CN110577935A - 一种增强t4 dna连接酶原核表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了α,ω‑二元醇在提高T4 DNA连接酶原核表达中的应用。本发明利用1,6‑己二醇及其同分异构体(1,5‑己二醇或2,5‑己二醇)，应用于T4 DNA连接酶原核表达体系中，从而有效地提高T4 DNA连接酶表达产量。由此可以解决现有技术中T4 DNA连接酶生产耗时、耗力的问题，本发明为T4 DNA连接酶的大规模工业化生产提供了很大的应用价值。

Description

一种增强T4 DNA连接酶原核表达的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种ɑ,ω-二元醇及其同分异构体有效地促进T4 DNA连接酶原核表达的方法。

背景技术

DNA连接酶通过催化核酸切口处两个核苷酸的3’-羟基和5’-磷酸末端形成磷酸二酯键，从而连接两段双链DNA或RNA分子，在DNA的修复和重组过程中发挥重要作用，广泛存在于真核生物、古细菌和多种病毒中。T4 DNA连接酶是一种依赖于ATP供能的连接酶，能连接单缺口、粘性末端、平末端双链DN A、双链RNA或者DNA/RNA杂交体，作为一种基因工程工具酶被广泛应用于分子生物学领域。科学家最早于1967年从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取得到T4 DNA连接酶，但这种方法只能获得极其微量的T4 DNA连接酶。后来发现利用λT4噬菌体溶源菌分离纯化T4 DNA连接酶可以获得更高的产量。目前，将携带T4 DNA连接酶基因的质粒转入大肠杆菌中通过原核表达获取T4 DNA连接酶已成为常用方法。但是T4 DNA连接酶每年消耗量巨大，原核表达纯化T4DNA连接酶耗时、耗力。因此，寻找提高T4 DNA连接酶原核表达产量的方法具有重大工业价值。

1,6-己二醇是一种ɑ,ω-二元醇，分子式为C₆H₁₄O₂，外表为白色针状晶体，可溶于水和乙醇，同分异构体有1,5-己二醇，2,5-己二醇，1,2-己二醇等。作为一种重要的化工中间体，能与有机酸、酸酐、异氰酸盐等反应产生各种类型的化合物，广泛应用于生产增塑剂、聚酯树脂、光固化剂、聚氨酯高弹体等领域。在基础生物医学研究领域，最新的研究表明1,6-己二醇可以通过破坏疏水作用，引起无膜结构颗粒的液-液相分离，因此可作为研究细胞无膜结构生理特性的工具。

目前鲜有关于1,6-己二醇应用于基础生物医药领域的研究报道，其应用前景值得我们进一步去发掘。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种增强T4 DNA连接酶原核表达的方法。

本发明的第一个目的是提供α,ω-二元醇在提高T4 DNA连接酶原核表达中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种T4 DNA连接酶原核表达的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

发明人经过创造的研究发现1,6-己二醇或者其同分异构体1,5-己二醇，2,5-己二醇应用于T4 DNA连接酶原核表达中，能在DNA水平和mRNA水平提高T4 DNA连接酶的表达量。因此本发明要求保护以下内容：

α,ω-二元醇在提高T4 DNA连接酶原核表达中的应用。

优选地，所述α,ω-二元醇为己二醇。

更优选地，所述α,ω-二元醇为1,6-己二醇、1,5-己二醇或2,5-己二醇中的一种或几种。

最优选地，所述α,ω-二元醇为1,6-己二醇。

一种T4 DNA连接酶原核表达的方法，在T4 DNA连接酶原核表达体系中添加α,ω-二元醇。

T4 DNA连接酶原核表达体系为培养有表达T4 DNA连接酶的原核表达菌株及其培养基。

所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

优选地，在T4 DNA连接酶原核表达体系中，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷启动诱导表达，同时加入α,ω-二元醇，进行T4 DNA连接酶的原核表达。

更优选地，其特征在于，培养原核表达T4 DNA连接酶的菌株的培养基中添加1,6-己二醇，终浓度不大于4％。

更优选地，其特征在于，培养原核表达T4 DNA连接酶的菌株的培养基中添加1,6-己二醇，终浓度为2％。

更优选地，其特征在于，IPTG的终浓度为1mM。

最优选地，在T4 DNA连接酶原核表达体系中，加入终浓度为1mM的IPTG启动诱导表达，同时加入α,ω-二元醇至终浓度为2％，进行T4 DNA连接酶的原核表达。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用1,6-己二醇及其同分异构体，应用于T4 DNA连接酶原核表达体系中，从而有效地提高T4 DNA连接酶表达产量。由此可以解决现有技术中T4 DNA连接酶生产耗时、耗力的问题，本发明为T4 DNA连接酶的大规模工业化生产提供了很大的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度的1,6-己二醇对大肠杆菌的毒性作用。

图2为连接了T4 DNA连接酶基因的pET15b表达质粒载体图。

图3为1,6-己二醇促进T4 DNA连接酶的原核表达以及浓度效应关系。

图4为2,5-己二醇、1,5-己二醇也能促进T4 DNA连接酶的原核表达。

图5为加入1,6-己二醇的条件下，小量表达和纯化T4 DNA连接酶。

图6为加入1,6-己二醇纯化的T4 DNA连接酶的功能验证。

图7为1,6-己二醇促进T4 DNA连接酶原核表达的机制研究。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 1,6-己二醇对大肠杆菌的毒性作用

1,6-己二醇是一种化学原料，在基础研究领域应用尚且有限，目前还没有关于1,6-己二醇对细菌的毒性作用的报道，因此我们检测了不同浓度的1,6-己二醇对大肠杆菌的毒性作用。

一、实验方法

将感受态BL21大肠杆菌接种到LB培养基，在37℃、220rpm细菌摇床中培养至OD值到0.6左右，加入终浓度分别为0.5％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、20％的1,6-己二醇(sigma)，继续培养12小时。由于诱导剂IPTG同样具有一定的细菌毒性，因此同时加入或不加终浓度为1mM的IPTG。

二、实验结果

结果如图1所示，1,6-己二醇对大肠杆菌有毒性，并且呈剂量依赖关系。因此在蛋白诱导表达过程中不宜加入过高浓度的1,6-己二醇。

实施例2不同浓度1,6-己二醇对T4 DNA连接酶的原核表达的作用

一、实验方法

将质粒pET15b-T4 DNA ligase(是连接了T4 DNA连接酶基因的pET15b表达质粒，图2所示)转入感受态BL21(DE3)，挑取单克隆接种到LB培养基，在37℃、220rpm细菌摇床中培养至OD值到0.6左右。取1ml菌液，加入终浓度1mM的IPTG和不同终浓度的1,6-己二醇，设置1,6-己二醇质量百分浓度梯度为0、1％、2％、4％、6％、8％，在37℃、220rpm细菌摇床中诱导培养。4小时后，收集菌体，超声破碎，取上清，加入5×loading buffer，100℃煮10分钟，SDS-PAGE胶电泳，恒压60V 30分钟转120V 60分钟。取出胶，用考马斯亮蓝染液染色1小时后，脱色液进行脱色4～6小时。

为了进一步研究1,6-己二醇的浓度与T4 DNA连接酶产量的关系，增设1,6-己二醇浓度梯度0.5％和1.5％。

二、实验结果

结果如图3所示，1,6-己二醇能促进T4 DNA连接酶的原核表达，且随着1,6-己二醇浓度的提高，T4 DNA连接酶的原核表达增强。但1,6-己二醇浓度达到4％时，效果降低，进一步增加1,6-己二醇浓度，毒性过强导致细菌大量死亡，几乎检测不到T4 DNA连接酶的表达。因此最适宜的1,6-己二醇浓度为2％。

实施例3 2,5-己二醇、1,5-己二醇促进T4 DNA连接酶的原核表达

为了验证1,6-己二醇的同分异构体2,5-己二醇、1,5-己二醇对T4 DNA连接酶的原核表达是否有相同的促进作用，采用同样的小量诱导表达方法，在诱导阶段加入不同浓度的2,5-己二醇或1,5-己二醇。

一、实验方法

同实施例2。

二、实验结果

结果如图4所示，2,5-己二醇、1,5-己二醇也能促进T4 DNA连接酶的原核表达，并且呈现浓度效应关系。

实施例4表达和纯化T4 DNA连接酶

一、实验方法

将转化了pET15b-T4 DNA ligase的单克隆BL21(DE3)，接种LB培养基，在37℃、220rpm细菌摇床中培养至OD值到0.6左右。加入终浓度1mM的IPTG和2％的1,6-己二醇，同时设置不加1,6-己二醇的对照组，在37℃、220rpm摇床诱导培养4小时。收集菌体，用CapturemTM his-tagged快速纯化试剂盒(Takara)纯化蛋白，用SDS-PAGE胶检验蛋白纯度，用BCA试剂盒(ThermoFisher Scientific)检测蛋白浓度。

二、实验结果

结果如图5所示，在相同的诱导条件下，加入2％1,6-己二醇可以提高T4DNA连接酶的产量至少5倍。

实施例5 T4 DNA连接酶的功能检测

一、实验方法

将加入或者不加入1,6-己二醇诱导表达纯化得到的T4 DNA连接酶，分别稀释5倍、10倍、20倍、100倍后去连接经HindⅢ消化的λDNA(ThermoFisher Scientific)。反应体系为：

16℃作用30分钟。同时用商业化的T4 DNA连接酶(takara)作阳性对照。

同时，为进一步验证T4 DNA连接酶对载体和酶切片段的连接效果，我们在连接反应体系中加入3μl酶切的线性化载体，14μl相同酶切的目的基因片段，2μl ATP缓冲液和1μl稀释的T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。第二日用感受态stbl3转化，观察形成的单克隆数目，并做菌落PCR鉴定阳性克隆。

二、实验结果

结果如图6所示，加入1,6-己二醇诱导表达纯化得到的T4 DNA连接酶连接活性正常。

实施例6 1,6-己二醇促进T4 DNA连接酶原核表达的机制研究

一、实验方法

转化了pET15b-T4 DNA ligase的BL21(DE3)诱导培养4小时后，收集菌体，用TRIZOL(life)裂解提取细菌总RNA，用反转试剂盒(诺唯赞)反转合成cDNA，接着用SYBRPremix ExTaq II Kit(Takara)按照说明书使用CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)进行定量PCR，用细菌16sRNA作为内参检测T4 DNA连接酶的mRNA表达水平。

转化了pET15b-T4 DNA ligase的BL21(DE3)诱导培养4小时后，收集菌体，经溶菌酶消化后，用细菌DNA提取试剂盒(omega)提取细菌总的DNA，用同样的方法进行定量PCR，检测T4 DNA连接酶的DNA表达水平。

二、实验结果

结果如图7所示，加入1,6-己二醇诱导的T4 DNA连接酶的mRNA水平和DNA水平均提高。

Claims (10)

1.α,ω-二元醇在提高T4 DNA连接酶原核表达中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α,ω-二元醇为己二醇。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述α,ω-二元醇为1,6-己二醇、1,5-己二醇或2,5-己二醇中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述α,ω-二元醇为1,6-己二醇。

5.一种T4 DNA连接酶原核表达的方法，其特征在于，在T4 DNA连接酶原核表达体系中添加α,ω-二元醇。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在T4 DNA连接酶原核表达体系中，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷启动诱导表达，同时加入α,ω-二元醇，进行T4 DNA连接酶的原核表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养原核表达T4 DNA连接酶的菌株的培养基中添加1,6-己二醇，终浓度不大于4％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养原核表达T4 DNA连接酶的菌株的培养基中添加1,6-己二醇，终浓度为2％。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，IPTG的终浓度为1mM。

10.根据权利要求1到6任一所述方法，其特征在于，在T4 DNA连接酶原核表达体系中，加入终浓度为1mM的IPTG启动诱导表达，同时加入α,ω-二元醇至终浓度为2％，进行T4 DNA连接酶的原核表达。