CN114540403B - 酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种酯化虾青素的制造方法，属于生物工程技术领域。所述制造方法包括：获取酯化基因，所述酯化基因来自于裂殖壶菌且与裂殖壶菌中的dgat2基因的同源性高于90％，所述dgat2基因用于形成DGAT2蛋白；采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体；将所述表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素。本公开通过该酯化虾青素的制造方法，可以制得酯化虾青素。

Description

酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用

技术领域

本公开属于生物工程技术领域，特别涉及一种酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用。

背景技术

虾青素(astaxanthin)是一种天然红色的酮基类胡萝卡素，天然存在于少数几类细菌、微藻，和一类植物金盏花中。海洋动物包括鱼和甲壳类动物虽然不能从头合成虾青素，但是可以通过摄取浮游动物或浮游植物来摄取虾青素，或者将其他摄取的类胡萝卜素转化为虾青素。虾青素的化学名称为3，3’-二羟基-4，4’－二酮基-β，β’-胡萝卡素，为萜烯类不饱和化合物，分子式为C₄₀H₅₂O₄。由于虾青素的分子两端的羟基很不稳定，极易被氧化。在自然环境中生产合成的虾青素包括游离虾青素、酯化虾青素和糖基化虾青素等。酯化虾青素相较于游离虾青素，稳定性更好，且有文献表明二者生物活性有差异。

相关技术中，酯化虾青素可以通过生物法得到。例如，基于微藻—雨生红球藻合成酯化虾青素。将雨生红球藻置于培养基中，并将培养基置于光照条件下，当积累一定生物量后转为缺氮等压力培养方式，使得雨生红球藻细胞内的虾青素迅速积累且大部分以酯化虾青素的方式积累，再通过浸提，过滤等提取酯化虾青素。除了雨生红球藻，目前有报道佐夫色绿藻和一种植物福寿花也能天然合成酯化虾青素，但是目前虾青素的酯化基因尚未从任何物种中鉴定出来。

然而，当通过其他生物方法，比如工程菌株获取得到虾青素时，尚无方法获得酯化虾青素。

发明内容

本公开实施例提供了一种酯化虾青素的制造方法，可以辅助产游离虾青素的工程菌株，获取得到酯化虾青素。所述技术方案如下：

本公开实施例提供了一种酯化虾青素的酯化基因，所述制造方法包括：获取酯化基因，所述酯化基因来自于裂殖壶菌，且与所述裂殖壶菌中的dgat2基因的同源性高于90％，所述dgat2基因用于形成DGAT2蛋白；采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体；将所述表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素。

本公开的又一种实现方式中，所述获取酯化基因，包括：获取dgat2基因；

从所述dgat2基因中，获取dgat2-1基因或者dgat2-3基因，作为所述酯化基因。

本公开的又一种实现方式中，采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体，包括：对所述酯化基因进行密码子优化；将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP’线性载体；将克隆有所述酯化基因的pYLXP’::dgat2载体转入DH5α菌株中；从转入pYLXP’::dgat2载体的所述DH5α菌株中提取所述表达载体。

本公开的又一种实现方式中，所述将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP’线性载体，包括：将pYLXP'载体进行双酶切，得到具有粘性末端且线性化的pYLXP'各载体片段；通过凝胶电泳对所述线性化的pYLXP'载体各片段分离，并用DNA凝胶回收试验盒对线性化的pYLXP'各载体片段中的目的载体片段进行回收，得到纯化后的pYLXP'线性化载体片段；将所述纯化后的pYLXP'线性化载体片段和优化后的所述酯化基因通过T4 DNA连接酶进行连接，使得优化后的所述酯化基因克隆到纯化后的pYLXP’线性化载体片段上。

本公开的又一种实现方式中，所述从转入pYLXP’::dgat2载体的所述DH5α菌株中提取所述表达载体，包括：从转入pYLXP’::dgat2载体的所述DH5α菌株中挑取抗氨苄青霉素的单克隆；对所述单克隆进行PCR检测，以确定所述单克隆中是否含有酯化基因；从含有酯化基因的所述单克隆中，提取所述表达载体。

本公开的又一种实现方式中，所述对所述单克隆进行PCR检测时，所用的检测引物分别为pTEFm-F和XP2ts-R。

本公开的又一种实现方式中，所述将所述表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素，包括：对所述工程菌株进行活化处理；将包含所述表达载体的所述工程菌株在活化处理后进行转化培养，得到培养液；对所述培养液进行处理，得到所述酯化虾青素。

本公开的又一种实现方式中，所述将包含所述表达载体的所述工程菌株在活化处理后进行转化培养，得到培养液，包括：

将活化处理后的所述工程菌株的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到底盘菌株；将所述表达载体转入所述底盘菌株中进行培养，得到所述培养液。

本公开的又一种实现方式中，所述提取所述培养液，得到所述酯化虾青素，包括：将所述培养液进行离心、漩涡震荡和萃取，得到提取液；对所述提取液进行薄层色谱法分离和液相色谱检测，得到所述酯化虾青素并加以鉴定。

本公开的又一种实现方式中，还提供一种酯化基因的应用，所述酯化基因用于对游离虾青素进行酯化，所述酯化基因来自于裂殖壶菌，且与所述裂殖壶菌中的dgat2基因的同源性高于90％。

本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

基于生物合成获得非天然来源的酯化虾青素，大大提高工程菌株合成虾青素的稳定性。通过调节脂肪酸组成，可获得不同类型的酯化虾青素，为开发不同类型酯化虾青素提供了一种高效的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本公开实施例提供的一种酯化虾青素的制造方法的流程图；

图2是本公开实施例提供的另一种酯化虾青素的制造方法的流程图；

图3是本公开实施例提供的一种单克隆的PCR检测示意图；

图4是本公开实施例提供的一种酯化虾青素的液相色谱图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。

本公开实施例还提供了一种酯化虾青素的制造方法，如图1所示，制造方法包括：

S101：获取酯化基因，酯化基因来自于裂殖壶菌，且与裂殖壶菌中的dgat2基因的同源性高于90％，dgat2基因用于形成DGAT2蛋白。

裂殖壶菌能够合成3种类型的虾青素(游离态)，包括13顺式、全反式和9顺式构型虾青素，其中以全反式构型为主，该构型虾青素具有更好的抗氧化活性。此外，还检测到裂殖壶菌合成的虾青素和二十二碳六烯酸(DHA)酯化，形成以虾青素单酯(momoesterastaxantin)为主的酯化虾青素。也就是说，裂殖壶菌能够对游离虾青素进行酯化。而经过反复验证，发现裂殖壶菌中一种二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT2蛋白)，不仅具有二酯酰甘油转移酶的活性，而且该酶还具有催化游离虾青素转化为酯化虾青素的能力。即裂殖壶菌中的DGAT2蛋白能够对虾青素进行酯化。所以，通过获取形成DGAT2蛋白的dgat2基因，便可以通过dgat2基因的表达，从而形成相应的酶，进而将游离虾青素进行酯化。

S102：采用酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体。

表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

在本公开实施例中，目的基因指前文的酯化基因。也就是说，表达载体就是在克隆载体的基础上，增加以上酯化基因。

本实施例中，克隆载体为质粒。

S103：将表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素。

本实施例中，产游离虾青素的工程菌株为解脂耶式酵母的工程菌株(Y.lipolytica HpDA*16)。当然，也可以为其他产游离虾青素的工程菌株。

在通过以上制造方法获取酯化虾青素时，由于该制造方法中是通过将酯化基因克隆到表达载体上，并通过将表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，这样就可以通过该酯化基因合成对应的蛋白，以此将催化产游离虾青素的工程菌株所产生的游离虾青素进行酯化，进而快速得到酯化虾青素，防止工程菌株所产生的虾青素氧化，大大提高工程菌株合成虾青素的稳定性。也就是说，以上方法可以配合生物合成获得非天然来源的酯化虾青素，大大提高工程菌株合成虾青素的稳定性。同时，通过调节脂肪酸组成，可获得不同类型的酯化虾青素，为开发不同类型酯化虾青素提供了一种高效的方法。

本公开实施例还提供了另一种酯化虾青素的制造方法，如图2所示，制造方法包括：

S201：获取酯化基因，酯化基因来自于裂殖壶菌，且与裂殖壶菌中的dgat2基因的同源性高于90％，dgat2基因用于形成DGAT2蛋白。

步骤S201包括：

2011：获取dgat2基因。

裂殖壶菌中的dgat2基因可以直接从基因库中获取。

2012：从dgat2基因中，获取dgat2-1或者dgat2-3基因，作为虾青素酯化基因。

本实施例中，将来自于裂殖壶菌同源物种Hondaea fermentalgiana的dgat2基因与裂殖壶菌基因库进行同源序列比对。发现裂殖壶菌中有3个与Hondaea fermentalgiana同源的dgat2基因，分别命名为dgat2-1、dgat2-2和dgat2-3(其中，dgat2-1的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，dgat2-2的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，dgat2-3的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示)，随后将这3个基因分别在仅能合成游离虾青素的工程菌株Y.lipolytica HpDA*16中过表达。可以发现：转入dgat2-1和dgat2-3基因的Y.lipolyticaHpDA*16工程菌株能够成功合成酯化虾青素，而转dgat2-2基因的Y.lipolytica HpDA*16工程菌株未检测到酯化虾青素的形成。这表明dgat2-1和dgat2-3具有酯化虾青素的能力。

也就是说，将dgat2-1和dgat2-3基因克隆到pYLXP'表达载体，然后再将该表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中进行培养，这样便可得到酯化虾青素。即酯化基因可以为dgat2-1或者dgat2-3。

S202：采用酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体。

步骤S202包括：

2021：对酯化基因进行密码子优化。

密码子是生物信息从基因流向蛋白质的重要桥梁，每一个密码子(包含三个碱基)最终会被翻译成一个氨基酸(终止密码子除外)。三个密码子对应一个氨基酸，但一个氨基酸可能对应多种密码子。

根据排列组合知识，可知一条长度为N的氨基酸序列，理论上有3^N条基因序列与之对应。如果一条蛋白质有100个氨基酸，则会有3¹⁰⁰条相对应的基因序列。所以，密码子优化就是为了从每一条蛋白质序列对应的所有可能碱基序列选出最优的碱基序列。也就是说，密码子优化就是从酯化基因所对应的多种密码子中找出适用于在解脂耶式酵母的工程菌株进行表达的密码子。而解脂耶式酵母的工程菌株适用的密码子可以通过实验进行确定。

通俗一点说，就是将酯化基因进行密码子优化之后，可以使得酯化基因在进入到后续的解脂耶式酵母的工程菌株中进行表达时，能够被高效的表达。

2022：将优化后的酯化基因克隆到pYLXP’线性载体。

步骤2022包括：

(1)将pYLXP'载体进行双酶切，得到具有粘性末端且线性化的pYLXP'各载体片段。

pYLXP'载体来自中国农业科学院油料作物研究所应用微生物课题组实验室。

pYLXP'载体为环形质粒载体，且pYLXP'载体中包括启动子和终止子。

双酶切为用两个限制性核酸内切酶进行切割，这样环形质粒载体被切割为线性的载体片段后会产生了两个黏性末端缺口。也就是说，环形质粒载体会变成多段线化性的载体片段。然后回收需要纯化的那一段线性化的载体片段，因为需要回收的线性化载体片段的两端具有与目的基因(也就是酯化基因)片段互补的黏性末端，这样，在T4 DNA连接酶的作用下，目的基因片段便可以与需要的那一段具有粘性末端的且线化的载体片段连接在一起，得到环状且克隆有酯化基因的表达载体。

本实施例中，pYLXP'载体使用KpnⅠ(内切酶1)-SnaBⅠ(内切酶2)双酶切。

相关反应体系参照表1(双酶切反应体系)，其中，反应条件为37℃，反应时间为60min。

表1：KpnI和SnaBI双酶切pYLXP'载体

组分	V(μL)
		KpnI	1
SnaBI	1
		Cut Smart(酶切缓冲液)	4
Plasmid(载体，pYLXP'载体)	15
		ddH2O(双蒸馏水)	19

本实施例中，当双酶切反应结束后，可以使用凝胶电泳来分离不同长度的DNA片段，进而确定双酶切反应是否成功。

(2)通过琼脂糖凝胶电泳对线性化的pYLXP'各载体片段分离，并用DNA凝胶回收试验盒对线性化的pYLXP'各载体片段中的目的载体片段进行片段回收，得到纯化后的pYLXP'线性化载体片段。

琼脂糖凝胶电泳是一种根据DNA片段长度不同，用于DNA片段分离的方法。

DNA凝胶回收试验盒是一种用于从DNA琼脂糖凝胶中回收需要的基因片段的试剂盒。

也就是说，通过DNA凝胶回收试验盒能够将pYLXP'载体中酶切出来的DNA片段进行回收。即pYLXP'片段为通过双酶切后形成的基因片段。

(3)将纯化后的pYLXP'线性化载体片段和优化后的酯化基因dgat2通过T4 DNA连接酶进行连接，使得优化后的酯化基因dgat2克隆到纯化后的pYLXP’线性化载体片段上。

将纯化后的pYLXP'线性化载体片段和优化后的酯化基因dgat2使用T4DNA连接酶进行DNA片段连接，可以使得优化后的酯化基因dgat2克隆到纯化后的pYLXP’线性化载体片段上。

具体DNA连接体系参见表2，其中，连接体系的反应条件为37℃，反应时间为60min。

表2：优化后的酯化基因克隆至pYLXP’线性载体片段

Composition	V(μL)
		pYLXP’	3
酯化基因(dgat2)	4
		T4 DNA ligase(连接酶)	1
5ⅹligase buffer(连接酶缓冲液)	2

2023：将克隆有酯化基因dgat2的pYLXP’::dgat2载体转入DH5α菌株中。

本实施例中，为了对克隆后的pYLXP’::dgat2载体进行筛选和复制，将以上获得克隆后的pYLXP’::dgat2载体用于转化至大肠杆菌DH5α中，以便后续PCR筛选正确的单克隆。

步骤2023包括：

(1)对商业化感受态大肠杆菌DH5α进初步处理，使其冰上融化。

大肠杆菌DH5α一般置于-80℃冰箱中保存，所以，大肠杆菌DH5α在使用时，需要进行解冻等初步处理。

(2)在超净工作台中，将克隆有酯化基因的pYLXP’::dgat2载体加入大肠杆菌DH5α的菌液中混匀。

(4)将混匀后的菌液加入无抗性的LB(Luria-Bertani)液体培养基进行培养，得到复苏液。

(5)在超净工作台中，取复苏液涂布于含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基上，将LB液体培养基封口后，LB液体培养基倒置于37℃恒温培养箱中，过夜培养。

以上操作便可将克隆有酯化基因的pYLXP’::dgat2载体转入DH5α菌株中进行培养。

2024：从转入pYLXP’::dgat2载体的DH5α菌株中提取表达载体。

步骤2024包括：

(1)从转入pYLXP’::dgat2载体的DH5α菌株中挑取抗氨苄青霉素的单克隆。

本实施例中，按照前序步骤2023中的(5)之后进行操作，通过LB液体培养基的筛选平板对单克隆进行筛选，并随机挑选抗氨苄青霉素的单克隆(也就是单个菌落)保存于新平板。

(2)对单克隆进行PCR检测，以确定单克隆中是否含有酯化基因。

将PCR检测片段大小正确的单克隆，活化培养后进行测序检测，以确定酯化基因是否正确连接。

本实例中，PCR检测时，检测引物为pTEFm-F和XP2ts-R。

在进行PCR检测时，以上检测引物能够同时对启动子区和终止子区进行扩增，将扩增的DNA片段通过凝胶电泳，直观观察启动子区和终止子区的大小来判断扩增片段大小是否正确，检测结果可以参照图3。

图3是本公开实施例提供的一种单克隆的PCR检测示意图，结合图3可以看到：纵向坐标为单克隆中所含有的碱基数(base pair简称为bp)。横向坐标为不同单克隆样本所对应的PCR条带，其中条带1-6为pYLXP’::dgat2-1(附有dgat2-1的单克隆)，条带7-10为pYLXP’::dgat2-2(附有dgat2-2的单克隆)，条带11-14为pYLXP’::dgat2-3(附有dgat2-3的单克隆)。

其中，根据图3可以看到，条带pYLXP’::dgat2-1(5)、pYLXP’::dgat2-2(7，9，10，11)和pYLXP’::dgat2-3(13，14)扩增的片段大小正确，说明在检测引物的扩增下，扩增对应的启动子区和终止子区符合要求，而其他条带不符合要求。

(3)从含有酯化基因的DH5α单克隆中，提取表达载体。

在后续使用时，表达载体可以直接从含有酯化基因的单克隆中进行抽提。

S203：对工程菌株进行活化处理。

由于工程菌株在使用之前，均是冷藏保存，所以需要对其进行解冻，以使其复苏活化。

S204：将包含表达载体的工程菌株在活化处理后进行转化培养，得到培养液。

步骤S204包括：

2041：将活化处理后的工程菌株的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到底盘菌株。

将活化24-36h的工程菌株的菌液涂于固体YPD(Yeast Extract PeptoneDextrose Medium，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)培养基平板，在28℃条件下静置培养48h。在固体培养基平板挑取产游离虾青素的底盘菌株。

2042：将表达载体转化至产游离虾青素的底盘菌株中进行培养，得到培养液。

取克隆有酯化基因的pYLXP’::dgat2载体300ng，90μL聚乙二醇6000、2Mol/L醋酸锂、5μL ssDNA(single-stranded DNA，单链DNA)和一定量的底盘菌株混匀放至30℃温浴30min，随后热激10min。

再将菌液涂至尿嘧啶缺陷型平板，28℃培养2-3天，得到培养液。

S205：对培养液进行处理，得到酯化虾青素。

步骤S205包括：

2051：将培养液进行离心、漩涡震荡和萃取，得到提取液。

本实施例中，取10mL培养液4000rpm下离心10分钟收集菌体，加入5mL乙酸乙酯和一定量2mm的玻璃珠，在多功能涡旋混匀仪上以2500rpm，50min萃取。经过短暂的离心收集上层油相，得到提取液。

2052：对提取液进行薄层色谱法(TLC)分离和高效液相色谱(HPLC)检测，得到酯化虾青素并加以鉴定。

本实施例中，TLC分离条件：将上述得到的提取液经过氮气浓缩并用10μL氯仿复溶后点至薄层色谱板，在载层剂(乙醚：正己烷＝2：3，v/v)中进行分离，回收酯化虾青素条带并复溶至氯仿中

HPLC检测条件：色谱柱为YMC Carotenoid C 30(4.6mm×250mm，5μm)。

流动相为A-B液进行梯度洗脱，0～90min，0～100％B液，100％～0％A液。体积流量1.0mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长450nm。

流动相A液：甲醇/甲基叔丁基醚/水＝81/15/4；流动相B液：甲醇/甲基叔丁基醚/水＝7/90/3。

通过观察HPLC对应的液相色谱图，如图4所示，图4中横坐标为进液时间，纵坐标为离子强度值，根据色谱图中的色谱峰值可以看到，在进液时间为25～40min时，对应的有4种主要的色谱峰，此色谱峰即为酯化虾青素的色谱峰(可以根据MS检测时的m/z进行酯化虾青素类型的鉴定)。

本公开实施例还提供了一种酯化基因的应用，酯化基因用于对游离虾青素进行酯化，酯化基因来自裂殖壶菌，且与裂殖壶菌中的dgat2基因的同源性高于90％。

本实施例中，酯化基因为裂殖壶菌中的dgat2中的dgat2-1或者dgat2-3基因。

通过本公开实施例提供的酯化基因dgat2-1或者dgat2-3对游离虾青素进行酯化时，能够通过表达该酯化基因，对游离虾青素进行酯化，以便快速得到酯化虾青素。也就是说，在利用工程菌株获取游离虾青素之后，可以通过表达该酯化基因对工程菌株中的游离虾青素进行酯化，防止游离虾青素氧化，大大提高工程菌株合成酯化虾青素的产量。

以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

序列表

<110> 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司

<120> 酯化虾青素的制造方法及酯化基因的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2574

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taggaggccg ccaagaacga ggctgcagac tttgccaacc tgcggctcga gcacgaggct 60

ttgcagaaac gatacgatgc gctcgaggca gcgtacgcca agttgctcct ggccaagggc 120

tcctccgagg agaccgacaa gaccgcggag aagccgtcga gctttgcggt ctggagcccg 180

tacatcaaaa tcgccgttct ctcgtccgtg actgcgctgc tactattcat ctttgccgag 240

cgccagtaca cctcgggtca aaaggtgggc ttcggcttcc tcgcagccgt cggcggcgcg 300

ggcgtgtttt tagccattcc cgcgacgcac tggatcggac actttttgca cgatgactac 360

aagatctggc aaccttttcg cggcggcgtg cgcttcgtcg tgctgcaggc catctcatgg 420

acattttacg gcatcaccgc ggtgattgtc atggcagccg tggctttcgc cgaacataat 480

aatggtatgc tcgcgagcgc tggcgtcgtc ggccttctct cgcaggtctt catggtgtcc 540

tcgctgctaa catacagcga cccatcgcag acggcccgca aggcacgccg catttggcga 600

caaaacagcg gcgtcatcaa tgccgacgac ccatccgatg aggtcgagga agaggcgcgc 660

caggcataca tgtcgcaacg cagaccctcg acggacagcg agtatagttc cggctctgga 720

tccacgtccg cgacggatag gtctgcacgt acgacgatgc gtcgtcggtc tgttgccaag 780

tcgatcatcg accatgacgc tggggcaaac gagcagcagg ttcccttgga caaagaccac 840

agcacatcga gcatcgtcaa ggaatttgtg caaatgaaca cctttctcgt tgtcattggc 900

attgtgctag gtgttctctc cgagcacagc ccggacagca agcacacacc catctttggt 960

atcctttcgc tcgtttgctg catcgtggcc atatcgctta cacatggcat cggcggtcgc 1020

ttgcgtcaca ttaaccgcgg ctggtcgttt gcgcagttct tccgcggcgg caaagagttc 1080

attcttttgc aaatctttgg atggtccttt ttcggcgttg ctgtcgtcgc acaaggcgcc 1140

ttcgtgctct cgtctgttta cctcggcacg cacggcatga aagggaccat gtatgtgggc 1200

gcgcttgcta ctgtgatctc gcactatgcc atcgtgagct cgctccctcg attcgaggac 1260

agtggcccaa tgcgtccgac catcacgcct cgcaactacc gtcctctgga agcctttacg 1320

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ccatggctgg ccgaggccac ctacggactc cttcccgagc tctctgcgaa ctcggcagaa 1500

cttgggcaca ccttcaaggt ttggtggatt ctgctctgcg ccatctcctt ttggaccttt 1560

ttctactcgg cgctcaatac ctggggaatc gatggctggc gccaaagcct cttgctttcg 1620

ctcgcagctg tcgcagccta tggtggtgtg attgcggttt ttcgcgagtc tccgcactat 1680

gccatgttgg tcgtcatttg ctcggcgaac ctcgtctaca tttccacgac ctttaccaag 1740

cgtcccgagt acaatgcgtg tcgcgagtgg tcaattttca aggaaattga cgtgcttcct 1800

cgcctcgcgg aaaagttctt tggattgcgt ctccagctca ccgaggaaat gcagcgtctc 1860

gcgccagttc ttggcgatgt aaatgccaaa gaccccaaga atcagcaggt gctgcttctc 1920

tttcacccgc acggcatctt gcccgtgacg catggcatct tgcagattac acatgtgtgg 1980

cgcaagatct ttccccacct cgacacaaat cctctcactg ccacaattac acatgtagtg 2040

cccgtgatgc gcgacgttat tcagtggatg ggctgctgcg acgtttcgcg agccactgtg 2100

cataatctca ttcgaatggg ccgcaacgtg cagatcgttt gcggcggcca aacagaaatg 2160

ttcgagtcgc gttcctggga caaccggatt gccatcgtgc gaaagcgtcg ccgcggaatc 2220

ttcaagatcg ccattcagca aggcctcggg attgtgccca tgttcagctt tggcgagcca 2280

cagattttcg ataatgtcta catgccgcgc acgcaggcgt ttttcaagaa tttgctgggc 2340

tttccgttcc caatcttcat gctcggaaag tttggtctgc ccattccctg tcgcgtgccc 2400

gtcactgtcg cattagacgc gccggtgcat cccgttcgcc agacagccaa tccaacgcca 2460

gaggaaattt ccgagttcca agatcgttac tttgccacgc ttgaggcact tttcgagcgc 2520

tacaaagaag aaaatggcca tggttctcat gagctttctt tcattgacaa ttga 2574

<210> 2

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<400> 2

taggagcggc ctcaggcgca ggcctcgccc gcacggtccg aggcgcggcg gcgacgcggc 60

gacaggtcca aggggttcgc cgacgaggat ggagagacca gcgtgaacac cccgaacggg 120

atgcagacac cgtacagcac gtcgatgggc tccgtctcga gctactcgtc gtctggcgac 180

tacgccatgt ccgaagcgga gggctccgaa gtggaccctg ccgatgacag gatgggcgac 240

tcaatcggat cgaaaccaag ctcctcgtcc gtgaccggac gccggcgact cacgcaagaa 300

gagcgcgact actttttgcg tcttgaaaag gaatggcgcg aggaggacgc atgggctgac 360

caacccgggt cctggtactc aatgctggcc tggatgccgg tcctcattgg cctgcgcgtc 420

ttcaacgtgc tgctttccat cgccttttgg cctgtctcct ttgtggcgcg ggtcttcttc 480

ggcaaaaaga ttcacacggt cagtttctgg gacgttccgc tttcccgccg taaacaaact 540

gccgtggtgc tcttgttcgt catgctcctg cccatggtcg tcgtggtgta ctcgtggacg 600

ctcgttctgc ttctcttccc gctcacgacc tttcccacac tgtgctacat ggtgtggatc 660

atttacgtgg acaagagtcc cgaaacaggc tcgcgccgac cctttttgcg ctattggaag 720

atgtggcgcc atttcgcgaa ctatttcccg cttcgactca ttcgcaccac gccgctcgac 780

tcccgtcgca agtacgtctt ttgctaccat ccgcacggaa tcatctcgct cggtgccttt 840

ggcaactttg cgacggactc gaccggattc tcgcgcaaat tccccggtat cgatttgcgc 900

gtgctcacgc ttgcgctcaa cttttactgc ccccttttgc gcgagtttct gctttacctg 960

ggcctttgca gcgccgcaaa gaagtcctgc aaccaaattt tgcagcgcgg gcctggatcc 1020

gccatcatgc tcgtcgttgg cggcgccgcc gagtctctcg actcccagcc aggcacctat 1080

cgattgacgc tcggccgaaa ggggttcgtg cgcgttgccc ttgacaatgg tgccgatcta 1140

gtgccggtgc ttgcctttgg cgagaatgac gtatttgaca ccgtgtacct cccaccgaac 1200

tcgtgggcac gaaacgtgca agagtttgtg cgcaagaagc ttggtttcgc cacaccaatt 1260

ttcagtggcc gcggtatctt ccagtacaac atggggctca tgcctcaccg ccgtcccatt 1320

attgtcgttg ttggaaaacc catcaaaatg cccaaaattc ccgatgagct caagggccgc 1380

gcgctttcca ccacggccga gggcgttgcc ctcgttgaca agtaccacga aaagtatgtc 1440

aaggcgcttc gcgagctctg gaacttgtac aaggagcgct gggccgtgca ccgtcaaggt 1500

tcgctgctca ttcaaaagta a 1521

<210> 3

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<400> 3

tagccggaac tagaaaagta ctatgtgcta gacctgtggc gagtgccgcg cgagctgctc 60

gcatcgaagc tgcccgtgtc ggaaacggac cctgacgaga cgcgcagaaa actcgaggac 120

gaagcgaatg agctcctgct tcgcgaatac gtggtggcgc acgaaggccc gtttcctgcc 180

gacgcactca cggagaaggc gtccatttcg gctggagagc aggctttggt gcttcttgcg 240

ctcttggtca ctcttggggg gccactcttt tggtttacgt tgggcctcgt tctcgcgata 300

ggcgcgacgt ggcagacatt tggaatttat gtgcttgcaa cgctcgtgct ggcgatgcac 360

ccgctgcctt cgtcagtgcc ggcactatgg acgtcaaagc tcatcaacgc catgtacaaa 420

tacttttcat atcgttttgt atggaagggt aatactcgcc aagtgctgcg agcagaaagt 480

cagtatctcg gatccggcgt cccgcacggg gtcatgcctt ttgcaaattt acttgcgatc 540

ccagcgacga attcggtgct ctatcgcgga tgcaactttt ggggcgcccc ggcctcagtg 600

gtctatcgta cgccgtttct gaggtactta tggatgcttc aatgttgcga tgtgggtcgt 660

gagtccatcg tgcgcgagct cgccaaaggt cactctgttg gtctcgttgg cgatgggatt 720

gcagggatct ttcagtcaaa tcatgaagat gaagtggttg ctctgaaaca taggaagggt 780

ttggcaaagc tcgcgcttcg cactgggacc tcagtcttgc cctgttactc gttaggaaat 840

acggctgcct tttcagcctg gtttgatcgt tttggtatca tggagtggct ctcacgcaag 900

gctcaagcgt cgatttttct ttactggggc cgcttcggac taccgattcc tcatcgggtc 960

aacatcacaa tgattgttgg agatcttatc aaggtggaca aagctacgga gcagccaacg 1020

accgcgcagg tcgacgctct gcacgagcag attctcgcag gtttccagac ggcctttgac 1080

tcccacaagt ctgctcttgg atggggcgcg cggaagctac gctttgttta a 1131

Claims (9)

1.一种酯化虾青素的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括：

获取dgat2基因，从所述dgat2基因中，获取dgat2-1基因或者dgat2-3基因，作为酯化基因，所述酯化基因来自于裂殖壶菌，所述dgat2基因用于形成DGAT2蛋白，所述dgat2-1基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述dgat2-3的基因序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述裂殖壶菌中的DGAT2蛋白能够对虾青素进行酯化；

采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体；

将所述表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，采用所述酯化基因，构建酯化虾青素的表达载体，包括：

对所述酯化基因进行密码子优化；

将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP’线性载体；

将克隆有所述酯化基因的pYLXP’::dgat2载体转入DH5α菌株中；

从转入pYLXP’::dgat2载体的所述DH5α菌株中提取所述表达载体。

3.根据权利要求2所述的制造方法，其特征在于，所述将优化后的所述酯化基因克隆到pYLXP’线性载体，包括：

将pYLXP'载体进行双酶切，得到具有粘性末端且线性化的pYLXP'各载体片段；

通过凝胶电泳对所述线性化的pYLXP'载体各片段分离，并用DNA凝胶回收试验盒对线性化的pYLXP'各载体片段中的目的载体片段进行回收，得到纯化后的pYLXP'线性化载体片段；

将所述纯化后的pYLXP'线性化载体片段和优化后的所述酯化基因通过T4 DNA连接酶进行连接，使得优化后的所述酯化基因克隆到纯化后的pYLXP’线性化载体片段上。

4.根据权利要求2所述的制造方法，其特征在于，所述从转入pYLXP’::dgat2载体的所述DH5α菌株中提取所述表达载体，包括：

从转入pYLXP’::dgat2载体的所述DH5α菌株中挑取抗氨苄青霉素的单克隆；

对所述单克隆进行PCR检测，以确定所述单克隆中是否含有酯化基因；

从含有酯化基因的所述单克隆中，提取所述表达载体。

5.根据权利要求4所述的制造方法，其特征在于，所述对所述单克隆进行PCR检测时，所用的检测引物分别为pTEFm-F和XP2ts-R。

6.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述将所述表达载体转化至产游离虾青素的工程菌株中，得到酯化虾青素，包括：

对所述工程菌株进行活化处理；

将包含所述表达载体的所述工程菌株在活化处理后进行转化培养，得到培养液；

对所述培养液进行处理，得到所述酯化虾青素。

7.根据权利要求6所述的制造方法，其特征在于，所述将包含所述表达载体的所述工程菌株在活化处理后进行转化培养，得到培养液，包括：

将活化处理后的所述工程菌株的菌液涂抹在培养基平板上进行培养，得到底盘菌株；

将所述表达载体转入所述底盘菌株中进行培养，得到所述培养液。

8.根据权利要求6所述的制造方法，其特征在于，所述提取所述培养液，得到所述酯化虾青素，包括：

将所述培养液进行离心、漩涡震荡和萃取，得到提取液；

对所述提取液进行薄层色谱法分离和液相色谱检测，得到所述酯化虾青素并加以鉴定。

9.一种酯化基因的应用，其特征在于，所述酯化基因用于对游离虾青素进行酯化，所述酯化基因来自于裂殖壶菌，所述酯化基因为dgat2-1基因或者dgat2-3基因，所述dgat2-1基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述dgat2-3的基因序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。