CN108129571A - Taq DNA连接酶融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Taq DNA连接酶融合蛋白，其Taq DNA连接酶的羧基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在Taq DNA连接酶的氨基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化，Taq DNA连接酶和古细菌的Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到了效率和活性更高的融合蛋白，Sso7d片段融合在Taq DNA连接酶羧基末端，融合在氨基末端，简化了酶的纯化方法，是将古细菌的Sso7d的DNA结合功能域和TaqDNA连接酶进行融合表达，融合基团设计在羧基末端，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲合柱和离子交换结合即可实现，新的酶分子用于SNP分析中的连接反应，显示出更高的效率，生产成本低，适合工业化。

Description

Taq DNA连接酶融合蛋白
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及Taq DNA连接酶融合蛋白。
背景技术
Taq DNA连接酶是连接酶检测反应(LDR)分型方法中不可少的一种工具酶。古细菌的 Sso7d的DNA结合功能域在分子生物学的工具酶上，也得到较为广泛的应用，如与Taq和Pfu DNA多聚酶进行融合表达，可使得酶的扩增速度增加几倍，显著性得提高酶效率。TaqDNA 连接酶是SNP分析中的关键酶，活性高低是试验是否成功的关键因素，为增强Taq DNA连接酶的效率，我们将古细菌的Sso7d的DNA结合功能域和Taq DNA连接酶融合表达，得到活性更高的连接酶，生产成本低，适合工业化使用。
发明内容
本发明的目的在于提供Taq DNA连接酶融合蛋白，活性更高，生产成本低，适合工业化使用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了Taq DNA连接酶融合蛋白，其Taq DNA连接酶的羧基末端引入古细菌的 Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在Taq DNA连接酶的氨基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化。
作为本发明的一种优选技术方案，将所述Taq DNA连接酶和古细菌的所述Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到了效率和活性更高的融合蛋白。
作为本发明的一种优选技术方案，将所述Sso7d片段融合在所述Taq DNA连接酶羧基末端，6个组氨酸标签融合在氨基末端。
作为本发明的一种优选技术方案，对于所述Sso7d也可以融合在其它高温连接酶分子上。
作为本发明的一种优选技术方案，所述Sso7d蛋白序列为：
作为本发明的一种优选技术方案，所述Taq DNA连接酶蛋白序列为：
作为本发明的一种优选技术方案，，所述Taq DNA连接酶蛋白序列为：
本发明所达到的有益效果是：该发明是Taq DNA连接酶融合蛋白，是将古细菌的Sso7d 的DNA结合功能域和TaqDNA连接酶进行融合表达，融合基团设计在羧基末端，在T4DNA连接酶的氨基末端引入6个组氨酸标签。预期得到的重组蛋白具有更高的连接效率，同时因在重组的融合蛋白氨基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过镍亲合柱和离子交换结合即可实现，新的酶分子用于SNP分析中的连接反应，显示出更高的效率，生产成本低，适合工业化。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
实施例1
本发明提供Taq DNA连接酶融合蛋白，其Taq DNA连接酶的羧基末端引入古细菌的Sso7d 的DNA，在构建融合蛋白的同时在Taq DNA连接酶的氨基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化。
将所述Taq DNA连接酶和古细菌的所述Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到了效率和活性更高的融合蛋白，更加适合于SNP分析。
将所述Sso7d片段融合在所述Taq DNA连接酶羧基末端，6个组氨酸标签融合在氨基末端。
对于所述Sso7d也可以融合在其它高温连接酶分子上，如Tth DNA连接酶等。
该发明是Taq DNA连接酶融合蛋白，首先将Sso7d-Taq DNA连接酶融合蛋白序列优化的核苷酸序列引入Nco I和Xho I位点序列，该人工合成序列，通过基因合成获得。克隆的载体选用pET28a，构建的表达载体转入BL21(DE3)进行表达；表达的融合蛋白，破菌后，上清蛋白在75℃处理20分钟，冰上30分钟，离心收集上清，先用DEAE-琼脂糖凝胶纯化，再用NTA-琼脂糖凝胶吸附，咪唑解离，得到纯度95％的酶液，酶液在10mM TrisHCl pH7.5，50mM KCl，1mM DTT，().1mM EDTA，50％甘油透析3次，-20度保存；为验证得到融合蛋白的酶活性，制备的酶和NEB的Taq DNA连接酶进行活性比较。试验方法是测定人基因组 DNArs177086686位点，序列为 AATGGAAAGAGGCTGGAAGCAGAGA[A/G]CGTTCCTCTCCGTGGAGCTTCCCAA。连接产物测序进行单核苷酸分析，理论上讲，酶的活性高，得到的连接产物量大，用于测序反应后，获得的测序产物的量也相应增大，毛细管电泳分析后，单核苷酸的峰值高，信号明显。下表是我们用相同摩尔量的的Taq DNA连接酶测定16个样品的结果，我们制备的Ssod7-Taq DNA连接酶的作用效果极显著高于NEB的Taq DNA连接酶。
其中作为本发明中的Sso7d蛋白序列为：
Taq DNA连接酶蛋白序列为：
Taq DNA连接酶融合蛋白序列为：
本发明所达到的有益效果是：该发明是Taq DNA连接酶融合蛋白，是将古细菌的Sso7d 的DNA结合功能域和TaqDNA连接酶进行融合表达，融合基团设计在羧基末端，在T4DNA连接酶的氨基末端引入6个组氨酸标签。预期得到的重组蛋白具有更高的连接效率，同时因在重组的融合蛋白氨基末端引入6个组氨酸标签，简化了酶的纯化方法，纯化工艺通过离子交换和镍亲合柱结合即可实现，新的酶分子用于SNP分析中的连接反应，显示出更高的效率，生产成本低，适合工业化。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.Taq DNA连接酶融合蛋白：其特征在于，其Taq DNA连接酶的羧基末端引入古细菌的Sso7d的DNA，在构建融合蛋白的同时在Taq DNA连接酶的氨基末端引入6个组氨酸的亲和标签，用镍亲和柱进行纯化。
2.根据权利要求1所述的Taq DNA连接酶融合蛋白，其特征在于，将所述Taq DNA连接酶和古细菌的所述Sso7dDNA结合功能域进行融合表达，得到了效率和活性更高的融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的Taq DNA连接酶融合蛋白，其特征在于，将所述Sso7d片段融合在所述Taq DNA连接酶羧基末端，融合在氨基末端。
4.根据权利要求1所述的Taq DNA连接酶融合蛋白，其特征在于，对于所述Sso7d也可以融合在其它高温连接酶分子上。
5.根据权利要求1所述的Taq DNA连接酶融合蛋白，其特征在于，所述Sso7d蛋白序列为：
1 MATVKFKYKG EEKEVDISKIK KVWRVGKMIS FTYDEGGGKT GRGAVSEKDA PKELLQMLE
61 KQ。
6.根据权利要求1所述的Taq DNA连接酶融合蛋白，其特征在于，所述Taq DNA连接酶蛋白序列为：
7.根据权利要求1所述的Taq DNA连接酶融合蛋白，其特征在于，所述Taq DNA连接酶蛋白序列为：
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