CN108315340A - 一种高效的dna编辑的方法 - Google Patents

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

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Abstract

本发明公开了一种高效的DNA编辑的方法，通过基因工程方法使T7核酸内切酶 I连接上DNA结合结构域，当含有DNA结合结构域特异识别特征的外源DNA结合到待编辑靶标DNA时，融合蛋白的T7核酸内切酶 I的核糖核酸内切酶活性识别碱基错配位点并切割DNA。本发明方法实现了特异高效地对DNA的编辑，可用于体内体外对DNA序列改变的方法，简单实用。

Description

一种高效的DNA编辑的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种高效DNA编辑的方法，具体为基于T7核酸内切酶I联合DNA结合结构域对靶标DNA进行序列修改的方法。
背景技术
DNA编辑技术指能够让人类对目标DNA进行序列修改，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。
在过去几年中，以ZFN(zinc-finger nucleases)和TALEN(transcriptionactivator-like effector nucleases)为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
CRISPR/Cas9系统也存在着一些不足。首先，Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠crRNA序列的匹配，在目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序(PAM)，如果目标序列周围不存在PAM或者无法严格配对，则Cas9蛋白不能对任意序列进行切割。最后，和ZFN及TALEN技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。
本发明开发的一种高效DNA编辑的方法。该技术基于T7核酸内切酶I联合DNA结合结构域对DNA/DNA杂交体系中的错配碱基进行切割的方法。本技术引入DNA结合结构域使T7核酸内切酶I可以更快，更准确地找到DNA/DNA杂交链中的错配碱基位点并进行切割。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对现有DNA编辑的技术存在的缺陷，旨在提供一种高效的DNA编辑的方法，本方法具有高效、简单、经济、准确的优点。
技术方案：一种高效的DNA编辑的方法，通过对特征DNA巧妙设计，使它带有DNA结合结构域结合的结构(如5’未端磷酸化修饰和自身形成发夹结构或者通过另一条短的磷酸化的寡核苷酸与该反义寡核苷酸形成双链结构)，在具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶I的融合蛋白以及相应的特征DNA的作用下切割错配位点DNA。
本发明所述特征DNA，为提高其在细胞内的稳定性，可对其中部分核苷酸进行硫代磷酸修饰。而且对切割位点进行硫代磷酸修饰还起到抑制T7核酸内切酶I对特征DNA切割，从而靶标DNA被切割后可以特征DNA为模板补上错配碱基，起到对靶标DNA进行高效修改。
本发明所述的具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶I的融合蛋白，可以通过原核表达(如大肠杆菌)并纯化得到：
所表达的蛋白质序列见SEQ ID NO.1所示，为了使该蛋白能够顺利进入细胞内，在N未端加入穿膜肽序列(RRRRRRRRRR)；为使蛋白能够进入细胞核中起作用，在融合蛋白中间加入核定位信号(PKKKRKV)为不影响DNA结合结构域与T7核酸内切酶I各自功能，在各功能区之间加入一段柔性肽(GGGGSGGGGSGGGGS和GGGGSGGGGSGGGGS)；同时为了纯化方便，在C未端加入组蛋白纯化标签(HHHHHH)。为了更高效得到有活性蛋白，运用软件对翻译该蛋白的密码子进行全面优化使它更适合于大肠杆菌中表达，并构建到原核表达载体上进行大肠杆菌表达并纯化。
本发明所述的具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶I融合蛋白，也可以构建真核表达载体，通过病毒或质粒直接转染细胞表达：
所表达的蛋白质序列见SEQ ID NO.2所示，与SEQ ID NO.1相比，该蛋白去除N未端加入穿膜肽序列和组蛋白纯化标签序列。为了更高效得到有活性蛋白，运用软件对翻译该蛋白的密码子进行全面优化使其适合于真核细胞中表达，并构建到真核表达载体或病毒载体上进行细胞内表达。
本发明方法按照常规的分子生物学方法进行。
本发明方法运用于体内或体外对DNA进行序列修改等。
有益效果：本发明的方法由于在T7核酸内切酶I的基础上加入DNA结合结构域，大大提高T7核酸内切酶I识别并切割DNA/DNA杂交体系中的错配碱基能力，与DNA编辑方法相比，提高效率而且使用起来更简单，适用于基因功能研究等应用；该方法按照流行的分子生物学方法进行，所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊购买。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种高效的DNA编辑的方法，将293T细胞含有co-GFAP质粒的co-GFAP基因敲除。具体通过以下方法：
1)根据SEQ ID NO.1序列，于原核表达并纯化得到融合蛋白；
2)在上述纯化蛋白加入表1寡核苷酸。然后把混合物加入培养细胞中。
3)再次培养72小时，即可敲除co-GFAP基因。
表1寡核苷酸序列
SEQUENCE LISTING
<110> 李燕强
<120> 一种高效DNA编辑的方法
<130> 20170118
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Trp Arg Lys
1 5 10 15
Arg Thr Glu Asn Asp Gly Trp Glu Lys Trp Gly Gly Tyr Met Ala Ala
20 25 30
Lys Val Gln Lys Leu Glu Glu Gln Phe Arg Thr Asp Ala Ala Asn Gln
35 40 45
Lys Asp Gly Thr Ala Ser Ala Ile Phe Ser Gly Val Ala Ile Tyr Val
50 55 60
Asn Gly Tyr Thr Asp Pro Ser Ala Glu Glu Leu Arg Asn Leu Met Met
65 70 75 80
Leu His Gly Gly Gln Tyr His Val Tyr Tyr Ser Arg Ser Lys Thr Thr
85 90 95
His Ile Ile Ala Thr Asn Leu Pro Asn Ala Lys Ile Lys Glu Leu Lys
100 105 110
Gly Glu Lys Val Ile Arg Pro Glu Trp Ile Val Glu Ser Ile Lys Ala
115 120 125
Gly Arg Leu Leu Ser Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
145 150 155 160
Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Met Ala Gly Tyr Gly Ala Lys Gly Ile Arg Lys Val Gly Ala Phe Arg
180 185 190
Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly Ile
195 200 205
Lys Phe Glu Tyr Glu Glu Trp Lys Val Pro Tyr Val Ile Pro Ala Ser
210 215 220
Asn His Thr Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe Val
225 230 235 240
Glu Thr Lys Gly Leu Trp Glu Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu Leu
245 250 255
Ile Arg Glu Gln His Pro Glu Leu Asp Ile Arg Ile Val Phe Ser Ser
260 265 270
Ser Arg Thr Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Glu Phe
275 280 285
Cys Glu Lys His Gly Ile Lys Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Ala Glu
290 295 300
Trp Ile Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro Phe Asp Arg Leu Lys Arg
305 310 315 320
Lys Gly Gly Lys Lys His His His His His His
325 330
<210> 2
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gly Gly Trp Arg Lys Arg Thr Glu Asn Asp Gly Trp Glu Lys Trp
1 5 10 15
Gly Gly Tyr Met Ala Ala Lys Val Gln Lys Leu Glu Glu Gln Phe Arg
20 25 30
Thr Asp Ala Ala Asn Gln Lys Asp Gly Thr Ala Ser Ala Ile Phe Ser
35 40 45
Gly Val Ala Ile Tyr Val Asn Gly Tyr Thr Asp Pro Ser Ala Glu Glu
50 55 60
Leu Arg Asn Leu Met Met Leu His Gly Gly Gln Tyr His Val Tyr Tyr
65 70 75 80
Ser Arg Ser Lys Thr Thr His Ile Ile Ala Thr Asn Leu Pro Asn Ala
85 90 95
Lys Ile Lys Glu Leu Lys Gly Glu Lys Val Ile Arg Pro Glu Trp Ile
100 105 110
Val Glu Ser Ile Lys Ala Gly Arg Leu Leu Ser Ser Ala Pro Tyr Gln
115 120 125
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gly Tyr Gly Ala Lys Gly Ile Arg
165 170 175
Lys Val Gly Ala Phe Arg Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln
180 185 190
Leu Glu Ser Lys Gly Ile Lys Phe Glu Tyr Glu Glu Trp Lys Val Pro
195 200 205
Tyr Val Ile Pro Ala Ser Asn His Thr Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu
210 215 220
Pro Asn Gly Ile Phe Val Glu Thr Lys Gly Leu Trp Glu Ser Asp Asp
225 230 235 240
Arg Lys Lys His Leu Leu Ile Arg Glu Gln His Pro Glu Leu Asp Ile
245 250 255
Arg Ile Val Phe Ser Ser Ser Arg Thr Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro
260 265 270
Thr Ser Tyr Gly Glu Phe Cys Glu Lys His Gly Ile Lys Phe Ala Asp
275 280 285
Lys Leu Ile Pro Ala Glu Trp Ile Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro
290 295 300
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<213> 人工序列
<400> 3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
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1 5
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<211> 54
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<213> 人工序列
<400> 8
actccaccct catgggtgga gttaatcaat aattaagcag ggcctcatga ccaa 54
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
actccaccct catgggtgga gttaatcaat aattgccttt ggtgatcttc atct 54
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
actccaccct catgggtgga gttaatcaat aatttgagcc acgagatggg ctac 54
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
actccaccct catgggtgga gttaatcaat aatttaggtg ccgatgtggt agaa 54

Claims (8)

1.一种高效的DNA编辑的方法，其特征在于：在具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶 I的融合蛋白以及相应的特征DNA的作用下对目标DNA进行编辑。
2.根据权利要求1所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶 I的融合蛋白中含有一段进入细胞核的引导肽。
3.根据权利要求1所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶 I的融合蛋白是通过大肠杆菌表达纯化得到或通过构建表达载体直接在真核细胞中表达得到。
4.根据权利要求1所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的具有特征DNA结合结构域与T7核酸内切酶 I的融合蛋白中的特征DNA结合结构域为REV1蛋白的DNA结合结构域。
5.根据权利要求4所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的相应的特征DNA是含有所编辑目标DNA结合的DNA序列，该DNA序列为双链DNA且5末端磷酸化。
6.根据权利要求1所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的特征DNA可以是通过自身形成发夹结构的双链DNA。
7.根据权利要求1所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的特征DNA含有一个或一个以上与被编辑DNA发生错配碱基。
8.根据权利要求1所述的高效的DNA编辑的方法，其特征在于：所述的特征DNA可以对碱基中的部分或全部进行硫代修饰。
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