CN111733147A - 一种t7核酸内切酶i的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸内切酶的制备方法。本发明所述的一种T7核酸内切酶的制备方法，包括以下步骤：(a)T7核酸内切酶的表达载体的构建；(b)将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及(c)采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即T7核酸内切酶。本发明所述方法获得的T7核酸内切酶I的切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相当，活性良好。本发明所述方法操作更为简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。
Description
本申请是中国国家申请号201410141111.4，发明名称为“一种T7核酸内切酶I的制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸内切酶的制备方法。
背景技术
T7核酸内切酶I是一种多功能核酸酶，可特异识别并拆分重组中间体(HolidayJunction，HJ)交叉结构，随机切刻双链DNA，特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点。
该酶蛋白是T7噬菌体基因3编码产物，由包含149个氨基酸残基的多肽链构成，两条肽链通过结构域交换形成同源二聚体，其催化中心由来自两个亚基的氨基酸侧链共同组成，两个催化结构域可以独立作为DNA切刻酶；通过结构域之间的协同作用，表现出结构特异性催化。作为一种已知的噬菌体类解离酶，该酶可以剪切分叉DNA，随机切刻线性DNA，识别并切刻nicked-DNA位点，识别单碱基错配位点，T7核酸内切酶I对HJ的结合具有高度特异性，其结合HJ的能力是结合线性双链DNA的1000倍左右，还具备随机在双链DNA中引入切刻位点的活性，专一性识别切刻位点并在另一条DNA链上对应位置引入另一切刻位点导致DNA双链的断裂，专一性识别并切割DNA双链中的单碱基错配位点。该酶应用广泛，具有作为工具酶的重要价值。主要的商业用途包括：可用于分支DNA结构的解离，基因组测序技术和DNA-shuffling技术中DNA的前处理，SNP的检测等。
目前制备T7核酸内切酶的方法是：将蛋白分别表达合成出两段肽链，在体外融合而成。采用IMPACT-TWIN蛋白纯化系统纯化与MBP融合表达的截短型无活性T7核酸内切酶I(tT7Endo I)，该融合蛋白的C-端带有硫酯键。然后体外合成一段合成肽，其中含有被前者截下来的氨基酸，将该合成肽与融合蛋白的C-端硫酯键相连接，形成全长具有活性的T7核酸内切酶I。最后，再用因子Xa将MBP融合头切去，纯化得到全长的野生型T7核酸内切酶I。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸内切酶的制备方法，该方法操作简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。
本发明所述的一种T7核酸内切酶的制备方法，包括以下步骤：
(a)T7核酸内切酶的表达载体的构建；
(b)将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及
(c)采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即T7核酸内切酶。
根据本发明所述的T7核酸内切酶的制备方法的进一步特征，所述表达载体包括：用于插入目的蛋白即T7核酸内切酶的编码序列的识别和切割位点；在所述识别和切割位点的上游具有如SEQ ID NO：1所示的gIIIs信号肽编码序列，其前面是起始密码子；在所述识别和切割位点的下游具有His6标签，其后面是终止密码子。
优选地，所述的识别和切割位点为BsaI识别及切割位点。
本发明的优点在于：构建N端带M13噬菌体蛋白III的前导序列(gIIIs)的载体，合成出来的信号肽能引导蛋白分泌出核外，在细胞周质中表达，对细胞本身的基因组无毒性，故能直接在体内表达出可溶并有生物活性的T7核酸内切酶I。这种生产方法简便易操作，易于规模化生产，并能有效节约成本。
经实验表明，本发明所述方法获得的T7核酸内切酶I能特异地识别DNA片段中不匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相当，活性良好。相比于现有技术，本发明所述方法操作更为简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。
附图说明
图1是T7核酸内切酶I的NI柱层析电泳图；图中，S：层析前样品；X：穿过样品；Elution：线性洗脱收集峰。
图2是T7核酸内切酶I的Heparin柱层析电泳图；图中，S：层析前样品；X：穿过样品；Elution：线性洗脱收集峰。
图3是T7核酸内切酶I的Hitrap SPP柱层析电泳图；图中，S：层析前样品；X：穿过样品；Elution：线性洗脱收集峰。
图4是反应产物用于琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：100-3000bp DNA Marker；1：加入NEB T7核酸内切酶I(NEB Catalog#M0302)的阳性对照；2：加入纯化后的T7核酸内切酶I；3：不加任何酶，加入ddH2O作为阴性对照；圆点：T7核酸内切酶I识别后切开所形成的条带，长度分别在480bp及330bp左右。
具体实施方式
以下合通过具体实施例结合附图的方式对本发明做进一步说明，目的在于本发明的内容而非限制发明的保护范围。下面实施例中，除非特别注明试验方法的具体条件，通常按照常规条件，如Sambrook等人著的《分子克隆：试验指南》(New York，Cold SpringHabour Laboratory Press)中所述条件，或按照制造厂商建议条件进行。实验所需菌种、质粒、试剂等均为商品化产品，均可通过生物制品厂商购买获得。
实施例1：T7核酸内切酶I的制备
制备方法：将T7基因的编码序列构建表达克隆，于大肠杆菌中表达，重组蛋白经过层析纯化后，获得目标蛋白。
具体流程如下：
(1)构建带BsaI酶切位点的pET28-gIIIs表达载体
在pET28表达载体XhoI酶切位点上游加入一个BsaI识别及切割位点(5’-GGTCTCT/AGGT-3’)，并在BsaI位点的上游加上起始密码子ATG和gIIIs信号肽编码序列，信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1KKLLFAIPLVVPFYSHS
(2)构建含基因片段的表达克隆
设计含有BsaI酶切位点的上游引物(SEQ ID NO：2)和XhoI(SEQ ID NO.3)酶切位点的下游引物，从大肠杆菌T7噬菌体基因组中进行PCR扩增，获得459bp含有T7核酸内切酶I基因编码序列的插入片段，其开放阅读框中不含有终止密码子。用BsaI和XhoI两个内切酶对片段及载体进行酶切，酶切之后的片段与载体含有相同的粘性末端。
SEQ ID NO：25’-atatatGGTCTCgTAGCatggcaggttacggcgct-3’
SEQ ID NO.35’-atatatCTCGAGtttctttcctcctttcctttttaa-3’
用T4 DNA连接酶连接插入片段和pET28载体。插入片段开放阅读框的下游包含有一个His6标签，以用于下游Ni柱纯化。His6标签后含有一个终止密码子TGA。连接产物进行转化到E.Coli 2T1感受态，在LB培养基上37℃过夜培养。通过鉴定后筛选出正确的转化子在LB液体培养基中扩大培养。
(3)收集菌液，细胞沉淀悬浮缓冲液A(20mMTris、50mM Nacl、2.5％甘油，PH7.0)和2X OTG等体积混合的溶液中，然后以大约18000psig通过高压破碎机，裂解物于12000rmp离心40min后收集上清。上清按1000∶1的比例加入Polyethylenimine充分混匀30分钟，12000rmp离心40分钟收集上清过0.22μm滤膜。
(4)将上清加到已用缓冲液A平衡好的Histrap-Ni柱上。用缓冲液A冲平基线，然后用0-500mM的Imidazole线性梯度洗脱收集。对各收集组份进行SDS-PAGE检测(图1)，收集含目的蛋白的组份。
(5)含目的蛋白的组份被汇集到一起，将样品上样到已经平衡好的Heparin柱子上。用缓冲液A冲平基线，然后用0-1M的Nacl线性洗脱。对各收集组份进行SDS-PAGE检测(图2)，收集含目的蛋白的组份。
(6)将上述各组份汇集到一起透析到缓冲液A后，样品上样到已用缓冲液A平衡好的Hitrap SPP柱子上。用缓冲液A冲平基线，然后用0-1M的Nacl线性洗脱。对各收集组份进行SDS-PAGE检测(图3)，收集含目的蛋白的组份。
(7)将上述各组份汇集到一起透析到贮存缓冲液(200mM Nacl、20mMTris-HclPH7.5、0.01mM EDTA、1mM DTT、0.15％TritonX-100、50％Glycerin)。纯化后的酶在-20℃保存。
实施例2：T7核酸内切酶I的活性检测
设计两个含有10个碱基差异的克隆，取相同的上游和下游引物进行扩增，得到一对有10个碱基不匹配的PCR产物。序列见SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5。
将两种PCR产物等量混合，在含有1X缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl21mM DTT，pH 7.9@25℃)中95℃变性5min，再退火至室温，形成具有一个重组中间体(HJ)的产物。在上述退火体系中加入1U实施例1所制备的T7核酸内切酶I，37℃孵育1小时。以NEB T7核酸内切酶I(Catalog#M0302)为阳性对照(PC)，并设置不加酶的阴性对照(NC)。反应结束后加入含有SDS的上样缓冲液终止反应。反应产物用于琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。
结果分析表明：本发明所述方法得到的T7核酸内切酶I能特异地识别DNA片段中不匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的T7核酸内切酶I相当，证明其活性保持良好。
Claims (2)
1.一种T7核酸内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)T7核酸内切酶的表达载体的构建；
(b)将T7核酸内切酶编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及
(c)采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即T7核酸内切酶；
所述表达载体包括：
用于插入目的蛋白即T7核酸内切酶的编码序列的识别和切割位点；
在所述识别和切割位点的上游具有如SEQ ID NO：1所示的gIIIs信号肽编码序列，其前面是起始密码子；
在所述识别和切割位点的下游具有His6标签，其后面是终止密码子。
2.根据权利要求1所述的T7核酸内切酶的制备方法，其特征在于：所述的识别和切割位点为BsaI识别及切割位点。
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| 康立新等: "T7核酸内切酶I的基因合成、克隆与表达", 2006年度学术研讨会论文摘要汇编, pages 84 * |
| 邵哲旭等: "大肠杆菌TOP10F’中重组质粒pBAD/gⅢ A-NTF2稳定性考察", 绵阳师范学院学报, vol. 29, no. 2, pages 79 - 83 * |
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