen Vektor pWH353 (Fig. 9), der gegebenenfalls z. B. in E. coli RR1 kloniert werden kann. Plasmid pWH353 enthält somit einen synthetisch adaptierten tetR-Promotor, in dessen -10 bis -35-Bereich der tet-Operator O₁ eingeschoben ist und unter dessen Kontrolle das tet-Repressorgen steht, sowie einen synthe tisch adaptierten xyl-Promotor, in dessen -35 bis -10- Bereich ebenfalls ein tet-Operator O₁ insertiert ist und unter dessen Kontrolle das cat-Gen steht.

Konstruktion des Vektors pWH354

Erfindungsgemäß kann bei Bedarf ein zusätzlicher tet- Operator O₁ in pWH353 insertiert werden, um eine optimale Repression des xyl-Promotors zu bewirken. Hierzu wird pWH353 mit HindIII hydrolysiert, und die 5′-überstehenden DNA-Enden werden üblicherweise wie üblich aufgefüllt. Der tet-Operator O₁ (Fig. 2, 5) kann beispielsweise erhalten werden durch Synthese des entsprechenden Oligonukleotids in an sich bekannter Weise.

Dieses DNA-Fragment wird nun in die aufgefüllte HindIII- Stelle von pWH353 nach Standardmethotik insertiert. Man erhält den neuen Vekto pWH354, in dem der Tet-Operator O₁ zwischen dem xyl-Promotor und dem cat-Gen angeordnet ist.

Die erfindungsgemäßen Plasmide pWH353 und pWH354 werden nun in Bacillus, vorzugsweise Bacillus subtilis, bei spielsweise B. subtilis BR151, in an sich bekannter Weise transformiert. Eine mögliche Variante von bekannten B. subtilis-Transformationen ist in Beispiel 3 beschrieben.

Efektivität der Expression und Induzierbarkeit der neuen erfindungsgemäßen Plasmide lassen sich durch Bestimmung der Chloramphenicol-Acetyltransferaseaktivität ermitteln. Der Nachweis der cat-Aktivität erfolgt vorzugsweise aus dem Überstand aufgebrochener und sedimentierter transfor mierter Zellen durch spektralphotometrische Messung (z. B. Shaw, Meth. Enzymol. 43 (1975), S. 737). Die Berechnung der spezifischen Cat-Aktivitäten erfolgt beispielsweise nach Rodriquez u. Tait (aus Recombinant DNA techniques: an introduction (1983), S. 187, Addison-Wesley Publishing Co., Reading, Mass.).

Die Regulation des xyl/tet-Promotors durch den Tet-Repres sor und die damit verbundene Induktion der Cat-Expression erfolgt vorzugsweise durch Zugabe von Tetracyclin oder auch 5a,6-Anhydrotetracyclin zu einem mit dem erfindungs gemäßen Plasmid pWH353 oder pWH354 oder von diesen abgelei teten transformierten Bacillus-Stamm. Die maximale Kon zentration an Tetracyclin bzw. Anhydrotetracyclin, die für die Induktion der Cat-Expression verwendet werden kann, richtet sich nach der durch das Antibiotikum gleich zeitig bewirkten Wachstumsinhibition des betreffenden Bacillus-Stammes. Im allgemeinen wird die Konzentration so gewählt, daß das Wachstum nicht oder nur gering fügig inhibiert wird. Für den Bacillus-Stamm B. subtilis BR151 wird so bevorzugt eine Antibiotikumkonzentration von 0,2 bis 0,5 µg/ml eingesetzt. Der Regulations- und Expressionsfähigkeit des jeweiligen Vektors wird durch Messung der Cat-Aktivität mittels einer Induktionskinetik ermittelt. Der mit dem erfindungsgemäßen Plasmid pWH353 transformierte Wirtsstamm B. subtilis BR151 produziert so zum Zeitpunkt Null (=Zeitpunkt der Zugabe des Antibio tikums) Chloramphenicol-Acetyltransferase lediglich in einer Ausbeute von 90 bis 110 nmol/min×mg, vorzugsweise von 95 bis 100 nmol/min×mg. Nach Zugabe von beispiels weise 0,4 µg/ml Tetracyclin wird nach ca. 2 bis 3 Stunden eine maximale Cat-Aktivität von 12 000 bis 14 000, vor zugsweise von 12 800 bis 13 300 nmol/min×mg gemessen. Dies zeigt, daß der xyl/tet-Promotor sehr gut regulier bar ist. Die relative Induktionsrate (Cat-Aktivität zum Zeitpunkt Null/cat-Aktivität ca. 3 h nach Induktion) ent spricht somit einem Faktor von 100 bis 140. Die maximal erreichbare cat-Aktivität durch pWH353, ist durchaus mit Enzym/Protein-Ausbeuten von anderen bekannten, guten Bacillusexpressionssystemen zu vergleichen. Plasmid pWH353 ist somit ein ausgezeichnet regulierbarer, guter Expressionsvektor für Bacillus-Wirte. Dies gilt insbeson dere im Vergleich mit den nicht adaptierten tetP_A und tetP_R-Promotoren in pWH332, für die in Bacilli nur ge ringe, nicht induzierbare Cat-Aktivitäten nachzuweisen sind. Die Adaption der tetP_A und tetP_R-Promotoren in pWH346 zeigt unter vergleichbaren Bedingungen eine rela tive Induktionsrate von nur etwa 7 bis 8% der Induktions rate von pWH353. Die mit pWH346 gemesseme Cat-Aktivität beträgt nur etwa 30 bis 40% der durch pWH353 erreichbaren Aktivität. Daraus läßt sich die Wirksamkeit des synthe tisch adaptierten xyl-Promotors inklusive der synthetisch adaptierten tetR-Region in dem erfindungsgemäßen Vektor pWH353 gegenüber den adaptierten tetA/tetR-Promotoren in pWH346 demonstrieren.

Die Klonierung eines weiteren tet-Operators (pWH354) führt zu einer vollständigen Repression des Promotors und damit auch zur vollständigen Unterdrückung der Cat-Expression vor Beginn der Induktion durch Tetracyclin oder 5a,6-An hydrotetracyclin. Plasmid pWH354 ist somit optimal repri miert, d. h. eine Expression von (Fremd)-Protein findet ohne Zusatz des Indukts nicht statt. Überraschenderweise läßt sich bei Einsatz von pWH354 feststellen, daß bei Zugabe von 5a,6-Anhydrotetracyclin eine etwa viermal höhere Cat-Akti vität erzielt werden kann als bei Zugabe der gleichen Menge Tetracyclin (z. B. jeweils 0,5 µl/ml). Dies ist aufgrund der besseren Umweltverträglichkeit von Anhydrotetracyclin als vorteilhaft anzusehen. Allerdings bewirkt pWH354 eine geringere Expression des cat-Gens. Die Regulationseinheit des Expressionsvektors pWH354 ist besonders immer dann vorteilhaft einsetzbar, wenn ein Fremdprotein exprimiert werden soll, das hoch toxisch für das Wirtszellenwachstum ist, so daß in der Wachstumsphase der Zellen eine absolute Repression des Promotors erforderlich ist.

Die erfindungsgemäßen, regulierbaren Expressionsvektoren für Bacillus, insbesondere B. subtilis, eignen sich vor züglich zur induzierten Expression von heterologen Struk turgenen bzw. von diesen kodierten (Fremd)-Proteinen. Dabei wird auf einfache und an sich bekannte Weise das entsprechende Strukturgen vorzugsweise zwischen die xyl/tet-Kontrollregion und das cat-Gen insertiert. Als heterologe Strukturgene eignen sich prinzipiell alle solche Gene, die aufgrund ihrer Größe die erfindungs gemäßen Plasmide nicht wesentlich destabilisieren. Als Beispiele socher geeigneten Gene seien, ohne eine be vorzugte Rangfolge angeben zu wollen, jene genannt, die für α-Amylase, β-Lactamase, Mutarotase, Glucosedehydro genase, pro-Urokinase, Proteinase K, Gamma-Interferon, Interleukin 1/2 (Il-1, Il-2), Erythropoietin oder auch für die Kolonie/Makrophagen-stimulierenden Faktoren, (m-csf, g-csf) kodieren. Die Gene bzw. ihre DNA-Sequenzen sind in der Regel bekannt und lassen sich entweder synthe tisieren oder aus bekannten Vektoren isolieren. Sie können dann in die erfindungsgemäßen Plasmide pWH353 oder pWH354 insertiert und in entsprechend transformierten Bacillus- Wirten, insbesondere B. subtilis, nach der hier beschrie benen Methode oder nach Standardverfahren zur induzierten Expressionen gebracht werden. Entsprechende Vektorkonstruk tionen für die Strukturgene von Mutarotase und pro-Uro kinase sind in den Beispielen 9 und 10 bzw. Fig. 10 und 11 aufgezeigt.

In der Beschreibung, in den Beispielen und Figuren werden, sofern dort nicht näher erläutert, folgende Abkürzungen verwendet:

A
Adenin
bp	Basenpaare
B. subtilis	Bacillus subtilis
C	Cytosin
cat	Gen der Chloramphenicolacetyltransferase
DE	Diethylaminoethylcellulose
DNA	Desoxyribonukleinsäure
E. coli	Escherichia coli
G	Guanin
mro	Mutarotase-Gen
neo	Neomycinresistenzgen (aus pHU110)
ori	Replikationsursprung
PEG	Polyethylenglykol
pUK	pro-Uorkinase-Gen
Tn10	Transposon 10
tetR	Gen des Tetracyclin-Repressors
tetO₁/O₂	Tetracyclin-Operator O₁ bzw. O₂
tetP_A	Tetracyclin-Promotor A
tetP_R	Tetracyclin-Promotor R
T	Thymin
SD	Shine-Dalgarno Sequenz
xyl-	Xylose-
MGX, MGXL, MGXXX	synthetische Oligonukleotide

Im folgenden sind die Abbildungen erläutert, in denen einzelne Textbereiche der Erfindung dargestellt sind:

Fig. 1 Polylinker aus pIC20R (oben)
Konstruktionen von pWH300, pWH331 und pWH341 aus dem Vektor pCPP3. Vektor pWH300 entsteht aus pCPP3 durch Eliminierung der BamHI-Stelle. In die EcoRI-Stelle von pWH300 wird der Polylinker insertiert. ori pBR332 (E. coli), ori pUB110 (B. subtilis).

Fig. 2 Kontrollregion der Tn10 kodierten Tetracyclin resistenz aus E. coli.

Fig. 3a Konstruktion von pWH332 aus pWH300. Der schwarze Balken symbolisiert das entspre chende Fragment aus der Tn10 Kontrollregion.

Fig. 3b DNA-Sequenz der Fusionsstelle in pWH332.

Fig. 4 Konstruktion von pWH333.

Fig. 5 Sequenz der adaptierten tet-Kontrollregion (MGX).

Fig. 6 Region zwischen den EcoRI-Erkennungssequenzen des Polylinkers im Vektor pWH343, B=BamHI Bg=BglII, E=EcoRI, H=HindIII, S=SaII, X=XbaI.

Fig. 7 Konstruktion von pWH346.

Fig. 8 Sequenz des adaptierten xyl-Promotors (MGXL) und des adaptierten tetR-Promotors (MGXXX).

Fig. 9 Insertion der Oligonukleotide MGXXX und MGXL in die Vektoren pWH350, pWH352 und pWH353. Alle Plasmide sind Derivate von pWH341. B=BamHI, C=ClaI, E=EcoRI, EV=EcoRV, H=HindIII, N=NdeI, S=SalI, Sp=SpeI, X=XbaI, Xh=XhoI, Sm=SmaI.

Fig. 10 Konstruktion des Vektors pWH355. pWH355 entspricht weitgehend pWH353, enthält aber zusätzlich das Mutarotasegen aus pWH1256.

Fig. 11 Vektor pWH359. pWH359 entspricht pWH353, enthält aber zusätzlich das pro-Urokinasegen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Synthese der adaptierten tet-Kontrollregion MGX

Das 88 bp lange Fragment der tet-Kontrollregion wird in vier Oligonukleotide (MGI-MGIV) von 40-48 bp Länge zerlegt (Fig. 5, gestrichelte Linie). Zur effizienten Hybridisierung und Ligation wird die Aufteilung so gewählt, daß die Oligonukleotide MGII und MGIII eine 8 pb lange, überlappende Sequenz besitzen. Die eigent liche Synthese und Aufreinigung der Syntheseprodukte erfolgt nach Mateucci and Caruthers (J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), S. 3185).

Von den Oligonukleotiden MGII und MGIII werden je 100 pmol in einem Gesamtvolumen von je 10 µl Kinase- Puffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCl ph 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol und 0,1 mM EDTA, mit einem molaren Überschuß von 100 : 1 (ATP: 5′-OH-Gruppen) nach der Me thode von Maniatis et al. (1.c.) phosphoryliert. Die Vollständigkeit der Phosphorylierung wird mittels γ[³²P]-ATP im Verhältnis 1 : 3000 zu ATP überprüft. Dazu wird der Reaktionsansatz 1 : 10 verdünnt mit TE-Puffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA, und je 2 µl werden auf einem 30%igen, denaturierenden (8 M Harnstoff) Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Audio radiogramm wird als Schablone verwendet, um die Banden der phosphorylierten Oligonukleotide und des nicht ein gebauten γ-[³²P]-ATP aus der Gelmatrix auszuschneiden. Die in den jeweiligen Banden vorhandene Cerenkow-Radio aktivität wird bestimmt und ins Verhältnis gesetzt.

Zu den phosphorylierten Oligonukleotiden werden äquimolare Mengen der komplementären, nicht phosphorylierten Oligo nukleotide hinzugeben (MGII+MGI, MGIII+MGIV). Die Mischungen wird 2 Minuten lang bei 80°C erhitzt und anschlie ßend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Hybridisierungen (MGII/MGI und MGIII/MGIV) werden anschließend vereint und bei Raumtemperatur ligiert. Der Reaktionsansatz wird auf einem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die 88 bp lange tet-Kontrollregion (MGX) wird aus der Gelmatrix eluiert und durch DE-52 Chromatographie gereinigt. Man erhält 10 pmol aufgereinigtes MGX.

Beispiel 2 Synthese des adaptierten xyl-Promotors (MGXL) und des adaptierten tetR-Promotors (MGXXX)

MGXXX wird zweckmäßigerweise in die vier Olikonukleotide MGXI bis MGXIV und MGXL in die vier Oligonukleotide MGXV bis MGXVIII (Fig. 8, gestrichelte Linien) mit einer Länge von 35-43 bp zerlegt. Synthese, Aufreinigung und Phosphorylierung erfolgen analog Beispiel 1.

Zu den phosphorylierten Oligonukleotiden werden äquimolare Mengen der komplementären nicht phosphorylierten Oligo nukleotide hinzugegeben (MGXII+MGXI, MGXIII+MGXIV, MGXVI+MGXV, MGXVII+MGXVIII) und 2 Minuten lang bei 90°C er hitzt. Die Mischungen werden auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Hybridisierung MGXII/MGXI werden mit MGXIII/MGXIV und die Hybridisierungen MGXVI/MGXV mit MGXVII/MGXVIII vereinigt und je 3 Stunden lang bei Raumtemperatur ligiert.

Die Ligationsansätze werden auf einem 5%igen Polyacryl amidgel aufgetrennt, die gewünschten Produkte, das 77 bp lange Oligonukleotid MGXXX und das 64 bp lange Oligo nukleotid MGXL, ausgeschnitten, eluiert und durch Chromatographie an DE-52 gereinigt. Von den Intensitäten der Banden auf einem 5%igen, silbergefärbten Polyacryl amidgel werden die Ausbeuten auf 20 pmol MGXXX und 2 pmol MGXL abgeschätzt.

Beispiel 3 Transformation von B. subtilis BR151

Es wird eine Übernachtkultur des Stammes in SP I-Medium (siehe unten) hergestellt. 100 ml SP I-Medium werden mit 3 ml der Übernachtkultur inokuliert und bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase wachsen gelassen. 10 ml der Kultur werden mit 90 ml SP II-Medium (siehe unten) versetzt und 90 min lang inkubiert. Die Zellen werden sedimentiert (5000 rpm, 10 min, 20°C). 10 ml des Über standes werden auf eine Endkonzentration von 10% (v/v) Glycerin eingestellt. Darin werden die Zellen resuspen diert, aliquotiert, in flüssiger Luft tiefgefroren und bei -70°C gelagert. Zur Transformation werden 0,5 ml im Wasserbad bei 37°C schnell aufgetaut, in einem 50 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 2 µg DNA (Plasmid) versetzt und 1 h lang bei 37°C unter leichtem Schütteln (100 rpm) inkubiert. Nach der Zugabe von 5 ml LB-Medium (siehe unten) werden die Zellen bei 37°C unter starkem Schütteln (300 rpm) inkubiert. Anschließend werden je 200 µl des Transformationsansatzes auf TYE-Platten (siehe unten) mit entsprechenden Antibiotika ausgespatelt.

Medien:

SP 4x
8 g/l [NH₄]₂SO₄
56 g/l K₂HPO₄
24 g/l KH₂PO₄
4g/l Trinatriumcitrat · 2 H₂O
0,8 g/l MgSO₄ · 7 H₂O
0,8 g/l CAA
4 g/l Hefeextrakt
mit NaOH auf pH 7,2 einstellen.

SP I
SP 4x auf einfach Konzentration verdünnen. Zugabe von 0,5% (w/v) Glucose, 100 µg/ml Thymin und der erforderlichen Aminosäuren in einer Endkonzentration von 50 µg/ml.

SP II
wie SP I, nur ohne die erforderlichen Amino säuren.

LB
10 g/l Trypton
10 g/l NaCl
5 g/l Hefeextrakt
mit NaOH auf pH 7,3 einstellen.

TYE-Platten
10 g/l Trypton
8 g/l NaCl
5 g/l Hefeextrakt
15 g/l Agar
mit NaOH auf pH 7,3 einstellen.

Beispiel 4 Präparation von Plasmiden aus B. subtilis BR151

4 ml LB-Medium (s. Beispiel 3) mit dem entsprechenden Antibiotikum (Ampicillin 100 mg/l, Kanamycin 25 mg/l oder Chloramphenicol 100 mg/l) werden mit einer einzelnen, zweimal unter selektivem Druck vereinzelten Kolonie inokuliert und 12-15 h lang unter starkem Schütteln (300 rpm) bei 37°C inkubiert. Mit 1 ml dieser Kultur wird 1 l LB-Medium in einem 2 l Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft und wie beschrieben inkubiert. Die in die Sättigung gewachsenen Zellen werden sedimentiert (8000 rpm, 10 min, 4°C), und nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979), S. 1513) einer alkalischen Lyse unterworfen. Die isolierten Nukleinsäuren wurden durch eine Cäsiumchlorid-Gleich gewichtsgradientenzentrifugation aufgereinigt (Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor, New York (1984)). Die Ausbeuten dieser Präpa ration betragen ca. 1 mg Plasmid/l Kultur.

Beispiel 5 Bestimmung der Aktivität von Chloramphenicol-Acetyl transferase

Der Nachweis der Chloramphenicol-Acetyltransferaseakti vität erfolgte durch spektralphotometrische Messung nach Shaw (Meth. Enzymol. 43 (1975), S. 737). Chloramphenicol- Acetyltransferase inaktiviert Chloramphenicol durch Acety lierung. Im Aktivitätstest dient dabei Acetyl-CoA als Acetylgruppen-Donor. Die entstehende freie Sulfhydryl gruppe des HS-CoA reagiert mit der zugesetzten 5,5′-Di thiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB). Es bilden sich ein gemischtes Disulfid aus CoA und Thionitrobenzoesäure und eine äquimolare Menge an freiem 5-Thio-2-nitrobenzoat. Letzteres hat einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13 600 Einheiten bei 412 nm und ist damit einem spektralphotometrischen Nachweis zugänglich.

Die jeweiligen Wirtsorganismen werden mit den zu testen den Plasmiden stets frisch transformiert und unter Selek tionsdruck vereinzelt. Je 4 ml LB (mit 0,2% Glucose und dem entsprechenden Antibiotikum supplementiert, siehe Beispiele 3 und 4) werden mit einzelnen Kolonien inoku liert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. Mit 30 µl der Übernachtkulturen werden je 3 ml LB (supplementiert wie beschrieben) beimpft und bei 37°C unter Schütteln bis OD₄₅₀=1,2 inkubiert. Alle folgenden Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Die Zellen werden durch wiederholte Zentrifugation (13 000 rpm; 1 min) in je einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml Volumeninhalt) sedimentiert. Die Überstände werden entfernt, die Zell sedimente in je 1 ml TDTT-Puffer (siehe unten) resuspen diert und nochmals sedimentiert. Die Zellen werden in 300µl TDTT-Puffer resuspendiert und durch Ultraschall behandlung (5 mm-Sonde, 50 Watt, 2×15 s, mit 45 s Pause, Probe dabei zum Abkühlen im Eisbad) aufgeschlossen. Die Zelltrümmer werden durch 15minütige Zentrifugation (13 000 rpm, 4°C) sedimentiert. Je 200 µl Überstand wer den in neue Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert und bis zur Durchführung des Aktivitätstestes bei -20°C gelagert (bis zu 4 Wochen ohne Aktivitätsverlust möglich).

Für Induktionskinetiken werden 80 ml LB (supplementiert wie oben) in einem 250 ml Schikanekolben mit 800 µl Über nachtkultur inokuliert und bis OD₄₅₀=1,2 angezogen.

Um eine exakte Konzentration des Induktors einstellen zu können, werden dann 60 ml der Kulturbrühe mit einer 25 ml Pipette in einen neuen Schikanekolben überführt und mit der entsprechenden Menge Induktor (Tetracyclin oder 5a,6-Anhydrotetracyclin) induziert. Zu den relevanten Zeitpunkten werden jeweils 4 ml Probe entnommen und die optische Dichte bei 450 nm bestimmt. Um die gleiche Zelldichte beim Ultraschallaufschluß zu gewährleisten, wird das Volumen bestimmt, das 3 ml einer Kultur von OD₄₅₀=1,2 entspricht, und das entsprechende Volumen Zellen sedimentiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie oben beschrieben. Aktivitätstest, Aktivitätsbestim mung, Proteinbestimmung und Berechnung der spezifischen Aktivität erfolgen nach Rodriquez und Tait (l.c.)

TDTT
50 mM Tris-HCl, pH 7,8
30 µM DL-dithiothreitol

Beispiel 6 Bestimmung der Aktivität von Mutarotase

Die Anzucht der auf Mutarotaseaktivität zu untersuchenden Stämme erfolgt im 80-m-Maßstab analog Beispiel 5.

Zu den zu untersuchenden Zeitpunkten vor bzw. nach der Induktion werden je 2 ml Probe entnommen. 1 ml wird für die Bestimmung der optischen Dichte bei 450 nm verwendet, die Zellen aus dem zweiten Volumenteil von 1 ml werden sedimentiert (13 000 rpm; 1 min). 900 µl werden abpipet tiert und für die Aktivitätsmessung des Überstandes verwendet. Der restliche Überstand wird abgezogen und verworfen.

Bacillus subtilis-Zellen werden in 50 µl Lysozymlösung (20 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert und 15 min im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Die Protoplasten werden anschließend durch Sonifikation bei 4°C (5 mm Sonde, 50 Watt, 5×15 s, mit je 45 s Pause, Probe dabei zum Abkühlen im Eisbad) aufgeschlossen.

Der Aktivtiätstest wird spektralphotometrisch, wie z. B. in der EP-OS-02 14 548 beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 7 Bestimmung der Aktivität von pro-Urokinase

Der hier beschriebene Test ist ein Plattentest. Es werden Fibrinplatten und die Methodik nach Ploug und Kjeldgaard (Biochem. Biophys. Acta 24 (1957), S. 278) verwendet. In diese Platten werden Löcher von 2 mm Durchmessser gestanzt und je 5 µl der entsprechenden Proben hineinpipettiert. Die Aktivität von vorhandener pro-Urokinase bewirkt ein Aufklaren der ansonsten trüben Platten in Form von Höfen um die aufgebrachte Probe.

Anzucht und Aufschluß der Zellen erfolgt wie in Beispiel 5 beschrieben.

Zur Gewinnung der nativen Konformation der pro-Urokinase, die in den Zellen nicht vorliegt, wird mit den Rohlysaten und Überständen vor der Durchführung des Aktivitätstestes ein De- und anschließender Renaturierungsschritt durchge führt.

Dazu werden 50 µl Rohlysat bzw. Überstand mit 10 µl 7 M Guanidinhydrochlorid versetzt und 60 min bei Raumtempe ratur inkubiert. Nach Zugabe von 500 µl,Tris-HCl (0,5 M, pH 9,) und 10 µl Glutathion-Reagenz (43,6 mg/ml red. Glutathion, 8,69 mg/ml ox. Glutathion in dd H₂O) wird die Suspension erneut 60 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf die Platten aufgetragen.

Als Standard werden 3,5, 0,35 und 0,035 U pro-Urokinase aufgetropft. Die Platten werden bei 25°C inkubiert, die Auswertung erfolgt nach 20-25 h.

Beispiel 8 Isolierung des Mutarotasegens

Das Mutarotasegen aus Acinetobacter calcoaceticus ist z. B. aus der EP-OS-03 07 730 bekannt. Es ist dort im Expressionsvektor pWH256 insertiert (Fig. 10). Zur Isolierung verwendet man vorzugsweise die PvuII-Stelle am 3′-Ende sowie die EcoRI-Stelle am 5′-Ende des Gens. Da sich aber im Mutarotasegen eine zweite Erkennungs sequenz für EcoRI befindet, wird eine partielle EcoRI- Restriktion durchgeführt. Zunächst werden 45 µg pWH1256 mit PvuII restringiert und die Vollständigkeit der Hydro lyse auf einem 1%igen Agarosegel kontrolliert. Mit je 10 µg der linearisierten Plasmide werden analytische EcoRI-Verdauungen durchgeführt. Es wird 1/25 der EcoRI- Einheiten, die zu einer vollständigen Verdauung in 1 h notwendig sind, eingesetzt und es werden für die Dauer einer Stunde im 5-Minuten Abstand Proben entnommen. Die Hydrolyseprodukte werden auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und die Bandenintensität des gewünschten, 1230 bp langen DNA-Fragmentes verfolgt. Die Intensität der 1230 bp-Bande, die aus der partiellen EcoRI-Restriktion von pWH1256/PvuII resultiert, ist zwischen den Zeit punkten 50 und 60 min am intensivsten. Der präparative Ansatz mit dem restlichen, durch PvuII linearisierten Plasmid wird mit gleicher Enzymkonzentration für 60 min inkubiert und die Reaktion durch Phenolisierung termi niert. Mit den Verdauungsansätzen wird ein Auffüll reaktion der 5′-überstehenden Enden durchgeführt. Anschließend werden die Hydrolyseprodukte auf einem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, das 1230 bp lange DNA-Fragment aus der Gelmatrix ausgeschnitten, eluiert und durch Chromatographie an DE-52 aufgereinigt. Von einem 5%igen, silbergefärbten Polyacrylamidgel wird die Konzentration des isolierten Fragmentes abgeschätzt.

Beispiel 9 Klonierung des Mutarotasegens in pWH353 und Expression von Mutarotase in B. subtilis BR151

5 µg pWH353 werden mit SmaI restringiert und die 5′-Enden dephosphoryliert.

Je 0,02 pmol Vektor werden mit je 0,035 pmol Fragment aus pWH1256 in einem Gesamtvolumen von 20 µl 2 h lang bei Raumtemperatur ligiert und anschließend E. coli RR1 damit transformiert. Von den insgesamt 45 erhaltenen Trans formanden werden von je 12 nach zweimaliger Vereinzelung auf TYE-Agar mit 25 mg/l Kanamycin DNA-Schnellpräpara tionen angefertigt. Die Analyse der Klone erfolgt durch eine NdeI-Restriktion. Da sich, neben zwei NdeI-Erkennungs sequenzen im Vektor, im Mutarotasegen eine asymmetrische NdeI-Stelle befindet, läßt sich durch diese Hydrolyse die Insertion und Orientierung des Gens in pWH353 nachweisen. Je 4 der 12 untersuchten Klone weisen die Insertion in der richtigen Orientierung auf. Man erhält 300 µg pWH355 (Fig. 10).

Die Transformation B. subtilis BR151 mit pWH355, die Anzucht der Kultur, deren Induktion mit 0,5 µg/ml Tetra cyclin und die Bestimmung der Aktivität von Mutarotase erfolgen analog Beispiel 5 und 6. In B. subtilis BR151 kann eine gut induzierbare Mutarotaseaktivität mit pWH355 nachgewiesen werden. Sie ist allerdings geringer als die Chloramphenicol-Acetyltransferaseaktivität im gleichen Wirt mit pWH353.

Beispiel 10 Insertion des humanen pro-Urokinasegens in pWH353 und Expression in B. subtilis BR151

Die DNA-Sequenz des pro-Urokinasegens ist bekannt. Das Gen ist z. B. aus Plasmiden isolierbar, die in der EP-OS 00 92 182 beschrieben sind, so beispielsweise der Vektor pUK54trp207-1.

Aus diesem Vektor (3 µg) wird durch Verdauung z. B. mit XbaI/ClaI und Auffüllen der 5′-überstehenden Enden das Urokinasegen herausgeschnitten und in pWH353 insertiert. Dazu wird der Reaktionsansatz durch die PEG-Fällung gereinigt und 0,08 pmol davon 0,01 pmol des mit SmaI hydrolysierten Vektors pWH353 (Beispiel 9) in einem Gesamtvolumen von 20 µl 17 Stunden lang bei 14°C ligiert. E. coli RR1 wird mit dem Ligationsansatz transformiert. Durch Restriktionsanalyse mit EcoRI wird die Insertion und die Orientierung des Fragmentes festgestellt. Man erhält 1,1 mg pWH359 (Fig. 11).

B. subtilis BR151 wird analog Beispiel 3 mit pWH359 transformiert. Die pro-Urokinaseaktivitäten werden im renaturierten Rohlysat gemessen (Beispiel 7). Der plasmid lose Stamm B. subtilis BR151 exprimiert keine pro-Uro kinaseaktivität. Vektor pWH359 ist vor der Induktion mit 0,5 µg/ml Tetracyclin nahezu vollständig reprimiert, d. h. es ist praktisch keine pro-Urokinaseaktivität nachweis bar. Etwa ein bis zwei Stunden nach erfolgter Induktion erreichte der mit pWH359 transformierte Stamm B. subtilis BR151 eine Expression von pro-Urokinase von 200 bis 400 Units/ml. Dies entspricht etwa 2 bis 4 mg Protein/l Kultur.

Beispiel 11 Induktionskinetiken des adaptierten xyl-Promotors in pWH353 und pWH354

B. subtilis BR151 wird jeweils mit pWH353 und pWH354 analog Beispiel 3 transformiert.

Die Aktivitäten der Chloramphenicol-Acetyltransferase werden analog Beispiel 7 gemessen und berechnet. Als Induktor wird jeweils 0,5 µg/ml Tetracyclin bzw. 5a,6- Anhydrotetracyclin eingesetzt. Die Aktivitäten werden in mmol/min · mg angegeben (spezif. Aktivität). Der Zeitpunkt der Zugabe des jeweiligen Induktors ist per Definition Null. Zum Vergleich sind die Aktivitäten in mit pWH346 transformierten B. subtilis BR151-Zellen angegeben. Vektor pWH346 enthält keinen xyl-Promotor.

Claims

1. Regulierbare Expressionsvektoren, geeignet zur Trans formation von Wirtszellen der Gattung Bacillus, ent haltend eine Regulationseinheit und ein beliebiges exprimierbares Strukturgen, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationseinheit

a) das Tetracyclin-Gen (tetR),
b) eine an Bacillus adaptierte tetR-Promotor sequenz,
c) eine adaptierte Xylose-Isomerase-Promotorsequenz (xylP) und
d) mindestens eine tet-Operatorsequenz (tetO) zwischen den Konsensussequenzen von xylP

enthält, und die Expression des Strukturgens durch die xylP-Sequenz kontrolliert wird.

2. Regulierbare Expressionsvektoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulationseinheit zwei tetO-Sequenzen in Richtung der xylP-Sequenz enthält.

3. Regulierbare Expressionsvektoren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine tetO-Sequenz zwischen der xylP-Sequenz und dem Strukturgen an geordnet ist.

4. Regulierbare Expressionsvektoren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die tetR-Promotorsequenz an Bacillus subtilis adaptiert ist.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß er ein Plasmid mit der Bezeichnung pWH353 und der Hinterlegungsnummer DSM 5555 ist.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß er ein Plasmid mit der Bezeichnung pWH354 und der Hinterlegungsnummer DSM 5556 ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch Trans formation und Kultivierung von Zellen der Gattung Bacillus in einem Nährmedium und Isolierung der zur Expression gebrachten Proteine, dadurch gekennzeich net, daß man die Zellen mit Expressionsvektoren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 trans formiert.

8. Verwendung von Expressionsvektoren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Überexpression von Proteinen in Wirtszellen der Gattung Bacillus.