DE60105728T2

DE60105728T2 - Verfahren zur Klonierung und Herstellung der MseI Restriktionsendonuklease

Info

Publication number: DE60105728T2
Application number: DE60105728T
Authority: DE
Inventors: Romualdas Rockport Vaisvila; Rebecca B. Hamilton Kucera; Elisabeth A. Somerville Raleigh; Richard D. Middleton Morgan; Toby E. Berverly Claus
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: EP1197549A2; US20050158769A1; DE60105728D1; JP2002306186A; US6846658B1; EP1197549B1; JP4825383B2; EP1197549A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Restriktionsendonucleasen gehören zur Klasse von Enzymen mit der Bezeichnung Nucleasen, die einzel- oder doppelsträngige DNA zerlegen oder zerschneiden. Eine Restriktionsendonuclease wirkt, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennt und sich an sie bindet. Nach dem Anbinden spaltet die Endonuclease das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Der Ort der Spaltung kann bei verschiedenen Restriktionsendonucleasen unterschiedlich sein, allerdings ist die Position bei jeder bestimmten Endonuclease festgesetzt. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben eine unterschiedliche Affinität zu Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundert Restriktionsendonucleasen, die einzigartige Spezifitäten erkennen, wurden unter den vielen Tausenden von bisher untersuchten Bakterien- und Archaea-Spezies identifiziert.
Restriktionsendonucleasen werden auf der Basis ihrer Zusammensetzung und Cofaktor-Anforderungen, der Art der Zielsequenz und der Position der DNA-Spaltstelle mit Bezug auf die Zielsequenz klassifiziert (Yuan, R. Ann, Rev. Biochem., 50:285–315 (1981)). Derzeit sind drei verschiedene, gut charakterisierte Klassen von Restriktionsendonucleasen bekannt (I, II, III). Enzyme des Typs I erkennen spezifische Sequenzen, spalten jedoch im Hinblick auf diese Sequenz zufällig. Restriktionsendonucleasen des Typs III erkennen spezifische Sequenzen, spalten an einer definierten Position an einer Seite dieser Sequenz, erreichen jedoch nie einen vollständigen Verdau. Keine dieser beiden Arten von Enzymen ist für den praktischen Gebrauch geeignet.
Restriktionsendonucleasen des Typs II erkennen spezifische Sequenzen (mit einer Länge von 4–8 Nucleotiden) und spalten an einer definierten Position entweder innerhalb oder sehr nahe an dieser Sequenz. Gewöhnlich benötigen sie für ihre Wirkung nur Mg²⁺ Ionen. Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen des Typs II im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in spezifische Fragmente verwendet werden. Aufgrund dieser Eigenschaft ist der Forscher in der Lage, das DNA-Molekül zu manipulieren und die resultierenden Konstruktionen zu analysieren.
Bakterien besitzen gewöhnlich höchstens nur eine geringe Anzahl von Restriktionsendonucleasen pro Isolat. Die Restriktionsendonucleasen werden mit einem aus drei Buchstaben bestehenden Akronym gekennzeichnet, das von dem Namen des Organismus, in dem sie auftreten, hergeleitet wird (Smith and Nathans, J. Mol. Biol. 81:419–423 (1973)). Der erste Buchstabe kommt von der Gattung und der zweite und dritte Buchstabe kommen von der Spezies. Somit synthetisiert ein Stamm der Spezies Deinococcus radiophilus zum Beispiel drei verschiedene Restriktionsendonucleasen des Typs II mit der Bezeichnung DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen TTTAAA, PuGGNCCPy und CACNNNGTG. Escherichia coli RY13 synthetisiert hingegen nur das Typ-II-Restriktionsenzym EcoRI, das die Sequenz GAATTC erkennt (Roberts R.J und Macelis D., Nucl. Acids Res., 28:306–7 (2000)).
Eine zweite Komponente von bakteriellen und archaealen Restriktionssystemen sind die Modifikationsmethylasen (Roberts und Halford, in 'Nucleases', 2nd ed., Linn et al., ed.'s, S. 35–88 (1993)). Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, eindringender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das eine oder andere Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase modifiziert und ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonucleasen empfindlich.
Man geht davon aus, dass Restriktionsendonucleasen des Typs II in der Natur Fremd-DNA wie Virus- und Plasmid-DNA spalten, wenn diese DNA nicht von dem entsprechenden Modifikationsenzym modifiziert wurde (Wilson und Murray, Annu. Rev. Genet. 25:585–627 (1991)). Auf diese Weise werden Zellen vor dem Eindringen von Fremd-DNA geschützt. Folglich ist man allgemein der Ansicht, dass die Entwicklung von Restriktionsmodifikationssystemen des Typs II durch das Bedürfnis der Zelle angetrieben wird, sich selbst vor einer Infektion durch Fremd-DNA zu schützen (Zellabwehrhypothese).
Seit dem Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, die sie kodieren, in größeren Mengen zu produzieren, als es mit konventionellen Reinigungstechniken möglich ist. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb von Genbibliotheken. Eine Schwierigkeit besteht möglicherweise darin, dass einige Restriktionsendonuclease- und Methylasegene aufgrund von Differenzen im Transkriptions- und Translationsmechanismus des Quellorganismus und E. coli nicht in E. coli exprimieren können, wie z.B. Differenzen in Promotor- oder Ribosomenbindungsstellen oder der Codon-Zusammensetzung des Gens. Die Isolierung des Methylasegens setzt voraus, dass die Methylase in E. coli ausreichend exprimiert, um wenigstens einige der das Gen tragenden Plasmide vollständig zu schützen. Die Isolierung der Endonuclease in aktiver Form setzt voraus, dass die Methylase ausreichend exprimiert, um die Wirts-DNA vollständig oder zumindest ausreichend zu schützen, um einen letalen Schaden infolge einer Spaltung durch die Endonuclease abzuwenden. Ein weiteres Hindernis für das Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen beruht in der Entdeckung, dass einige Stämme von E. coli auf eine Cytosin- oder Adenin-Modifikation ungünstig reagieren; sie besitzen Systeme, die DNA zerstören, die methyliertes Cytosin (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070–9074 (1986)) oder methyliertes Adenin enthält (Heitman und Model, J. Bact. 196:3243–3250 (1987); Raleigh, et al., Genetics, 122:279–296, 1989)) Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173:5207–5219 (1991)). Cytosin-spezifische oder Adeninspezifische Methylasegene können nicht ohne weiteres in diese Stämme kloniert werden, weder alleine, noch zusammen mit ihren entsprechenden Endonucleasegenen. Um dieses Problem zu umgehen, müssen Mutantenstämme von E. coli (McrA^- und McrB^- oder Mrr^-) verwendet werden, in denen diese Systeme defekt sind.
Es wurden mehrere Methoden angewendet, um die Restriktionsgene in E. coli zu klonieren:
1) Selektion auf der Basis der Phagenrestriktion
Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophagen-Infektion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178:717–719, (1980)); HhaII: Mann et al., Gene 3:97–112, (1978)); PstI: Walder et al., Proc. Nat Acad. Sci. 78:1503-1507, (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigen, Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand zeigen, umselektives Überleben unter Standardbedingungen zu gewähren.
2) Selektion auf der Basis der Vektormodifikation
Ein zweiter Ansatz, der zum Klonieren einer zunehmenden Zahl von Systemen angewendet wird, schließt die Selektion eines aktiven Methylasegens ein (siehe US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13:6403–6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen möglicherweise nur das Methyltransferasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10:219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20:197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21:111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258:1235–1241 (1983)).
3) Subklonieren natürlicher Plasmide
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRVI: Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7I: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19:355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501–509 (1985)).
4) Mehrstufen-Klonierung
Gelegentlich kann mit dem direkten Methylaseselektionsverfahren aufgrund verschiedener Hindernisse kein Methylase- (und/oder Endonuclease) -Klon hervorgebracht werden (siehe z.B. Lunnen, et al., Gene, 74(1):25–32 (1988)). Ein Hindernis für die Klonierung von Restriktions-Modifikationsgenen besteht möglicherweise darin, dass versucht wird, das Endonucleasegen in einen Wirt einzubringen, der noch nicht durch Modifikation geschützt wurde. Wenn das Methylasegen und das Endonucleasegen zusammen als ein einzelner Klon eingeführt werden, dann muss die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuclease die Gelegenheit erhält, sie zu spalten. Gelegentlich können die Gene daher nur sequentiell kloniert werden, zuerst die Methylase und dann die Endonuclease (siehe U.S. Patent Nr. 5,320,957).
5) Selektion auf der Basis der Induktion der DNA-Schaden induzierbaren SOS-Reaktion
Ein weiteres Verfahren zur Klonierung von Methylaseund Endonucleasegenen beruht auf einem kolorimetrischen Assay hinsichtlich DNA-Schäden (siehe US-Patent Nr. 5,492,823). Beim Screenen nach einer Methylase wird die Plasmidbibliothek in einen empfindlichen E. coli-Wirtsstamm wie AP1-200 transformiert. Durch die Expression einer Methylase wird die SOS-Reaktion in einem E. coli-Stamm ausgelöst, der McrA⁺, McrBC⁺ oder Mrr⁺ ist. Der AP1-200 Stamm ist temperaturempfindlich im Hinblick auf die Mcr und Mrr Systeme und beinhaltet ein lacZ Gen, das mit dem schadeninduzierbaren dinD Locus von E. coli fusioniert ist. Der Nachweis rekombinanter Plasmide, die ein Methylaseoder Endonucleasegen kodieren, basiert auf einer Induktion bei der restriktiven Temperatur des lacZ Gens. Methylasegene kodierende Transformanten werden auf X-Gal-haltigen LB-Agarplatten als blaue Kolonien nachgewiesen (Piekarowicz, et al., Nucleic Acids Res. 19:1831–1835 (1991) und Piekarowicz, et al., J. Bacteriology 173:150–155 (1991)). Der E. coli Stamm ER1992 enthält ebenfalls eine dinD1-LacZ Fusion, ihm fehlen jedoch die methylierungsabhängigen Restriktionssysteme McrA, McrBC und Mrr. In diesem System (mit der Bezeichnung „Endo-Blue"-Verfahren) kann das Endonucleasegen in Abwesenheit seiner zugehörigen Methylase nachgewiesen werden, wenn die Endonuclease die Wirtszell-DNA beschädigt und die SOS-Reaktion auslöst. Die SOS-induzierten Zellen bilden tiefblaue Kolonien auf LB-Agarplatten, die mit X-Gal angereichert sind (Fomenkov, et al. Nucleic Acids Res. 22:2399–2403 (1994) und US-Patent Nr. 5,498,535).
6) Degeneriertes inverses PCR-Verfahren auf der Basis der N-terminalen Sequenz
Es kann vorkommen, dass ein Modifikationsmethyltransferasegen nicht identifiziert werden kann (siehe US-Patent Nr. 5,945,288) oder dass ein Methylasegen identifiziert werden kann, aber das offene Leseraster, das die Restriktionsendonuclease angibt, ungewiss ist. In diesen Fällen kann ein zusätzliches Verfahren zur Identifizierung des Gens für die Endonuclease im Speziellen angewendet werden, wenn die Restriktionsendonuclease in ausreichender Menge und Reinheit von dem ursprünglichen Organismus gereinigt werden kann. In diesem Verfahren wird die Restriktionsendonuclease auf im Wesentlichen Homogenität gereinigt und einer Polypeptidsequenzierung unterzogen. Die erhaltene Polypeptidsequenz wird umgekehrt in DNA-Sequenz translatiert und degenerierte PCR-Primer können entworfen werden, um einen Teil des Endonucleasegens von genomischer DNA des ursprünglichen Organismus oder von einer davon hergestellten Genbibliothek zu amplifizieren. Die DNA-Sequenz der kompletten Gene kann mit Verfahren, die von einer Southern-Blot-Analyse abhängig sind, oder mit weiteren direkten oder inversen PCR-Verfahren erhalten werden. Wenn das zugehörige Methyltransferasegen nicht erhalten oder nicht exprimiert werden kann, dann wird die Stabilität und Nützlichkeit des einzelnen Restriktionsendonucleaseklons gewöhnlich stark gefährdet.
Es kann sein, dass Gene für die Methyltransferase und Restriktionsendonuclease eines speziellen Systems mit den oben beschriebenen Verfahren erhalten werden können, aber trotzdem die Etablierung eines verwendbaren Stammes für die Enzymproduktion problematisch ist. Häufig liegt die Schwierigkeit in der Expression des Methyltransferasegens auf einem geeigneten Niveau. Dies trifft vor allem auf das Verfahren (6) zu. Solche Klone können manchmal durch die Verwendung von heterospezifischen Methyltransferasegenen stabilisiert werden, die nicht mit dem Endonucleasegen im ursprünglichen Wirt verbunden waren, die jedoch die gleiche oder eine verwandte Sequenz erkennen und verhindern, dass die Endonuclease ihre Erkennungssequenz spaltet (siehe US-Patent Nr. 6,048,731).
Es kann vorkommen, dass keine geeignete heterospezifische Methyltransferase verfügbar ist und der Grad an Schutz, der dem Wirt durch die zugehörige Methyltransferase geboten wird, unzureichend ist; oder es kann sein, dass scheinbar angemessene Methyltransferaseniveaus erhalten werden können, die allerdings für die Zelle toxisch sind, so dass sich Stämme ergeben, die nicht gelagert werden können; oder es kann vorkommen, dass der Schutz scheinbar ausreicht und der geschützte Stamm lebensfähig ist, aber die Kombination der Methyltransferase- und Endonucleasegene einen Stamm hervorbringt, der keine nachweisbare Endonuclease exprimiert; oder es kann sein, dass der Schutz scheinbar ausreicht, aber die Kombination der Methyltransferase- und Endonucleasegene einen Stamm hervorbringt, der nachweisbare Endonuclease exprimiert, aber nicht stabil genug ist, um kommerziell nützliche Enzymniveaus zu produzieren.
Man kann sich viele Faktoren vorstellen, die möglicherweise das erforderliche Enzymniveau verändern, das für einen effektiven Schutz der Wirtszelle vor Spaltung durch eine Restriktionsendonuclease notwendig ist. Zu solchen Faktoren gehören ein schnelles Wachstum, währenddessen mehr DNA-Kopien in der Zelle als während der stationären Wachstumsphase vorliegen; die Wiederherstellung von einem Ruhezustand, während der möglicherweise eine neue Synthese der Modifikationsmethyltransferase notwendig ist, bevor eine neue Synthese der Restriktionsendonuclease beginnt; verschiedene Arten von Verarmung, während der Niveaus erforderlicher DNA-Methyltransferase-Cofaktoren wie S-Adenosylmethionin verändert werden können; und spezielle physiologische Zustände, wie DNA-Schäden oder andere physiologische Verletzungen. Darüber hinaus kann das Methyltransferaseniveau möglicherweise zu hoch sein und toxisch werden, indem zum Beispiel an Fremdorte, die mit dem zugehörigen Ort verwandt sind, gebunden wird oder diese methyliert werden, so dass das Lesen der DNA-Sequenz durch regulatorische oder DNA-kondensierende Proteine gestört wird. Folglich muss das absolute Expressionsniveau der Methyltransferase als Reaktion auf Bedingungen über die Lebensdauer einer Kultur möglicherweise fluktuieren, um auf unbestimmte Zeit aufrechterhalten zu werden.
Diese Notwendigkeit eines feinen Kontrollniveaus gibt es nicht nur bei Modifikationsmethyltransferasen. Im Laufe einer Studienzeit von 50 Jahren wurden viele detaillierte Regulationssysteme für verschiedene Funktionsarten beschrieben, wie katabolische und anabolische Gensätze, die Nährstoffe (lac, ara, gal) abbauen oder essentielle Verbindungen (trp, his) synthetisieren, oder eine Reaktion auf Stressoren (DNA-Schaden-Reaktion, Hitzeschockreaktion). Diese Regulationseffekte werden beispielsweise durch Veränderungen der Promotoraktivität (durch Aktivatoren oder Repressoren), der Transkriptstabilität (durch retroregulatorische Elemente), durch eine Veränderung des Translationsniveaus (durch Attenuation oder Translationskopplung) vermittelt. Trotz dieses hohen Grads an Verständnis ist es nicht einfach vorherzusagen, wie sich der Bedarf an einer Funktion mit physiologischen Veränderungen ändert und wie das erwünschte Niveau einer Funktion erreicht wird.
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren von Genen im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Bakterienstämme durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme. im Überfluss synthetisieren. Solche Stämme wären von Nutzen, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen und außerdem das Mittel zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen bereitstellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren zur Klonierung und Expression eines MseI Restriktionsmodifikationsystems angewendet werden, umfassend zunächst das Implementieren eines Verfahrens zur Herstellung eines ausgewogenen Aktivitätsniveaus einer schützenden Modifikationsmethyltransferase, so dass die Expression Änderungen im physiologischen Zustand der Zelle kompensiert und daher einen vollen Schutz, vorzugsweise während aller Wachstumsphasen, vor einer Spaltung durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gewährt; und dann das Einführen des Restriktionsendonucleasegens und Erzielen seiner Expression.
Im Rahmen der Erfindung kann ein Verfahren zur Erzeugung eines ausgewogenen Aktivitätsniveaus einer schützenden Modifikationsmethyltransferase angewendet werden, umfassend das spezifische Testen des Schutzumfangs während kritischer Wachstumsphasen, die ausgewählt sein können aus stationärer Phase, logarithmischer Wachstumsphase, Wiederherstellung von der Lagerung oder anderen Wachstumsphasen, und dann das Identifizieren eines geeigneten Expressionsvektors durch Selektieren im Hinblick auf seine Funktion in diesen kritischen Wachstumsphasen.
Die Erfindung betrifft das Klonieren und Exprimieren des MseI Restriktionsmodifikationssystems, das auf einem DNA-(Desoxyribonucleinsäure)-Fragment kodiert ist, wobei das Fragment zwei verwandte Enzyme kodiert, nämlich ein Enzym, das die DNA-Sequenz 5'-TTAA-3' erkennt und die Phosphodiesterbindung zwischen den T-Resten dieser Erkennungssequenz spaltet, um eine 2 Basen 5' Verlängerung zu erzeugen (Morgan R.D., Nucl. Acids Res., 16:3104 (1988)) (nachfolgend als MseI Restritionsendonuclease bezeichnet), und ein zweites Enzym, bekannt als M.MseI, das die gleiche DNA-Sequenz, 5'-TTAA-3', erkennt, diese Sequenz jedoch durch die Zugabe einer Methylgruppe modifiziert, um eine Spaltung durch die MseI Endonuclease zu verhindern. Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Fragment, einen Vektor mit dem DNA-Fragment, einen transformierten Wirt, der dieses DNA-Fragment enthält, und ein Verfahren zur Herstellung von MseI Restriktionsendonuclease von einem solchen transformierten Wirt bereit.
Erfindungsgemäß produzierte MseI
Restriktionsendonuclease ist im Wesentlichen rein und frei von den Kontaminanten, die gewöhnlich in konventionell hergestellten Restriktionsendonucleasepräparaten zu finden sind.
Das MseI Methylasegen, aber nicht das MseI
Endonucleasegen, wurde im Allgemeinen mit der als Methylaseselektion bezeichneten Technik erhalten (US-Patent Nr. 5,200,333). Allerdings exprimierte keiner der durch Methylaseselektion erhaltenen Klone nachweisbare MseI Restriktionsendonucleaseaktivität und keiner war nach einer Übernachtinkubation völlig vor MseI-Verdau geschützt. Ein Methylaseklon wurde sequenziert und das MseI Methylasegen wurde auf der Basis der Homologie zu anderen N6-Adenin-Methylasen identifiziert. Zwar brachte der Methylaseklon keine nachweisbare MseI Endonucleaseaktivität hervor, doch wurde vermutet, dass das Endonucleasegen wahrscheinlich neben dem Methylasegen lag. An das MseI Methylasegen angrenzende DNA wurde daher von Micrococcus species durch inverse PCR-Techniken amplifiziert und sequenziert.
Zum Lokalisieren und positiven Identifizieren des MseI Endonucleasegens wurde die N-terminale Aminsäuresequenz von hochgereinigtem MseI Restriktionsendonucleaseprotein von Micrococcus species bestimmt. Ein offenes Leseraster, in dem die abgeleitete Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der MseI Endonuclease übereinstimmte, wurde in der durch inverse PCR-Techniken erhaltenen DNA-Sequenz beobachtet und war 3' zum Methylasegen gelegen. Das MseI Methylasegen wurde amplifiziert und in einen Vektor kloniert, der mit einem standardmäßigen starken Expressionsvektor kompatibel war. Das MseI Endonucleasegen wurde dann amplifiziert, mit einem Expressionsvektor wie die pET Serie von Vektoren ligiert und in einen Wirt eingeführt, der zuvor mit der auf einem separaten kompatiblen Vektor getragenen MseI Methylase modifiziert wurde; in den wenigen so erhaltenen Konstrukten wurde jedoch keine MseI Aktivität festgestellt. Anhand der folgenden weiteren Ergebnisse scheint es, dass diese mangelhafte MseI Expression von einer unzureichenden Expression der Methylase, so dass eine erfolgreiche Endonucleaseexpression in einem letalen Ereignis resultierte. Nach dem Erhalten eines völlig modifizierenden Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Expression der Endonuclease auch vorsichtig durch die Konstruktion eines Vektors reguliert, der die Expression der Endonuclease während des Zellwachstums vor der Induktion des Endonucleasegens unterdrückte. Anschließend wurde ein Wirt, der die Endonuclease- und Methylasegene in diesen speziellen Konstrukten trug, wachsen gelassen, induziert und geerntet und zur Herstellung der MseI Endonuclease verwendet.
Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren und Exprimieren des MseI Restriktions-Modifikationssystems umfasst das Erhalten methylasepositiver Klone mit dem Methylaseselektionsverfahren und das Bestimmen der DNA-Sequenz dieser MseI methylasepositiven Klone. Die DNA neben dem Methylasegen wird durch inverse PCR-Techniken erhalten und sequenziert. Das MseI Endonucleaseprotein von Micrococcus species wird auf nahezu Homogenität gereinigt und die N-terminale Aminosäuresequenz wird bestimmt. Das MseI Endonucleasegen wird auf der Basis von DNA-Sequenz- und Aminosäuresequenzdaten ermittelt. Die Expression der MseI Methylase wird moduliert, um einen vollen Schutz des Wirtsgenoms zu erreichen, ohne dass es zu einer so starken Methylaseexpression kommt, dass sie für den Wirt toxisch ist. Dieser Vollmethylierungszustand wird durch Testen von DNA, die von Zellen im schnellen logarithmischen Wachstum erhalten wird, im Hinblick auf einen Schutz vor MseI Endonucleasespaltung und unter Verwendung eines Konstrukts überwacht, das unter diesen schnellen Wachstumsbedingungen völligen Schutz gewährt. Die MseI Endonuclease wird dann durch Amplifizieren des kompletten Gens von genomischer Micrococcus species DNA und Ligieren in einen Expressionsvektor exprimiert, der so gestaltet ist, dass die Expression der MseI Endonuclease während des Zellwachstums vor der Induktion begrenzt wird, wie z.B. pVR-24 (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.). Das Konstrukt wird in einen Wirt mit angemessener genetischer Zusammensetzung eingeführt, um eine ausreichende Regulationskapazität zu erbringen, der zuvor an MseI Orten dadurch modifiziert wird, dass er das auf dem separaten kompatiblen Plasmid exprimierte MseI Methylasegen trägt, das einen vollständigen Schutz vor MseI Spaltung bietet. Die MseI Endonuclease wird durch Wachsenlassen des Wirts, der die MseI Endonuclease- und Methylasegene enthält, Induzieren mit den angemessenen Expressionsbedingungen, Ernten der Zellen und Reinigen der MseI Endonuclease davon erzeugt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pVR-18, das das MseI DNA-Methyltransferasegen kodiert.
1B zeigt die Agarosegelanalyse der Empfänglichkeit für MseI des pVR-18 Plasmids, das M.MseI kodiert. Bahn 1, unzerschnittenes pVR-18; Bahn, pVR-18 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 3, unzerschnittenes pBR322; Bahn 4, pBR322 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 4, pVR-18 + pBR322 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 5, Molekülmassenstandard (1 kb DNA-Leiter, New England Biolabs, Inc.).
2A zeigt eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pEsaDix4I, das das angebliche DNA-Methyltransferasegen kodiert.
2B zeigt die Agarosegelanalyse der Empfänglichkeit für MseI des pEsaDix4I Plasmids, das ein angebliches DNA-Methyltransferasegen kodiert. Bahn 1, unzerschnittenes pEsaDix4I; Bahn 2, pEsaDix4I nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 3, unzerschnittenes pUC19; Bahn 4, pUC19 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 4, pEsaDix4I + pUC19 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten MseI; Bahn 5, Molekülmassenstandard (1 kb DNA-Leiter, New England Biolabs, Inc.).
3A zeigt eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pEsaDix5I, das das angebliche DNA-Methyltransferasegen kodiert.
3B zeigt die Agarosegelanalyse der Empfänglichkeit für MseI des pEsaDix5I Plasmids, das das angebliche DNA-Methyltransferasegen kodiert. Bahn 1, unzerschnittenes pEsaDix5I; Bahn 2, pEsaDix5I nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 3, unzerschnittenes pUC19; Bahn 4, pUC19 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 4, pEsaDix5I + pUC19 nach einer Inkubation über Nacht mit zehn Einheiten von MseI; Bahn 5, Molekülmassenstandard (1 kb DNA Ladder, New England Biolabs, Inc.).
4 zeigt die DNA-Sequenz vom mseIM Gen (SEQ ID NR. 1) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
5 zeigt die DNA-Sequenz vom esaDix4IM Gen (SEQ ID Nr. 3) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
6 zeigt die DNA-Sequenz vom esaDixSIM Gen (SEQ ID Nr. 5) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6).
7 zeigt die DNA-Sequenz vom mseIR Gen (SEQ ID Nr. 7) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8).
8 zeigt eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pNKR1707mseIM, das zur Konstruktion einer Bibliothek konstitutiver Promotoren verwendet wurde, die durch fehlerauslösende PCR zufällig mutagenisiert wurden.
9A zeigt eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pNKR1707mseIM-9, das das MseI DNA-Methyltransferasegen und Upstream-Regulationselemente kodiert.
9B zeigt die DNA-Sequenz stromaufwärts des MseI DNA-Methyltransferasegens (SEQ ID Nr. 9), die eine optimale Promotorsequenz enthält.
10 zeigt die Konstruktion der Plasmide pVR-26 und pVR-27, die zur kontrollierten Expression des MseI DNA Methyltransferasegens verwendet werden.
11 zeigt die Konstruktion des pVR-24 Expressionsvektors.
12A zeigt eine Restriktionskarte von pVR-25, das das MseI Restriktionsendonucleasegen kodiert.
12B zeigt den Aktionsmechanismus des strengen Regulationssystems in pVR-25 zur Klonierung von Genen, die zytotoxische Proteine kodieren.
13 zeigt eine Restriktionskarte von pCEF-8, das T7 Lysozymgen kodiert.
14 zeigt einen Assay der MseI Restriktionsendonucleaseaktivität in Rohzellextrakten aus E. coli Stämmen MseRM4, MseRM5 und MseRM6. Die Wachstumsbedingungen sind im Beispiel IV beschrieben.
15 zeigt einen Assay der MseI Restriktionsendonucleaseaktivität in Rohzellextrakten aus dem E. coli Stamm MseRM4 (NEB Nr. 1284) nach dem Wachstum im 100-Liter-Fermenter.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren zur Herstellung von MseI Restriktionsendonuclease angewendet werden, indem zuerst ein Vektor, der ein Modifikationsmethyltransferasegen exprimiert, das DNA vor Restriktionsenzymspaltung schützt, in einer solchen Form bereitgestellt wird, dass ein kompletter Schutz der Wirts-DNA vorzugsweise in allen Wachstumsphasen beobachtet wird, in denen die zugehörige Restriktionsendonuclease anwesend ist, ohne dass es zur Toxizität kommt (ein völlig schützender Methyltransferasevektor), und anschließend ein Vektor bereitgestellt wird, der das gewünschte Restriktionsendonucleasegen exprimiert.
Der völlig schützende Methyltransferasevektor kann dadurch erhalten werden, dass regulatorische Elemente identifiziert werden, die die Methyltransferaseexpression bewirken können, um völligen Schutz während einer Wachstumsphase zu gewähren, die gegenüber dem Methyltransferaseexpressionsmuster besonders empfindlich ist. Dies kann anhand der folgenden Schritte erfolgen:

(1) Erhalten eines Methyltransferasegens in einem Vektor durch in der Technik bekannte Verfahren;
(2) Platzieren eines regulatorischen Elements, das ein Promotor ist, an einem geeigneten Ort im Hinblick auf das Gen;
(3) Transformieren in die gewünschte Wirtszelle;
(4) Reisolieren des Vektors von den gepoolten Transformanten, während sie in der logarithmischen Wachstumsphase sind;
(5) Selektieren durch Verdau mit der Endonuclease; und
(6) Retransformieren der überlebenden unverdauten und somit geschützten Vektorpopulation in einen frischen Wirt.

Die fachkundige Person wird verstehen, dass Schritt (4) dieses Verfahrens mit gepooltem Vektor durchgeführt werden kann, der von der logarithmischen Phase oder von verschiedenen anderen Wachstumsphasen isoliert wurde, zum Beispiel von der stationären Phase, von einem Ruhezustand, der durch Kohlenstoff- oder Stickstoffverarmung oder Verarmung eines anderen essentiellen Nährstoffs erreicht wurde, oder von Zellen in einem speziellen physiologischen Zustand, wie einem DNA-Schaden-Zustand, oder in Anwesenheit physiologischer Verletzungen wie saure Medien oder toxische Verbindungen, je nach Bedarf.
Der Promotor aus Schritt (2) wird durch ein Verfahren ermittelt, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Klonieren eines Pools von Fragmenten, die verschiedene getrennte Promotoren enthalten, in den Vektor, der das Methyltransferasegen enthält, an einem gewünschten Ort; und
(b) Fortfahren mit den Schritten (3) bis (6).

Die fachkundige Person wird ferner verstehen, dass das Selektionsverfahren aus den Schritten (3) bis (6) wiederholt werden kann, um eine weitere Verbesserung zu selektieren.
Die fachkundige Person wird ferner verstehen, dass Schritt (2a) – Klonieren eines Pools von Fragmenten mit Promotoren am gleichen oder einem anderen Ort – wiederholt werden kann, wonach bei Bedarf die Selektion wiederholt werden kann.
Das Methyltransferasegen aus Schritt (1) wird durch das Methylaseselektionsverfahren (US-Patent Nr. 5,200,333) isoliert. Das angewendete Verfahren ist nicht auf in dieser Weise isolierte Methyltransferasegene begrenzt, sondern beinhaltet Gene, die durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren isoliert werden, wie Phagenselektion, Subklonierung natürlicher Plasmide, Identifizierung auf der Basis der Induktion der DNA-Schaden induzierbaren SOS-Reaktion, durch inverse PCR auf der Basis der Aminosäuresequenz eines gereinigten Proteins oder Identifizierung in Sequenzdatenbanken von Ähnlichkeiten mit Sequenzen anderer Methyltransferasen, gefolgt von einer Klonierung durch PCR oder durch Verfahren auf Southern-Blot-Basis (siehe z.B. Kong, et al., Nucleic Acids Res. 28:3216–3223 (2000)).
Die Sammlung getrennter Promotoren aus Schritt (2a) umfasst Kopien des his Promotors von S. typhimurium, der durch fehlerauslösende PCR zufällig mutagenisiert ist, sowie solche kontaminierenden Chromosomenfragmente, die bei der Präparation mutagenisierter Fragmente anwesend sein können. Das angewendete Verfahren ist nicht auf in dieser Weise erhaltene Fragmente begrenzt, sondern kann Sammlungen von Fragmenten beinhalten, die von genomischer DNA von E.
coli oder einem anderen Organismus isoliert werden, oder Fragmente, die von der Oligonucleotidsynthese mit degenerierten Sequenzen an zufälligen oder spezifischen Orten abgeleitet werden, oder Fragmente, die durch Rekombinations-PCR einer zufälligen oder spezifischen Sammlung von Fragmenten abgeleitet werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der so erhaltene Promotor die Sequenz von SEQ ID Nr. 9.
Die vorliegende Erfindung kann die Bereitstellung eines erwünschten Restriktionsendonucleasegens beinhalten, das von einem Vektor mit strenger Regulation exprimiert wird, so dass ohne Induktion äußerst geringe Proteinniveaus exprimiert werden (es wird eine sehr geringe Grundexpression beobachtet). In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst dieser strenge Regulationsvektor einen Vektor mit antagonistischen und unabhängig regulierbaren Promotoren, die durch das klonierte Zielgen hindurch lesen, wie in der WO 99/11821 beschrieben, allerdings wird die Grundexpression weiter verringert, indem eine geringere Kopiezahl als in dem zuvor existierenden Vektor pLT7K vorgesehen wird, der für diesen Zweck verwendet wurde. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Kopiezahl des Vektors dadurch verringert, dass der Replikationsstartpunkt von pLT7K gegen den von pACYCl84 ausgetauscht wird. Es können auch andere Replikationsstartpunkte verwendet werden, wie solche von pSC101 (Stoker, et al., Gene 18:335–341 (1982)), pSYX20 (US-Patent Nr. 5,262,313), F (Shizuya, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(18):8794–8797 (1992)) oder anderer Vektoren niedriger Kopiezahl (Harayama, et al., Mol. Gen. Genet. 184:52–55 (1981) und Wohlfarth, et al., J. Gen. Microbiol. 134:433–440 (1988)). In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der Vektor pVR-24.
Eine weitere Verringerung des Grundexpressionsniveaus wird durch die Verwendung eines Stammes erreicht, der ein hohes Niveau des negativen Expressionsregulators in die Richtung exprimiert, die eine Translation des Targetgens zulässt.
Das oben beschriebene Verfahren wird in der vorliegenden Erfindung exemplifiziert, und zwar die Klonierung und Expression des MseI Restriktions-Modifikationssystems.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem neuartige DNA-Konstrukte und neuartige Zusammensetzungen bereit, die Mikrobenstämme umfassen, die MseI Restriktionsendonuclease produzieren. Die in der vorliegenden Erfindung interessante Restriktionsendonuclease MseI erkennt die DNA-Sequenz 5'-TTAA-3' und spaltet die Phosphodiesterbindung zwischen den T-Resten dieser Erkennungssequenz, um eine 2 Basen 5' Verlängerung zu erzeugen.
Zum Überexprimieren der MseI Restriktionsendonuclease sind zusätzliche Schritte über die allgemein bekannte Technik des Methylaseselektionsverfahrens (US-Patent Nr. 5,200,333) hinaus erforderlich, einschließlich insbesondere die Feinabstimmung der MseI Methyltransferaseexpression, um die genomische Wirts-DNA völlig vor MseI Verdau in vivo zu schützen, wohingegen aber nicht so viel Methyltransferase erzeugt wird, dass sie für den Wirt toxisch ist. Ein Vektor, der das mseIM Gen enthält, das für eine Expression optimiert ist, so dass ein voller Schutz vor MseI Endonuclease selbst während eines sehr schnellen (logarithmisches Stadium des) Zellwachstums beobachtet wird, wird zunächst zum Modifizieren eines E. coli Wirts verwendet. Dieser Wirt wird dann mit einem kompatiblen Vektor wie pVR-25 transformiert, der das mseIR Gen enthält, gefolgt von der Selektion im Hinblick auf Kolonien, die beide Vektoren auf den entsprechenden Antibiotikaplatten enthalten. MseI Endonuclease produzierende Konstrukte werden durch Wachsenlassen individueller Transformanten und Prüfen hinsichtlich MseI Endonucleaseaktivität identifiziert (wie im Beispiel V unten).
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das MseI Methylasegen und die MseI Restriktionsendonucleasegene kloniert und exprimiert werden in E. coli, umfasst die folgenden Schritte:
1) Klonieren der DNA-Methyltransferasegene, die vor MseI Spaltung schützen.
Es ist allgemein bekannt, dass Modifikationsmethylasen die gleiche Nucleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease erkennen und sich an diese binden, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das ein oder andere Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im Anschluss an diese Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr gebunden oder gespalten durch die Restriktionsendonuclease. Die DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund ihrer Modifikationsmethylase stets völlig modifiziert und ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert in dieser Situation auf eine Erkennung und einen Angriff durch Restriktionsendonuclease empfindlich. Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, das DNA-Methyltransferasegen zu identifizieren, das vor MseI Spaltung schützt. Um dies zu erreichen, kann die DNA-Methylase von Micrococcus species (NEB446) kloniert werden. Alternativ kann eine DNA-Methyltransferase von einem anderen R-M-System als dem MseI R-M-System, das aber die DNA schützend modifizieren kann, um einen Verdau durch das MseI Restriktionsenzym zu verhindern, wie in dem US-Patent Nr. 5,179,015 beschrieben, identifiziert werden. In der vorliegenden Erfindung wurden drei DNA-Methylasen ermittelt, die die DNA vor einem Verdau durch das MseI Restriktionsenzym schützen können.
Zunächst wurde die gesamte genomische DNA von Micrococcus species (NEB Nr. 446) gereinigt. Eine Zufallsbibliothek dieser DNA wurde durch einen teilweisen Verdau der DNA mit einer häufig schneidenden Endonuclease, Sau3AI, konstruiert, um Fragmente mit einer Länge von etwa 1 bis 10 Kilobasen (kb) zu produzieren. Diese Fragmente wurden in den Vektor pBR322 ligiert, der zuvor mit BamHI gespalten und dephosphoryliert wurde. Die Ligationsreaktion wurde in chemisch kompetente E. coli ER2502 Zellen transformiert. Die Transformanten wurden gepoolt und das Plasmid wurde populationsgereinigt, um die Primärplasmidbibliothek zu bilden. Ein aliquoter Teil dieser gereinigten Plasmide wurde mit MseI Restriktionsendonuclease verdaut, um alle Plasmide zu zerstören, die das MseI Methylasegen in vivo nicht exprimiert hatten und somit die Plasmid-DNA nicht vor Verdau schützten. Der verdaute Plasmidpool wurde wieder in E. coli ER2502 transformiert, um die intakten, MseI Methylase exprimierenden Plasmide zu gewinnen. Individuelle Klone wurden aufgenommen, die Plasmid-DNA wurde gereinigt und durch Spaltung mit MseI Endonuclease behandelt. Plasmide, die nicht durch MseI zerschnitten wurden, enthielten das MseI Methyltransferasegen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Methyltransferasegen ein solches, das vor der von Micrococcus species (NEB Nr. 446) erhältlichen Restriktionsendonuclease MseI schützt, und kann aus dem Satz Sequenzen ausgewählt werden, die Proteine kodieren können, die in der SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 7 angegeben sind. Diese Proteine können zum Beispiel durch solche DNA-Sequenzen kodiert werden, die in der SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 dargelegt sind.
Zur Suche nach alternativen DNA-Methyltransferasen, die DNA vor einer Spaltung durch MseI Endonuclease schützen können, kann eine Bibliothek von Klonen von einer anderen DNA-Quelle als Micrococcus species in einem Vektor konstruiert werden, der einen oder mehrere MseI Restriktionsort e) enthält. Diese Bibliothek von Klonen wird dann in einer oder mehreren Runden des MseI Verdaus selektiert, um nicht schützende Klone zu zerstören, wonach die verdauten Plasmide transformiert werden, um geschützte Klone zu gewinnen. Eine solche Bibliothek wurde von DNA (mit der Bezeichnung „Umwelt-DNA") erzeugt, die von einer Probe einer gemischten Grünfilament- und Mattengemeinschaft von Prokaryoten isoliert wurde, die bei 68°C in Dixie Valley Hot Spring, Nevada wuchsen. Gereinigte Umwelt-DNA wurde mit NsiI Endonuclease verdaut und in den Vektor pNEB193 ligiert, der zuvor mit PstI Restriktionsendonuclease gespalten und dephosphoryliert wurde. Die Ligationsreaktion wurde in E. coli ER2683 durch Elektroporation transformiert. Die Transformanten wurden gepoolt und die Plasmidpopulation wurde gereinigt, um die Primärplasmidbibliothek zu bilden. Ein aliquoter Teil dieser gereinigten Plasmide wurde vollständig mit einem Überschuss an MseI Restriktionsendonuclease verdaut und zum Transformieren von ER2683 verwendet. Plasmide der resultierenden Transformanten wurden mit dem Miniprep-Verfahren behandelt und durch MseI Restriktionsenzymverdau und anschließende Agarosegelelektrophorese analysiert. Neun untersuchte Plasmide erwiesen sich gegenüber MseI Verdau resistent, wobei jedes eines von zwei verschiedenen Methylasegenen kodierte, die jeweils die Aufgabe hatten, DNA vor einer Spaltung durch MseI zu schützen. Diese beiden Methylasen hatten die Bezeichnung esaDix4IM (SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4) und esaDix5IM (SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6). Eine Analyse von Rohzellextrakten, die von diesen Klonen präpariert wurden, ergab keine Endonucleaseaktivität. Diese oder andere ähnliche Methyltransferasen können verwendet werden, um die DNA eines Wirts zu schützen und somit eine erfolgreiche Expression der MseI Endonuclease zu ermöglichen.
2) Sequenzbestimmung des gesamten MseI Restriktions-Modifikationssystems
Das MseI Methylasegen, aber nicht das MseI Endonucleasegen, wurde im Allgemeinen gemäß der Technik, die als Methylaseselektion bezeichnet wird (US-Patent Nr. 5,200,333), wie oben in Schritt 1 erhalten. Allerdings exprimierte keiner der durch Methylaseselektion erhaltenen Klone nachweisbare MseI Restriktionsendonucleaseaktivität. Ein Methylaseklon wurde mit Standardtechniken auf einem ABI 373 DNA-Sequenzierungsgerät sequenziert. Das MseI Methylasegen wurde auf der Basis von Aminosäurehomologie zu anderen N6-Adenin-Methylasen identifiziert. Obwohl der Methylaseklon keine nachweisbare MseI Endonucleaseaktivität produzierte, wurde vermutet, dass das Endonucleasegen wahrscheinlich neben dem Methylasegen lag. An das von Micrococcus species (NEB NR. 446) erhaltene MseI Methylasegen angrenzende DNA wurde daher von genomischer Micrococcus species DNA durch inverse PCR-Techniken amplifiziert und sequenziert.
Zum Lokalisieren und positiven Identifizieren des MseI Endonucleasegens wurde die N-terminale Aminosäuresequenz von hochgereinigtem MseI Restriktionsendonucleaseprotein von Micrococcus species bestimmt. MseI Endonuclease kann von Micrococcus species (NEB Nr. 446) wie im folgenden Beispiel III beschrieben gereinigt werden. Ein offenes Leseraster, in dem die abgeleitete Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der MseI Endonuclease übereinstimmte, wurde in der durch inverse PCR-Techniken erhaltenen DNA-Sequenz beobachtet und war 3' zum Methylasegen gelegen.
Alternativ kann die N-terminate Aminosäuresequenz von MseI Restriktionsendonuclease verwendet werden, um degenerierte Otigonucleotidprimer zur PCR-Amplifikation eines Teils des MseI Endonucleasegens von Micrococcus species (NEB Nr. 446) zu entwerfen. Die erhaltene DNA-Sequenz kann dann zum Lenken der inversen PCR-Amplifikation der DNA auf beiden Seiten dieses ursprünglichen Teils des MseI Endonucleasegens verwendet werden, und die mseIM und MseI Gene können in dieser DNA-Sequenz wie oben identifiziert werden. Beide Verfahren wurden zum Klonieren und Bestimmen der Sequenz des gesamten MseI Restriktionsmodifikationssystems verwendet.
3) Feinoptimierung der MseI Methyltransferaseexpression
Nachdem die kompletten Gene für die MseI Endonuclease und MseI Methyltransferase identifiziert wurden (jeweils SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2), können sie auf verschiedene Weisen für eine Expression manipuliert werden. Unter Verwendung der wie oben erhaltenen Methylasekonstrukte wurde die Expression des MseI Restriktionsendonucleasegens unter T7 Promotorkontrolle mit der pET Serie von Vektoren (Novagen Inc., Madison, WI) intensiv ausprobiert, allerdings brachte sie keinen MseI Restriktionsendonuclease produzierenden Klon hervor.
Eine einzigartige Kombination von Verfahren, einschließlich der Einführung eines zweiten, kontrollierbaren Promotors vor dem Methylasegen, Verwendung eines Replikons geringer Kopiezahl für das Endonucleasegen und Erhöhung der Kopiezahl des LacI Repressors in dem Wirt vor der Einführung des Endonucleasegens, wurde zum Kontrollieren der Überexpression rekombinanter MseI Endonuclease angewendet.
Es wurde beobachtet, dass die durch Methylaseselektion erhaltenen Methylasekonstrukte die chromosomale E. coli Wirts-DNA nicht völlig schützten, wenn die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase schnell wuchsen. Zum Erhöhen der Expression der Methylase und somit völligen Schützen der Wirts-DNA, so dass mseIR erfolgreich in die Zellen eingeführt und exprimiert werden konnte, wurde das Methylasegen von Micrococcus species DNA amplifiziert und in eine Familie von Vektoren (pNK Serie, siehe Beispiel IV unten) unter der Expression konstitutiver Promotoren unterschiedlicher Stärke kloniert. Bei diesem Versuch wurden keine Methylasekonstrukte für die beiden Promotoren mit höchstem Expressionsniveau erhalten, was unserer Ansicht nach in der Toxizität für die Zelle infolge einer zu starken Expression der Methylase begründet ist. Konstrukte mit den beiden Promotoren mit geringerem Expressionsniveau schützten den Wirt nicht völlig vor MseI Spaltung bei einer Prüfung in der logarithmischen Wachstumsphase. Zum Erhöhen der Methylaseexpression, um die Wirts-DNA während eines schnellen Wachstums völlig zu schützen, aber unter dem Toxizitätsniveau zu bleiben, wurde eines der Promotorkonstrukte einer Zufallsmutagenese durch fehlerauslösende PCR in der Promotorregion unterzogen. MseI Methylase exprimierende mutierte Klone wurden mit der oben erwähnten Methylaseselektionstechnik selektiert, und anschließend wurden individuelle Klone im Hinblick auf die Fähigkeit getestet, die genomische Wirts-DNA völlig vor MseI Spaltung während eines schnellen logarithmischen Wachstums zu schützen, indem Zellen während des logarithmischen Wachstums geerntet, DNA von diesen Wirtszellen gereinigt und im Hinblick auf den völligen Schutz vor MseI Spaltung getestet wurden. Eines der gefundenen Konstrukte, das völlig vor MseI schützte, wurde dann für die Expression der MseI Endonuclease verwendet.
4) Expression der MseI Restriktionsendonuclease unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors
Zur Optimierung der Expression von rekombinanter MseI der vorliegenden Erfindung sind induzierbare oder konstitutive Promotoren allgemein bekannt, die verwendet werden können, um hohe Niveaus eines mseIR Gens in einem rekombinanten Wirt zu exprimieren. Ebenso können Vektoren mit hoher Kopiezahl, die in der Technik allgemein bekannt sind, verwendet werden, um ein hohes Expressionsniveau zu erreichen. Es wurde gefunden, dass ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Expression der MseI Restriktionsendonuclease ein Expressionsvektor ist, der so gestaltet ist, dass die Expression der MseI Endonuclease während des Zellwachstums vor der Induktion begrenzt wird, wie z.B. pVR-24 (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.). Dieses Plasmid enthält das Segment, das die replikative Funktion kodiert (ori), ein Chloramphenicol-Resistenzgen (Cm), ein Gen, das Kanamycin-Resistenz kodiert, das durch Restriktionsendonucleaseorte flankiert wird, die zum Klonieren geeignet sind. Das cI857 Gen kodiert eine Mutantenform des Lambda-Bakteriophagen- Repressorproteins, die sich konditionell an DNA-Sequenzen bindet (CI-Operator), die PL und PR überlappen (jeweils die starken linksgerichteten und rechtsgerichteten Lambda-Bakteriophage-Promotoren). Das lacI Gen kodiert ein Repressorprotein, LacI, das sich konditionell an eine DNA-Sequenz bindet (lac-Operator), die so konstruiert ist, dass sie P_T7 überlappt (Bakteriophage-T7-RNA-Polymerase-Transkriptionspromotor). Kurz, bei einer hohen Temperatur (42°C) ohne IPTG ist der Antisense-Promotor aktiv, während P_T7 durch LacI reprimiert wird. Bei 30°C und mit IPTG erfolgt eine Expression von P_T7 (siehe 11 und 12). Bei mittleren Temperaturen und mittleren IPTG-Konzentrationen kann ein mittleres Expressionsniveau erreicht werden.
Zum Erhalten eines stabilen Klons, der die Restriktionsendonuclease überexprimiert, wird der Wirt im Allgemeinen zuvor vor einem Restriktionsendonucleaseverdau geschützt.
Dies wird durch Klonieren des MseI Methylasegens oder eines anderen Methylasegens erreicht, das vor MseI Spaltung schützt, wie esaDix4IM oder esaDix5IM, das auf dem separaten kompatiblen Plasmid in einer Weise exprimiert ist, die einen völligen Schutz vor MseI Spaltung gewährt. Wie in dem folgenden Beispiel V dargestellt ist, wurde gefunden, dass die Stabilität des Expressionsplasmids, das das Restriktionsendonucleasegenkonstrukt und/oder seine mRNA enthielt, verbessert werden konnte, wenn dem MseI Methyltransferasegen ein DNA-Fragment vorausging, das eine neuartige Promotorsequenz kodierte. Die MseI Endonuclease wird durch Wachsenlassen des Wirts, der die MseI Endonuclease und das schützende Methylasegen enthält, Induzieren mit angemessenen Expressionsbedingungen, Ernten der Zellen und Reinigen der MseI Endonuclease davon produziert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung der MseI Restriktionsendonuclease bereit, wobei rekombinante DNA-Modifikationsverfahren zum Transformieren eines Mikroorganismus angewendet werden, so dass das die MseI Restriktionsendonuclease kodierende Gen und ein Gen, das eine DNA-Methyltransferase kodiert, die die Wirts-DNA vor MseI Spaltung schützt, in den genannten Mikroorganismus eingeführt werden, der Organismus unter Bedingungen wachsen gelassen wird, die zur Expression von MseI Endonuclease geeignet sind, geerntet wird und die MseI Endonuclease davon gereinigt wird.
Zwar repräsentieren die oben beschriebenen Schritte die bevorzugte Art und Weise der Umsetzung der vorliegenden Erfindung, doch wird es für die fachkundige Person offensichtlich sein, dass der oben beschriebene Ansatz gemäß in der Technik bekannten Methoden variieren kann.
Anhand der folgenden Beispiele werden derzeit bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung illustriert. Es ist zu verstehen, dass diese Beispiele illustrativ sind und dass die Erfindung nicht als darauf beschränkt anzusehen ist, mit Ausnahme der Angaben in den beiliegenden Ansprüchen.
BEISPIEL I
Klonierunq des MseI Methyltransferasegens (mseIM)
Micrococcus species (NEB Nr. 496) wurde über Nacht in 1 l LB-Nährlösung wachsen gelassen, die Zellen wurden geerntet und genomische DNA wurde mit dem Qiagen Genomictip 100/G Genomic DNA Purification Kit (Cat. Nr. 10234) gemäß Herstelleranweisungen isoliert. Genomische DNA wurde teilweise mit Sau3AI verdaut, um Fragmente von 1 bis 10 kb zu produzieren, und 20 μg dieser gespaltenen genomischen DNA wurden mit 3 μg BamHI-verdautem und desphosphoryliertem pBR322 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in den E. coli Stamm ER2502 transformiert. Es wurden etwa 100.000 Transformanten erhalten. Die Transformanten wurden gepoolt, in 500 ml LB-Nährlösung mit 100 μg/ml Ampicillin wachsen gelassen, und die Plasmidpopulation wurde gereinigt, um die Primärplasmidbibliothek zu bilden. Zwei Mikrogramm dieser Plasmidbibliothek wurden vollständig mit einem Überschuss an MseI Restriktionsendonuclease verdaut und zum Transformieren von ER2505 verwendet. Plasmide der resultierenden Transformanten wurden einer zweiten Selektionsrunde ausgesetzt. Es wurden 80 Transformanten erhalten und von 16 davon wurde die Plasmid-DNA durch MseI Restriktionsenzymverdau und eine anschließende Agarosegelelektrophorese analysiert. Vierzehn von 16 untersuchten Plasmiden erwiesen sich gegenüber einem MseI Verdau resistent und trugen das gleiche mseIM Gen (SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2) auf einem Sau3AI Fragment von etwa 1,6 kb. Eine Analyse von Rohzellextrakten, die von diesen 14 Klonen präpariert wurden, ergab keine MseI Aktivität.
BEISPIEL II
Klonierung von zwei DNA-Methylasen von einer Umwelt-DNA-Probe, die DNA vor einer Spaltung durch MseI Endonuclease schützen
Zum Suchen nach alternativen DNA-Methyltransferasen, die DNA vor einer Spaltung durch MseI Endonuclease schützen können, kann eine Bibliothek von Klonen von einer anderen DNA-Quelle als Micrococcus species (NEB446) in einem Vektor konstruiert werden, der einen oder mehrere MseI Restriktionsort e) enthält. Diese Bibliothek von Klonen wird dann wie oben in einer oder zwei Runden des MseI Verdaus selektiert, um nicht schützende Klone zu zerstören, woraufhin eine Transformation der verdauten Plasmide folgt, um geschützte Klone wie im 1. Beispiel oben zu gewinnen. Eine solche Bibliothek wurde von DNA erzeugt, die von einer Probe einer Grünfilament- und Mattengemeinschaft von Prokaryoten isoliert wurde, die bei 68°C in Dixie Valley Hot Spring, Nevada wuchsen. Zwei Mikrogramm der DNA wurden mit NsiI Endonuclease verdaut und in 1 Mikrogramm des Vektors pNEB193 ligiert, der zuvor mit PstI gespalten und dephosphoryliert wurde. Die Ligationsreaktion wurde in E. coli ER2683 durch Elektroporation transformiert und etwa 1.000.000 Transformanten wurden erhalten. Die Transformanten wurden gepoolt, in 500 ml LB-Nährlösung mit 100 μg/ml Ampicillin wachsen gelassen, und die Plasmidpopulation wurde gereinigt, um die Primärplasmidbibliothek zu bilden. Ein Mikrogramm dieser Plasmidbibliothek wurde vollständig mit einem Überschuss an MseI Restriktionsendonuclease verdaut und zum Transformieren von ER2683 verwendet. Plasmide der resultierenden Transformanten wurden mit dem Miniprep-Verfahren behandelt und durch MseI Restriktionsenzymverdau und anschließende Agarosegelelektrophorese analysiert. Neun untersuchte Plasmide erwiesen sich gegenüber einem MseI Verdau resistent und kodierten eines von zwei verschiedenen Methylasegenen, die beide die Aufgabe hatten, die DNA vor einer Spaltung durch MseI zu schützen. Diese beiden Methylasen wurden esaDix4IM und esaDix5IM genannt (SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6). Eine Analyse von Rohzellextrakten, die von diesen Klonen präpariert wurden, ergab keine Endonucleaseaktivität. Diese oder ähnliche Methyltransferasen können zum Schutz der DNA eines Wirts verwendet werden und ermöglichen somit eine erfolgreiche Expression der MseI Endonuclease.
BEISPIEL III
Identifizierung und Sequenzbestimmung des MseI Restriktionsendonucleasegens mit der N-terminalen Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz neben der durch das inverse PCR-Verfahren erhaltenen MseI Methylase
A) Reinigung der MseI Restriktionsendonuclease von Micrococcus species auf nahezu Homogenität:
Micrococcus species (NEB Nr. 446) Zellen wurden in LB-Medium bei 30°C vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation nach einem 20-stündigen Wachstum geerntet und bei –70°C bis zum Gebrauch gelagert. Alle Vorgänge fanden auf Eis oder bei 4°C statt. Die MseI Endonuclease wurde gemäß dem Schema aus Beispiel VI gereinigt. Etwa 10.000 Einheiten MseI Aktivität wurden auf nahezu Homogenität gereinigt. 16 μl der Peakfraktion wurden auf ein SDS-PAGE-Proteingel geladen und Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt, und es wurde eine auffällige Bande bei etwa 21 kD beobachtet, die der MseI Restriktionsendonucleaseaktivität entsprach.
B) Aminoterminale MseI Proteinsequenz:
Die wie beschrieben präparierte MseI
Restriktionsendonuclease wurde Elektrophorese unterzogen und mit dem Verfahren von Matsudaira elektrogeblottet (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035–10038 (1987)), mit den zuvor beschriebenen Modifikationen (Looney, et al., Gene 80:193–208 (1989)). Die Membran wurde mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt, die Proteinbande von etwa 21 kD wurde exzidiert und einem sequentiellen Abbau auf einem Gasphasenproteinsequenzer Modell 407A (Waite-Rees, et al., J. Bacteriol. 173:5207–5219 (1991)) von Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corporation (Foster City, Kalifornien) unterzogen. Die ersten 25 Reste des 21 kD Proteins entsprachen (Met)-Thr-His-Glu-Pro-Thr-Asp-Asp-Pro-Asp-Phe-Ile-Val-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Xxx-Asn-Leu-Ala-Asp-Xxx-Tyr (SEQ ID Nr. 10). Diese Daten wurden für einen Vergleich mit Aminosäuresequenz verwendet, die von der DNA-Sequenz neben dem Methylasegen abgeleitet wurde, um das Endonucleasegen zu ermitteln.
C) Bestimmung der DNA-Sequenz neben der mseIM Methylase:
Matrizenpräparation zur inversen PCR-Amplifikation: 1 μg Micrococcus species (NEB Nr. 446) DNA wurde mit 10 Einheiten HaeII Restriktionsendonuclease in 1X NEBuffer Nr. 4 in einem 50 μl Reaktionsvolumen 1 Stunde lang bei 37°C verdaut. Das HaeII Enzym wurde durch 20-minütiges Inkubieren bei 75°C hitzeinaktiviert. Die mit HaeII verdaute DNA wurde durch Zugabe von 50 μl 10X T4 DNA-Ligasepuffer und 400 μl dH₂O, gefolgt von 5 μl (2000 NEB-Einheiten) T4 DNA-Ligase (NEB Nr. 202) und eine 16-stündige Inkubation bei 16°C zirkularisiert. Ein Teil dieser Zirkularisierungsligationsreaktion wurde dann als Matrize für anschließende inverse PCR-Reaktionen verwendet.
Es wurden die Primer MseI-IP1 und MseI-IP2 der nachfolgend dargestellten Sequenzen synthetisiert. Diese Primer hybridisieren innerhalb des MseI Endonucleasegens und sind relativ zueinander in entgegengesetzter Richtung ausgerichtet:
Primer MseI-IP1
Primer MseI-IP2
In der Reaktion, die das Produkt erfolgreich amplifizierte, wurde ein Reaktionsgemisch durch Kombinieren der folgenden Bestandteile hergestellt:
10 μl 10X Vent^® Reaktionspuffer
6 μl 4 mM dNTP-Lösung
5 μl Primer MseI-IP1 bei 10 μM Konzentration
5 μl Primer MseI-IP2 bei 10 μM Konzentration
3 μl 100 mM MgSO₄ (5 mM Mg⁺⁺ Endkonzentration)
12,5 μl zirkularisierte DNA-Matrize (etwa 25 ng)
58 μl dH₂O 2 μl (4 Einheiten) Vent^® Exo Polymerase NEB Nr. 257
Die PCR-Amplifikationsbedingungen umfassten: einen Zyklus bei 95°C (3 min), anschließend 4 Zyklen bei 95°C (30 sec), 52°C (30 sec) und 72°C (1,5 min), gefolgt von 20 Zyklen bei 95°C (30 sec), 62°C (30 sec) und 72°C (1,5 min). 10 μl der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel analysiert.
Ein Produkt von etwa 1350 bp wurde in der PCR-Reaktion mit HaeII zirkulärer Matrize beobachtet. Das Produkt wurde gelgereinigt und in 25 μl DNA (1X TE) Puffer suspendiert. Dieses PCR-Produkt wurde dann mit den obigen PCR-Primern als Sequenzierungsprimer auf einem ABI 373 automatisierten Sequenzierungssystem gemäß Herstelleranweisungen sequenziert. Außerdem wurde die MseI Endonucleaseregion in einer ähnlichen Reaktion mit den folgenden Primern PCR-amplifiziert und das PCR-Produkt wurde sequenziert.
Primer MseI-IP3
Primer MseI-IP4
Das MseI Endonucleasegen wird identifiziert, indem die Aminosäuretranslation von DNA-Sequenzen neben dem MseI Methylasegen mit den Aminosäuresequenzdaten verglichen wird, die von N-terminaler Aminosäuresequenzierung der MseI Endonuclease erhalten werden. Es wurde ein offenes Leseraster gefunden, das in die gleiche Richtung wie das MseI Methylasegen ausgerichtet war und das Methylasegen um 7 Aminosäurereste überlappte und in dem die in der DNA-Sequenz kodierten ersten 25 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz übereinstimmten, die von dem MseI Endonucleaseprotein bestimmt wurde.
Die Sequenzierung des Inserts, das die MseI Methylaseund Restriktionsendonucleasegene trug, fand mit dem GPS^®-1 des Genome Priming System (New England Biolabs, Beverly, Mass.) statt. GPS^®-1 enthält modifiziertes Tn7 mit dem nptII Gen für Resistenz gegen Kanamycin, und Insertionen wurden in vitro in pVR-18 und pNEB 193 mit einem Teil des MseI Methylasegens gemäß Herstelleranweisungen erzeugt (New England Biolabs, Beverly, MA). Diese Insertionen wurden dann mit den im GPS^®-1 Kit enthaltenen Primern (Primer S und Primer N für jeweils das linke und rechte Ende des Transprimers) mit dem ABI 373 automatisierten Sequenzierungssystem gemäß Herstelleranweisungen sequenziert.
BEISPIEL IV
Optimierung der MseI M Expression
1) Setzen des MseI Methylasegens unter konstitutive Promotoren unterschiedlicher Stärke
Zum Erreichen einer Auswahl an konstitutiver Expression der MseI Methylase wurde eine verwandte Familie von pNK-Vektoren (großzügige Spenden von N. Kleckner) mit konstitutiven Promotoren unterschiedlicher Stärke verwendet. Diese Plasmide enthalten entweder die WT oder mutierten pHis Promotoren stromaufwärts eines BamHI Ortes und sind Derivate des RS415 Plasmids (Simons, et al. Gene, 53 (1987) 85–96). Ihre Bezeichnungen und Promotorstärken sind wie folgt:
Die obigen Plasmide wurden durch BamHI, MunI und BanII verdaut und die Vektor-Rückgrate mit den konstitutiven Promotoren wurden gelgereinigt. (Der BanII Verdau wurde einbezogen, um die Gelreinigung des Vektorrückgrats durch Beseitigen eines Plasmidfragments von ähnlicher Größe zu unterstützen.)
Zum Präparieren des MseI Methylasegens für eine Insertion stromabwärts der oben beschriebenen konstitutiven Promotoren erfolgte eine PCR mit Vent^® DNA-Polymerase, 1X ThermoPol Puffer, 4 mM MgSO₄, 80 ng pVR19 Plasmid (R. Vaisvila) mit dem MseI Methylasegen als Matrize in einer 100 μl PCR-Reaktion, und Primern, die einen stromaufwärtigen BamHI Ort 5'-GAACCGGATCCGACCCTGAGTGAGAACATGCC-3'(SEQ ID Nr. 15) und einen stromabwärtigen MfeI Ort 5'-AGGTCGCAATTGCCAGG GGTCGTCTTCACTCGCTAC-3' (SEQ ID Nr. 16) mit Bezug auf das Methylasegen einführen. Fünfundzwanzig Zyklen erfolgten bei 95° (10 sec), 60°C (60 sec) und 72°C (75 sec). Das resultierende 1019 bp PCR-Produkt wurde mit einem QiaQuick PCR-Reinigungsprotokoll gereinigt, sequentiell durch BamHI und MunI verdaut und noch einmal mit dem QiaQuick PCR-Reinigungsprotokoll gereinigt.
Das MseI Methylasegen wurde in alle vier BamHI-MunI Vektor-Rückgrate ligiert, in ER2688 Zellen transformiert und auf Luria-Bertani (angereichert mit 1 Gramm Glucose und 1 Gramm MgCl₂ je Liter; im Folgenden als angereichertes LB bezeichnet) Agarplatten plattiert. Versuche, die MseI Methylase unter die beiden höchsten Expressionsniveaus zu setzen, scheiterten jedoch, vermutlich aufgrund der Instabilität infolge des hohen Methylierungsniveaus in den Zellen. Konstrukte mit den beiden niedrigeren Expressionsniveaus (pNKR1707MseIm, pNKR2213MseIm) führten zu keiner vollständigen Methylierung der Zell-DNA, wie anhand der Empfänglichkeit von gereinigter Plasmid-DNA von diesen Zellen für eine Restriktion durch MseI beurteilt wurde (1 μg Plasmid-DNA in 50 μl Volumen, 20 Einheiten MseI, 1 Stunde bei 37°).
2) Konstruktion einer Bibliothek von zufällig mutagenisierten konstitutiven Promotoren durch fehlerauslösende PCR
Zur Suche nach einem Promotorkonstrukt von mittlerem Niveau für die MseI Methylase zwischen dem von pNKR2213MseIm und dem scheinbar instabilen pNKR1786MseIm wurde die konstitutive Promotorregion einer zufälligen PCR-Mutagenese und Selektion unterzogen. Das Mutageneseprotokoll verwendete hohe Taq DNA-Polymerase-Niveaus (5 Einheiten/100 μl Reaktionsvolumen), ungleiche dNTP Pools (1,2 mM dCTP und TTP; 0,2 mM dATP und dGTP), hohe MgCl₂-Niveaus (7 mM), die Anwesenheit von MnCl₂ (0,5 mM), 2 ng von pNKR1707MseIm je 100 μl Volumen und hohe PCR-Zykluszahlen (35). Die Primer flankierten das MseI Methylasegen jeweils an den AgeI und BamHI Restriktionsorten 5'-GCGATACAGACCGGTTCAGACAGGATAAAG-3' (SEQ ID Nr. 17) und 5'-GGTCGGATCCGGCGATACAGCGAG-3' (SEQ ID Nr. 18).
Im Anschluss an die PCR wurden die mutierten Promotorkopien durch AgeI und BamHI beschränkt, mit einem Qiagen Gelreinigungskit gelgereinigt und in ein AgeI-BamHIbeschränktes pNKRMseIm Konstrukt ligiert, das von seinem endogenen konstitutiven Promotor weggereinigt worden war. Nach Elektroporation in kompetente ER2688 Zellen wurden 20.000 Kolonien erzielt. Diese Kolonien wurden gepoolt und die Plasmide wurden unter Verwendung eines Qiagen Reinigungsprotokolls gereinigt. Dies ergab eine Bibliothek von zufällig mutagenisierten konstitutiven Promotoren stromaufwärts des MseI Methylasegens.
3) Selektion von Klonen, die Plasmide erzielen, die gegen MseI Restriktion resistent sind
Für eine Selektion im Hinblick auf Plasmide, die einen mutierten konstitutiven Promotor besitzen, der in einer stabilen Methylierung von hohem Niveau resultiert, wurden 5 μg der Plasmidbibliothek durch MseI Restriktion behandelt (5 μg DNA, 50 Einheiten MseI 4 Stunden bei 37°C, gefolgt von einer 20-minütigen Inkubation bei 65°C) um die MseI Restriktionsendonuclease zu inaktivieren. Ein Teil des behandelten Pools (250 ng) wurde in Calcium-kompetente ER2688 Zellen transformiert, auf angereicherte LB-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Dies ergab 63 Kolonien.
Sechs dieser 63 Kolonien wurden für eine weitere individuelle Untersuchung zufällig ausgewählt; nach einem Übernachtwachstum in 10 ml angereichertem LB-Medium wurde Plasmid-DNA unter Verwendung eines Qiagen Qia-prep Spin Miniprep Protokolls gereinigt. Als 100 ng der gereinigten Plasmid-DNA mit 20 Einheiten MseI 30 Minuten lang bei 37°C behandelt wurden, wurde gefunden, dass alle 6 vollständig eingeschränkt waren, was auf ein unangemessenes Methylierungsniveau hinwies.
Die restlichen 57 Kolonien wurden gepoolt und es fand eine Plasmidreinigung unter Verwendung eines Qiagen Plasmidreinigungsprotokolls statt. Von diesem Plasmidpool wurden 50 ng einer längeren (über Nacht) Behandlung mit 50 Einheiten MseI ausgesetzt und anschließend 20 Minuten lang bei 65°C inkubiert, um die MseI Restriktionsendonuclease zu inaktivieren. Ein Teil des behandelten Pools (4 ng) wurde in Calcium-kompetente ER2688 Zellen transformiert, auf angereicherte LB-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Dies ergab 13 Kolonien.
Neun dieser 13 Kolonien wurden für eine weitere individuelle Untersuchung zufällig ausgewählt; nach einem Übernachtwachstum und einer Plasmidreinigung wie zuvor beschrieben wurde gefunden, dass 7 der 9 vollständig methyliert wurden, wenn 1 μg Plasmid-DNA mit 50 Einheiten MseI in einem 50 μl Reaktionsvolumen über Nacht bei 37°C inkubiert wurde.
Für eine weitere Ermittlung des in den Zellen vorliegenden Methylierungsniveaus wurden die 7 Kolonien für eine Plasmidreinigung während der logarithmischen Kulturwachstumsphase geerntet (Zellen wurden 4 Stunden bei 37°C nach einer 1:100 Verdünnung einer Übernachtkultur in frischem angereichertem LB-Wachstumsmedium geerntet). Man würde davon ausgehen, dass solche Zellen ihre DNA in einer solchen Geschwindigkeit replizieren, dass eine Methylierung durch eine exprimierte MseI Methylase keine komplette Methylierung erreichen könnte. Plasmid-DNA wurde von diesen logarithmisch wachsenden Kulturen mit den Qiagen Qia-prep Reinigungsprotokollen gereinigt, und 0,5 μg dieser Plasmid- DNA wurden über Nacht bei 37°C mit 50 Einheiten MseI inkubiert. Mit diesem schwierigeren Methylierungsstandard waren 3 von 7 Kolonien völlig geschützt (methyliert) und gegen Restriktion resistent.
Bei den drei Klonen (Nr. 4, Nr. 9 und Nr. 10), die in einer stabilen und einem vollen Niveau von MseI Methylierung resultierten, wurden die Promotorregionen durch Kartieren mit AgeI und BamHI und Sequenzieren mit einem Primer mit einer Anlagerungsposition stromaufwärts der Promotorregion untersucht. (5'-GGATCTTCCAGTGGTGCATGAACG-3' (SEQ ID Nr. 19). Zwei der drei Klone (Nr. 9 und Nr. 10) waren identisch; folglich wurden durch das beschriebene Zweistufen-Selektionsverfahren zwei unabhängige Promotoren gefunden, die eine stabile MseI Methylierung mit vollem Niveau erzielten.
Unerwarteterweise waren die beiden Promotoren Nr. 4 und Nr. 9/Nr.10 keine mutagenisierten konstitutiven Promotoren wie bei dem Versuchsentwurf, sondern stattdessen AgeI-BamHI E. coli Sequenzen, die von dem geringen Niveau an E. coli DNA-Kontaminierung abstammen mussten, die in den Plasmidpräparaten vorlag.
Der Promotor Nr. 4 schien gemäß AgeI/BamHI Kartierung eine Länge von etwa 1000 bp zu haben; anhand einer Sequenzierung waren die ersten 438 bp mit E. coli K-12 MG1655 Sektion 349 identisch (Beitritts-Nr. AE000459), Basen-Nr. 7813-8251. Nach einer Untersuchung der Sequenzdaten wurde ein BamHI Ort bei Basen-Nr. 8814 gefunden, der das AgeI-BamHI E. coli Fragment von 1002 bp erzielen würde. Diese E. coli Sequenz enthält das 5' Ende von yigW 2 orf und zwei vorhergesagte Promotoren, von denen einer in die gleiche Richtung wie die MseI Methylase (Nr. 8672–8704) ausgerichtet ist.
Die Promotoren Nr. 9/Nr. 10 schienen gemäß AgeI/BamHI Kartierung eine Länge von etwa 420 bp zu haben; anhand einer Sequenzierung war der Promotor mit E. coli K-12 MG1655 Sektion 41 identisch (Beitritts-Nr. AE000151), Basen-Nr. 2511–2998. Dies definiert ein 488 bp AgeI/BamHI E. coli Fragment, das das 5' Ende von cof orf und zwei vorhergesagte Promotoren enthält, die in die gleiche Richtung wie die MseI Methylase an den Positionen Nr. 2605-2632 und Nr. 2714–2742 ausgerichtet sind. Diese Nr. 9/Nr. 10 Sequenz wurde für weitere Arbeiten verwendet.
4) Weitere Optimierung der MseI Methylaseexpression
Mit der oben beschriebenen Strategie wurde ein MseI Methyltransferase-Expressionsniveau erreicht, das die Expression der MseI Endonuclease im Plasmid pVR-25 zuließ. Während der ER2566 Wirt, der die optimierte MseI Methylase (Nr. 9 oben) und die MseI Endonuclease im Plasmid pVR-25 trug, MseI Endonuclease beim ersten Transformieren und Wachsenlassen exprimierte, wurde die MseI unerwarteterweise nicht stabil aufrechterhalten, wenn dieses Konstrukt in Glycerol bei –70°C aufbewahrt wurde.
Das MseI Methylasekonstrukt wurde weiter modifiziert, um eine stärkere MseI Modifikation des Wirts zu erreichen. Wie oben beschrieben, scheiterten die Versuche, die MseI Methylase unter die beiden höchsten konstitutiven Expressionsniveaus zu setzen, vermutlich aufgrund der Instabilität infolge eines hohen Methylierungsniveaus in den Zellen. Zum Erreichen eines tolerierten Höchstniveaus an Methylierung wurde ein neues M.MseI Expressionsplasmid, pVR-26, konstruiert. pVR-26 wurde durch Einsetzen eines zweiten Promotors konstruiert, der wie in (3) oben beschrieben abgeleitet wurde (siehe Tabelle 1). Dies erfolgte dadurch, dass ein 1,244 kb DNA-Fragment mit der M.MseI Kodierregion (mselM Gen) und stromaufwärtigem Promotor vom Plasmid pNKR1707 mseIM-9 (verdaut mit PmeI und MfeI) herausgeschnitten und gerade stromabwärts des P_lacUV5 Promotors im Vektor pNEB193 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) eingesetzt wurde, der mit EcoRI und HincII zerschnitten wurde. Ein weiteres MseI Methylasekonstrukt, pVR-27, wurde durch Deletieren eines 0,379 kb PmeI-AflIII Fragments mit dem P_lacUV5 Promotor und lacI Operator von pVR-26 hergestellt. Der pVR-26 mseIM Methylase exprimierende Vektor ermöglichte eine stabile Expression von MseI Endonuclease.
BEISPIEL V
Optimierung der MseI Restriktionsendonucleaseexpression
1) Expressionsvektorkonstruktion
Wie in der Technik allgemein bekannt ist, sind Restriktionsendonucleasen zytotoxische Proteine. Der Versuch zur Klonierung eines toxischen Gens in ein Plasmid, das so gestaltet ist, dass es eine hohe Expression erleichtert, ist in vielen Fällen äußerst schwierig. Ein besonders bevorzugtes Plasmid zur Expression zytotoxischer Gene ist pLT7K (Kong, et al., Nucl. Acids Res. 28:3216–3222 (2000)). Dieses Plasmid enthält das Segment, das die replikative Funktion kodiert (ori), ein Gen, das β-Lactamase kodiert, und ein Gen, das Kanamycin-Resistenz kodiert, das von Restriktionsendonucleaseorten flankiert wird, die zum Klonieren geeignet sind. Das cI857 Gen kodiert eine Mutantenform des Lambda-Bakteriophage-Repressorproteins, das sich konditionell an DNA-Sequenzen bindet (CI-Operator), die PL und PR überlappen (jeweils starken linkgerichteten und rechtsgerichteten Lambda-Bacteriophage-Promotoren). Das lacI Gen kodiert ein Repressorprotein, LacI, das sich konditionell an eine DNA-Sequenz bindet (lac-Operator), die so konstruiert ist, dass sie PT7 überlappt (Bakteriophage T7 RNA-Polymerasetranskriptionspromotor). Kurz, bei einer hohen Temperatur (42°C) ohne IPTG ist der Antisense-Promotor aktiv, während P_T7 durch LacI reprimiert wird. Bei 30°C mit IPTG erfolgt die Expression von P_T7.
Zum Adaptieren von pLT7K zur Oberexpression des MseI Restriktionsendonucleasegens wurden ein NdeI Restriktionsendonucleaseort und Ribosomenbindungsort eingeführt. Darüber hinaus wurde das colEI Replikon in das p15A Replikon geändert und die Kopiezahl wurde 3 mal verringert (von ~50 auf ~15). Um dies zu erreichen, wurde pLT7K mit AclI und BamHI verdaut. Das resultierende 1,2 kb Fragment mit cI857, Lambda PL, Kn Resistenzgen und T7 Promotor wurde von einem Agarosegel mit dem Qiagen QIAquick Gelreinigungskit (Cat. Nr. 28709) isoliert und in pACYC189-T7terΔPshAI Vektor ligiert, der zuvor mit ClaI und BamHI verdaut wurde. pACYC184-T7terΔPshAI ist ein PshAI Deletionsderivat von pACYC189-T7ter. Dieses Konstrukt wurde pVR-29 genannt (11).
Das offene Leseraster (ORF) für das mseIR Gen wurde durch PCR mit einem Satz Vorwärts-(5' AGACTCCCCCATAT GACCCACGAACCGACGGATG 3' (SEQ ID Nr. 20) und Rückwärts-(5'GGGTGGTCCCGCTAGCTATTAGTAGGGACCGGGG 3' (SEQ ID Nr. 21)-Primern amplifiziert, wobei die unterstrichenen Basen die Positionen der NdeI Spaltstellen für den Vorwärtsprimer angeben. Eine PCR wurde mit Vent^® DNA-Polymerase, 1X ThermoPol Puffer, 500 ng chromosomaler Micrococcus species (NEB Nr. 946) DNA als Matrize in einer 100 μl PCR Reaktion und Primern durchgeführt. Es erfolgten fünfundzwanzig Zyklen bestehend aus 15 sec bei 95°C, 60 sec bei 68°C und 95 sec bei 72°C. Das resultierende 700 bp PCR Produkt wurde mit einem QiaQuick PCR Reinigungsprotokoll gereinigt, mit Klenow-Fragment behandelt, mit NdeI verdaut und noch einmal mit dem QiaQuick PCR-Reinigungsprotokoll gereinigt.
Das resultierende 700 bp NdeI Blunt-End-Fragment mit dem MseI Restriktionsendonucleasegen wurde in einen pVR-29 Vektor ligiert, der mit NdeI und StuI verdaut wurde, und das Ligationsgemisch wurde in E. coli ER2502 Zellen transformiert, die zuvor mit dem MseI Methylasegenkonstrukt pNKR1707MseIm-9 modifiziert wurden. Von 18 analysierten individuellen Transformanten enthielten drei das mseIR Gen.
Nach dem Sequenzieren des DNA-Inserts, das das MseI Restriktionsendonucleasegen enthielt, wurde ein rekombinantes Plasmid, pVR-25, zur Herstellung der MseI Restriktionsendonuclease selektiert.
2) Stammkonstruktion
Zum Erhöhen der LacI Repressor-Kopiezahl in dem Wirt wurde der Stamm ER2833 (T71acIq Stamm) konstruiert.
3) Optimierung der MseI Restriktionsendonuclease-Überexpression in E. coli durch Kombinieren verschiedener Wirte und Plasmide, die unterschiedliche MseI Methylaseniveaus exprimieren
Zur Optimierung der MseI Restriktionsendonuclease-überexpression in E. coli wurde das pVR-25 Plasmid in den Expressionsstamm ER2566/pCEF-8 übertragen, der zuvor durch Tragen eines dieser MseI Methylase exprimierenden Plasmide (pNKR1707MseIm-9, pCR-26 und pVR-27) vor MseI Endonuclease-Selbstverdauung geschützt wurde. ER2566/pCEF-8 ist ein Wirtsstamm, der eine chromosomale Kopie des Gens für T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren lac-Promotors und ein Plasmid auf der Basis von pSYX20, pCEF-B, enthält, das geringe Niveaus von T7 Lysozym spezifiziert, einem natürlichen Inhibitor von T7 RNA-Polymerase. Für zusätzliche Informationen siehe Moffatt, B.A. und Studier, F.W., "T7 Lysozyme inhibits transcription by T7 RNA polymerase", Cell, 49:221–227 (1987). In nicht induzierten Zellen reduziert Lysozym die Grundaktivität der T7 RNA-Polymerase und erhöht die Auswahl von Zielgenen, die in dem Expressionswirt stabil aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus wurde ein weiterer Expressionsstamm, ER2833/pCEF-8, verwendet, der eine Kopie des lacIq Gens auf dem F' Episom hat.
Insgesamt wurden sechs Stämme von MseI Restriktionsendonuclease in Expressionsstudien in E. coli verwendet (Tabelle 1). Alle Stämme enthielten pVR-25 Plasmid, das MseI Restriktionsendonuclease exprimierte, und pCEF-8 Plasmid, das ein T7 Bakteriophage-Lysozymgen kodierte. Es wurde eine Vielfalt an Wachstumsbedingungen verwendet, um transformierte Wirtszellen wachsen zu lassen, um im Hinblick auf höhere Erträge von MseI Restriktionsendonuclease zu selektieren. Das bevorzugte Medium in Optimierungsexperimenten war Luria-Bertani-Medium (angereichert mit 1 Gramm Glucose und 1 Gramm MgCL₂ je Liter; anschließend als angereichertes LB bezeichnet).
Die Wachstumsbedingungen waren wie folgt:

MseRM1: Zellen von einer individuellen Kolonie wurden 8 Stunden lang in 0,5 Liter LB-Medium bei 92°C wachsen gelassen, woraufhin IPTG auf eine Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben wurde, um die T7 RNA-Polymerase zu induzieren, und die Zellen wurden über Nacht (15 Stunden) bei 30°C wachsen gelassen. Antibiotika wurden nach Bedarf zugegeben: 30 μg Kanamycin je ml, 100 μg Ampicillin je ml und 30 μg Chloramphenicol je ml. Schließlich wurden Kulturen durch Zentrifugation geerntet und bei –20°C eingefroren.
MseRM3: für jedes Experiment wurden Zellen von einer individuellen Kolonie in 0,5 Liter LB-Medium bei 30°C über Nacht (17 Stunden) wachsen gelassen, woraufhin IPTG auf eine Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben wurde, um T7 RNA-Polymerase zu induzieren, und die Zellen wurden weitere 4 Stunden wachsen gelassen. Antibiotika wurden nach Bedarf zugegeben: 30 μg Kanamycin je ml, 100 μg Ampicillin je ml und 30 μg Chloramphenicol je ml. Schließlich wurden Kulturen durch Zentrifugation geerntet und bei –20°C eingefroren.
MseRM4, MseRM5 und MseRM6: Bakterienkulturen wurden als gefrorene Stammlösungen bei 70°C in 50 % Glycerol aufbewahrt. Zur Sameninokulation verwendete Kulturen wurden auf LB-Mediumplatten ausgestrichen, die angemessene Antibiotika enthielten, um einzelne Kolonien zu erhalten. Eine individuelle Kolonie wurde in 1 ml LB-Medium resuspendiert und in eine 1000-ml-Flasche mit 500 ml LB-Medium inokuliert; das mit 30 μg Kanamycin/ml, 100 μg Ampicillin/ml und 30 μg Chloramphenicol/ml angereichert war. Zellen wurden über Nacht (16 Stunden) in einem Schüttelinkubator bei 37°C und 250 rpm wachsen gelassen. Anschließend wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben. Die Zellen wurden weitere 9 Stunden kultiviert und dann 5 Minuten lang durch Zentrifugation bei 8.000 g und 4°C geerntet und bei –20°C eingefroren. Es wurden zwei bevorzugte Restriktionsendonuclease-Assays zum Identifizieren von Klonen mit hohem Expressionsniveau angewendet.
Beschallungsverfahren: induzierte Kulturen (500 ml) wurden geerntet und in 20 ml Beschallungspuffer mit 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA resuspendiert. Zellen wurden auf Eis durch vier 30-Sekunden-Stößen mit einer Makrospitzensonde beschallt. Ein Teil des Rohextrakts wurde zu Lambda-DNA (1 μl) in NEBuffer 2 Puffer (50 μl) gegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. DNA wurde durch 0,8 % Gelelektrophorese fraktioniert und durch EtBr-Färbung visualisiert.
EXPRESS-Verfahren: ein Milliliter einer Obernacht- oder induzierten Kultur (10 – 500 ml) wurde geerntet und in 0,2 ml Puffer mit 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, und 25 % (vol/vol) Saccharose resuspendiert und vermischt, bis die Lösung homogen war. 11 μl 200 mM EDTA, pH 8,0, plus 200 μl frisch präpariertes 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0) wurden zugegeben und die Lösung wurde 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 11,5 μl 1 M MgCl₂ und 29,2 μl 5 % (vol/vol) Brij-58 zugegeben. Die Lösung wurde vorsichtig vermischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde das Rohzelllysat bei maximaler Drehzahl in einer Mikrozentrifuge 15 Minuten lang bei 9°C zentrifugiert. Der überstand wurde in ein neues Eppendorf-Röhrchen abpipettiert und bis zum Gebrauch auf Eis gelagert. Lambda-DNA-Substrat (1,0 μg) wurde in MseI Reaktionspuffer (NEBuffer 2) mit seriellen Verdünnungen von Zellextrakt 1 Stunde lang bei 37°C verdaut. DNA wurde durch Elektrophorese fraktioniert und durch EtdBr-Färbung visualisiert. Die Aktivität wurde durch die Anwesenheit von Banden geeigneter Größe bestimmt, die mit einem MseI Verdau von Lambda-DNA verbunden waren.

Die Ergebnisse der Optimierung von MseI Restriktionsendonucleaseexpression sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Der MseRM1 Stamm erbrachte einen variablen Ertrag von MseI Restriktionsendonuclease (0,08–0,5×10⁶ U/g nasse Zellen). Zellen wuchsen langsam und die lag-Phase war ungewöhnlich lang.
Zur Erhöhung der Stabilität und Reproduzierbarkeit von rekombinanten Expressionsystemen auf lac-Basis wurde der neue Wirtsstamm EA2833 konstruiert, der eine Kopie des lacI^q Gens auf dem F' Episom hat. In der Tat wurde die Expressionsstabilität und Plasmiderhaltung in dem lacI^q Wirt (MseRM3) stark verbessert: der Ertrag der MseI Restriktionsendonuclease betrug 0,5–1,9×10⁶ U/g nasse Zellen. Die von diesem Stamm gereinigte MseI Restriktionsendonuclease (siehe Beispiel VI) war im Wesentlichen frei von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease und der Endertrag Tag bei ~150.000 U/g. Dieser Ertrag ist etwa 100 mal höher als der von nativer Micrococcus species (NEB Nr. 446).
Leider wies der MseRM3 Stamm nach einer Lagerung bei –70°C und Wiederbelebung keine MseI
Restriktionsendonucleaseaktivität auf. Zur Lösung dieses Problems wurde das MseI Methylaseexpressionsniveau durch die Konstruktion von pVR-26 und pVR-27 Plasmiden erhöht (Beispiel IV oben). Diese Stämme (MseRM4, MseRM5 und MseRM6) erbrachten selbst nach der Lagerung des Stammes bei –70°C einen hohen MseI Restriktionsendonucleaseertrag und ein Stamm, MseRM4 (NEB Nr. 1284; New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), wurde zur Maßstabsvergrößerung in einem 100-1-Produktionsfermenter verwendet (siehe Beispiel VI). Der Ertrag von MseI Restriktionsendonuclease aus dieser maßstabsvergrößerten Fermentation lag bei 0,5×10⁶ U/g Nasszellen.
BEISPIEL VI
Produktion der rekombinanten MseI Restriktionsendonuclease
Das MseI Restriktionsenzym wurde vom rekombinanten E. coli Stamm NEB Nr. 1284 erzeugt, der bis zur späten log-Phase in einem 100-1-Fermenter vermehrt wurde. Eine Probe dieser Zellen wurde am 28. August 2000 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags mit der ATCC Beitritts-Nr. PTA-2421 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt.
A) Zellwachstum
Der transformierte E. coli Wirt NEB Nr. 1284 mit dem rekombinanten MseI Restriktionsendonucleaseklon wurde als Gefrierstammlösung bei –70°C in 50 % Glycerol gelagert. Zur Sameninokulation verwendete Kulturen wurden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 μg/ml), Chloramphenicol (30 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Mehrere Kolonien wurden zum Inokulieren von 10 ml LB-Medium verwendet, das mit 30 μg Kanamycin/ml, 100 μg Ampicillin/ml und 30 μg Chloramphenicol/ml angereichert war. Zellen wurden 3 Stunden lang in einem Schüttelinkubator bei 37°C und 250 rpm und dann bei 30°C weitere 3,5 Stunden wachsen gelassen (um ein Überwachsen der Kultur zu vermeiden). Der endgültige korrigierte Klett dieser Kultur betrug 122 oder mittlerer Log. Diese Kultur wurde zum Inokulieren von 100 Liter LB verwendet, das mit 30 μg Kanamycin/ml, 100 μg Ampicillin/ml und 30 μg Chloramphenicol/ml angereichert war. Die Fermentation erfolgte 18 Stunden lang bei 30°C mit einer Belüftung von 2 SCFM (Normalkubikfuß je Minute) und einer Rührgeschwindigkeit von 200 rpm. Der endgültige korrigierte Klett betrug 313. Von dieser Fermentation wurden 331 Gramm Zellen (Nassgewicht) durch Dauerdurchflusszentrifugation geerntet und die Zellen wurden bei –70°C gelagert. Rohextrakt wurde von 1 g Zellen hergestellt und die Enzymaktivität geschätzt mit dem oben beschriebenen Verfahren (siehe Beispiel V). Der Ertrag der MseI Restriktionsendonuclease im Rohextrakt lag bei 500.000# U/g und war etwa 100 mal höher als der des Rohextrakts von Micrococcus species (NEB Nr. 446).
B) Reinigung der MseI Restriktionsendonuclease von NEB Nr. 1284
Alle nachfolgenden Verfahren fanden entweder auf Eis oder bei 4°C statt. 330 Gramm Zellen wurden in 990 ml Puffer A (0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM BME, 1 mM EDTA und 5 % (v/v) Glycerol) suspendiert und in 4 Durchgängen bei 12.000 psig durch eine Gaulin-Presse auf einen O.D.-Wert von 0,56 zerbrochen. Der Überstand von 1150 ml wurde mit PEG präzipitiert, indem PEG 6000 zu 7,5 % und NaCl zu 0,5 M zugegeben wurden, und anschließend 50 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Der PEG-Schlamm wurde 30 Minuten lang bei 12.000 und 4°C zentrifugiert. 580 ml Überstand wurden auf 0,1 M NaCl mit Puffer A ohne NaCl verdünnt und auf eine 430 ml Heparin-Hyper-D-Säule geladen, die mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 1200 ml Puffer A gewaschen, woraufhin ein linearer Gradient (4000 ml) von 0,1 M NaCl bis 1,0 NaCl angewendet wurde. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,25 bis 0,35 M NaCl und wurde gepoolt. Der Heparin-Hyper-D-Pool wurde auf 0,1 M NaCl mit Puffer A ohne NaCl verdünnt und auf eine 88 ml PEI-Säule geladen, die mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer A gewaschen und anschließend wurde ein linearer Gradient (1000 ml) von 0,1 M bis 1,7 M NaCl angewendet. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,7 bis 0,9 M NaCl und wurde gegen Puffer C (50 mM NaCl, 15 mM Tris, pH 7,5, 10 mM BME, 0,1 mM EDTA und 5 % (v/v) Glycerol) über Nacht dialysiert und auf eine mit Puffer C äquilibrierte 20 ml Source-Q-Säule geladen. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer C gewaschen und es wurde ein linearer Gradient (400 ml) von 0,05 M NaCl bis 1,0 M NaCl angewendet. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,25 M bis 0,35 M NaCl und wurde gepoolt. Der Source-Q-Pool wurde gegen Puffer D (10 mM KPO4, pH 7,0, 0,075 M NaCl, 10 mM BME, 0,1 mM EDTA, 5 % (v/v) Glycerol) dialysiert und auf eine 20 ml Heparin-TSK-Säule geladen, die mit Puffer D äquilibriert war. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer D gewaschen und es wurde ein linearer Gradient (400 ml) von 0,075 M bis 1 M NaCl in Puffer D angewendet. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,3 M bis 0,4 M NaCl und wurde gepoolt. BSA wurde auf eine Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben. Der Pool wurde gegen Lagerpuffer (20 mM Tris, pH 7,5, 0,1 M EDTA, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 50 (v/v) Glycerol, 200 μg/ml BSA) über Nacht dialysiert. Mit diesem Reinigungsschema wurden 26.000.000 Einheiten von MseI Restriktionsendonuclease erzielt. Die aus dieser Reinigung hervorgehende MseI Restriktionsendonuclease war im Wesentlichen frei von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease.
Die Reinheit des MseI Restriktionsendonuclease-Präparates wurde anhand der folgenden Kriterien überprüft:

1. Ligation: Im Anschluss an einen 5fachen Überverdau von Lambda-DNA wurden mehr als 95 % der produzierten DNA-Fragmente mit T4 DNA-Ligase ligiert (bei einer 5' Termini-Konzentration von 1–2 μM bei 16°C). Von diesen ligierten Fragmenten konnten 95 % erneut zerschnitten werden.
2. Verlängerter Verdau: Im Anschluss an eine 16-stündige Inkubation einer 50 μl Reaktion mit 1 μg Lambda und 100 Einheiten Enzym wurde das gleiche Bandenmuster von DNA-Banden wie bei einer Reaktion erzeugt, die in einer Stunde mit einer Einheit Enzym stattfindet.
3. Exonucleaseaktivität: Im Anschluss an eine 4-stündige Inkubation von 100 Einheiten Enzym bei 37°C in einer 50 μl Reaktion mit 1 μg beschallter ³H DNA (10⁵ cpm/μg) wurde eine Radioaktivität von weniger als 0,4 % freigesetzt.

Alle Tests fanden in dem folgenden Reaktionspuffer statt: NEBuffer 2 (50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, (pH 7,9 bei 25°C, angereichert mit 100 μg/ml BSA. Einheitsbestimmung: Lambda-DNA-Substrat (1,0 μg) wurde in 50 μl 1X MseI Reaktionspuffer (NEBuffer 2) mit seriellen Verdünnungen von MseI Endonuclease 1 Stunde lang bei 37°C verdaut. DNA wurde durch Elektrophorese fraktioniert und durch EtdBr Färbung visualisiert. Die Aktivität wurde anhand der Anwesenheit von Banden angemessener Größe in Verbindung mit einem MseI Verdau von Lambda DNA bestimmt.
Eine Einheit von Restriktionsendonucleaseaktivität wird als die Menge an Enzym definiert, die für einen kompletten Verdau von 1 μg Substrat-DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl in einer Stunde unter Verwendung des angegebenen NEBuffer erforderlich ist.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die MseI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-2421 erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, in den ein DNA-Segment nach Anspruch 1 eingesetzt wurde.
Isoliertes DNA-Segment, das von ATCC Nr. PTA-2421 erhältlich ist, wobei die isolierte DNA ein erstes Segment, das die M.MseI Methylase kodiert, und ein zweites Segment umfasst, das einen Promotor umfasst, der mit der ersten Region funktionell verknüpft ist.
Klonierungsvektor, der die isolierte DNA aus Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, transformiert durch den Klonierungsvektor aus Anspruch 2 oder 4.
Verfahren zur Herstellung der MseI Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit den Vektoren aus Anspruch 2 und 4 transformiert wurde, unter Bedingungen zur Expression der MseI Restriktionsendonuclease in der Wirtszelle.