JP4825383B2 - ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングする方法及び製造する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１つの実施態様において、発現が細胞の生理的状態の変化を補正するように、従ってあらゆる増殖段階において同族の制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して好ましくは完全な保護を与えるように、保護的修飾メチルトランスフェラーゼ活性の均衡の取れたレベルを産出するために先ず方法を実施すること；次いで制限エンドヌクレアーゼを導入すること及びその発現を提供することを含む、目的の制限修飾システムをクローニングし、発現する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼは、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡを分解するか又は切断するヌクレアーゼと呼ばれる酵素の部類に属する。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿って特定のヌクレオチドの配列（「認識配列」）を認識し、結合することによって作用する。いったん結合すると、エンドヌクレアーゼは認識配列の範囲内で又は一方で分子を切断する。いかなる任意のエンドヌクレアーゼについても位置は固定しているが、切断の位置は種々の制限エンドヌクレアーゼの間で異なってもよい。様々な制限エンドヌクレアーゼが認識配列に対して様々な親和性を有する。今日までに調べられた幾千もの細菌種及び古細菌種の中で、２００を超える、独特の特異性を認識する制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、その組成並びに補因子の必要性、標的配列の性質、及び標的配列に関するＤＮＡ切断部位の位置に基づいて分類される（Yuan, R., Ann. Rev. Biochem., 50:285-315, 1981）。現在のところ、性状のよく判っている３種の制限エンドヌクレアーゼが知られている（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）。Ｉ型酵素は特異的な配列を認識するが、その配列に関して無作為に切断する。ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な配列を認識し、その配列の一方に対して定められた位置で切断するが、決して完全には消化しない。この２種の酵素はどちらとも実用的な用途には好適ではない。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な配列（４〜８個の長さのヌクレオチド）を認識し、その配列の範囲内の位置か又はそれに極めて近い定められた位置で切断する。通常、それらは、その作用にＭｇ２＋イオンのみを必要とする。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼがその他の細菌成分から精製された場合、実験室でＤＮＡ分子を特異的な断片に切断するのにそれらを用いることができる。この特性によって研究者はＤＮＡ分子を操作することができ、生じた構造を解析することができる。
【０００４】
細菌は、単離によってせいぜいほんのわずかな制限エンドヌクレアーゼを処理する傾向があるにすぎない。制限エンドヌクレアーゼは、それらが生じる生物の名称に由来する３文字の頭字語によって命名される（Smith and Nathans, J. Mol. Biol., 81:419-423, 1973）。最初の文字は属に由来し、２番目と３番目の文字は種に由来する。従って、例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種の株は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと命名された３種の異なるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを合成する。このような酵素はそれぞれ、配列、ＴＴＴＡＡＡ、ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ及びＣＡＣＮＮＮＧＴＧを認識して切断する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＲＹ１３株は、たった１つのＩＩ型制限酵素であるＥｃｏＲＩを合成し、それは、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する（Roberts R. J., and Macelis D., Nucl. Acids Res., 28:306-7, 2000）。
【０００５】
細菌及び古細菌の制限システムの第２の成分は、修飾メチラーゼである（Roberts and Halford, in 'Nucleases' 2nd ed., Linn et al., ed.'s, p.35-88, 1993）。このような酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護し、外来の、侵入ＤＮＡから区別することができる手段を提供する。修飾メチラーゼは、相当する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することにより配列の範囲内の１つか又はその他のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって切断されることはない。修飾メチラーゼの活性の効力によって細菌細胞のＤＮＡは修飾され、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に感受性がない。制限エンドヌルレアーゼの認識と切断に感受性があるのは修飾されていない、従って識別することが可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００６】
自然状態では、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ウイルス及びプラスミドＤＮＡのような外来ＤＮＡを、そのＤＮＡが適当な修飾酵素によって修飾されていない場合、切断すると考えられている（Wilson and Murray, Annu. Rev. Genet. , 25:585-627, 1991）。このようにして細胞は外来ＤＮＡによる侵略から保護されている。従って、ＩＩ型制限修飾システムの進化は、外来ＤＮＡによる感染からそれ自体を保護する細胞の必要性によって進んできたと広く考えられている（細胞性防御仮説）。
【０００７】
遺伝子操作技術の出現によって、今や遺伝子をクローン化し、それらがコードしているタンパク質や酵素を、従来の精製技術で入手可能なものよりも大量に製造することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵は、遺伝子ライブラリの中でそのようなクローンを同定する簡単で信頼できる方法を開発することである。可能性のある困難さの１つは、プロモータ若しくはリボソームの結合部位の差異又は遺伝子のコドン組成の差異のように、起源となる生物の転写及び翻訳装置が大腸菌とは異なっているために制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子の中には、大腸菌で発現されない可能性があるものがあることである。メチラーゼ遺伝子の単離には、メチラーゼが十分に大腸菌で発現し、遺伝子を運んでいるプラスミドの少なくとも一部を完全に保護することが必要とされる。活性型でのエンドヌクレアーゼの単離には、メチラーゼが十分に発現して宿主ＤＮＡを完全に保護するか又はエンドヌクレアーゼによる切断に由来する致命的な損傷を妨げることが必要とされる。制限エンドヌクレアーゼをクローニングするもう１つの障害は、大腸菌株の一部がシトシン又はアデニンの修飾に有害に反応する；メチル化シトシン（Raleigh and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA83:9070-9074, 1986）又はメチル化アデニン（Heitman and Model, J. Bact., 196:3243-3250; Raleigh et al., Genetics, 122:279-296, 1989; Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173:5207-5219, 1991）を含有するＤＮＡを破壊するシステムを生じるという発見である。シトシン特異的又はアデニン特異的メチラーゼ遺伝子は、それら自体又はそれらに相当するエンドヌクレアーゼ遺伝子と共にいずれにおいてもこのような株で容易にクローニングすることはできない。この問題を回避するためには、このようなシステムが欠損している大腸菌の変異株（ＭｃｒＡ−及びＭｃｒＢ−又はＭｒｒ−）を使うことが必要である。
【０００８】
制限遺伝子を大腸菌にクローニングするために、以下のようないくつかのアプローチが用いられてきた。
（１）ファージの制限に基づいた選定
最初にクローニングされたシステムでは、制限エンドヌクレアーゼのクローンを同定し、選定する手段としてバクテリオファージ感染が用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：Kosykh et al., Molec. Gen. Genet., 178:717-719, 1980; ＨｈａＩＩ：Mann et al., Gene 3:97-112, 1978; ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 78:1503-1507, 1981）。細菌における制限−修飾システムの存在によって細菌はバクテリオファージの感染に抵抗することができるので、クローン化された制限−修飾遺伝子を運んでいる細胞は原則として、ファージにさらされたライブラリから生き残りとして選択的に単離される。しかしながら、この方法は限定された利点しか有さないことが判明した。具体的には、クローン化された制限−修飾遺伝子は、通常の条件下で選択的生き残りを提供する十分なファージ抵抗性を常に示すとは限らないことが判ったのである。
【０００９】
（２）ベクターの修飾に基づいた選定
数の上で増えているシステムをクローニングするのに用いられる第２のアプローチには、活性のあるメチラーゼ遺伝子の選定が関与する（米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kiss et al., Nucl. Acid Res., 13:6403-6421, 1985を参照のこと）。制限遺伝子と修飾遺伝子は密接に連関していることが多いので、両遺伝子を同時にクローニングすることができることも多い。この選定では常に完全な制限システムが得られるとは限らないが、その代わり、メチルトランスフェラーゼ遺伝子だけを得る可能性がある（ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi et al., Gene 10:219-225, 1980; ＢｃｎＩ：Janulaitis et al., Gene 20:197-204, 1982; ＢｓｕＲＩ：Kiss and Baldauf, Gene 21:111-119, 1983;及びＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem., 258:1235-1241, 1983）。
【００１０】
（３）天然プラスミドのサブクローニング
もう１つのクローニング法には、当初、プラスミド由来の大腸菌にクローニングするプラスミドとして特徴付けされた転移システムである（ＥｃｏＲＶＩ：Bougueleret et al., Nucl. Acid Res., 12:3659-3676, 1984; ＰａｅＲ７Ｉ：Gingeras and Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:402-406, 1983; Theriault and Roy, Gene 19:355-359, 1982; ＰｖｕＩＩ：Blumenthal et al., J. Bacteriol., 164:501-509, 1985）。
【００１１】
（４）複数工程のクローニング
直接的なメチラーゼ選定法は、種々の障害のためにメチラーゼ（及び／又はエンドヌクレアーゼ）クローンを得ることができないことがある。例えば、ＬｕｎｎｅｎらのＧｅｎｅ７４（１）巻（１９８８年）の２５〜３２ページを参照のこと。制限−修飾遺伝子をクローニングするのに障害となる可能性の１つは、修飾により予め保護されていない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることである。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を単一のクローンとして共に導入する場合、エンドヌクレアーゼが切断する機会を有する前にメチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾しなければならない。従って、時には、遺伝子を順に、先ずメチラーゼを次いでエンドヌクレアーゼをクローニングすることが可能なこともある（米国特許第５，３２０，９５７号を参照のこと）。
【００１２】
（５）ＤＮＡの損傷で誘導可能なＳＯＳ反応の誘導に基づいた選定
メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするもう１つの方法は、ＤＮＡ損傷に関する比色アッセイに基づく（米国特許第５，４９２，８２３号を参照のこと）。メチラーゼに関してスクリーニングする場合、ＡＰ１−２００のような感受性宿主の大腸菌株をプラスミドライブラリで形質転換する。メチラーゼの発現によって、ＭｃｒＡ＋、ＭｃｒＢＣ＋、又はＭｒｒ＋である大腸菌株でＳＯＳ反応が誘導される。ＡＰ１−２００株は、Ｍｃｒ及びＭｒｒシステムに対して温度感受性であり、大腸菌の損傷で誘導可能なｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌａｃＺを含む。メチラーゼ又はエンドヌクレアーゼをコードする組換えプラスミドの検出は、限定的な温度でのｌａｃＺの誘導に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上で青いコロニーとして検出される（Piekarowicz et al., Nucleic Acids Res., 19:1831-1835, 1991;及びPiekarowicz et al., J. Bacteriology 173:150-155, 1991 ）。同様に、大腸菌株、ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ１−ｌａｃＺ融合物を含有するが、メチル化依存性の制限システム、ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒを欠いている。このシステム（「エンド−ブルー（ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ）」法と呼ばれる）では、ＳＯＳ反応を含めて、エンドヌクレアーゼが宿主細胞のＤＮＡを損傷する場合、同族のメチラーゼの非存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子を検出することができる。Ｘ−ｇａｌを補ったＬＢ寒天プレート上で、ＳＯＳ誘導された細胞は、深青色のコロニーを形成する（Fomenkov et al., Nucleic Acids Res., 22:2399-2403, 1994、及び米国特許第５，４９８，５３５号）。
【００１３】
（６）Ｎ末端配列に基づいた同義性インバースＰＣＲ
修飾メチルトランスフェラーゼ遺伝子を同定することができない（米国特許第５，９４５，２８８号を参照のこと）、又はメチラーゼ遺伝子を同定することはできるが、制限エンドヌクレアーゼを特定するオープンリーディングフレームがはっきりしないということが起き得る。これらの場合、起源となった生物から十分な量及び純度で制限エンドヌクレアーゼを精製することができるときは、エンドヌクレアーゼ遺伝子を同定するための追加的な方法を特に適用することができる。この方法では、エンドヌクレアーゼを実質的な均一性まで精製して、ポリペプチドの配列決定を行う。得られたポリペプチド配列をＤＮＡ配列に逆翻訳し、起源となった生物のゲノムＤＮＡから又はそれから作成した遺伝子ライブラリからエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅するために同義性ＰＣＲプライマーを設計することができる。サザンブロット分析又は更なる直接若しくはインバースＰＣＲ法によって完全な遺伝子のＤＮＡ配列を得ることができる。同族のメチルトランスフェラーゼが得られない場合か又はそれを発現することができない場合、制限エンドヌクレアーゼのクローン単独の安定性及び利便性は、通常、ひどく危うくなる。
【００１４】
上記の方法によって、特定のシステムのメチルトランスフェラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを得ることができてもよいが、それでもやはり、酵素製造のために使用可能な株の確立は問題である。困難さは好適なレベルでのメチルトランスフェラーゼの発現と共にあることが多い。このことは方法（６）と共に特に真実である。本来の宿主におけるエンドヌクレアーゼとは関係がなかったが、同じか又は関連した配列を認識し、エンドヌクレアーゼが認識配列を切断するのを妨げる、ヘテロ特異的なメチルトランスフェラーゼを用いて、かかるクローンを安定化することができることもある（米国特許第６，０４８，７３１号を参照のこと）。
【００１５】
利用できる好適なヘテロ特異的メチルトランスフェラーゼがない、及び同族のメチルトランスフェラーゼにより宿主に与えられる保護の程度が不適当であるこいうことが生じる可能性がある；又は明らかに適当なレベルのメチルトランスフェラーゼを得ることができるが、かかるレベルは細胞に対して毒性があり、結果として保存することができない株を生じるということが起きる可能性がある；又は保護が明らかに適当であり、保護された細胞は生存可能であるが、メチルトランスフェラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子の組合せによって検出可能なエンドヌクレアーゼを発現しない株を生じることが起きる可能性がある；又は保護が明白に適当であり、メチルトランスフェラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子の組合せによって検出可能なエンドヌクレアーゼを発現する株を生じるが、商業的に有用なレベルの酵素を製造するには十分に好適ではないことが起きる可能性がある。
【００１６】
制限エンドヌクレアーゼによる切断から宿主細胞を効果的に保護するのに必要な酵素の要求レベルを変更する数多くの因子を仮定することができる。かかる因子には、増殖の静止期の間に細胞に存在するよりも大量のＤＮＡコピーが存在する急速な増殖；制限エンドヌクレアーゼの新しい合成が開始する前に修飾メチルトランスフェラーゼの新しい合成が必要とされる可能性がある休止状態からの回復；例えば、Ｓ−アデノシルメチオニンのような要求されるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ補因子のレベルが変化する可能性がある、種々の飢餓；及びＤＮＡ損傷又はその他の生理的障害のような特定の生理状態が挙げられる。さらに、メチルトランスフェラーゼのレベルが高くなりすぎ、例えば、同族部位に関係する無関係な部位に結合するか又はそれをメチル化することによって毒性となり、従って、調節タンパク質又はＤＮＡ凝縮タンパク質によるＤＮＡ配列の読み取りを妨害する可能性がある。従って、無制限に永続化するためには、メチルトランスフェラーゼの発現の絶対的なレベルを培養の期間にわたる条件に応じて変動させる必要がある可能性がある。
【００１７】
制御の微細レベルに対するこの必要性は、修飾メチルトランスフェラーゼに独特なのではない。５０年の研究のうちに、例えば、栄養を分解する、又は必須成分を合成する（ｔｒｐ、ｈｉｓ）、又は有害因子に反応する（ＤＮＡ損傷反応、熱ショック反応）異化及び同化遺伝子のセット（ｌａｃ、ａｒａ、ｇａｌ）のような種々の機能について多数の詳細な調節図式が記載されてきた。このような調節性の効果には、例えば、プロモータ活性（アクチベータ又はリプレッサによる）、転写安定性（レトロ調節要素による）における変化が、翻訳レベル（弱化又は翻訳連結）の変化が介在する。この高いレベルの理解にもかかわらず、機能に対する要求が生理的変化と共にいかに変化するのか及び機能の所望のレベルをいかにして達成するのかを前もって予測することは簡単ではない。
【００１８】
精製された制限エンドヌクレアーゼ、及び、程度は少ないが修飾メチラーゼは、実験室で遺伝子を特徴付けるのに有用なツールなので、組換えＤＮＡ技術を介して、このような酵素を大量に合成する細菌株を入手しようとする商業的な動機がある。かかる株は、商業的に有用な量で製造する手段を提供することはもとより、精製の作業を簡略化するので有用である。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１つの実施態様において、発現が細胞の生理的状態の変化を補正するように、従ってあらゆる増殖段階において同族の制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して好ましくは完全な保護を与えるように、保護的修飾メチルトランスフェラーゼ活性の均衡の取れたレベルを産出するために先ず方法を実施すること；次いで制限エンドヌクレアーゼを導入すること及びその発現を提供することを含む、目的の制限修飾システムをクローニングし、発現する方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、静止期、対数増殖期、保存からの再生期又はその他の増殖期から選択してもよい決定的な増殖期の間に保護の程度を具体的に調べること、及び次いでそのような決定的な増殖期における機能について選択することにより好適な発現ベクターを同定することを含む、保護的修飾メチルトランスフェラーゼ活性の均衡の取れたレベルを産出するための方法に関する。
【００２１】
上記方法は、ＭｓｅＩ制限修飾システムのクローニングと発現によって例示され、システムはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）断片にコードされており、断片は、２つの関連する酵素、すなわち、ＤＮＡ配列５’−ＴＴＡＡ−３’を認識し、この認識配列のＴ残基間のリン酸二エステル結合を切断して２塩基の５’伸長を産出する酵素（Morgan R. D., Nucl. Acids Res., 16:3104, 1988）（以後、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼと呼ぶ）、及び同じＤＮＡ配列、５’−ＴＴＡＡ−３’を認識するが、メチル基を付加することによって修飾し、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断を妨げる、Ｍ．ＭｓｅＩとして知られる第２の酵素をコードする。さらに発明は、それぞれＭ．ＭｓｅＩとは配列で異なり、Ｍ．ＭｓｅＩと同じ機能を実行する、すなわち、メチル基を付加することにより配列５’−ＴＴＡＡ−３’を修飾してＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断を妨げる酵素をコードする、２つの追加的なＤＮＡ断片に関する。本発明はまた、ＤＮＡ断片、ＤＮＡ断片を含有するベクター、このＤＮＡ断片を含有する形質転換された宿主の調製方法、及びかかる形質転換宿主からのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの改良製造方法にも関する。
【００２２】
【課題を解決する手段】
本発明に基づいて製造されるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、従来の技術で作られた制限エンドヌクレアーゼ調製物に一般的に見い出される混入物を含まない。
【００２３】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子ではなく、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子は、一般にメチラーゼ選定として引用される技術に従って得られた（米国特許第５，２００，３３３号、その開示を参考として本明細書に組み入れる）。しかしながら、メチラーゼ選定によって得られたクローンはどれも検出可能なＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を発現しておらず、且つ、一晩のインキュベートの後、ＭｓｅＩ消化から完全には保護されてはいなかった。メチラーゼのクローンを配列決定し、他のＮ６−アデニンメチラーゼとの相同性に基づいてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を同定した。メチラーゼのクローンは検出可能なＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性を生じなかったが、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝子に隣接して位置するらしいことが推測された。従って、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種から、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡをインバースＰＣＲ技術によって増幅し、配列を決定した。
【００２４】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定し、確実に同定するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得た高度に精製したＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。推定アミノ酸配列がＭｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列と一致したオープンリーディングフレームが、インバースＰＣＲ技術によって得られたＤＮＡ配列の中に認められ、メチラーゼ遺伝子の３’側に位置していた。ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、通常の高発現ベクターに適合するベクターでクローニングした。次いで、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅し、ベクターのｐＥＴシリーズのような発現ベクターに連結して、別の適合ベクターで運ばれたＭｓｅＩメチラーゼで予め修飾された宿主に導入した；しかしながら、得られたわずかなかかるコンストラクトではＭｓｅＩ活性は見い出されなかった。以下の更なる結果から、ＭｓｅＩ発現のこの失敗は、メチラーゼの不適当な発現によるものであり、上手く行ったエンドヌクレアーゼの発現は致死的事象となったと思われる。本発明に従って完全に修飾しているベクターを入手した後、エンドヌクレアーゼ遺伝子の誘導に先だって細胞増殖の間、エンドヌクレアーゼの発現を抑制したベクターの構築によってエンドヌクレアーゼの発現も慎重に調節した。このような特別のコンストラクトでエンドヌクレアーゼ遺伝子とメチラーゼ遺伝子を運ぶ宿主を次いで増殖させ、誘導し、回収して、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを作製するのに用いた。
【００２５】
ＭｓｅＩ制限−修飾システムをクローニングし、発現する好ましい方法は、メチラーゼ選定法に従ってメチラーゼ陽性クローンを得ること及びこのようなＭｓｅＩメチラーゼ陽性クローンのＤＮＡ配列を決定することから成る。インバースＰＣＲ技術によりメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡを入手し、配列を決定する。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種からのＭｓｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質をほぼ均質まで精製してＮ−末端のアミノ酸配列を決定する。ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列のデータに基づいてＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。ＭｓｅＩメチラーゼの発現を調整して、宿主に対して毒性になるほど多量のメチラーゼを発現することなく、宿主ゲノムの完全な保護を達成する。急速な対数増殖期にある細胞から得られたＤＮＡをＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの切断に対する保護について調べ、このような急速な増殖条件下で完全な保護を提供するコンストラクトを用いて、この完全なメチル化状態をモニターする。次いで、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のゲノムＤＮＡから完全な遺伝子を増幅し、ｐＶＲ−２４（米国マサチューセッツ州、ベバリーのニューイングランド・バイオラボズ社）のような誘導に先立つ細胞増殖の間、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現を制限するように設計された発現ベクターに連結することによりＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを発現する。十分な調節能を提供する適当な遺伝組成を持った（米国特許出願出願番号第０９／６８９，３５９号）、ＭｓｅＩの切断に対して完全な保護を提供する、別の適合プラスミドで発現されたＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を運ぶことによってＭｓｅＩ部位を予め修飾した宿主にコンストラクトを導入する。適当な発現条件を含めてＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を含有する宿主を増殖させ、細胞を回収し、それからＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製することによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼが製造される。
【００２６】
【発明の実施の形態】
１つの実施態様では、本発明は、同族の制限エンドヌクレアーゼが毒性にならずに存在するあらゆる増殖段階で好ましくは宿主ＤＮＡの完全な保護が認められるような形態で制限酵素による切断からＤＮＡを保護する修飾メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するベクター（完全に保護するメチルトランスフェラーゼベクター）を先ず提供し、次いで所望の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現するベクターを提供することによって目的の制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。 本発明は、修飾メチルトランスフェラーゼが制限酵素による切断に対して保護しなければならないことを除いて、修飾メチルトランスフェラーゼ又は前記制限酵素の特性によって限定されない。
【００２７】
好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼの発現パターンに特に敏感である増殖段階の間に完全な保護を提供するために、メチルトランスフェラーゼの発現を操作することができる調節要素を同定することによって、完全に保護するメチルトランスフェラーゼベクターを入手してもよい。本発明に従って、以下の工程によってこれを実行してもよい：
（１） 公知の方法によってベクターにおけるメチルトランスフェラーゼ遺伝子を入手すること；
（２） 該遺伝子に関して好適な位置にプロモータのような調節要素を入れること；
（３） 所望の宿主細胞における形質転換；
（４） 指数増殖期にある間にプールした形質転換体からベクターを再単離すること；
（５） エンドヌクレアーゼによって消化することによる選定；及び
（６） 生き残っている、消化されていない、従って保護されたベクター集団による新しい宿主の再形質転換。
【００２８】
この方法の工程（４）は、指数増殖期から、又はその他の種々の増殖段階から適宜、例えば、静止期から、炭素又は窒素又はその他の必須栄養素の飢餓により活性化された休止期から、又はＤＮＡの損傷状態のような特別な生理的状態の細胞から、又は酸性培地若しくは毒性化合物のような生理的傷害の原因の存在下での細胞から、単離されたプールしたベクターによって実行されてもよいことは当業者に理解されるだろう。
【００２９】
好ましい実施態様では、前記工程（２）の調節要素は、以下の工程を含む方法によって同定される。すなわち、
（ａ）種々の異なった調節要素を含有する断片のプールを所望の位置で、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するベクターにクローニングすること；及び
（ｂ）前記工程（３）から（６）までを続行すること。
【００３０】
さらに改善されたものを選択するために前記工程（３）から（６）までを含む選定方法を反復してもよいことは当業者にさらに理解されるだろう。
【００３１】
前記工程（２ａ）、同一又は異なった位置で調節要素を含有する断片のプールをクローニングすることを反復し、続いて適宜、選定を反復してもよいことは当業者にさらに理解されるだろう。
【００３２】
本発明は、プロモータ、オペレータ、エンハンサ又は下流の調節要素であってもよい調節要素の個性によって限定されない。
【００３３】
好ましい実施態様では、前記工程（１）のメチルトランスフェラーゼはメチラーゼ選定法によって単離される（米国特許第５，２００，３３３号）。 本発明は、この方法によって単離されるメチルトランスフェラーゼ遺伝子に限定されず、 上記の方法、例えば、ファージ選定、天然プラスミドのサブクローニング、ＤＮＡの損傷によって誘導可能なＳＯＳ反応の誘導に基づいた同定、精製タンパク質のアミノ酸配列に基づいたインバースＰＣＲ、又は他のメチルトランスフェラーゼの配列に対する類似性から配列データベースにおいて同定し、続いてＰＣＲによるクローニング若しくは方法に基づいたサザンブロットのいずれかによって単離された遺伝子を包含する（Kong, et al., Nucleic Acids Res., 28:3216-3223, 2000）。
【００３４】
好ましい実施態様では、前記工程（２ａ）の異なった調節要素の収集は、変異誘発された断片の調製物に存在する可能性があるような混入する染色体断片と共に、エラー傾向のＰＣＲにより無作為に変異誘発されたＳ．ｔｙｈｉｍｕｒｉｕｍのｈｉｓプロモータのコピーを含む。本発明は、このようにして得られた断片に限定されず、大腸菌若しくは別の生物のゲノムＤＮＡから単離された断片、又は無作為な位置若しくは特定の位置での同義性配列によるオリゴヌクレオチド合成によってもたらされる断片、又は無作為若しくは特定の断片収集の組換え的ＰＣＲによりもたらされる断片の収集を包含する。好ましい実施態様では、このようにして得られる調節要素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列である。
【００３５】
本発明による方法は、該当する制限エンドヌクレアーゼによる切断からの保護を与えるどのメチルトランスフェラーゼに適用されてもよく、単に、どれが特定の天然単離物における前記エンドヌクレアーゼと共に共起するだけではないことが当業者にさらに理解されるだろう。
【００３６】
本発明は、さらに、それが含有される生物を先ず培養するのではなく、環境資源のＤＮＡから所望の特異性のメチルトランスフェラーゼを単離することに関する。好ましい実施態様では、このような遺伝子は、米国ネバダ州のディクシー・バレー・ホット・スプリングにて６８℃で増殖している原核生物の混合緑色細糸と台座の群生試料から得たＤＮＡからメチラーゼ選定によって単離される。
【００３７】
本発明はさらに、誘導の非存在下では極めて低いレベルのタンパク質が発現されるように、厳重な調節でベクターから発現された所望の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の供給に関する（極めて低い基本的な発現が認められる）。好ましい実施態様では、この厳重な調節ベクターは、ＷＯ第９９／１１８２１号及び米国特許出願出願番号第０９／４８６，３５６号に記載されているようなクローン化された目的遺伝子を介して読み取る、拮抗的な、且つ独立して調節可能なプロモータを伴うベクターを含むが、この目的のために使用される、予め存在するベクターｐＬＴ７Ｋに存在するよりも低いコピー数を提供することにより基本的な発現はさらに低くされている。好ましい実施態様では、ｐＬＴ７Ｋの複製開始点をｐＡＣＹＣ１８４のそれと交換することによってベクターのコピー数を低くする。その他の複製開始点も使用してもよい；例えば、ｐＳＣ１０１（Stoker, et al., Gene 18:335-341, 1982）、ｐＳＹＸ２０（米国特許第５，２６２，３１３号）、Ｆ（Shizuya, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(18):8794-8797. 1992）、又はその他のコピー数の少ないベクター（Harayama, et al., Mol. Gen. Genet., 184:52-55, 1981及びWohlfarth, et al., J. Gen. Microbiol., 134:433-440, 1988）である。好ましい実施態様では、ベクターはｐＶＲ−２４である。
【００３８】
好ましい実施態様では、添付の米国特許出願、出願番号第０９／７０１，６２６号に記載されるような、目的遺伝子を翻訳することができる方向で負の調節因子の発現を高いレベルで発現する株を採用することによって、基本的な発現レベルをさらに低下させることが達成される。
【００３９】
上記の方法は、本発明のもう１つの実施態様、即ち、ＭｓｅＩ制限−修飾システムのクローニング及び発現における例示となる。
【００４０】
本発明は、また、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを産生する微生物株を含む新規なＤＮＡコンストラクト及び新規な組成物も提供する。本発明において関心が向けられている制限エンドヌクレアーゼ、ＭｓｅＩは、ＤＮＡ配列５’−ＴＴＡＡ−３’を認識し、この認識配列のＴ残基間においてリン酸二エステル結合を切断して、２塩基５’伸長を生じる。
【００４１】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを過剰発現させるために、公知のメチラーゼ選定法（米国特許第５，２００，３３３号）を超えて追加の工程が必要とされ、それには、特に、宿主に対して毒性になるほど多量のメチルトランスフェラーゼを産生しないが、ｉｎ ｖｉｖｏでＭｓｅＩの消化から宿主のゲノムＤＮＡを完全に保護するために微妙に均衡の取れたＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼの発現が包含される。極めて急激な細胞増殖の間（指数増殖期）でさえＭｓｅＩエンドヌクレアーゼに対する完全な保護が認められるように発現を最適化したｍｓｅＩＭ遺伝子を含有するベクターを先ず用いて、大腸菌宿主を修飾する。次いで、ｍｓｅＩＲ遺伝子を含有する、例えばｐＶＲ−２５のような適合するベクターでこの宿主を形質転換し、その後適当な抗生物質プレート上で両ベクターを含有するコロニーを選定する。個々の形質転換体を増殖させ、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする（以下の実施例５のように）ことによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ産生コンストラクトを同定する。
【００４２】
ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子及びＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を好ましくは大腸菌でクローニングし、発現させる、本明細書に記載された方法は、以下の工程を採用する。
１）ＭｓｅＩによる切断から保護するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
ＤＮＡ修飾メチラーゼが相当する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することによって配列の範囲内で１つの又はその他のヌクレオチドを化学的に修飾することは周知である。このメチル化の後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合されることはなく、切断されることもない。細菌細胞のＤＮＡは常にその修飾メチラーゼによって完全に修飾されており、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感受性である。この状況では、修飾されていない、従って識別可能な外来ＤＮＡのみが、制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に感受性である。本方法の第１の工程は、ＭｓｅＩによる切断から保護するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を同定することである。これを達成するためにＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のＤＮＡメチラーゼ（ＮＥＢ４４６）をクローニングすることができる。別の方法としては、米国特許第５，１７９，０１５号に記載されたように、ＭｓｅＩのＲ−Ｍシステム以外のＲ−Ｍシステムから、ＭｓｅＩ制限酵素による消化を防ぐためにＤＮＡを保護的に修飾することができるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを同定することができる。本発明では、ＭｓｅＩ制限酵素による消化からＤＮＡを保護することができる３種のメチラーゼＤＮＡを同定した。
【００４３】
先ず、全ゲノムＤＮＡをＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（小球菌）（ＮＥＢ＃４４６）から精製した。およそ１〜１０キロベース（ｋｂ）の長さの断片を作製するために頻回切断エンドヌクレアーゼ、Ｓａｕ３ＡＩでＤＮＡを部分的に消化することによって、このＤＮＡのランダムライブラリを構築した。予めＢａｍＨＩで開裂し、脱リン酸化したベクター、ｐＢＲ３２２にこのような断片を連結した。連結反応物で化学的に応答能のある（コンピテント）大腸菌ＥＲ２５０２細胞を形質転換した。形質転換体をプールし、プラスミドは１次プラスミドライブラリを形成するために精製された集団だった。この精製されたプラスミドの部分試料をＭｓｅＩで消化して、ｉｎ ｖｉｖｏにてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を発現していなかった、従って消化からプラスミドＤＮＡを保護していなかったプラスミドをすべて破壊した。消化したプラスミドプールで再び大腸菌ＥＲ２５０２を形質転換して、ＭｓｅＩメチラーゼを発現している、無傷のプラスミドを回収した。個々のクローンを選び、プラスミドＤＮＡを精製して、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断に暴露した。ＭｓｅＩによって切断されなかったプラスミドがＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有していた。
【００４４】
好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から入手可能な制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩに対して保護するものであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で特定されるタンパク質をコードすることができる配列のセットの間から選択してもよい。このようなタンパク質は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で述べられているＤＮＡ配列でコードされてもよい。
【００４５】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断からＤＮＡを保護することができる代替メチルトランスフェラーゼＤＮＡを探すために、１又はそれより多くのＭｓｅＩ制限部位を含有するベクターでＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種以外のＤＮＡ源に由来するクローンのライブラリを構築してもよい。次いで、保護しないクローンを破壊するための１回又はそれより多い回数のＭｓｅＩによる消化、続いて保護されたクローンを回収するための消化したプラスミドによる形質転換によってこのクローンのライブラリを選定する。かかるライブラリは、米国ネバダ州のディクシー・バレー・ホット・スプリングにて６８℃で増殖している原核生物の混合緑色細糸と台座の群生試料から単離されたＤＮＡ（『環境からのＤＮＡ』と命名された）から作成される。精製した環境からのＤＮＡをＮｓｉＩエンドヌクレアーゼで消化し、予めＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、脱リン酸化したベクターｐＮＥＢ１９３に連結した。エレクトロポレーションにより連結反応物で大腸菌ＥＲ２６８３を形質転換した。形質転換体をプールし、プラスミド集団を精製して１次プラスミドライブラリを作製した。このような精製プラスミドの部分試料を過剰のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、ＥＲ２６８３を形質転換するのに用いた。得られた形質転換体のプラスミドをミニプレップし、ＭｓｅＩ制限酵素による消化及びそれに続く寒天ゲル電気泳動によって解析した。調べた９種のプラスミドがＭｓｅＩの消化に抵抗性であることが見い出され、それぞれ、ＭｓｅＩによる切断からＤＮＡを保護するように機能する２種の異なったメチラーゼ遺伝子の１つをコードしていることが判明した。２種のメチラーゼ遺伝子は、ｅｓａＤｉｘ４ＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤＮＯ：４）及びｅｓａＤｉｘ５ＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と命名された。このようなクローンから調製された細胞粗抽出物の分析では、エンドヌクレアーゼ活性は示されなかった。宿主自体のＤＮＡを保護するのにこのようなメチルトランスフェラーゼ又はそのようなその他のものを用いてもよく、従ってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを首尾よく発現させることができる。
【００４６】
２） ＭｓｅＩ制限−修飾システム全体の配列決定
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子ではなくＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子は一般に、上記工程１）のように、メチラーゼ選定（米国特許第５，２００，３３３号）と呼ばれる技法に基づいて得られる。しかしながら、メチラーゼ選定によって得られたクローンはいずれも検出可能なＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。ＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列決定装置によって通常の技法を用いて、１つのメチラーゼクローンを配列決定した。その他のＮ６−アデニンメチラーゼに対するアミノ酸の相同性に基づいてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を同定した。メチラーゼクローンはいかなる検出可能なＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性も産生しなかったが、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝子に隣接して位置するらしいことが推測された。従って、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から得られたＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡをインバースＰＣＲ技法によって、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のゲノムＤＮＡから増幅して、配列を決定した。
【００４７】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定し、それを同定するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得た高度に精製したＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ−末端のアミノ酸配列を決定した。ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼは以下の実施例ＩＩＩに述べるようにＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から精製してもよい。インバースＰＣＲ技法で得られた、メチラーゼ遺伝子の３’に位置するＤＮＡ配列の中に、推定アミノ酸配列が、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列と一致するオープンリーディングフレームが認められた。
【００４８】
別の方法としては、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）に由来するＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部をＰＣＲで増幅するための同義性オリゴヌクレオチドのプライマーを設計するのに、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列を用いることができる。次いで、得られたＤＮＡ配列を用いて、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のこの元来の部分のどちら側でもＤＮＡのインバースＰＣＲ増幅を導くことができ、上記のようにこのＤＮＡ配列においてｍｓｅＩＭ遺伝子及びＭｓｅＩ遺伝子を同定することができる。ＭｓｅＩ制限−修飾システム全体をクローニングし、配列を決定するために両方の方法を用いた。
【００４９】
３） ＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼの発現の微妙な最適化
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ及びＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼに対する完全な遺伝子がいったん同定されると（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、発現を提供するために種々の方法によってそれらを操作してもよい。上記で得られたメチラーゼのコンストラクトを用いて、ｐＥＴシリーズのベクター（米国ウィスコンシン州、マジソン、ノバジェン社（Novagen））を用いたＴ７プロモータ制御のもとでＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を精力的に試みたが、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを産生するクローンを得ることはできなかった。
【００５０】
メチラーゼ遺伝子の前に第２の制御可能なプロモータを導入すること、エンドヌクレアーゼ遺伝子のためにコピー数の少ないレプリコンを用い、且つエンドヌクレアーゼ遺伝子の導入に先だって宿主においてＬａｃＩリプレッサのコピー数を増やすことを含む、方法の独特の組合せを用いて、組換えＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの過剰発現を制御した。
【００５１】
細胞が指数増殖期で急激に増殖している場合、メチラーゼ選定によって得られたメチラーゼのコンストラクトは宿主の大腸菌の染色体ＤＮＡを完全には保護しないことが認められた。ｍｓｅＩＲが細胞に上手く導入され、発現されるようにメチラーゼの発現を高め、従って宿主のＤＮＡを完全に保護するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のＤＮＡからメチラーゼ遺伝子を増幅し、種々の強度で構成プロモータの発現下にてベクターのファミリー（ｐＮＫシリーズ、以下の実施例ＩＶを参照のこと）でクローニングした。この試みでは、２つの最高レベルのプロモータの発現に対してメチラーゼのコンストラクトは得られず、我々はメチラーゼの過剰発現による細胞への毒性のためであると考えている。２つのさらに低いレベルで発現しているプロモータを伴ったコンストラクトは、指数増殖期でチェックした場合、ＭｓｅＩによる切断に対して宿主を完全に保護することはできなかった。急激な増殖の間、宿主ＤＮＡを完全に保護するが、毒性レベルよりは低く保つようにメチラーゼの発現を高めるために、プロモータコンストラクトの１つでエラー傾向のＰＣＲによってプロモータ領域において無作為変異誘発を行った。上記で引用したメチラーゼ選定技法を用いて、ＭｓｅＩメチラーゼを発現している変異クローンを選択し、次いで、指数増殖期の細胞を回収し、このような宿主細胞からＤＮＡを精製し、ＭｓｅＩの切断からの完全な保護について調べることによって、急激な指数増殖の間にＭｓｅＩの切断から宿主のゲノムＤＮＡを完全に保護する能力について個々のクローンを調べた。次いで、ＭｓｅＩに対して完全に保護することが見い出されたコンストラクトの１つを、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現に用いた。
【００５２】
宿主細胞の増殖のあらゆる段階で完全な保護を達成するためにメチルトランスフェラーゼの発現を調整するこの方法が、エンドヌクレアーゼが宿主細胞で発現するのが困難であるか又は発現が不可能であることを示すその他のシステムに適用可能であることを立証してもよい（米国特許第６，０２５，１７９号及び第６，０４８，７３１号を参照のこと）。
【００５３】
４）誘導可能なプロモータの制御下におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの発現
本発明の組換えＭｓｅＩの発現を最適化するために、誘導可能な又は構成プロモータが周知であり、組換え宿主において高いレベルでｍｓｅＩＲ遺伝子を発現するのに用いてもよい。同様に、高いレベルの発現を達成するために、公知のコピー数の多いベクターを使用してもよい。本発明に従って、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に特に好ましい方法は、例えばｐＶＲ−２４（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）のような、誘導に先立つ細胞増殖の間、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現を制限するように設計された発現ベクターである。このプラスミドは、複製機能（ｏｒｉ）をコードする断片、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ）、クローニングに好適な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接するカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含有する。ｃＩ８５７遺伝子は、ラムダ・バクテリオファージのリプレッサタンパク質の変異型をコードし、ＰＬ及びＰＲ（ラムダ・バクテリオファージの主要なそれぞれ左側及び右側のプロモータ）を重ね合わせるＤＮＡ配列に条件付きで結合する。ｌａｃＩ遺伝子は、リプレッサタンパク質、ＬａｃＩをコードし、ＰＴ７（バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写プロモータ）を重ね合わせるように構築されているＤＮＡ配列（ｌａｃオペレータ）に条件付きで結合する。 簡単に言えば、ＩＰＴＧの非存在下の高温（４２℃）ではアンチセンス・プロモータが活性を持つが、ＰＴ７はＬａｃＩによって抑制される。３０℃でＩＰＴＧ存在下では発現はＰＴ７から起きる（図１４及び１５を参照のこと）。中間の温度で中間の濃度のＩＰＴＧがあると、中間レベルの発現が得られる。
【００５４】
制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定的なクローンを得るために、宿主は一般に制限エンドヌクレアーゼの消化から予め保護される。本発明では、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子をクローニングすることによって、又は、ＭｓｅＩの切断に対して完全な保護を提供する方式で別の適合プラスミドに発現されている、例えば、ｅｓａＤｉｘ４ＩＭ若しくはｅｓａＤｉｘ５ＩＭのようなＭｓｅＩの切断に対して保護するもう１つのメチラーゼ遺伝子をクローニングすることによって、これを達成する。以下の実施例５に示されるように、新規のプロモータ配列をコードするＤＮＡ断片がＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子に先行する場合、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子コンストラクト及び／又はそのｍＲＮＡを含有する発現プラスミドの安定性が改善されうることが判明した。ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ及び保護的メチラーゼ遺伝子を含有する宿主を増殖させ、適当な発現条件で誘導し、細胞を回収して、それからＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製することによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼは製造される。
【００５５】
本発明はさらに、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子及びＭｓｅＩの切断から宿主ＤＮＡを保護するメチルトランスフェラーゼＤＮＡをコードする遺伝子が微生物に導入され、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下で生物を増殖させ、それを回収し、それからＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製するように前記微生物を形質転換するために組換えＤＮＡ修飾法を用いる、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法を提供する。
【００５６】
上記で概略が述べられた工程は、本発明を実施するのに好ましい態様を表しているが、公知の技術に従って上述のアプローチを変えることができることは当業者に明らかであろう。
【００５７】
実際に実施するにあたり好ましいため、本発明の実施態様を説明するために以下の実施例を示す。このような実施例はあくまでも例となるものであって、本発明は、本明細書の請求項を除いて、それらに制約されるとはみなされない。
【００５８】
上記及び下記で引用した引用文献は参考として本明細書に組み入れられている。
【００５９】
【実施例】
実施例１：ＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｍｓｅＩＭ）のクローニング
１ＬのＬＢブロス培地中で一晩、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）を増殖させ、細胞を回収し、製造元の指示書に従ってキアゲンのゲノムチップ１００／ＧゲノムＤＮＡ精製キット（カタログ番号１０２４３）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。Ｓａｕ３ＡＩでゲノムＤＮＡを部分的に消化して１〜１０ｋｂの断片を作製し、この切断されたゲノムＤＮＡの２０μｇを、ＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化した３μｇのｐＢＲ３２２に連結した。連結混合物で大腸菌株ＥＲ２５０２を形質転換した。およそ１００，０００の形質転換体が得られた。形質転換体をプールし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢブロス培地で増殖させ、プラスミド集団を精製して１次プラスミド・ライブラリを形成した。このプラスミド・ライブラリ、２μｇを過剰のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化してＥＲ２５０５を形質転換するのに用いた。得られた形質転換体のプラスミドを２回目の選定の対象とした。８０の形質転換体が得られ、これらのうち１６のプラスミドＤＮＡをＭｓｅＩ制限酵素消化、続いて寒天ゲル電気泳動によって分析した。調べられた１６のプラスミドのうち１４はＭｓｅＩの消化に抵抗性であることが判明し、およそ１．６ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片上に同一のｍｓｅＩＭ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２）を持つことが判明した。これら１４のクローンから調製された細胞の粗抽出物の分析は、ＭｓｅＩ活性を示さなかった。
【００６０】
実施例２：ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断に対してＤＮＡを保護している環境からのＤＮＡ試料からの２つのメチラーゼＤＮＡのクローニング
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断からＤＮＡを保護することができる代替メチルトランスフェラーゼＤＮＡを探すために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ４４６）以外のＤＮＡ源からのクローンのライブラリを、１又はそれより多くのＭｓｅＩ制限部位を含有するベクター内に構築してもよい。次いで、このクローンのライブラリは保護していないクローンを破壊するために１又はそれより多くの回数のＭｓｅＩ消化、続いて上記実施例Ｉのような、保護されたクローンを回収するための消化されたプラスミドによる形質転換によって上記のように選定される。ネバダ州、ディクシーバレーのホットスプリングで６８℃にて増殖している原核生物の混合緑色細糸と台座の群生試料から単離されたＤＮＡから、かかるライブラリを創った。２μｇのＤＮＡをＮｓｉＩエンドヌクレアーゼで消化し、予めＰｓｔＩで切断し、脱リン酸化した１μｇのベクターｐＮＥＢ１９３に連結した。エレクトロポレーションにより連結反応物で大腸菌ＥＲ２６８３を形質転換し、およそ１，０００，０００の形質転換体を得た。形質転換体をプールし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢブロス培地で増殖させ、プラスミド集団を精製して１次プラスミド・ライブラリを形成した。このプラスミド・ライブラリの１μｇを過剰のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化して、ＥＲ２６８３を形質転換するのに用いた。得られた形質転換体のプラスミドをミニプレップし、ＭｓｅＩ制限酵素消化とそれに続く寒天ゲル電気泳動によって解析した。調べられた９プラスミドは、ＭｓｅＩ消化に抵抗性であることが判明し、両者共ＭｓｅＩによる切断からＤＮＡを保護するように機能する２つの異なったメチラーゼ遺伝子のいずれか１つをコードすることが判明した。これら２つのメチラーゼをｅｓａＤｉｘ４ＩＭ及びｅｓａＤｉｘ５ＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と命名した。これらのクローンから調製された細胞粗抽出物の分析は、エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。これらのメチルトランスフェラーゼ又はそのような他のものを用いて宿主自体のＤＮＡを保護してもよく、従ってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを上手く発現することができる。
【００６１】
実施例３：Ｎ−末端アミノ酸配列及びインバースＰＣＲ法により得られたＭｓｅＩメチラーゼに隣接するＤＮＡ配列を用いたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の同定及び配列決定
（Ａ）Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種に由来するＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのほぼ均質になるまでの精製
３０℃にてＬＢ培地中でＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）の細胞を増殖させた。２０時間の増殖の後、遠心により細胞を回収し、使用するまで−７０℃に保管した。手順のすべては氷上にて又は４℃にて行った。実施例ＶＩと同様の図式に従ってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製した。およそ１０，０００単位のＭｓｅＩ活性をほぼ均質になるまで精製した。１６μｌのピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルに載せて、電気泳動を行った。クマシーブルーＲ２５０にてゲルを染色し、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に相当する約２１ｋＤの顕著なバンドが認められた。
【００６２】
（Ｂ）ＭｓｅＩタンパク質のアミノ末端の配列
記載されたように調製されたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを電気泳動し、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（Matsudaira, P., J. Biol. Chem., 262:10035-10038, 1987）の方法に従い、以前記載されたように改変して電気的にブロットした（Looney, et al., Gene 80:193-208, 1989）。クマシーブルーＲ−２５０で膜を染色し、約２１ｋｄのタンパク質バンドを切り出し、パーキンエルマー社（米国カリフォルニア州、フォスターシティ）のアプライド・バイオシステムズ・ディビジョンのモデル４０７Ａガス相タンパク質シーケンサーによる連続分解を行った（Waite-Rees, et al., J. Bacteriol., 173:5207-5219, 1991）。２１ｋＤのタンパク質の最初の２５残基は（Ｍｅｔ）−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｘｘｘ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｘｘｘ−Ｔｙｒ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）に相当した。このデータを用いて、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列と比較し、エンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
【００６３】
（Ｃ）ｍｓｅＩＭメチラーゼに隣接するＤＮＡ配列の決定
インバースＰＣＲの増幅のための鋳型調製：５０μｌの反応容量にて１ｘＮＥＢ緩衝液＃４中で３７℃にて１時間、１μｇのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）のＤＮＡを１０単位のＨａｅＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。７５℃にて２０分間インキュベートすることによりＨａｅＩＩ酵素を熱失活させた。５０μｌの１０ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液及び４００μｌのｄＨ２Ｏ、続いて５μｌ（２０００ＮＥＢ単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃２０２）を加え、１６℃にて１６時間インキュベートすることによって、ＨａｅＩＩで消化したＤＮＡを環化した。次いで、続いて行うインバースＰＣＲ反応用鋳型として、この環化連結反応物の一部を用いた。
【００６４】
以下に示した配列のプライマー、ＭｓｅＩ−ＩＰ１及びＭｓｅＩ−ＩＰ２を合成した。これらプライマーをＭｓｅＩエンドヌクレアーゼとハイブリッド形成させ、互いに関して反対向きに向かせる。
【００６５】
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ１
５’−ＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＣ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ２
５’−ＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＧＴＣＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
【００６６】
産物を増幅するのに成功した反応では、以下を組合せて反応ミックスを作製した。
１０μｌの１０ｘベント（登録商標名）反応緩衝液
６μｌの４ｍＭ−ｄＮＴＰ溶液
５μｌの１０μＭ濃度のプライマーＭｓｅＩ−ＩＰ１
５μｌの１０μＭ濃度のプライマーＭｓｅＩ−ＩＰ２
３μｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４（Ｍｇ＋＋の最終濃度５ｍＭ）
１２．５μｌの環化ＤＮＡ鋳型（およそ２５ｎｇ）
５８μｌのｄＨ２Ｏ
２μｌ（４単位）のベント（登録商標名）エクソ−ポリメラーゼＮＥＢ＃２５７
【００６７】
ＰＣＲの増幅条件は：９５℃にて３分間が１サイクル、続いて９５℃にて３０秒間、５２℃にて３０秒間及び７２℃にて１．５分間が４サイクル、続いて９５℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１．５分間が２０サイクルであった。０．８％寒天ゲルの電気泳動によって１０μｌのＰＣＲ反応物を分析した。
【００６８】
ＨａｅＩＩ環状鋳型ＰＣＲ反応においておよそ１３５０塩基対の産物が認められた。産物をゲルで精製し、２５μｌのＤＮＡ（１ｘＴＥ）緩衝液に浮遊した。次いで、配列決定プライマーとして上記のＰＣＲプライマーを用いて、製造元の指示書に従い、ＡＢＩ３７３自動配列決定システムによってこのＰＣＲ産物の配列を決定した。さらに、以下のプライマーで同様の反応においてＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ領域をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物を配列決定した。
【００６９】
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ３
５’−ＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＴＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ４
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＧＴＡＣＣＧＡＧＣＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
【００７０】
ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列をアミノ酸翻訳したものとＭｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列のデータを比較することによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。ＭｓｅＩメチラーゼと同一方向を向き、メチラーゼ遺伝子と７個のアミノ酸残基が重なり合っているオープンリーディングフレームが見い出され、その中では、ＤＮＡ配列をコードする最初の２５個のアミノ酸が、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質から決定されたアミノ酸配列に一致していた。
【００７１】
ゲノムプライミングシステム（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ）のＧＰＳ（登録商標名）−１を用いて、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を持つ挿入物の配列決定を行った。ＧＰＳ（登録商標名）−１は、カナマイシン耐性のｎｐｔＩＩ遺伝子と共に修飾されたＴｎ７を含有しており、製造元（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）の指示書に従って、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子の一部を含有するｐＶＲ−１８及びｐＮＥＢ１９３においてｉｎ ｖｉｔｒｏにて挿入物を作成した。次いで、ＧＰＳ（登録商標名）−１キット（トランスプライマーのそれぞれ左端及び右端に対するプライマーＳ及びプライマーＮ）に含まれるプライマーを用いて、製造元の指示書に従ってＡＢＩ３７３自動配列決定システムを用いて、これら挿入物の配列を決定した。
【００７２】
実施例４：ＭｓｅＩＭの発現の最適化
（１）構成プロモータの別の強度のもとにＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を配置すること
ＭｓｅＩメチラーゼの構成的発現の範囲を達成するために、異なった強度の構成プロモータを含有するｐＮＫベクターの関連するファミリー（Ｎ．Ｋｌｅｃｋｎｅｒによる供与）を利用した。このようなプラスミドは、ＢａｍＨＩ部位の上流にＷＴ又は変異型ｐＨｉｓプロモータのどちらかを含有し、ＲＳ４１５プラスミドの誘導体である（Simons, et al., Gene, 53:85-96, 1987）。名称とプロモータ強度は以下のとおりである
【００７３】
【表１】
【００７４】
ＢａｍＨＩ、ＭｕｎＩ及びＢａｎＩＩで上記プラスミドを消化し、構成プロモータを含有するベクターの骨格をゲルで精製した（類似する大きさのプラスミド断片を除去することによってベクター骨格のゲルによる精製を助けるために、ＢａｎＩＩ消化を含めた）。
【００７５】
上述の構成プロモータの下流に挿入するのにＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を調製するために、ベント（登録商標名）ＤＮＡポリメラーゼ、１ｘサーモポル緩衝液、４ｍＭのＭｇＳＯ４、１００μｌのＰＣＲ反応物における鋳型としてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を含有する８０ｎｇのｐＶＲ１９プラスミド（Ｒ．Ｖａｉｓｖｉｌａ）、及びメチラーゼ遺伝子に関してＢａｍＨＩ部位の上流に導入する、５’−ＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）プライマー並びにＭｆｅＩ部位の下流に導入する５’−ＡＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）プライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃にて１０秒間、６０℃にて６０秒間及び７２℃にて７５秒間を２５サイクル行った。キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いて、得られた１０１９塩基対のＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩとＭｕｎＩで順に消化し、キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いてもう１回精製した。
【００７６】
４つのＢａｍＨＩ−ＭｕｎＩベクター骨格すべてにＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を連結し、ＥＲ２６８８細胞を形質転換して、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（リットル当り１グラムのグルコースと１グラムのＭｇＣｌ２を補った；以下補完ＬＢという）寒天プレートに播いた。しかしながら、おそらく細胞における高いレベルのメチル化に由来する不安定性のために、発現の最も高い２つのレベルのもとにＭｓｅＩメチラーゼを配置するという試みは失敗した。さらに低い２つのレベルの発現を含有するコンストラクト、ｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ及びｐＮＫＲ２２１３ＭｓｅＩｍは、このような細胞から精製したプラスミドＤＮＡのＭｓｅＩによる制限（５０μｌ容量における１μｇのプラスミドＤＮＡ、２０単位のＭｓｅＩで３７℃にて１時間）に対する感受性により判断されるように、細胞性ＤＮＡの完全なメチル化は生じなかった。
【００７７】
（２)エラー傾向ＰＣＲによる無作為に変異誘発を行った構成プロモータのライブラリの構築
ｐＮＫＲ２２１３ＭｓｅＩｍと明らかに不安定なｐＮＫＲ１７８６ＭｓｅＩｍとの間の、ＭｓｅＩメチラーゼに対する中間レベルのプロモータコンストラクトを見つけるために、構成プロモータ領域を無作為ＰＣＲ変異誘発と選定の対象とした。変異誘発プロトコールでは、高レベルのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１００μｌの反応容量当り５単位）、不均等ｄＮＴＰプール（１．２ｍＭのｄＣＴＰとＴＴＰ；０．２ｍＭのｄＡＴＰとｄＧＴＰ）、高レベルのＭｇＣｌ２（７ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（０．５ｍＭ）の存在、１００μｌ容量当り２ｎｇのｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ及びサイクル数の多い（３５）ＰＣＲを採用した。ＡｇｅＩ制限部位及びＢａｍＨＩ制限部位でＭｓｅＩメチラーゼに隣接するプライマーはそれぞれ、５’−ＧＣＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）及び５’−ＧＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。
【００７８】
ＰＣＲの後、ＡｇｅＩ及びＢａｍＨＩで変異誘発したプロモータコピーを切断し、キアゲンのゲル精製キットでゲルによる精製を行い、その内因性構成プロモータを精製して除いた、ＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ制限部位を持つｐＮＫＲＭｓｅＩｍコンストラクトに連結した。ＥＲ２６８８コンピテント細胞にエレクトロポレーションした後、２０，０００個のコロニーを得た。このようなコロニーをプールし、キアゲン精製プロトコールを用いてプラスミドを精製した。これによって、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子の上流に無作為で変異誘発された構成プロモータのライブラリが構築された。
【００７９】
（３）ＭｓｅＩ制限切断に耐性のプラスミドをもたらすクローンの選定
安定な、高レベルのメチル化を生じる変異誘発された構成プロモータを処理するプラスミドを選定するために、５μｇのプラスミドライブラリをＭｓｅＩ制限（５μｇのＤＮＡ、５０単位のＭｓｅＩ）に３７℃で４時間暴露し、続いて６５℃で２０分インキュベートしてＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを不活化した。暴露したプールの一部（２５０ｎｇ）でＥＲ２６８８カルシウム−コンピテント細胞を形質転換し、補完ＬＢ寒天プレートに播いて、３７℃にて一晩増殖させた。これによって６３コロニーが生じた。
【００８０】
６３コロニーのうち６個を無作為に選択し、さらに個々の実験を行った；１０ｍｌの補完ＬＢ培地中での一晩の増殖の後、キアゲンのキア−プレップスピン・ミニプレップ・プロトコールを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。１００ｎｇの精製プラスミドＤＮＡを３７℃にて３０分間２０単位のＭｓｅＩに暴露すると、６個すべて完全に制限されたということは、不適当なレベルのメチル化を示している。
【００８１】
残りの５７コロニーをプールし、キアゲンのプラスミド精製プロトコールを用いてプラスミドの精製を行った。このプラスミドのプールから、５０ｎｇをさらに長い（一晩）５０単位のＭｓｅＩ暴露の対象とし、続いて６５℃にて２０分間インキュベートしてＭｓｅＩの制限エンドヌクレアーゼを不活化した。暴露したプールの一部（４ｎｇ）でＥＲ２６８８カルシウム−コンピテント細胞を形質転換し、補完ＬＢ寒天プレートに播いて、３７℃にて一晩増殖させた。これによって１３コロニーが生じた。
【００８２】
１３コロニーのうち９個を無作為に選択し、さらに個々の実験を行った；一晩の増殖及び以前記載したようなプラスミドの精製の後、１μｇのプラスミドＤＮＡを５０μｌの反応容量中の５０単位のＭｓｅＩとともに３７℃にて一晩インキュベートすると、９個のうち７個で完全にメチル化されたことが判明した。
【００８３】
細胞に存在するメチル化のレベルをさらに立証するために、培養の対数増殖期の間にプラスミド精製のために７コロニーを回収した（一晩の培養を新鮮な補完ＬＢ増殖培地で１：１００に希釈した４時間後、３７℃にて、細胞を回収した。）。かかる細胞は、発現されたＭｓｅＩメチラーゼによるメチル化が完全なメチル化を達成することができないような速度でＤＮＡを複製していることが予想される。キアゲンのキア−プレップ精製プロトコールを用いて、このような対数的に増殖している培養からプラスミドＤＮＡを精製し、０．５μｇのこのプラスミドＤＮＡを３７℃にて一晩、５０単位のＭｓｅＩとインキュベートした。このさらにメチル化が困難な基準を用いて、７コロニーのうち３個が完全に保護され（メチル化され）、制限切断に抵抗性であった。
【００８４】
安定で、完全なレベルのＭｓｅＩメチル化を生じる３個のクローン（＃４、＃９及び＃１０）は、ＡｇｅＩ及びＢａｍＨＩでマッピングすることによって、及びプロモータ領域の上流にアニーリング部位を持つプライマーを用いて配列決定することによって調べられたプロモータ領域を有していた（５’−ＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＡＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９））。３クローンのうち２個（＃９と＃１０）は同一であり；従って、記載された２段階選定工程によって、結果として、安定な、ＭｓｅＩメチル化の完全なレベルが得られる２つの別々のプロモータが見い出された。
【００８５】
思いがけないことに、両プロモータ＃４及び＃９／＃１０は、実験設計したような変異誘発された構成プロモータではなかったが、その代わり、プラスミド調製物に存在する低レベルの大腸菌ＤＮＡの混入に起源があるに違いないＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ大腸菌配列であった。
【００８６】
＃４プロモータは、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩのマッピングによれば、約１０００塩基対の長さであると思われ、配列決定によれば、最初の４３８塩基対は、大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５区分３４９（寄託受入番号、第ＡＥ０００４５９号）の塩基番号７８１３〜８２５１と同一であった。配列データを調べると、ＢａｍＨＩ部位は、塩基番号８８１４で見い出され、それによって１００２塩基対のＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ大腸菌断片が得られた。この大腸菌配列は、ｙｉｇＷ＿２ｏｒｆの５’末端及び２つの予測されたプロモータを含有しており、そのうちの１つは、ＭｓｅＩメチラーゼと同一方向を向いている（８６７２〜８７０４番目）。
【００８７】
＃９／＃１０プロモータのマッピングは、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩによって約４２０塩基対の長さであると思われ；配列決定によれば、プロモータは大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５の区分４１（寄託受入番号、第ＡＥ０００１５１号）の塩基番号２５１１〜２９９８と同一であった。これによって４８８塩基対のＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ大腸菌断片が決定され、それは、ｃｏｆ ｏｒｆの５’末端及び塩基番号２６０５〜２６３２及び２７１４〜２７４２にてＭｓｅＩメチラーゼと同じ方向を向いた２つの予測されたプロモータを含有する。この＃９／＃１０の配列を用いてさらに調べた。
【００８８】
（４）ＭｓｅＩメチラーゼ発現のさらなる最適化
上記の戦略を用いて、プラスミドｐＶＲ−２５でＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現を許すＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼの発現レベルを達成した。思いがけないことに、初めて形質転換され、増殖させた場合、プラスミドｐＶＲ−２５の中で最適化されたＭｓｅＩメチラーゼ（上記＃９）及びＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを持つＥＲ２５６６宿主細胞はＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを発現したが、このコンストラクトをグリセロール中で−７０℃にて保存した場合、ＭｓｅＩは安定的に維持されなかった。
【００８９】
宿主のＭｓｅＩのさらに大きな修飾を達成するためにＭｓｅＩメチラーゼのコンストラクトをさらに修飾した。上述したように、おそらく細胞における高いレベルのメチル化に由来する不安定性のために、最も高い２つのレベルの構成的な発現のもとにＭｓｅＩメチラーゼを配置するという試みは失敗した。最大限、認容されるレベルのメチル化を達成するために、新しいＭ．ＭｓｅＩ発現プラスミド、ｐＶＲ−２６を構築した。上記（３）で記載されたものに由来する第２のプロモータを挿入することによってｐＶＲ−２６を構築した（表２を参照のこと）。Ｍ．ＭｓｅＩをコードする領域（ｍｓｅＩＭ遺伝子）及びプラスミドｐＮＫＲ１７０７ｍｓｅＩＭ−９（ＰｍｅＩとＭｆｅＩで消化された）からの上流のプロモータを含有する１．２４４−ｋｂのＤＮＡ断片を切断し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｃＩＩで切断したベクターｐＮＥＢ１９３（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）におけるＰｌａｃＵＶ５プロモータのすぐ下流に挿入することによって、これを行った。もう１つのＭｓｅＩメチラーゼのコンストラクト、ｐＶＲ２７は、ＰｌａｃＵＶ５プロモータとｐＶＲ２６からのｌａｃＩオペレータを含有する０．３７９−ｋｂのＰｍｅＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片を削除することによって作成した。ｐＶＲ−２６ｍｓｅＩＭメチラーゼ発現ベクターによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの安定な発現が得られた。
【００９０】
【表２】
【００９１】
実施例５：ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ発現の最適化
（１）発現ベクターの構築
当該技術で周知のように、制限エンドヌクレアーゼは細胞毒性のタンパク質である。多くの場合、高い発現を助長にするように設計されたプラスミドに毒性遺伝子をクローニングする試みは極めて難しい。細胞毒性遺伝子を発現するのに特に好ましいプラスミドの１つは、ｐＬＴ７Ｋである（Kong, et al., Nucl. Acids Res., 28:3216-3222, 2000）。このプラスミドは、複製機能をコードする断片（ｏｒｉ）、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子、及びクローニングに好適な制限エンドヌクレアーゼに隣接するカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含有する。ｃＩ８５７遺伝子は、ＰＬとＰＲ（ラムダバクテリオファージの主要な、それぞれ左側と右側のプロモータ）を重ね合わせるＤＮＡ配列（ＣＩオペレータ）に条件付きで結合するラムダバクテリオファージのリプレッサタンパク質に由来する変異体をコードする。ｌａｃＩ遺伝子は、リプレッサタンパク質ＬａｃＩをコードし、それは、ＰＴ７（バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ転写プロモータ）を重ね合わせるように構築されたＤＮＡ配列（ｌａｃオペレータ）に条件付きで結合する。簡単に言えば、ＩＰＴＧ無しでの高温（４２℃）では、アンチセンスのプロモータが活性を持ち、ＰＴ７はＬａｃＩによって抑制される。ＩＰＴＧを伴った３０℃では、発現はＰＴ７から生じる。
【００９２】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現にｐＬＴ７Ｋを適合させるために、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とリボソーム結合部位を導入した。さらに、ｃｏｌＥＩレプリコンをｐ１５Ａレプリコンに変更し、コピー数を１／３に減らした（約５０から約１５に）。これを達成するために、ＡｃｌＩとＢａｍＨＩでｐＬＴ７Ｋを消化した。ｃＩ８５７、ラムダＰＬ、Ｋｎ耐性遺伝子及びＴ７プロモータを含有する得られた１．２−ｋｂの断片をキアゲンのキアクイック・ゲル精製キット（カタログ番号２８７０４）を用いて寒天ゲルから単離し、予めＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＹＣ１８４−Ｔ７ｔｅｒΔＰｓｈＡＩベクターに連結した。ｐＡＣＹＣ１８４−Ｔ７ｔｅｒΔＰｓｈＡＩは、ｐＡＣＹＣ１８４−Ｔ７ｔｅｒのＰｓｈＡＩ欠失誘導体である。このコンストラクトをｐＶＲ−２４と命名した（図１４）。
【００９３】
正方向（５’−ＡＧＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）及び逆方向（５’−ＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）のプライマーのセットによるＰＣＲによってｍｓｅＩＲ遺伝子に対するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。下線を引いた塩基は正方向プライマーのＮｄｅＩ切断部位の位置を示す。ベント（登録商標名）ＤＮＡポリメラーゼ、１ｘサーモポル緩衝液、１００μ１のＰＣＲ反応物中の鋳型としての５００ｎｇのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）の染色体ＤＮＡ及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃にて１５秒間、６８℃にて６０秒間、７２℃にて４５秒間から成るサイクルを２５回行った。キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いて、得られた７００塩基対のＰＣＲ産物を精製し、クレノウ酵素で処理し、ＮｄｅＩで消化して、キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いて、もう１回精製した。
【００９４】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する、得られた７００塩基対のＮｄｅＩ−平滑末端断片を、ＮｄｅＩとＳｔｕＩで消化したｐＶＲ−２４ベクターに連結し、 予めＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子コンストラクト、ｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ−９で修飾した大腸菌ＥＲ２５０２細胞を、連結物で形質転換した。分析した１８の形質転換体のうち、３個がｍｓｅＩＲ遺伝子を含有していた。ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ挿入体の配列を決定した後、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを製造するために、１個の組換えプラスミド、ｐＶＲ−２５を選択した。
【００９５】
（２）株の構築
宿主においてＬａｃＩリプレッサのコピー数を増やすために、米国特許出願 出願番号第０９／６８９，３５９号に記載されたように、株ＥＲ２８３３（Ｔ７ｌａｃＩｑ株）を構築した。
【００９６】
（３）別の宿主及び異なったレベルでＭｓｅＩメチラーゼを発現するプラスミドと組合せた大腸菌におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの過剰発現の最適化大腸菌におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの過剰発現を最適化するために、これらＭｓｅＩメチラーゼを発現するプラスミド（ｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ−９、ｐＣＲ−２６及びｐＶＲ−２７）の１つを持つことによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの自己消化から事前に保護された、発現株、ＥＲ２５６６／ｐＣＥＦ−８にｐＶＲ−２５を移入した。ＥＲ２５６６／ｐＣＥＦ−８は、誘導可能なｌａｃプロモータ及び、低レベルのＴ７リゾチームとＴ７ＲＮＡポリメラーゼの天然阻害を特徴とするｐＳＹＸ２０を基にしたプラスミド、ｐＣＥＦ−８の制御のもと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対する遺伝子の染色体コピーを含有する宿主株である。さらなる情報については、Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｂ．Ａ．及びＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．の『Ｔ７リゾチームはＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写を阻害する』（Cell, 49:221-227, 1987）を参照のこと。誘導されない細胞では、リゾチームはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの基礎的な活性を低下させ、発現宿主中で安定に維持することができる標的遺伝子の範囲を増やす。さらに、Ｆ’エピゾーム上にｌａｃＩｑ遺伝子を１コピー有するもう１つの発現株、ＥＲ２８３３／ｐＣＥＦ−８を用いた。
【００９７】
全体として、大腸菌におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ発現の研究には６株を用いた（表２）。株はすべて、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを発現するｐＶＲ−２５プラスミド及びＴ７バクテリオファージのリゾチーム遺伝子をコードするｐＣＥＦ−８プラスミドを含有する。ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの高い収量について選択するために、種々の増殖条件を用いて、形質転換された宿主細胞を増殖させた。最適化実験で好ましい培地は、ルリア−ベルターニ（１リットル当り１グラムのグルコースと１グラムのＭｇＣｌ２を補った；以後補完ＬＢという）培地であった。
【００９８】
増殖条件は以下のとおりであった。
ＭｓｅＲＭ１： 個々のコロニーからの細胞を０．５リットルのＬＢ培地中で４２℃にて８時間増殖させ、その後、０．２ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、３０℃にて一晩（１５時間）細胞を増殖させた。必要に応じて抗生物質：３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加えた。最後に遠心によって培養したものを回収し、−２０℃に凍結した。
【００９９】
ＭｓｅＲＭ３： 各実験について、個々のコロニーからの細胞を０．５リットルのＬＢ培地中で３０℃にて一晩（１７時間）増殖させ、その後、０．２ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、細胞を４時間増殖させ続けた。必要に応じて抗生物質：３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加えた。最後に遠心によって培養したものを回収し、−２０℃に凍結した。
【０１００】
ＭｓｅＲＭ４、ＭｓｅＲＭ５及びＭｓｅＲＭ６： 細菌培養物は５０％グリセロール中、−７０℃における凍結保存溶液として保持された。播種に用いた培養物は、単一コロニーを得るために適当な抗生物質を含有したＬＢプレート上に筋状に播いた。個々のコロニーを１ｍｌのＬＢ培地に再浮遊し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った５００ｍｌのＬＢ培地を含有する１０００−ｍｌのフラスコに播種した。振盪培養器で３７℃、２５０ｒｐｍにて細胞を一晩（１６時間）増殖させた。その後、最終濃度０．２ｍＭでＩＰＴＧを加えた。さらに４時間細胞を培養し、次いで４℃で５分間８，０００ｒｐｍにて遠心することによって細胞を回収し、−２０℃にて凍結した。
【０１０１】
高レベルの発現クローンを同定するために２つの好ましい制限エンドヌクレアーゼアッセイを用いた。
超音波破砕法： 誘導した細胞（５００ｍｌ）を回収し、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含有する超音波破砕用緩衝液２０ｍｌに再浮遊した。氷上にてマクロ−チップのプローブで３０秒間の衝撃を４回行うことによって細胞を超音波破砕した。粗抽出物の一部をＮＥＢ緩衝液２緩衝液（５０μｌ）中のラムダＤＮＡ（１μｌ）に加え、３７℃にて１時間インキュベートした。０．８％のゲル電気泳動によってＤＮＡを分画し、ＥｔＢｒ染色によって視覚化した。
【０１０２】
エクスプレス法： 一晩、培養物又は誘導培養物（１０〜５００ｍｌ）を１ｍｌ回収し、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５及び２５％（容量／容量）のスクロースを含有する緩衝液０．２ｍｌに再浮遊し、溶液が均質になるまで混合した。２００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１１μｌそれに０．２５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で新しく調製した１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを２００μｌ溶液に加え、氷上で５分間インキュベートした。次いで１１．５μｌの１Ｍ、ＭｇＣｌ２及び２４．２μｌの５％（容量／容量）Ｂｒｉｊ−５８を加えた。溶液をゆっくり混合し、室温にて１５分間インキュベートした。インキュベートした後、４℃にて１５分間、微量遠心機の最大速度で細胞粗溶解物を遠心した。上清をピペットにより新しいエッペンドルフ管に移し、必要になるまで氷上で保管した。３７℃にて１時間、ＭｓｅＩ反応緩衝液（ＮＥＢ緩衝液２）中で細胞抽出物の連続希釈によって、ラムダＤＮＡ基質（１．０μｇ）を消化した。電気泳動によりＤＮＡを分画し、ＥｔＢｒ染色によって視覚化した。ラムダＤＮＡのＭｓｅＩ消化と関係する適当なサイズのバンドの存在によって活性を決定した。
【０１０３】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ発現の最適化に関する結果を表３に要約した。
【０１０４】
ＭｓｅＲＭ１株によって様々な収量のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（０．０８〜０．５ｘ１０６Ｕ／ｇ細胞の湿重量）が得られた。細胞は緩やかに増加し、遅延時間はことのほか長かった。
【０１０５】
ｌａｃを基にした組換え発現システムの安定性及び再現性を高めるために、Ｆ’エピゾーム上にｌａｃＩｑ遺伝子を１コピー有する新しい宿主株ＥＲ２８３３を構築した（米国特許出願、出願番号第０９／６８９，３５９）。実際、ｌａｃＩｑ宿主（ＭｓｅＲＭ３）における発現の安定性及びプラスミドの維持性は著しく高められた：ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの収量は、０．５〜１．４ｘ１０６Ｕ／ｇ細胞の湿重量であった。この株（実施例４を参照のこと）から精製されたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に非特異的エンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼを含まず、最終的な収量は約１５０，０００Ｕ／ｇであった。それは、元来のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から得られるよりも約１００倍多かった。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
残念ながら、ＭｓｅＲＭ３株は、−７０℃で保存し、回復させた後、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。この問題を解決するために、ｐＶＲ−２６及びｐＶＲ−２７（上記実施例４）を構築することによってＭｓｅＩメチラーゼの発現レベルを高めた。このような株（ＭｓｅＲＭ４、ＭｓｅＲＭ５及びＭｓｅＲＭ６）では、−７０℃で株を保存した後でさえ高いＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ収量が得られ、ＭｓｅＲＭ４（ＮＥＢ＃１２８４；米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）は、１００リットルの製造用発酵槽でのスケールアップに用いられた（実施例４を参照のこと）。この大規模発酵でのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの収量は細胞の湿重量当り０．５ｘ１０６Ｕ／ｇであった。
【０１０８】
実施例６：組換えＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造
１００リットルの発酵槽において、晩期対数増殖期に増殖した組換え大腸菌株ＮＥＢ＃１２８４からＭｓｅＩ制限酵素を製造した。この細胞の試料を、２０００年８月２８日、ブタペスト協定の規約と条件のもとにＡＴＣＣに供託し、「ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２４２１」を受け取った。
【０１０９】
（Ａ）細胞の増殖
５０％グリセロール中−７０℃での凍結保存溶液として、組換えＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する形質転換された大腸菌宿主、ＮＥＢ＃１２８４を保存した。播種用に用いた培養物を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレートに筋状に播き、３７℃にて一晩インキュベートして単一コロニーを得た。３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った１０ｍｌのＬＢ培地に播種するのに数個のコロニーを用いた。３７℃、２５０ｒｐｍの振盪培養器にて細胞を３時間増殖させ、次いで３０℃にてさらに３．５時間増殖させた（培養物の過剰増殖を回避するため）。この培養の最終的に補正されたクレットは１２２又は対数増殖期の中ほどであった。この培養物を用いて、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った１００リットルのＬＢに播種した。２ＳＣＦＭの通気（１分当りの標準立方フィート）及び２００ｒｐｍの撹拌速度で３０℃にて１８時間、発酵を行った。最終補正クレットは３１３であった。この発酵から３３１グラムの細胞（湿重量）を連続流れ方式の遠心によって回収し、−７０℃に保存した。１ｇの細胞から粗抽出物を作成し、上記の方法（実施例５を参照のこと）を用いて、酵素活性を推定した。 粗抽出物中のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの収量は５００，０００＃Ｕ／ｇであり、それは、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）の粗抽出物に比べて約１００倍高い。
【０１１０】
（Ｂ）ＮＥＢ＃１２８４からのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの精製
以下の工程はすべて氷上にて又は４℃のどちらかにて行った。９９０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＢＭＥ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び５％（容量／容量）のグリセロール）に３３０グラムの細胞を浮遊し、０．５６のＯ．Ｄ．までガウリン・プレスによってｐｓｉｇ１２Ｋにて４回破砕した。ＰＥＧ６０００を７．５％でＮａＣｌを０．５Ｍで加えることにより、１１５０ｍｌの上清をＰＥＧ沈殿し、次いで４℃にて５０分間インキュベートした。４℃にて１２Ｋで３０分間、ＰＥＧスラリーを遠心した。５８０ｍｌの上清をＮａＣｌを含まない緩衝液Ａで０．１ＭのＮａＣｌに希釈し、緩衝液Ａで平衡化した４３０ｍｌのヘパリンハイパーＤカラムにかけた。１２００ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄し、次いで４０００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌ〜１．０ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．２５Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、それをプールした。ヘパリンハイパーＤプールをＮａＣｌを含まない緩衝液Ａで０．１ＭのＮａＣｌに希釈し、緩衝液Ａで平衡化した８８ｍｌのＰＥＩカラムにかけた。１００ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄し、１０００ｍｌの０．１Ｍ〜１．７ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．７〜０．９ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのトリスｐＨ７．５、１０ｍＭのＢＭＥ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５％（容量／容量）のグリセロール）に対して一晩透析し、緩衝液Ｃで平衡化した２０ｍｌのソースＱカラムにかけた。４０ｍｌの緩衝液Ｃでカラムを洗浄し、４００ｍｌの０．０５ＭのＮａＣｌ〜１．０ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．２５Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、それをプールした。ソースＱプールを緩衝液Ｄ（１０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．０、０．０７５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＢＭＥ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、及び５％（容量／容量）のグリセロール）に対して透析し、緩衝液Ｄで平衡化した２０ｍｌのヘパリンＴＳＫカラムにかけた。４０ｍｌの緩衝液Ｄでカラムを洗浄し、４００ｍｌの緩衝液Ｄ中の０．０７５Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．３〜０．４ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、それをプールした。最終濃度１００μｇ／ｍｌでＢＳＡを加えた。プールしたものを保存用緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０％（容量／容量）のグリセロール、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に対して一晩透析した。この精製法で２６，０００，０００単位のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼが得られた。この精製で得られたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に非特異的なエンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼを含んでいなかった。
【０１１１】
以下の基準を見ることによってＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度をチェックした。
【０１１２】
１．連結：ラムダＤＮＡの５倍過剰消化の後、生じたＤＮＡ断片の９５％を越えるものが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結された（１６℃にて１〜２μＭの５’末端濃度）。この連結断片のうち９５％が再切断可能であった。
【０１１３】
２．持続消化：１μｇのラムダと１００単位の酵素を含有する５０μｌの反応物を１６時間インキュベートした後、１単位の酵素で１時間行われた反応としてＤＮＡバンドの同じバンドパターンが生じた。
【０１１４】
３．エクソヌクレアーゼ活性： １μｇの超音波破砕した３Ｈ ＤＮＡ（１０５ｃｐｍ／μｇ）を含有する５０μｌの反応において３７℃にて４時間、１００単位の酵素をインキュベートした後、０．４％未満の放射活性が放出された。
【０１１５】
試験はすべて、以下の反応緩衝液：ＮＥＢ緩衝液２（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃にてｐＨ７．９、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ補完）で行った。単位の決定：５０μｌの１ｘＭｓｅＩ反応緩衝液（ＮＥＢ緩衝液２）中で、３７℃にて１時間、連続希釈したＭｓｅＩエンドヌクレアーゼでラムダＤＮＡ基質（１．０μｇ）を消化した。電気泳動によってＤＮＡを分画し、ＥｔｄＢｒによって視覚化した。ラムダＤＮＡのＭｓｅＩ消化に関係する適当なサイズのバンドの存在によって活性を決定した。制限エンドヌクレアーゼ活性の１単位は、特定したＮＥＢ緩衝液を用いて、５０μｌの総反応容量中の１μｇの基質ＤＮＡを１時間で完全に消化するのに必要な量として定義される。
【０１１６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭｓｅＩＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＶＲ１８の制限地図を示す。
【図２】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＥｓａＤｉｘ４Ｉの制限地図を示す。
【図３】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＥｓａＤｉｘ５Ｉの制限地図を示す。
【図４】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするｐＥｓａＤｉｘ４ＩプラスミドのＭｓｅＩに対する感受性の寒天ゲル解析を示す。レーン１、切断されていないｐＥｓａＤｉｘ４Ｉ；レーン２、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ４Ｉ；レーン３、切断されていないｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ４Ｉ＋ｐＵＣ１９；レーン５、分子量の基準（１ｋｂのＤＮＡラダー、ニューイングランドバイオラボズ社）。
【図５】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするｐＥｓａＤｉｘ５ＩプラスミドのＭｓｅＩに対する感受性の寒天ゲル解析を示す。レーン１、切断されていないｐＥｓａＤｉｘ５Ｉ；レーン２、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ５Ｉ；レーン３、切断されていないｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ５Ｉ＋ｐＵＣ１９；レーン５、分子量の基準（１ｋｂのＤＮＡラダー、ニューイングランドバイオラボズ社）。
【図６】ｍｓｅＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。
【図７】ｅｓａＤｉｘ４ＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。
【図８】ｅｓａＤｉｘ５ＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を示す。
【図９】ｍｓｅＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を示す。
【図１０】エラー傾向ＰＣＲによって無作為に変異誘発された構成プロモータのライブラリの構築に用いられた組換えプラスミドｐＮＫＲ１７０７ｍｓｅＩＭの制限地図を示す。
【図１１】ＭｓｅＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子及び上流の調節要素をコードする組換えプラスミドｐＮＫＲ１７０７ｍｓｅＩＭ−９の制限地図を示す。
【図１２】最適プロモータ配列を含有するＭｓｅＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の上流のＤＮＡ配列を示す。
【図１３】ＭｓｅＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の制御された発現に用いられたプラスミドｐＶＲ−２６及びｐＶＲ−２７の構築を示す。
【図１４】ｐＶＲ−２４発現ベクターの構築を示す。
【図１５】ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするｐＶＲ−２５の制限地図を示す。
【図１６】Ｔ７リゾチーム遺伝子をコードするｐＣＥＦ−８の制限地図を示す。
【図１７】細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするためのｐＶＲ−２５における厳密な調節システムの作用機序を示す。
【図１８】大腸菌ＭｓｅＲＭ４、ＭｓｅＲＭ５及びＭｓｅＲＭ６から作製された細胞粗抽出物におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性のアッセイを示す。増殖条件は実施例６に記載されている。
【図１９】１００リットル発酵槽における増殖後の、大腸菌株ＭｓｅＲＭ４（ＮＥＢ＃１２８４）から作製された細胞粗抽出物でのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性のアッセイを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、１つの実施態様において、発現が細胞の生理的状態の変化を補正するように、従ってあらゆる増殖段階において同族の制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して好ましくは完全な保護を与えるように、保護的修飾メチルトランスフェラーゼ活性の均衡の取れたレベルを産出するために先ず方法を実施すること；次いで制限エンドヌクレアーゼを導入すること及びその発現を提供することを含む、目的の制限修飾システムをクローニングし、発現する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼは、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡを分解するか又は切断するヌクレアーゼと呼ばれる酵素の部類に属する。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿って特定のヌクレオチドの配列（「認識配列」）を認識し、結合することによって作用する。いったん結合すると、エンドヌクレアーゼは認識配列の範囲内で又は一方で分子を切断する。いかなる任意のエンドヌクレアーゼについても位置は固定しているが、切断の位置は種々の制限エンドヌクレアーゼの間で異なってもよい。様々な制限エンドヌクレアーゼが認識配列に対して様々な親和性を有する。今日までに調べられた幾千もの細菌種及び古細菌種の中で、２００を超える、独特の特異性を認識する制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、その組成並びに補因子の必要性、標的配列の性質、及び標的配列に関するＤＮＡ切断部位の位置に基づいて分類される（Yuan, R., Ann. Rev. Biochem., 50:285-315, 1981）。現在のところ、性状のよく判っている３種の制限エンドヌクレアーゼが知られている（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）。Ｉ型酵素は特異的な配列を認識するが、その配列に関して無作為に切断する。ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な配列を認識し、その配列の一方に対して定められた位置で切断するが、決して完全には消化しない。この２種の酵素はどちらとも実用的な用途には好適ではない。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な配列（４〜８個の長さのヌクレオチド）を認識し、その配列の範囲内の位置か又はそれに極めて近い定められた位置で切断する。通常、それらは、その作用にＭｇ２＋イオンのみを必要とする。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼがその他の細菌成分から精製された場合、実験室でＤＮＡ分子を特異的な断片に切断するのにそれらを用いることができる。この特性によって研究者はＤＮＡ分子を操作することができ、生じた構造を解析することができる。
【０００４】
細菌は、単離によってせいぜいほんのわずかな制限エンドヌクレアーゼを処理する傾向があるにすぎない。制限エンドヌクレアーゼは、それらが生じる生物の名称に由来する３文字の頭字語によって命名される（Smith and Nathans, J. Mol. Biol., 81:419-423, 1973）。最初の文字は属に由来し、２番目と３番目の文字は種に由来する。従って、例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種の株は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと命名された３種の異なるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを合成する。このような酵素はそれぞれ、配列、ＴＴＴＡＡＡ、ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ及びＣＡＣＮＮＮＧＴＧを認識して切断する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＲＹ１３株は、たった１つのＩＩ型制限酵素であるＥｃｏＲＩを合成し、それは、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する（Roberts R. J., and Macelis D., Nucl. Acids Res., 28:306-7, 2000）。
【０００５】
細菌及び古細菌の制限システムの第２の成分は、修飾メチラーゼである（Roberts and Halford, in 'Nucleases' 2nd ed., Linn et al., ed.'s, p.35-88, 1993）。このような酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護し、外来の、侵入ＤＮＡから区別することができる手段を提供する。修飾メチラーゼは、相当する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することにより配列の範囲内の１つか又はその他のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって切断されることはない。修飾メチラーゼの活性の効力によって細菌細胞のＤＮＡは修飾され、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に感受性がない。制限エンドヌルレアーゼの認識と切断に感受性があるのは修飾されていない、従って識別することが可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００６】
自然状態では、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ウイルス及びプラスミドＤＮＡのような外来ＤＮＡを、そのＤＮＡが適当な修飾酵素によって修飾されていない場合、切断すると考えられている（Wilson and Murray, Annu. Rev. Genet. , 25:585-627, 1991）。このようにして細胞は外来ＤＮＡによる侵略から保護されている。従って、ＩＩ型制限修飾システムの進化は、外来ＤＮＡによる感染からそれ自体を保護する細胞の必要性によって進んできたと広く考えられている（細胞性防御仮説）。
【０００７】
遺伝子操作技術の出現によって、今や遺伝子をクローン化し、それらがコードしているタンパク質や酵素を、従来の精製技術で入手可能なものよりも大量に製造することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵は、遺伝子ライブラリの中でそのようなクローンを同定する簡単で信頼できる方法を開発することである。可能性のある困難さの１つは、プロモータ若しくはリボソームの結合部位の差異又は遺伝子のコドン組成の差異のように、起源となる生物の転写及び翻訳装置が大腸菌とは異なっているために制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子の中には、大腸菌で発現されない可能性があるものがあることである。メチラーゼ遺伝子の単離には、メチラーゼが十分に大腸菌で発現し、遺伝子を運んでいるプラスミドの少なくとも一部を完全に保護することが必要とされる。活性型でのエンドヌクレアーゼの単離には、メチラーゼが十分に発現して宿主ＤＮＡを完全に保護するか又はエンドヌクレアーゼによる切断に由来する致命的な損傷を妨げることが必要とされる。制限エンドヌクレアーゼをクローニングするもう１つの障害は、大腸菌株の一部がシトシン又はアデニンの修飾に有害に反応する；メチル化シトシン（Raleigh and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA83:9070-9074, 1986）又はメチル化アデニン（Heitman and Model, J. Bact., 196:3243-3250; Raleigh et al., Genetics, 122:279-296, 1989; Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173:5207-5219, 1991）を含有するＤＮＡを破壊するシステムを生じるという発見である。シトシン特異的又はアデニン特異的メチラーゼ遺伝子は、それら自体又はそれらに相当するエンドヌクレアーゼ遺伝子と共にいずれにおいてもこのような株で容易にクローニングすることはできない。この問題を回避するためには、このようなシステムが欠損している大腸菌の変異株（ＭｃｒＡ−及びＭｃｒＢ−又はＭｒｒ−）を使うことが必要である。
【０００８】
制限遺伝子を大腸菌にクローニングするために、以下のようないくつかのアプローチが用いられてきた。
（１）ファージの制限に基づいた選定
最初にクローニングされたシステムでは、制限エンドヌクレアーゼのクローンを同定し、選定する手段としてバクテリオファージ感染が用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：Kosykh et al., Molec. Gen. Genet., 178:717-719, 1980; ＨｈａＩＩ：Mann et al., Gene 3:97-112, 1978; ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 78:1503-1507, 1981）。細菌における制限−修飾システムの存在によって細菌はバクテリオファージの感染に抵抗することができるので、クローン化された制限−修飾遺伝子を運んでいる細胞は原則として、ファージにさらされたライブラリから生き残りとして選択的に単離される。しかしながら、この方法は限定された利点しか有さないことが判明した。具体的には、クローン化された制限−修飾遺伝子は、通常の条件下で選択的生き残りを提供する十分なファージ抵抗性を常に示すとは限らないことが判ったのである。
【０００９】
（２）ベクターの修飾に基づいた選定
数の上で増えているシステムをクローニングするのに用いられる第２のアプローチには、活性のあるメチラーゼ遺伝子の選定が関与する（米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kiss et al., Nucl. Acid Res., 13:6403-6421, 1985を参照のこと）。制限遺伝子と修飾遺伝子は密接に連関していることが多いので、両遺伝子を同時にクローニングすることができることも多い。この選定では常に完全な制限システムが得られるとは限らないが、その代わり、メチルトランスフェラーゼ遺伝子だけを得る可能性がある（ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi et al., Gene 10:219-225, 1980; ＢｃｎＩ：Janulaitis et al., Gene 20:197-204, 1982; ＢｓｕＲＩ：Kiss and Baldauf, Gene 21:111-119, 1983;及びＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem., 258:1235-1241, 1983）。
【００１０】
（３）天然プラスミドのサブクローニング
もう１つのクローニング法には、当初、プラスミド由来の大腸菌にクローニングするプラスミドとして特徴付けされた転移システムである（ＥｃｏＲＶＩ：Bougueleret et al., Nucl. Acid Res., 12:3659-3676, 1984; ＰａｅＲ７Ｉ：Gingeras and Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:402-406, 1983; Theriault and Roy, Gene 19:355-359, 1982; ＰｖｕＩＩ：Blumenthal et al., J. Bacteriol., 164:501-509, 1985）。
【００１１】
（４）複数工程のクローニング
直接的なメチラーゼ選定法は、種々の障害のためにメチラーゼ（及び／又はエンドヌクレアーゼ）クローンを得ることができないことがある。例えば、ＬｕｎｎｅｎらのＧｅｎｅ７４（１）巻（１９８８年）の２５〜３２ページを参照のこと。制限−修飾遺伝子をクローニングするのに障害となる可能性の１つは、修飾により予め保護されていない宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることである。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を単一のクローンとして共に導入する場合、エンドヌクレアーゼが切断する機会を有する前にメチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾しなければならない。従って、時には、遺伝子を順に、先ずメチラーゼを次いでエンドヌクレアーゼをクローニングすることが可能なこともある（米国特許第５，３２０，９５７号を参照のこと）。
【００１２】
（５）ＤＮＡの損傷で誘導可能なＳＯＳ反応の誘導に基づいた選定
メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするもう１つの方法は、ＤＮＡ損傷に関する比色アッセイに基づく（米国特許第５，４９２，８２３号を参照のこと）。メチラーゼに関してスクリーニングする場合、ＡＰ１−２００のような感受性宿主の大腸菌株をプラスミドライブラリで形質転換する。メチラーゼの発現によって、ＭｃｒＡ＋、ＭｃｒＢＣ＋、又はＭｒｒ＋である大腸菌株でＳＯＳ反応が誘導される。ＡＰ１−２００株は、Ｍｃｒ及びＭｒｒシステムに対して温度感受性であり、大腸菌の損傷で誘導可能なｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌａｃＺを含む。メチラーゼ又はエンドヌクレアーゼをコードする組換えプラスミドの検出は、限定的な温度でのｌａｃＺの誘導に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上で青いコロニーとして検出される（Piekarowicz et al., Nucleic Acids Res., 19:1831-1835, 1991;及びPiekarowicz et al., J. Bacteriology 173:150-155, 1991 ）。同様に、大腸菌株、ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ１−ｌａｃＺ融合物を含有するが、メチル化依存性の制限システム、ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒを欠いている。このシステム（「エンド−ブルー（ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ）」法と呼ばれる）では、ＳＯＳ反応を含めて、エンドヌクレアーゼが宿主細胞のＤＮＡを損傷する場合、同族のメチラーゼの非存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子を検出することができる。Ｘ−ｇａｌを補ったＬＢ寒天プレート上で、ＳＯＳ誘導された細胞は、深青色のコロニーを形成する（Fomenkov et al., Nucleic Acids Res., 22:2399-2403, 1994、及び米国特許第５，４９８，５３５号）。
【００１３】
（６）Ｎ末端配列に基づいた同義性インバースＰＣＲ
修飾メチルトランスフェラーゼ遺伝子を同定することができない（米国特許第５，９４５，２８８号を参照のこと）、又はメチラーゼ遺伝子を同定することはできるが、制限エンドヌクレアーゼを特定するオープンリーディングフレームがはっきりしないということが起き得る。これらの場合、起源となった生物から十分な量及び純度で制限エンドヌクレアーゼを精製することができるときは、エンドヌクレアーゼ遺伝子を同定するための追加的な方法を特に適用することができる。この方法では、エンドヌクレアーゼを実質的な均一性まで精製して、ポリペプチドの配列決定を行う。得られたポリペプチド配列をＤＮＡ配列に逆翻訳し、起源となった生物のゲノムＤＮＡから又はそれから作成した遺伝子ライブラリからエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅するために同義性ＰＣＲプライマーを設計することができる。サザンブロット分析又は更なる直接若しくはインバースＰＣＲ法によって完全な遺伝子のＤＮＡ配列を得ることができる。同族のメチルトランスフェラーゼが得られない場合か又はそれを発現することができない場合、制限エンドヌクレアーゼのクローン単独の安定性及び利便性は、通常、ひどく危うくなる。
【００１４】
上記の方法によって、特定のシステムのメチルトランスフェラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを得ることができてもよいが、それでもやはり、酵素製造のために使用可能な株の確立は問題である。困難さは好適なレベルでのメチルトランスフェラーゼの発現と共にあることが多い。このことは方法（６）と共に特に真実である。本来の宿主におけるエンドヌクレアーゼとは関係がなかったが、同じか又は関連した配列を認識し、エンドヌクレアーゼが認識配列を切断するのを妨げる、ヘテロ特異的なメチルトランスフェラーゼを用いて、かかるクローンを安定化することができることもある（米国特許第６，０４８，７３１号を参照のこと）。
【００１５】
利用できる好適なヘテロ特異的メチルトランスフェラーゼがない、及び同族のメチルトランスフェラーゼにより宿主に与えられる保護の程度が不適当であるこいうことが生じる可能性がある；又は明らかに適当なレベルのメチルトランスフェラーゼを得ることができるが、かかるレベルは細胞に対して毒性があり、結果として保存することができない株を生じるということが起きる可能性がある；又は保護が明らかに適当であり、保護された細胞は生存可能であるが、メチルトランスフェラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子の組合せによって検出可能なエンドヌクレアーゼを発現しない株を生じることが起きる可能性がある；又は保護が明白に適当であり、メチルトランスフェラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子の組合せによって検出可能なエンドヌクレアーゼを発現する株を生じるが、商業的に有用なレベルの酵素を製造するには十分に好適ではないことが起きる可能性がある。
【００１６】
制限エンドヌクレアーゼによる切断から宿主細胞を効果的に保護するのに必要な酵素の要求レベルを変更する数多くの因子を仮定することができる。かかる因子には、増殖の静止期の間に細胞に存在するよりも大量のＤＮＡコピーが存在する急速な増殖；制限エンドヌクレアーゼの新しい合成が開始する前に修飾メチルトランスフェラーゼの新しい合成が必要とされる可能性がある休止状態からの回復；例えば、Ｓ−アデノシルメチオニンのような要求されるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ補因子のレベルが変化する可能性がある、種々の飢餓；及びＤＮＡ損傷又はその他の生理的障害のような特定の生理状態が挙げられる。さらに、メチルトランスフェラーゼのレベルが高くなりすぎ、例えば、同族部位に関係する無関係な部位に結合するか又はそれをメチル化することによって毒性となり、従って、調節タンパク質又はＤＮＡ凝縮タンパク質によるＤＮＡ配列の読み取りを妨害する可能性がある。従って、無制限に永続化するためには、メチルトランスフェラーゼの発現の絶対的なレベルを培養の期間にわたる条件に応じて変動させる必要がある可能性がある。
【００１７】
制御の微細レベルに対するこの必要性は、修飾メチルトランスフェラーゼに独特なのではない。５０年の研究のうちに、例えば、栄養を分解する、又は必須成分を合成する（ｔｒｐ、ｈｉｓ）、又は有害因子に反応する（ＤＮＡ損傷反応、熱ショック反応）異化及び同化遺伝子のセット（ｌａｃ、ａｒａ、ｇａｌ）のような種々の機能について多数の詳細な調節図式が記載されてきた。このような調節性の効果には、例えば、プロモータ活性（アクチベータ又はリプレッサによる）、転写安定性（レトロ調節要素による）における変化が、翻訳レベル（弱化又は翻訳連結）の変化が介在する。この高いレベルの理解にもかかわらず、機能に対する要求が生理的変化と共にいかに変化するのか及び機能の所望のレベルをいかにして達成するのかを前もって予測することは簡単ではない。
【００１８】
精製された制限エンドヌクレアーゼ、及び、程度は少ないが修飾メチラーゼは、実験室で遺伝子を特徴付けるのに有用なツールなので、組換えＤＮＡ技術を介して、このような酵素を大量に合成する細菌株を入手しようとする商業的な動機がある。かかる株は、商業的に有用な量で製造する手段を提供することはもとより、精製の作業を簡略化するので有用である。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１つの実施態様において、発現が細胞の生理的状態の変化を補正するように、従ってあらゆる増殖段階において同族の制限エンドヌクレアーゼによる切断に対して好ましくは完全な保護を与えるように、保護的修飾メチルトランスフェラーゼ活性の均衡の取れたレベルを産出するために先ず方法を実施すること；次いで制限エンドヌクレアーゼを導入すること及びその発現を提供することを含む、目的の制限修飾システムをクローニングし、発現する方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、静止期、対数増殖期、保存からの再生期又はその他の増殖期から選択してもよい決定的な増殖期の間に保護の程度を具体的に調べること、及び次いでそのような決定的な増殖期における機能について選択することにより好適な発現ベクターを同定することを含む、保護的修飾メチルトランスフェラーゼ活性の均衡の取れたレベルを産出するための方法に関する。
【００２１】
上記方法は、ＭｓｅＩ制限修飾システムのクローニングと発現によって例示され、システムはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）断片にコードされており、断片は、２つの関連する酵素、すなわち、ＤＮＡ配列５’−ＴＴＡＡ−３’を認識し、この認識配列のＴ残基間のリン酸二エステル結合を切断して２塩基の５’伸長を産出する酵素（Morgan R. D., Nucl. Acids Res., 16:3104, 1988）（以後、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼと呼ぶ）、及び同じＤＮＡ配列、５’−ＴＴＡＡ−３’を認識するが、メチル基を付加することによって修飾し、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断を妨げる、Ｍ．ＭｓｅＩとして知られる第２の酵素をコードする。さらに発明は、それぞれＭ．ＭｓｅＩとは配列で異なり、Ｍ．ＭｓｅＩと同じ機能を実行する、すなわち、メチル基を付加することにより配列５’−ＴＴＡＡ−３’を修飾してＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断を妨げる酵素をコードする、２つの追加的なＤＮＡ断片に関する。本発明はまた、ＤＮＡ断片、ＤＮＡ断片を含有するベクター、このＤＮＡ断片を含有する形質転換された宿主の調製方法、及びかかる形質転換宿主からのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの改良製造方法にも関する。
【００２２】
【課題を解決する手段】
本発明に基づいて製造されるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、従来の技術で作られた制限エンドヌクレアーゼ調製物に一般的に見い出される混入物を含まない。
【００２３】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子ではなく、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子は、一般にメチラーゼ選定として引用される技術に従って得られた（米国特許第５，２００，３３３号、その開示を参考として本明細書に組み入れる）。しかしながら、メチラーゼ選定によって得られたクローンはどれも検出可能なＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を発現しておらず、且つ、一晩のインキュベートの後、ＭｓｅＩ消化から完全には保護されてはいなかった。メチラーゼのクローンを配列決定し、他のＮ６−アデニンメチラーゼとの相同性に基づいてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を同定した。メチラーゼのクローンは検出可能なＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性を生じなかったが、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝子に隣接して位置するらしいことが推測された。従って、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種から、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡをインバースＰＣＲ技術によって増幅し、配列を決定した。
【００２４】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定し、確実に同定するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得た高度に精製したＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。推定アミノ酸配列がＭｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列と一致したオープンリーディングフレームが、インバースＰＣＲ技術によって得られたＤＮＡ配列の中に認められ、メチラーゼ遺伝子の３’側に位置していた。ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、通常の高発現ベクターに適合するベクターでクローニングした。次いで、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅し、ベクターのｐＥＴシリーズのような発現ベクターに連結して、別の適合ベクターで運ばれたＭｓｅＩメチラーゼで予め修飾された宿主に導入した；しかしながら、得られたわずかなかかるコンストラクトではＭｓｅＩ活性は見い出されなかった。以下の更なる結果から、ＭｓｅＩ発現のこの失敗は、メチラーゼの不適当な発現によるものであり、上手く行ったエンドヌクレアーゼの発現は致死的事象となったと思われる。本発明に従って完全に修飾しているベクターを入手した後、エンドヌクレアーゼ遺伝子の誘導に先だって細胞増殖の間、エンドヌクレアーゼの発現を抑制したベクターの構築によってエンドヌクレアーゼの発現も慎重に調節した。このような特別のコンストラクトでエンドヌクレアーゼ遺伝子とメチラーゼ遺伝子を運ぶ宿主を次いで増殖させ、誘導し、回収して、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを作製するのに用いた。
【００２５】
ＭｓｅＩ制限−修飾システムをクローニングし、発現する好ましい方法は、メチラーゼ選定法に従ってメチラーゼ陽性クローンを得ること及びこのようなＭｓｅＩメチラーゼ陽性クローンのＤＮＡ配列を決定することから成る。インバースＰＣＲ技術によりメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡを入手し、配列を決定する。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種からのＭｓｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質をほぼ均質まで精製してＮ−末端のアミノ酸配列を決定する。ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列のデータに基づいてＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。ＭｓｅＩメチラーゼの発現を調整して、宿主に対して毒性になるほど多量のメチラーゼを発現することなく、宿主ゲノムの完全な保護を達成する。急速な対数増殖期にある細胞から得られたＤＮＡをＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの切断に対する保護について調べ、このような急速な増殖条件下で完全な保護を提供するコンストラクトを用いて、この完全なメチル化状態をモニターする。次いで、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のゲノムＤＮＡから完全な遺伝子を増幅し、ｐＶＲ−２４（米国マサチューセッツ州、ベバリーのニューイングランド・バイオラボズ社）のような誘導に先立つ細胞増殖の間、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現を制限するように設計された発現ベクターに連結することによりＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを発現する。十分な調節能を提供する適当な遺伝組成を持った（米国特許出願出願番号第０９／６８９，３５９号）、ＭｓｅＩの切断に対して完全な保護を提供する、別の適合プラスミドで発現されたＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を運ぶことによってＭｓｅＩ部位を予め修飾した宿主にコンストラクトを導入する。適当な発現条件を含めてＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を含有する宿主を増殖させ、細胞を回収し、それからＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製することによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼが製造される。
【００２６】
【発明の実施の形態】
１つの実施態様では、本発明は、同族の制限エンドヌクレアーゼが毒性にならずに存在するあらゆる増殖段階で好ましくは宿主ＤＮＡの完全な保護が認められるような形態で制限酵素による切断からＤＮＡを保護する修飾メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するベクター（完全に保護するメチルトランスフェラーゼベクター）を先ず提供し、次いで所望の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現するベクターを提供することによって目的の制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。 本発明は、修飾メチルトランスフェラーゼが制限酵素による切断に対して保護しなければならないことを除いて、修飾メチルトランスフェラーゼ又は前記制限酵素の特性によって限定されない。
【００２７】
好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼの発現パターンに特に敏感である増殖段階の間に完全な保護を提供するために、メチルトランスフェラーゼの発現を操作することができる調節要素を同定することによって、完全に保護するメチルトランスフェラーゼベクターを入手してもよい。本発明に従って、以下の工程によってこれを実行してもよい：
（１） 公知の方法によってベクターにおけるメチルトランスフェラーゼ遺伝子を入手すること；
（２） 該遺伝子に関して好適な位置にプロモータのような調節要素を入れること；
（３） 所望の宿主細胞における形質転換；
（４） 指数増殖期にある間にプールした形質転換体からベクターを再単離すること；
（５） エンドヌクレアーゼによって消化することによる選定；及び
（６） 生き残っている、消化されていない、従って保護されたベクター集団による新しい宿主の再形質転換。
【００２８】
この方法の工程（４）は、指数増殖期から、又はその他の種々の増殖段階から適宜、例えば、静止期から、炭素又は窒素又はその他の必須栄養素の飢餓により活性化された休止期から、又はＤＮＡの損傷状態のような特別な生理的状態の細胞から、又は酸性培地若しくは毒性化合物のような生理的傷害の原因の存在下での細胞から、単離されたプールしたベクターによって実行されてもよいことは当業者に理解されるだろう。
【００２９】
好ましい実施態様では、前記工程（２）の調節要素は、以下の工程を含む方法によって同定される。すなわち、
（ａ）種々の異なった調節要素を含有する断片のプールを所望の位置で、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するベクターにクローニングすること；及び
（ｂ）前記工程（３）から（６）までを続行すること。
【００３０】
さらに改善されたものを選択するために前記工程（３）から（６）までを含む選定方法を反復してもよいことは当業者にさらに理解されるだろう。
【００３１】
前記工程（２ａ）、同一又は異なった位置で調節要素を含有する断片のプールをクローニングすることを反復し、続いて適宜、選定を反復してもよいことは当業者にさらに理解されるだろう。
【００３２】
本発明は、プロモータ、オペレータ、エンハンサ又は下流の調節要素であってもよい調節要素の個性によって限定されない。
【００３３】
好ましい実施態様では、前記工程（１）のメチルトランスフェラーゼはメチラーゼ選定法によって単離される（米国特許第５，２００，３３３号）。 本発明は、この方法によって単離されるメチルトランスフェラーゼ遺伝子に限定されず、 上記の方法、例えば、ファージ選定、天然プラスミドのサブクローニング、ＤＮＡの損傷によって誘導可能なＳＯＳ反応の誘導に基づいた同定、精製タンパク質のアミノ酸配列に基づいたインバースＰＣＲ、又は他のメチルトランスフェラーゼの配列に対する類似性から配列データベースにおいて同定し、続いてＰＣＲによるクローニング若しくは方法に基づいたサザンブロットのいずれかによって単離された遺伝子を包含する（Kong, et al., Nucleic Acids Res., 28:3216-3223, 2000）。
【００３４】
好ましい実施態様では、前記工程（２ａ）の異なった調節要素の収集は、変異誘発された断片の調製物に存在する可能性があるような混入する染色体断片と共に、エラー傾向のＰＣＲにより無作為に変異誘発されたＳ．ｔｙｈｉｍｕｒｉｕｍのｈｉｓプロモータのコピーを含む。本発明は、このようにして得られた断片に限定されず、大腸菌若しくは別の生物のゲノムＤＮＡから単離された断片、又は無作為な位置若しくは特定の位置での同義性配列によるオリゴヌクレオチド合成によってもたらされる断片、又は無作為若しくは特定の断片収集の組換え的ＰＣＲによりもたらされる断片の収集を包含する。好ましい実施態様では、このようにして得られる調節要素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列である。
【００３５】
本発明による方法は、該当する制限エンドヌクレアーゼによる切断からの保護を与えるどのメチルトランスフェラーゼに適用されてもよく、単に、どれが特定の天然単離物における前記エンドヌクレアーゼと共に共起するだけではないことが当業者にさらに理解されるだろう。
【００３６】
本発明は、さらに、それが含有される生物を先ず培養するのではなく、環境資源のＤＮＡから所望の特異性のメチルトランスフェラーゼを単離することに関する。好ましい実施態様では、このような遺伝子は、米国ネバダ州のディクシー・バレー・ホット・スプリングにて６８℃で増殖している原核生物の混合緑色細糸と台座の群生試料から得たＤＮＡからメチラーゼ選定によって単離される。
【００３７】
本発明はさらに、誘導の非存在下では極めて低いレベルのタンパク質が発現されるように、厳重な調節でベクターから発現された所望の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の供給に関する（極めて低い基本的な発現が認められる）。好ましい実施態様では、この厳重な調節ベクターは、ＷＯ第９９／１１８２１号及び米国特許出願出願番号第０９／４８６，３５６号に記載されているようなクローン化された目的遺伝子を介して読み取る、拮抗的な、且つ独立して調節可能なプロモータを伴うベクターを含むが、この目的のために使用される、予め存在するベクターｐＬＴ７Ｋに存在するよりも低いコピー数を提供することにより基本的な発現はさらに低くされている。好ましい実施態様では、ｐＬＴ７Ｋの複製開始点をｐＡＣＹＣ１８４のそれと交換することによってベクターのコピー数を低くする。その他の複製開始点も使用してもよい；例えば、ｐＳＣ１０１（Stoker, et al., Gene 18:335-341, 1982）、ｐＳＹＸ２０（米国特許第５，２６２，３１３号）、Ｆ（Shizuya, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(18):8794-8797. 1992）、又はその他のコピー数の少ないベクター（Harayama, et al., Mol. Gen. Genet., 184:52-55, 1981及びWohlfarth, et al., J. Gen. Microbiol., 134:433-440, 1988）である。好ましい実施態様では、ベクターはｐＶＲ−２４である。
【００３８】
好ましい実施態様では、添付の米国特許出願、出願番号第０９／７０１，６２６号に記載されるような、目的遺伝子を翻訳することができる方向で負の調節因子の発現を高いレベルで発現する株を採用することによって、基本的な発現レベルをさらに低下させることが達成される。
【００３９】
上記の方法は、本発明のもう１つの実施態様、即ち、ＭｓｅＩ制限−修飾システムのクローニング及び発現における例示となる。
【００４０】
本発明は、また、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを産生する微生物株を含む新規なＤＮＡコンストラクト及び新規な組成物も提供する。本発明において関心が向けられている制限エンドヌクレアーゼ、ＭｓｅＩは、ＤＮＡ配列５’−ＴＴＡＡ−３’を認識し、この認識配列のＴ残基間においてリン酸二エステル結合を切断して、２塩基５’伸長を生じる。
【００４１】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを過剰発現させるために、公知のメチラーゼ選定法（米国特許第５，２００，３３３号）を超えて追加の工程が必要とされ、それには、特に、宿主に対して毒性になるほど多量のメチルトランスフェラーゼを産生しないが、ｉｎ ｖｉｖｏでＭｓｅＩの消化から宿主のゲノムＤＮＡを完全に保護するために微妙に均衡の取れたＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼの発現が包含される。極めて急激な細胞増殖の間（指数増殖期）でさえＭｓｅＩエンドヌクレアーゼに対する完全な保護が認められるように発現を最適化したｍｓｅＩＭ遺伝子を含有するベクターを先ず用いて、大腸菌宿主を修飾する。次いで、ｍｓｅＩＲ遺伝子を含有する、例えばｐＶＲ−２５のような適合するベクターでこの宿主を形質転換し、その後適当な抗生物質プレート上で両ベクターを含有するコロニーを選定する。個々の形質転換体を増殖させ、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする（以下の実施例５のように）ことによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ産生コンストラクトを同定する。
【００４２】
ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子及びＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を好ましくは大腸菌でクローニングし、発現させる、本明細書に記載された方法は、以下の工程を採用する。
１）ＭｓｅＩによる切断から保護するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
ＤＮＡ修飾メチラーゼが相当する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することによって配列の範囲内で１つの又はその他のヌクレオチドを化学的に修飾することは周知である。このメチル化の後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合されることはなく、切断されることもない。細菌細胞のＤＮＡは常にその修飾メチラーゼによって完全に修飾されており、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感受性である。この状況では、修飾されていない、従って識別可能な外来ＤＮＡのみが、制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に感受性である。本方法の第１の工程は、ＭｓｅＩによる切断から保護するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を同定することである。これを達成するためにＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のＤＮＡメチラーゼ（ＮＥＢ４４６）をクローニングすることができる。別の方法としては、米国特許第５，１７９，０１５号に記載されたように、ＭｓｅＩのＲ−Ｍシステム以外のＲ−Ｍシステムから、ＭｓｅＩ制限酵素による消化を防ぐためにＤＮＡを保護的に修飾することができるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを同定することができる。本発明では、ＭｓｅＩ制限酵素による消化からＤＮＡを保護することができる３種のメチラーゼＤＮＡを同定した。
【００４３】
先ず、全ゲノムＤＮＡをＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（小球菌）（ＮＥＢ＃４４６）から精製した。およそ１〜１０キロベース（ｋｂ）の長さの断片を作製するために頻回切断エンドヌクレアーゼ、Ｓａｕ３ＡＩでＤＮＡを部分的に消化することによって、このＤＮＡのランダムライブラリを構築した。予めＢａｍＨＩで開裂し、脱リン酸化したベクター、ｐＢＲ３２２にこのような断片を連結した。連結反応物で化学的に応答能のある（コンピテント）大腸菌ＥＲ２５０２細胞を形質転換した。形質転換体をプールし、プラスミドは１次プラスミドライブラリを形成するために精製された集団だった。この精製されたプラスミドの部分試料をＭｓｅＩで消化して、ｉｎ ｖｉｖｏにてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を発現していなかった、従って消化からプラスミドＤＮＡを保護していなかったプラスミドをすべて破壊した。消化したプラスミドプールで再び大腸菌ＥＲ２５０２を形質転換して、ＭｓｅＩメチラーゼを発現している、無傷のプラスミドを回収した。個々のクローンを選び、プラスミドＤＮＡを精製して、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断に暴露した。ＭｓｅＩによって切断されなかったプラスミドがＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有していた。
【００４４】
好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から入手可能な制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩに対して保護するものであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で特定されるタンパク質をコードすることができる配列のセットの間から選択してもよい。このようなタンパク質は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で述べられているＤＮＡ配列でコードされてもよい。
【００４５】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断からＤＮＡを保護することができる代替メチルトランスフェラーゼＤＮＡを探すために、１又はそれより多くのＭｓｅＩ制限部位を含有するベクターでＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種以外のＤＮＡ源に由来するクローンのライブラリを構築してもよい。次いで、保護しないクローンを破壊するための１回又はそれより多い回数のＭｓｅＩによる消化、続いて保護されたクローンを回収するための消化したプラスミドによる形質転換によってこのクローンのライブラリを選定する。かかるライブラリは、米国ネバダ州のディクシー・バレー・ホット・スプリングにて６８℃で増殖している原核生物の混合緑色細糸と台座の群生試料から単離されたＤＮＡ（『環境からのＤＮＡ』と命名された）から作成される。精製した環境からのＤＮＡをＮｓｉＩエンドヌクレアーゼで消化し、予めＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、脱リン酸化したベクターｐＮＥＢ１９３に連結した。エレクトロポレーションにより連結反応物で大腸菌ＥＲ２６８３を形質転換した。形質転換体をプールし、プラスミド集団を精製して１次プラスミドライブラリを作製した。このような精製プラスミドの部分試料を過剰のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、ＥＲ２６８３を形質転換するのに用いた。得られた形質転換体のプラスミドをミニプレップし、ＭｓｅＩ制限酵素による消化及びそれに続く寒天ゲル電気泳動によって解析した。調べた９種のプラスミドがＭｓｅＩの消化に抵抗性であることが見い出され、それぞれ、ＭｓｅＩによる切断からＤＮＡを保護するように機能する２種の異なったメチラーゼ遺伝子の１つをコードしていることが判明した。２種のメチラーゼ遺伝子は、ｅｓａＤｉｘ４ＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤＮＯ：４）及びｅｓａＤｉｘ５ＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と命名された。このようなクローンから調製された細胞粗抽出物の分析では、エンドヌクレアーゼ活性は示されなかった。宿主自体のＤＮＡを保護するのにこのようなメチルトランスフェラーゼ又はそのようなその他のものを用いてもよく、従ってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを首尾よく発現させることができる。
【００４６】
２） ＭｓｅＩ制限−修飾システム全体の配列決定
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子ではなくＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子は一般に、上記工程１）のように、メチラーゼ選定（米国特許第５，２００，３３３号）と呼ばれる技法に基づいて得られる。しかしながら、メチラーゼ選定によって得られたクローンはいずれも検出可能なＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。ＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列決定装置によって通常の技法を用いて、１つのメチラーゼクローンを配列決定した。その他のＮ６−アデニンメチラーゼに対するアミノ酸の相同性に基づいてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を同定した。メチラーゼクローンはいかなる検出可能なＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ活性も産生しなかったが、エンドヌクレアーゼ遺伝子はメチラーゼ遺伝子に隣接して位置するらしいことが推測された。従って、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から得られたＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡをインバースＰＣＲ技法によって、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のゲノムＤＮＡから増幅して、配列を決定した。
【００４７】
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定し、それを同定するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得た高度に精製したＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ−末端のアミノ酸配列を決定した。ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼは以下の実施例ＩＩＩに述べるようにＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から精製してもよい。インバースＰＣＲ技法で得られた、メチラーゼ遺伝子の３’に位置するＤＮＡ配列の中に、推定アミノ酸配列が、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列と一致するオープンリーディングフレームが認められた。
【００４８】
別の方法としては、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）に由来するＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部をＰＣＲで増幅するための同義性オリゴヌクレオチドのプライマーを設計するのに、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列を用いることができる。次いで、得られたＤＮＡ配列を用いて、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のこの元来の部分のどちら側でもＤＮＡのインバースＰＣＲ増幅を導くことができ、上記のようにこのＤＮＡ配列においてｍｓｅＩＭ遺伝子及びＭｓｅＩ遺伝子を同定することができる。ＭｓｅＩ制限−修飾システム全体をクローニングし、配列を決定するために両方の方法を用いた。
【００４９】
３） ＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼの発現の微妙な最適化
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ及びＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼに対する完全な遺伝子がいったん同定されると（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、発現を提供するために種々の方法によってそれらを操作してもよい。上記で得られたメチラーゼのコンストラクトを用いて、ｐＥＴシリーズのベクター（米国ウィスコンシン州、マジソン、ノバジェン社（Novagen））を用いたＴ７プロモータ制御のもとでＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を精力的に試みたが、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを産生するクローンを得ることはできなかった。
【００５０】
メチラーゼ遺伝子の前に第２の制御可能なプロモータを導入すること、エンドヌクレアーゼ遺伝子のためにコピー数の少ないレプリコンを用い、且つエンドヌクレアーゼ遺伝子の導入に先だって宿主においてＬａｃＩリプレッサのコピー数を増やすことを含む、方法の独特の組合せを用いて、組換えＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの過剰発現を制御した。
【００５１】
細胞が指数増殖期で急激に増殖している場合、メチラーゼ選定によって得られたメチラーゼのコンストラクトは宿主の大腸菌の染色体ＤＮＡを完全には保護しないことが認められた。ｍｓｅＩＲが細胞に上手く導入され、発現されるようにメチラーゼの発現を高め、従って宿主のＤＮＡを完全に保護するために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種のＤＮＡからメチラーゼ遺伝子を増幅し、種々の強度で構成プロモータの発現下にてベクターのファミリー（ｐＮＫシリーズ、以下の実施例ＩＶを参照のこと）でクローニングした。この試みでは、２つの最高レベルのプロモータの発現に対してメチラーゼのコンストラクトは得られず、我々はメチラーゼの過剰発現による細胞への毒性のためであると考えている。２つのさらに低いレベルで発現しているプロモータを伴ったコンストラクトは、指数増殖期でチェックした場合、ＭｓｅＩによる切断に対して宿主を完全に保護することはできなかった。急激な増殖の間、宿主ＤＮＡを完全に保護するが、毒性レベルよりは低く保つようにメチラーゼの発現を高めるために、プロモータコンストラクトの１つでエラー傾向のＰＣＲによってプロモータ領域において無作為変異誘発を行った。上記で引用したメチラーゼ選定技法を用いて、ＭｓｅＩメチラーゼを発現している変異クローンを選択し、次いで、指数増殖期の細胞を回収し、このような宿主細胞からＤＮＡを精製し、ＭｓｅＩの切断からの完全な保護について調べることによって、急激な指数増殖の間にＭｓｅＩの切断から宿主のゲノムＤＮＡを完全に保護する能力について個々のクローンを調べた。次いで、ＭｓｅＩに対して完全に保護することが見い出されたコンストラクトの１つを、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現に用いた。
【００５２】
宿主細胞の増殖のあらゆる段階で完全な保護を達成するためにメチルトランスフェラーゼの発現を調整するこの方法が、エンドヌクレアーゼが宿主細胞で発現するのが困難であるか又は発現が不可能であることを示すその他のシステムに適用可能であることを立証してもよい（米国特許第６，０２５，１７９号及び第６，０４８，７３１号を参照のこと）。
【００５３】
４）誘導可能なプロモータの制御下におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの発現
本発明の組換えＭｓｅＩの発現を最適化するために、誘導可能な又は構成プロモータが周知であり、組換え宿主において高いレベルでｍｓｅＩＲ遺伝子を発現するのに用いてもよい。同様に、高いレベルの発現を達成するために、公知のコピー数の多いベクターを使用してもよい。本発明に従って、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に特に好ましい方法は、例えばｐＶＲ−２４（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）のような、誘導に先立つ細胞増殖の間、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現を制限するように設計された発現ベクターである。このプラスミドは、複製機能（ｏｒｉ）をコードする断片、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ）、クローニングに好適な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接するカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含有する。ｃＩ８５７遺伝子は、ラムダ・バクテリオファージのリプレッサタンパク質の変異型をコードし、ＰＬ及びＰＲ（ラムダ・バクテリオファージの主要なそれぞれ左側及び右側のプロモータ）を重ね合わせるＤＮＡ配列に条件付きで結合する。ｌａｃＩ遺伝子は、リプレッサタンパク質、ＬａｃＩをコードし、ＰＴ７（バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写プロモータ）を重ね合わせるように構築されているＤＮＡ配列（ｌａｃオペレータ）に条件付きで結合する。 簡単に言えば、ＩＰＴＧの非存在下の高温（４２℃）ではアンチセンス・プロモータが活性を持つが、ＰＴ７はＬａｃＩによって抑制される。３０℃でＩＰＴＧ存在下では発現はＰＴ７から起きる（図１４及び１５を参照のこと）。中間の温度で中間の濃度のＩＰＴＧがあると、中間レベルの発現が得られる。
【００５４】
制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定的なクローンを得るために、宿主は一般に制限エンドヌクレアーゼの消化から予め保護される。本発明では、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子をクローニングすることによって、又は、ＭｓｅＩの切断に対して完全な保護を提供する方式で別の適合プラスミドに発現されている、例えば、ｅｓａＤｉｘ４ＩＭ若しくはｅｓａＤｉｘ５ＩＭのようなＭｓｅＩの切断に対して保護するもう１つのメチラーゼ遺伝子をクローニングすることによって、これを達成する。以下の実施例５に示されるように、新規のプロモータ配列をコードするＤＮＡ断片がＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子に先行する場合、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子コンストラクト及び／又はそのｍＲＮＡを含有する発現プラスミドの安定性が改善されうることが判明した。ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ及び保護的メチラーゼ遺伝子を含有する宿主を増殖させ、適当な発現条件で誘導し、細胞を回収して、それからＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製することによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼは製造される。
【００５５】
本発明はさらに、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子及びＭｓｅＩの切断から宿主ＤＮＡを保護するメチルトランスフェラーゼＤＮＡをコードする遺伝子が微生物に導入され、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下で生物を増殖させ、それを回収し、それからＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製するように前記微生物を形質転換するために組換えＤＮＡ修飾法を用いる、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法を提供する。
【００５６】
上記で概略が述べられた工程は、本発明を実施するのに好ましい態様を表しているが、公知の技術に従って上述のアプローチを変えることができることは当業者に明らかであろう。
【００５７】
実際に実施するにあたり好ましいため、本発明の実施態様を説明するために以下の実施例を示す。このような実施例はあくまでも例となるものであって、本発明は、本明細書の請求項を除いて、それらに制約されるとはみなされない。
【００５８】
上記及び下記で引用した引用文献は参考として本明細書に組み入れられている。
【００５９】
【実施例】
実施例１：ＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｍｓｅＩＭ）のクローニング
１ＬのＬＢブロス培地中で一晩、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）を増殖させ、細胞を回収し、製造元の指示書に従ってキアゲンのゲノムチップ１００／ＧゲノムＤＮＡ精製キット（カタログ番号１０２４３）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。Ｓａｕ３ＡＩでゲノムＤＮＡを部分的に消化して１〜１０ｋｂの断片を作製し、この切断されたゲノムＤＮＡの２０μｇを、ＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化した３μｇのｐＢＲ３２２に連結した。連結混合物で大腸菌株ＥＲ２５０２を形質転換した。およそ１００，０００の形質転換体が得られた。形質転換体をプールし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢブロス培地で増殖させ、プラスミド集団を精製して１次プラスミド・ライブラリを形成した。このプラスミド・ライブラリ、２μｇを過剰のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化してＥＲ２５０５を形質転換するのに用いた。得られた形質転換体のプラスミドを２回目の選定の対象とした。８０の形質転換体が得られ、これらのうち１６のプラスミドＤＮＡをＭｓｅＩ制限酵素消化、続いて寒天ゲル電気泳動によって分析した。調べられた１６のプラスミドのうち１４はＭｓｅＩの消化に抵抗性であることが判明し、およそ１．６ｋｂのＳａｕ３ＡＩ断片上に同一のｍｓｅＩＭ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２）を持つことが判明した。これら１４のクローンから調製された細胞の粗抽出物の分析は、ＭｓｅＩ活性を示さなかった。
【００６０】
実施例２：ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断に対してＤＮＡを保護している環境からのＤＮＡ試料からの２つのメチラーゼＤＮＡのクローニング
ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼによる切断からＤＮＡを保護することができる代替メチルトランスフェラーゼＤＮＡを探すために、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ４４６）以外のＤＮＡ源からのクローンのライブラリを、１又はそれより多くのＭｓｅＩ制限部位を含有するベクター内に構築してもよい。次いで、このクローンのライブラリは保護していないクローンを破壊するために１又はそれより多くの回数のＭｓｅＩ消化、続いて上記実施例Ｉのような、保護されたクローンを回収するための消化されたプラスミドによる形質転換によって上記のように選定される。ネバダ州、ディクシーバレーのホットスプリングで６８℃にて増殖している原核生物の混合緑色細糸と台座の群生試料から単離されたＤＮＡから、かかるライブラリを創った。２μｇのＤＮＡをＮｓｉＩエンドヌクレアーゼで消化し、予めＰｓｔＩで切断し、脱リン酸化した１μｇのベクターｐＮＥＢ１９３に連結した。エレクトロポレーションにより連結反応物で大腸菌ＥＲ２６８３を形質転換し、およそ１，０００，０００の形質転換体を得た。形質転換体をプールし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢブロス培地で増殖させ、プラスミド集団を精製して１次プラスミド・ライブラリを形成した。このプラスミド・ライブラリの１μｇを過剰のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化して、ＥＲ２６８３を形質転換するのに用いた。得られた形質転換体のプラスミドをミニプレップし、ＭｓｅＩ制限酵素消化とそれに続く寒天ゲル電気泳動によって解析した。調べられた９プラスミドは、ＭｓｅＩ消化に抵抗性であることが判明し、両者共ＭｓｅＩによる切断からＤＮＡを保護するように機能する２つの異なったメチラーゼ遺伝子のいずれか１つをコードすることが判明した。これら２つのメチラーゼをｅｓａＤｉｘ４ＩＭ及びｅｓａＤｉｘ５ＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と命名した。これらのクローンから調製された細胞粗抽出物の分析は、エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。これらのメチルトランスフェラーゼ又はそのような他のものを用いて宿主自体のＤＮＡを保護してもよく、従ってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを上手く発現することができる。
【００６１】
実施例３：Ｎ−末端アミノ酸配列及びインバースＰＣＲ法により得られたＭｓｅＩメチラーゼに隣接するＤＮＡ配列を用いたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の同定及び配列決定
（Ａ）Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種に由来するＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのほぼ均質になるまでの精製
３０℃にてＬＢ培地中でＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）の細胞を増殖させた。２０時間の増殖の後、遠心により細胞を回収し、使用するまで−７０℃に保管した。手順のすべては氷上にて又は４℃にて行った。実施例ＶＩと同様の図式に従ってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製した。およそ１０，０００単位のＭｓｅＩ活性をほぼ均質になるまで精製した。１６μｌのピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルに載せて、電気泳動を行った。クマシーブルーＲ２５０にてゲルを染色し、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に相当する約２１ｋＤの顕著なバンドが認められた。
【００６２】
（Ｂ）ＭｓｅＩタンパク質のアミノ末端の配列
記載されたように調製されたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを電気泳動し、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（Matsudaira, P., J. Biol. Chem., 262:10035-10038, 1987）の方法に従い、以前記載されたように改変して電気的にブロットした（Looney, et al., Gene 80:193-208, 1989）。クマシーブルーＲ−２５０で膜を染色し、約２１ｋｄのタンパク質バンドを切り出し、パーキンエルマー社（米国カリフォルニア州、フォスターシティ）のアプライド・バイオシステムズ・ディビジョンのモデル４０７Ａガス相タンパク質シーケンサーによる連続分解を行った（Waite-Rees, et al., J. Bacteriol., 173:5207-5219, 1991）。２１ｋＤのタンパク質の最初の２５残基は（Ｍｅｔ）−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｘｘｘ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｘｘｘ−Ｔｙｒ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）に相当した。このデータを用いて、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列と比較し、エンドヌクレアーゼ遺伝子を同定した。
【００６３】
（Ｃ）ｍｓｅＩＭメチラーゼに隣接するＤＮＡ配列の決定
インバースＰＣＲの増幅のための鋳型調製：５０μｌの反応容量にて１ｘＮＥＢ緩衝液＃４中で３７℃にて１時間、１μｇのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）のＤＮＡを１０単位のＨａｅＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。７５℃にて２０分間インキュベートすることによりＨａｅＩＩ酵素を熱失活させた。５０μｌの１０ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液及び４００μｌのｄＨ２Ｏ、続いて５μｌ（２０００ＮＥＢ単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃２０２）を加え、１６℃にて１６時間インキュベートすることによって、ＨａｅＩＩで消化したＤＮＡを環化した。次いで、続いて行うインバースＰＣＲ反応用鋳型として、この環化連結反応物の一部を用いた。
【００６４】
以下に示した配列のプライマー、ＭｓｅＩ−ＩＰ１及びＭｓｅＩ−ＩＰ２を合成した。これらプライマーをＭｓｅＩエンドヌクレアーゼとハイブリッド形成させ、互いに関して反対向きに向かせる。
【００６５】
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ１
５’−ＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＣ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ２
５’−ＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＧＴＣＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
【００６６】
産物を増幅するのに成功した反応では、以下を組合せて反応ミックスを作製した。
１０μｌの１０ｘベント（登録商標名）反応緩衝液
６μｌの４ｍＭ−ｄＮＴＰ溶液
５μｌの１０μＭ濃度のプライマーＭｓｅＩ−ＩＰ１
５μｌの１０μＭ濃度のプライマーＭｓｅＩ−ＩＰ２
３μｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４（Ｍｇ＋＋の最終濃度５ｍＭ）
１２．５μｌの環化ＤＮＡ鋳型（およそ２５ｎｇ）
５８μｌのｄＨ２Ｏ
２μｌ（４単位）のベント（登録商標名）エクソ−ポリメラーゼＮＥＢ＃２５７
【００６７】
ＰＣＲの増幅条件は：９５℃にて３分間が１サイクル、続いて９５℃にて３０秒間、５２℃にて３０秒間及び７２℃にて１．５分間が４サイクル、続いて９５℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１．５分間が２０サイクルであった。０．８％寒天ゲルの電気泳動によって１０μｌのＰＣＲ反応物を分析した。
【００６８】
ＨａｅＩＩ環状鋳型ＰＣＲ反応においておよそ１３５０塩基対の産物が認められた。産物をゲルで精製し、２５μｌのＤＮＡ（１ｘＴＥ）緩衝液に浮遊した。次いで、配列決定プライマーとして上記のＰＣＲプライマーを用いて、製造元の指示書に従い、ＡＢＩ３７３自動配列決定システムによってこのＰＣＲ産物の配列を決定した。さらに、以下のプライマーで同様の反応においてＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ領域をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物を配列決定した。
【００６９】
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ３
５’−ＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＴＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
プライマー ＭｓｅＩ−ＩＰ４
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＧＴＡＣＣＧＡＧＣＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
【００７０】
ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列をアミノ酸翻訳したものとＭｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列から得られたアミノ酸配列のデータを比較することによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定する。ＭｓｅＩメチラーゼと同一方向を向き、メチラーゼ遺伝子と７個のアミノ酸残基が重なり合っているオープンリーディングフレームが見い出され、その中では、ＤＮＡ配列をコードする最初の２５個のアミノ酸が、ＭｓｅＩエンドヌクレアーゼタンパク質から決定されたアミノ酸配列に一致していた。
【００７１】
ゲノムプライミングシステム（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ）のＧＰＳ（登録商標名）−１を用いて、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を持つ挿入物の配列決定を行った。ＧＰＳ（登録商標名）−１は、カナマイシン耐性のｎｐｔＩＩ遺伝子と共に修飾されたＴｎ７を含有しており、製造元（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）の指示書に従って、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子の一部を含有するｐＶＲ−１８及びｐＮＥＢ１９３においてｉｎ ｖｉｔｒｏにて挿入物を作成した。次いで、ＧＰＳ（登録商標名）−１キット（トランスプライマーのそれぞれ左端及び右端に対するプライマーＳ及びプライマーＮ）に含まれるプライマーを用いて、製造元の指示書に従ってＡＢＩ３７３自動配列決定システムを用いて、これら挿入物の配列を決定した。
【００７２】
実施例４：ＭｓｅＩＭの発現の最適化
（１）構成プロモータの別の強度のもとにＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を配置すること
ＭｓｅＩメチラーゼの構成的発現の範囲を達成するために、異なった強度の構成プロモータを含有するｐＮＫベクターの関連するファミリー（Ｎ．Ｋｌｅｃｋｎｅｒによる供与）を利用した。このようなプラスミドは、ＢａｍＨＩ部位の上流にＷＴ又は変異型ｐＨｉｓプロモータのどちらかを含有し、ＲＳ４１５プラスミドの誘導体である（Simons, et al., Gene, 53:85-96, 1987）。名称とプロモータ強度は以下のとおりである
【００７３】
【表１】
ＢａｍＨＩ、ＭｕｎＩ及びＢａｎＩＩで上記プラスミドを消化し、構成プロモータを含有するベクターの骨格をゲルで精製した（類似する大きさのプラスミド断片を除去することによってベクター骨格のゲルによる精製を助けるために、ＢａｎＩＩ消化を含めた）。
【００７５】
上述の構成プロモータの下流に挿入するのにＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を調製するために、ベント（登録商標名）ＤＮＡポリメラーゼ、１ｘサーモポル緩衝液、４ｍＭのＭｇＳＯ４、１００μｌのＰＣＲ反応物における鋳型としてＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を含有する８０ｎｇのｐＶＲ１９プラスミド（Ｒ．Ｖａｉｓｖｉｌａ）、及びメチラーゼ遺伝子に関してＢａｍＨＩ部位の上流に導入する、５’−ＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）プライマー並びにＭｆｅＩ部位の下流に導入する５’−ＡＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）プライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃にて１０秒間、６０℃にて６０秒間及び７２℃にて７５秒間を２５サイクル行った。キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いて、得られた１０１９塩基対のＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩとＭｕｎＩで順に消化し、キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いてもう１回精製した。
【００７６】
４つのＢａｍＨＩ−ＭｕｎＩベクター骨格すべてにＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子を連結し、ＥＲ２６８８細胞を形質転換して、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（リットル当り１グラムのグルコースと１グラムのＭｇＣｌ２を補った；以下補完ＬＢという）寒天プレートに播いた。しかしながら、おそらく細胞における高いレベルのメチル化に由来する不安定性のために、発現の最も高い２つのレベルのもとにＭｓｅＩメチラーゼを配置するという試みは失敗した。さらに低い２つのレベルの発現を含有するコンストラクト、ｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ及びｐＮＫＲ２２１３ＭｓｅＩｍは、このような細胞から精製したプラスミドＤＮＡのＭｓｅＩによる制限（５０μｌ容量における１μｇのプラスミドＤＮＡ、２０単位のＭｓｅＩで３７℃にて１時間）に対する感受性により判断されるように、細胞性ＤＮＡの完全なメチル化は生じなかった。
【００７７】
（２)エラー傾向ＰＣＲによる無作為に変異誘発を行った構成プロモータのライブラリの構築
ｐＮＫＲ２２１３ＭｓｅＩｍと明らかに不安定なｐＮＫＲ１７８６ＭｓｅＩｍとの間の、ＭｓｅＩメチラーゼに対する中間レベルのプロモータコンストラクトを見つけるために、構成プロモータ領域を無作為ＰＣＲ変異誘発と選定の対象とした。変異誘発プロトコールでは、高レベルのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１００μｌの反応容量当り５単位）、不均等ｄＮＴＰプール（１．２ｍＭのｄＣＴＰとＴＴＰ；０．２ｍＭのｄＡＴＰとｄＧＴＰ）、高レベルのＭｇＣｌ２（７ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（０．５ｍＭ）の存在、１００μｌ容量当り２ｎｇのｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ及びサイクル数の多い（３５）ＰＣＲを採用した。ＡｇｅＩ制限部位及びＢａｍＨＩ制限部位でＭｓｅＩメチラーゼに隣接するプライマーはそれぞれ、５’−ＧＣＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）及び５’−ＧＧＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。
【００７８】
ＰＣＲの後、ＡｇｅＩ及びＢａｍＨＩで変異誘発したプロモータコピーを切断し、キアゲンのゲル精製キットでゲルによる精製を行い、その内因性構成プロモータを精製して除いた、ＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ制限部位を持つｐＮＫＲＭｓｅＩｍコンストラクトに連結した。ＥＲ２６８８コンピテント細胞にエレクトロポレーションした後、２０，０００個のコロニーを得た。このようなコロニーをプールし、キアゲン精製プロトコールを用いてプラスミドを精製した。これによって、ＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子の上流に無作為で変異誘発された構成プロモータのライブラリが構築された。
【００７９】
（３）ＭｓｅＩ制限切断に耐性のプラスミドをもたらすクローンの選定
安定な、高レベルのメチル化を生じる変異誘発された構成プロモータを処理するプラスミドを選定するために、５μｇのプラスミドライブラリをＭｓｅＩ制限（５μｇのＤＮＡ、５０単位のＭｓｅＩ）に３７℃で４時間暴露し、続いて６５℃で２０分インキュベートしてＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを不活化した。暴露したプールの一部（２５０ｎｇ）でＥＲ２６８８カルシウム−コンピテント細胞を形質転換し、補完ＬＢ寒天プレートに播いて、３７℃にて一晩増殖させた。これによって６３コロニーが生じた。
【００８０】
６３コロニーのうち６個を無作為に選択し、さらに個々の実験を行った；１０ｍｌの補完ＬＢ培地中での一晩の増殖の後、キアゲンのキア−プレップスピン・ミニプレップ・プロトコールを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。１００ｎｇの精製プラスミドＤＮＡを３７℃にて３０分間２０単位のＭｓｅＩに暴露すると、６個すべて完全に制限されたということは、不適当なレベルのメチル化を示している。
【００８１】
残りの５７コロニーをプールし、キアゲンのプラスミド精製プロトコールを用いてプラスミドの精製を行った。このプラスミドのプールから、５０ｎｇをさらに長い（一晩）５０単位のＭｓｅＩ暴露の対象とし、続いて６５℃にて２０分間インキュベートしてＭｓｅＩの制限エンドヌクレアーゼを不活化した。暴露したプールの一部（４ｎｇ）でＥＲ２６８８カルシウム−コンピテント細胞を形質転換し、補完ＬＢ寒天プレートに播いて、３７℃にて一晩増殖させた。これによって１３コロニーが生じた。
【００８２】
１３コロニーのうち９個を無作為に選択し、さらに個々の実験を行った；一晩の増殖及び以前記載したようなプラスミドの精製の後、１μｇのプラスミドＤＮＡを５０μｌの反応容量中の５０単位のＭｓｅＩとともに３７℃にて一晩インキュベートすると、９個のうち７個で完全にメチル化されたことが判明した。
【００８３】
細胞に存在するメチル化のレベルをさらに立証するために、培養の対数増殖期の間にプラスミド精製のために７コロニーを回収した（一晩の培養を新鮮な補完ＬＢ増殖培地で１：１００に希釈した４時間後、３７℃にて、細胞を回収した。）。かかる細胞は、発現されたＭｓｅＩメチラーゼによるメチル化が完全なメチル化を達成することができないような速度でＤＮＡを複製していることが予想される。キアゲンのキア−プレップ精製プロトコールを用いて、このような対数的に増殖している培養からプラスミドＤＮＡを精製し、０．５μｇのこのプラスミドＤＮＡを３７℃にて一晩、５０単位のＭｓｅＩとインキュベートした。このさらにメチル化が困難な基準を用いて、７コロニーのうち３個が完全に保護され（メチル化され）、制限切断に抵抗性であった。
【００８４】
安定で、完全なレベルのＭｓｅＩメチル化を生じる３個のクローン（＃４、＃９及び＃１０）は、ＡｇｅＩ及びＢａｍＨＩでマッピングすることによって、及びプロモータ領域の上流にアニーリング部位を持つプライマーを用いて配列決定することによって調べられたプロモータ領域を有していた（５’−ＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＡＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９））。３クローンのうち２個（＃９と＃１０）は同一であり；従って、記載された２段階選定工程によって、結果として、安定な、ＭｓｅＩメチル化の完全なレベルが得られる２つの別々のプロモータが見い出された。
【００８５】
思いがけないことに、両プロモータ＃４及び＃９／＃１０は、実験設計したような変異誘発された構成プロモータではなかったが、その代わり、プラスミド調製物に存在する低レベルの大腸菌ＤＮＡの混入に起源があるに違いないＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ大腸菌配列であった。
【００８６】
＃４プロモータは、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩのマッピングによれば、約１０００塩基対の長さであると思われ、配列決定によれば、最初の４３８塩基対は、大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５区分３４９（寄託受入番号、第ＡＥ０００４５９号）の塩基番号７８１３〜８２５１と同一であった。配列データを調べると、ＢａｍＨＩ部位は、塩基番号８８１４で見い出され、それによって１００２塩基対のＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ大腸菌断片が得られた。この大腸菌配列は、ｙｉｇＷ＿２ｏｒｆの５’末端及び２つの予測されたプロモータを含有しており、そのうちの１つは、ＭｓｅＩメチラーゼと同一方向を向いている（８６７２〜８７０４番目）。
【００８７】
＃９／＃１０プロモータのマッピングは、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩによって約４２０塩基対の長さであると思われ；配列決定によれば、プロモータは大腸菌Ｋ−１２ＭＧ１６５５の区分４１（寄託受入番号、第ＡＥ０００１５１号）の塩基番号２５１１〜２９９８と同一であった。これによって４８８塩基対のＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ大腸菌断片が決定され、それは、ｃｏｆ ｏｒｆの５’末端及び塩基番号２６０５〜２６３２及び２７１４〜２７４２にてＭｓｅＩメチラーゼと同じ方向を向いた２つの予測されたプロモータを含有する。この＃９／＃１０の配列を用いてさらに調べた。
【００８８】
（４）ＭｓｅＩメチラーゼ発現のさらなる最適化
上記の戦略を用いて、プラスミドｐＶＲ−２５でＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの発現を許すＭｓｅＩメチルトランスフェラーゼの発現レベルを達成した。思いがけないことに、初めて形質転換され、増殖させた場合、プラスミドｐＶＲ−２５の中で最適化されたＭｓｅＩメチラーゼ（上記＃９）及びＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを持つＥＲ２５６６宿主細胞はＭｓｅＩエンドヌクレアーゼを発現したが、このコンストラクトをグリセロール中で−７０℃にて保存した場合、ＭｓｅＩは安定的に維持されなかった。
【００８９】
宿主のＭｓｅＩのさらに大きな修飾を達成するためにＭｓｅＩメチラーゼのコンストラクトをさらに修飾した。上述したように、おそらく細胞における高いレベルのメチル化に由来する不安定性のために、最も高い２つのレベルの構成的な発現のもとにＭｓｅＩメチラーゼを配置するという試みは失敗した。最大限、認容されるレベルのメチル化を達成するために、新しいＭ．ＭｓｅＩ発現プラスミド、ｐＶＲ−２６を構築した。上記（３）で記載されたものに由来する第２のプロモータを挿入することによってｐＶＲ−２６を構築した（表２を参照のこと）。Ｍ．ＭｓｅＩをコードする領域（ｍｓｅＩＭ遺伝子）及びプラスミドｐＮＫＲ１７０７ｍｓｅＩＭ−９（ＰｍｅＩとＭｆｅＩで消化された）からの上流のプロモータを含有する１．２４４−ｋｂのＤＮＡ断片を切断し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｃＩＩで切断したベクターｐＮＥＢ１９３（米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）におけるＰｌａｃＵＶ５プロモータのすぐ下流に挿入することによって、これを行った。もう１つのＭｓｅＩメチラーゼのコンストラクト、ｐＶＲ２７は、ＰｌａｃＵＶ５プロモータとｐＶＲ２６からのｌａｃＩオペレータを含有する０．３７９−ｋｂのＰｍｅＩ−ＡｆｌＩＩＩ断片を削除することによって作成した。ｐＶＲ−２６ｍｓｅＩＭメチラーゼ発現ベクターによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの安定な発現が得られた。
【００９０】
【表２】
実施例５：ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ発現の最適化
（１）発現ベクターの構築
当該技術で周知のように、制限エンドヌクレアーゼは細胞毒性のタンパク質である。多くの場合、高い発現を助長にするように設計されたプラスミドに毒性遺伝子をクローニングする試みは極めて難しい。細胞毒性遺伝子を発現するのに特に好ましいプラスミドの１つは、ｐＬＴ７Ｋである（Kong, et al., Nucl. Acids Res., 28:3216-3222, 2000）。このプラスミドは、複製機能をコードする断片（ｏｒｉ）、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子、及びクローニングに好適な制限エンドヌクレアーゼに隣接するカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含有する。ｃＩ８５７遺伝子は、ＰＬとＰＲ（ラムダバクテリオファージの主要な、それぞれ左側と右側のプロモータ）を重ね合わせるＤＮＡ配列（ＣＩオペレータ）に条件付きで結合するラムダバクテリオファージのリプレッサタンパク質に由来する変異体をコードする。ｌａｃＩ遺伝子は、リプレッサタンパク質ＬａｃＩをコードし、それは、ＰＴ７（バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ転写プロモータ）を重ね合わせるように構築されたＤＮＡ配列（ｌａｃオペレータ）に条件付きで結合する。簡単に言えば、ＩＰＴＧ無しでの高温（４２℃）では、アンチセンスのプロモータが活性を持ち、ＰＴ７はＬａｃＩによって抑制される。ＩＰＴＧを伴った３０℃では、発現はＰＴ７から生じる。
【００９２】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現にｐＬＴ７Ｋを適合させるために、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とリボソーム結合部位を導入した。さらに、ｃｏｌＥＩレプリコンをｐ１５Ａレプリコンに変更し、コピー数を１／３に減らした（約５０から約１５に）。これを達成するために、ＡｃｌＩとＢａｍＨＩでｐＬＴ７Ｋを消化した。ｃＩ８５７、ラムダＰＬ、Ｋｎ耐性遺伝子及びＴ７プロモータを含有する得られた１．２−ｋｂの断片をキアゲンのキアクイック・ゲル精製キット（カタログ番号２８７０４）を用いて寒天ゲルから単離し、予めＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＹＣ１８４−Ｔ７ｔｅｒΔＰｓｈＡＩベクターに連結した。ｐＡＣＹＣ１８４−Ｔ７ｔｅｒΔＰｓｈＡＩは、ｐＡＣＹＣ１８４−Ｔ７ｔｅｒのＰｓｈＡＩ欠失誘導体である。このコンストラクトをｐＶＲ−２４と命名した（図１４）。
【００９３】
正方向（５’−ＡＧＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）及び逆方向（５’−ＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）のプライマーのセットによるＰＣＲによってｍｓｅＩＲ遺伝子に対するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。下線を引いた塩基は正方向プライマーのＮｄｅＩ切断部位の位置を示す。ベント（登録商標名）ＤＮＡポリメラーゼ、１ｘサーモポル緩衝液、１００μ１のＰＣＲ反応物中の鋳型としての５００ｎｇのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）の染色体ＤＮＡ及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃にて１５秒間、６８℃にて６０秒間、７２℃にて４５秒間から成るサイクルを２５回行った。キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いて、得られた７００塩基対のＰＣＲ産物を精製し、クレノウ酵素で処理し、ＮｄｅＩで消化して、キアクイックＰＣＲ精製プロトコールを用いて、もう１回精製した。
【００９４】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する、得られた７００塩基対のＮｄｅＩ−平滑末端断片を、ＮｄｅＩとＳｔｕＩで消化したｐＶＲ−２４ベクターに連結し、 予めＭｓｅＩメチラーゼ遺伝子コンストラクト、ｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ−９で修飾した大腸菌ＥＲ２５０２細胞を、連結物で形質転換した。分析した１８の形質転換体のうち、３個がｍｓｅＩＲ遺伝子を含有していた。ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ挿入体の配列を決定した後、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを製造するために、１個の組換えプラスミド、ｐＶＲ−２５を選択した。
【００９５】
（２）株の構築
宿主においてＬａｃＩリプレッサのコピー数を増やすために、米国特許出願 出願番号第０９／６８９，３５９号に記載されたように、株ＥＲ２８３３（Ｔ７ｌａｃＩｑ株）を構築した。
【００９６】
（３）別の宿主及び異なったレベルでＭｓｅＩメチラーゼを発現するプラスミドと組合せた大腸菌におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの過剰発現の最適化大腸菌におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの過剰発現を最適化するために、これらＭｓｅＩメチラーゼを発現するプラスミド（ｐＮＫＲ１７０７ＭｓｅＩｍ−９、ｐＣＲ−２６及びｐＶＲ−２７）の１つを持つことによってＭｓｅＩエンドヌクレアーゼの自己消化から事前に保護された、発現株、ＥＲ２５６６／ｐＣＥＦ−８にｐＶＲ−２５を移入した。ＥＲ２５６６／ｐＣＥＦ−８は、誘導可能なｌａｃプロモータ及び、低レベルのＴ７リゾチームとＴ７ＲＮＡポリメラーゼの天然阻害を特徴とするｐＳＹＸ２０を基にしたプラスミド、ｐＣＥＦ−８の制御のもと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対する遺伝子の染色体コピーを含有する宿主株である。さらなる情報については、Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｂ．Ａ．及びＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．の『Ｔ７リゾチームはＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写を阻害する』（Cell, 49:221-227, 1987）を参照のこと。誘導されない細胞では、リゾチームはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの基礎的な活性を低下させ、発現宿主中で安定に維持することができる標的遺伝子の範囲を増やす。さらに、Ｆ’エピゾーム上にｌａｃＩｑ遺伝子を１コピー有するもう１つの発現株、ＥＲ２８３３／ｐＣＥＦ−８を用いた。
【００９７】
全体として、大腸菌におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ発現の研究には６株を用いた（表２）。株はすべて、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを発現するｐＶＲ−２５プラスミド及びＴ７バクテリオファージのリゾチーム遺伝子をコードするｐＣＥＦ−８プラスミドを含有する。ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの高い収量について選択するために、種々の増殖条件を用いて、形質転換された宿主細胞を増殖させた。最適化実験で好ましい培地は、ルリア−ベルターニ（１リットル当り１グラムのグルコースと１グラムのＭｇＣｌ２を補った；以後補完ＬＢという）培地であった。
【００９８】
増殖条件は以下のとおりであった。
ＭｓｅＲＭ１： 個々のコロニーからの細胞を０．５リットルのＬＢ培地中で４２℃にて８時間増殖させ、その後、０．２ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、３０℃にて一晩（１５時間）細胞を増殖させた。必要に応じて抗生物質：３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加えた。最後に遠心によって培養したものを回収し、−２０℃に凍結した。
【００９９】
ＭｓｅＲＭ３： 各実験について、個々のコロニーからの細胞を０．５リットルのＬＢ培地中で３０℃にて一晩（１７時間）増殖させ、その後、０．２ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加えてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、細胞を４時間増殖させ続けた。必要に応じて抗生物質：３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加えた。最後に遠心によって培養したものを回収し、−２０℃に凍結した。
【０１００】
ＭｓｅＲＭ４、ＭｓｅＲＭ５及びＭｓｅＲＭ６： 細菌培養物は５０％グリセロール中、−７０℃における凍結保存溶液として保持された。播種に用いた培養物は、単一コロニーを得るために適当な抗生物質を含有したＬＢプレート上に筋状に播いた。個々のコロニーを１ｍｌのＬＢ培地に再浮遊し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った５００ｍｌのＬＢ培地を含有する１０００−ｍｌのフラスコに播種した。振盪培養器で３７℃、２５０ｒｐｍにて細胞を一晩（１６時間）増殖させた。その後、最終濃度０．２ｍＭでＩＰＴＧを加えた。さらに４時間細胞を培養し、次いで４℃で５分間８，０００ｒｐｍにて遠心することによって細胞を回収し、−２０℃にて凍結した。
【０１０１】
高レベルの発現クローンを同定するために２つの好ましい制限エンドヌクレアーゼアッセイを用いた。
超音波破砕法： 誘導した細胞（５００ｍｌ）を回収し、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含有する超音波破砕用緩衝液２０ｍｌに再浮遊した。氷上にてマクロ−チップのプローブで３０秒間の衝撃を４回行うことによって細胞を超音波破砕した。粗抽出物の一部をＮＥＢ緩衝液２緩衝液（５０μｌ）中のラムダＤＮＡ（１μｌ）に加え、３７℃にて１時間インキュベートした。０．８％のゲル電気泳動によってＤＮＡを分画し、ＥｔＢｒ染色によって視覚化した。
【０１０２】
エクスプレス法： 一晩、培養物又は誘導培養物（１０〜５００ｍｌ）を１ｍｌ回収し、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５及び２５％（容量／容量）のスクロースを含有する緩衝液０．２ｍｌに再浮遊し、溶液が均質になるまで混合した。２００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１１μｌそれに０．２５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で新しく調製した１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを２００μｌ溶液に加え、氷上で５分間インキュベートした。次いで１１．５μｌの１Ｍ、ＭｇＣｌ２及び２４．２μｌの５％（容量／容量）Ｂｒｉｊ−５８を加えた。溶液をゆっくり混合し、室温にて１５分間インキュベートした。インキュベートした後、４℃にて１５分間、微量遠心機の最大速度で細胞粗溶解物を遠心した。上清をピペットにより新しいエッペンドルフ管に移し、必要になるまで氷上で保管した。３７℃にて１時間、ＭｓｅＩ反応緩衝液（ＮＥＢ緩衝液２）中で細胞抽出物の連続希釈によって、ラムダＤＮＡ基質（１．０μｇ）を消化した。電気泳動によりＤＮＡを分画し、ＥｔＢｒ染色によって視覚化した。ラムダＤＮＡのＭｓｅＩ消化と関係する適当なサイズのバンドの存在によって活性を決定した。
【０１０３】
ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ発現の最適化に関する結果を表３に要約した。
【０１０４】
ＭｓｅＲＭ１株によって様々な収量のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（０．０８〜０．５ｘ１０６Ｕ／ｇ細胞の湿重量）が得られた。細胞は緩やかに増加し、遅延時間はことのほか長かった。
【０１０５】
ｌａｃを基にした組換え発現システムの安定性及び再現性を高めるために、Ｆ’エピゾーム上にｌａｃＩｑ遺伝子を１コピー有する新しい宿主株ＥＲ２８３３を構築した（米国特許出願、出願番号第０９／６８９，３５９）。実際、ｌａｃＩｑ宿主（ＭｓｅＲＭ３）における発現の安定性及びプラスミドの維持性は著しく高められた：ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの収量は、０．５〜１．４ｘ１０６Ｕ／ｇ細胞の湿重量であった。この株（実施例４を参照のこと）から精製されたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に非特異的エンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼを含まず、最終的な収量は約１５０，０００Ｕ／ｇであった。それは、元来のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）から得られるよりも約１００倍多かった。
【０１０６】
【表３】
残念ながら、ＭｓｅＲＭ３株は、−７０℃で保存し、回復させた後、ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。この問題を解決するために、ｐＶＲ−２６及びｐＶＲ−２７（上記実施例４）を構築することによってＭｓｅＩメチラーゼの発現レベルを高めた。このような株（ＭｓｅＲＭ４、ＭｓｅＲＭ５及びＭｓｅＲＭ６）では、−７０℃で株を保存した後でさえ高いＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ収量が得られ、ＭｓｅＲＭ４（ＮＥＢ＃１２８４；米国マサチューセッツ州、ベバリー、ニューイングランド・バイオラボズ社）は、１００リットルの製造用発酵槽でのスケールアップに用いられた（実施例４を参照のこと）。この大規模発酵でのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの収量は細胞の湿重量当り０．５ｘ１０６Ｕ／ｇであった。
【０１０８】
実施例６：組換えＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造
１００リットルの発酵槽において、晩期対数増殖期に増殖した組換え大腸菌株ＮＥＢ＃１２８４からＭｓｅＩ制限酵素を製造した。この細胞の試料を、２０００年８月２８日、ブタペスト協定の規約と条件のもとにＡＴＣＣに供託し、「ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２４２１」を受け取った。
【０１０９】
（Ａ）細胞の増殖
５０％グリセロール中−７０℃での凍結保存溶液として、組換えＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する形質転換された大腸菌宿主、ＮＥＢ＃１２８４を保存した。播種用に用いた培養物を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレートに筋状に播き、３７℃にて一晩インキュベートして単一コロニーを得た。３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った１０ｍｌのＬＢ培地に播種するのに数個のコロニーを用いた。３７℃、２５０ｒｐｍの振盪培養器にて細胞を３時間増殖させ、次いで３０℃にてさらに３．５時間増殖させた（培養物の過剰増殖を回避するため）。この培養の最終的に補正されたクレットは１２２又は対数増殖期の中ほどであった。この培養物を用いて、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った１００リットルのＬＢに播種した。２ＳＣＦＭの通気（１分当りの標準立方フィート）及び２００ｒｐｍの撹拌速度で３０℃にて１８時間、発酵を行った。最終補正クレットは３１３であった。この発酵から３３１グラムの細胞（湿重量）を連続流れ方式の遠心によって回収し、−７０℃に保存した。１ｇの細胞から粗抽出物を作成し、上記の方法（実施例５を参照のこと）を用いて、酵素活性を推定した。 粗抽出物中のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの収量は５００，０００＃Ｕ／ｇであり、それは、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ＮＥＢ＃４４６）の粗抽出物に比べて約１００倍高い。
【０１１０】
（Ｂ）ＮＥＢ＃１２８４からのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの精製
以下の工程はすべて氷上にて又は４℃のどちらかにて行った。９９０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＢＭＥ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び５％（容量／容量）のグリセロール）に３３０グラムの細胞を浮遊し、０．５６のＯ．Ｄ．までガウリン・プレスによってｐｓｉｇ１２Ｋにて４回破砕した。ＰＥＧ６０００を７．５％でＮａＣｌを０．５Ｍで加えることにより、１１５０ｍｌの上清をＰＥＧ沈殿し、次いで４℃にて５０分間インキュベートした。４℃にて１２Ｋで３０分間、ＰＥＧスラリーを遠心した。５８０ｍｌの上清をＮａＣｌを含まない緩衝液Ａで０．１ＭのＮａＣｌに希釈し、緩衝液Ａで平衡化した４３０ｍｌのヘパリンハイパーＤカラムにかけた。１２００ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄し、次いで４０００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌ〜１．０ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．２５Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、それをプールした。ヘパリンハイパーＤプールをＮａＣｌを含まない緩衝液Ａで０．１ＭのＮａＣｌに希釈し、緩衝液Ａで平衡化した８８ｍｌのＰＥＩカラムにかけた。１００ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄し、１０００ｍｌの０．１Ｍ〜１．７ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．７〜０．９ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのトリスｐＨ７．５、１０ｍＭのＢＭＥ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５％（容量／容量）のグリセロール）に対して一晩透析し、緩衝液Ｃで平衡化した２０ｍｌのソースＱカラムにかけた。４０ｍｌの緩衝液Ｃでカラムを洗浄し、４００ｍｌの０．０５ＭのＮａＣｌ〜１．０ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．２５Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、それをプールした。ソースＱプールを緩衝液Ｄ（１０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．０、０．０７５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＢＭＥ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、及び５％（容量／容量）のグリセロール）に対して透析し、緩衝液Ｄで平衡化した２０ｍｌのヘパリンＴＳＫカラムにかけた。４０ｍｌの緩衝液Ｄでカラムを洗浄し、４００ｍｌの緩衝液Ｄ中の０．０７５Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌの直線勾配を適用した。０．３〜０．４ＭのＮａＣｌで制限酵素活性が溶出し、それをプールした。最終濃度１００μｇ／ｍｌでＢＳＡを加えた。プールしたものを保存用緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０％（容量／容量）のグリセロール、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に対して一晩透析した。この精製法で２６，０００，０００単位のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼが得られた。この精製で得られたＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に非特異的なエンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼを含んでいなかった。
【０１１１】
以下の基準を見ることによってＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度をチェックした。
【０１１２】
１．連結：ラムダＤＮＡの５倍過剰消化の後、生じたＤＮＡ断片の９５％を越えるものが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結された（１６℃にて１〜２μＭの５’末端濃度）。この連結断片のうち９５％が再切断可能であった。
【０１１３】
２．持続消化：１μｇのラムダと１００単位の酵素を含有する５０μｌの反応物を１６時間インキュベートした後、１単位の酵素で１時間行われた反応としてＤＮＡバンドの同じバンドパターンが生じた。
【０１１４】
３．エクソヌクレアーゼ活性： １μｇの超音波破砕した３Ｈ ＤＮＡ（１０５ｃｐｍ／μｇ）を含有する５０μｌの反応において３７℃にて４時間、１００単位の酵素をインキュベートした後、０．４％未満の放射活性が放出された。
【０１１５】
試験はすべて、以下の反応緩衝液：ＮＥＢ緩衝液２（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃にてｐＨ７．９、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ補完）で行った。単位の決定：５０μｌの１ｘＭｓｅＩ反応緩衝液（ＮＥＢ緩衝液２）中で、３７℃にて１時間、連続希釈したＭｓｅＩエンドヌクレアーゼでラムダＤＮＡ基質（１．０μｇ）を消化した。電気泳動によってＤＮＡを分画し、ＥｔｄＢｒによって視覚化した。ラムダＤＮＡのＭｓｅＩ消化に関係する適当なサイズのバンドの存在によって活性を決定した。制限エンドヌクレアーゼ活性の１単位は、特定したＮＥＢ緩衝液を用いて、５０μｌの総反応容量中の１μｇの基質ＤＮＡを１時間で完全に消化するのに必要な量として定義される。
【０１１６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭｓｅＩＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＶＲ１８の制限地図を示す。
【図２】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＥｓａＤｉｘ４Ｉの制限地図を示す。
【図３】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドｐＥｓａＤｉｘ５Ｉの制限地図を示す。
【図４】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするｐＥｓａＤｉｘ４ＩプラスミドのＭｓｅＩに対する感受性の寒天ゲル解析を示す。レーン１、切断されていないｐＥｓａＤｉｘ４Ｉ；レーン２、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ４Ｉ；レーン３、切断されていないｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ４Ｉ＋ｐＵＣ１９；レーン５、分子量の基準（１ｋｂのＤＮＡラダー、ニューイングランドバイオラボズ社）。
【図５】推定上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするｐＥｓａＤｉｘ５ＩプラスミドのＭｓｅＩに対する感受性の寒天ゲル解析を示す。レーン１、切断されていないｐＥｓａＤｉｘ５Ｉ；レーン２、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ５Ｉ；レーン３、切断されていないｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＵＣ１９；レーン４、１０単位のＭｓｅＩと共に一晩インキュベートした後のｐＥｓａＤｉｘ５Ｉ＋ｐＵＣ１９；レーン５、分子量の基準（１ｋｂのＤＮＡラダー、ニューイングランドバイオラボズ社）。
【図６】ｍｓｅＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。
【図７】ｅｓａＤｉｘ４ＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。
【図８】ｅｓａＤｉｘ５ＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を示す。
【図９】ｍｓｅＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びそれにコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を示す。
【図１０】エラー傾向ＰＣＲによって無作為に変異誘発された構成プロモータのライブラリの構築に用いられた組換えプラスミドｐＮＫＲ１７０７ｍｓｅＩＭの制限地図を示す。
【図１１】ＭｓｅＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子及び上流の調節要素をコードする組換えプラスミドｐＮＫＲ１７０７ｍｓｅＩＭ−９の制限地図を示す。
【図１２】最適プロモータ配列を含有するＭｓｅＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の上流のＤＮＡ配列を示す。
【図１３】ＭｓｅＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子の制御された発現に用いられたプラスミドｐＶＲ−２６及びｐＶＲ−２７の構築を示す。
【図１４】ｐＶＲ−２４発現ベクターの構築を示す。
【図１５】ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするｐＶＲ−２５の制限地図を示す。
【図１６】Ｔ７リゾチーム遺伝子をコードするｐＣＥＦ−８の制限地図を示す。
【図１７】細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするためのｐＶＲ−２５における厳密な調節システムの作用機序を示す。
【図１８】大腸菌ＭｓｅＲＭ４、ＭｓｅＲＭ５及びＭｓｅＲＭ６から作製された細胞粗抽出物におけるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性のアッセイを示す。増殖条件は実施例６に記載されている。
【図１９】１００リットル発酵槽における増殖後の、大腸菌株ＭｓｅＲＭ４（ＮＥＢ＃１２８４）から作製された細胞粗抽出物でのＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性のアッセイを示す。
Claims (7)
- 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなるＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
- 配列番号７に示される塩基配列を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ。
- 請求項１又は２に記載のＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡベクター。
- 請求項３に記載のベクターで形質転換された形質転換細胞。
- さらに、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡベクターを含む、請求項４に記載の形質転換細胞。
- ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２４２１株である、請求項４又は５に記載の形質転換細胞。
- ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下にて請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換細胞を培養することを含むＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
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