CN108913737B - 使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，包括使用目的基因和质粒构建重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌加以诱导和培养，使其产生目标环二核苷酸，并从培养物分离纯化所述环二核苷酸。本发明方法的步骤较少，所需原材料和设备较少，从而显著降低生产成本，且产率较高。

Description

使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法
技术领域
本发明涉及使用重组微生物发酵制备环二核苷酸的领域，具体而言涉及使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法。
背景技术
环二核苷酸（CDNs）是细菌和哺乳动物细胞中广泛存在的第二信使分子，包括c-di-GMP、c-di-AMP、3’3’-cGAMP和2’3’-cGAMP等，在调节病原微生物的致病性、形态方面，以及哺乳动物先天免疫应答中具有重要的作用。环二核苷酸可被人体的免疫系统识别以抵抗病原微生物的进攻，同时可通过刺激肿瘤患者的免疫系统而杀伤肿瘤细胞，具有良好的药物开发前景。天然环二核苷酸的大量制备一直受限于其较高的成本以及相对繁琐的步骤。因此，开发一种可靠、简单、有效的大量制备环二核苷酸（CDNs）的生产方法具有重要意义。
目前，环二核苷酸的制备主要通过化学合成和酶合成等方法制备，但化学合成方法需要使用多种保护基团，耗时长，步骤多且不环保，而酶合成方法需要使用成本较高的底物GTP和高效高纯的酶蛋白，因此目前市售CDNs的价格仍然非常昂贵，达4000-6000元/mg。尤其2’3’-cGAMP作为人类先天免疫中的重要信号分子，自发现后就成为热点明星分子，具有很大的潜在使用需求，但目前仅见少量关于其少量合成的文献报道。
CN104152472A公开以来自野油菜黄单胞菌的双鸟苷酸环化酶基因构建重组载体，转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌来生产重组双鸟苷酸环化酶，再用所述酶催化GTP产生c-di-GMP。CN106318997A公开以鼠源cGAMP合成酶cGAS基因构建重组载体，转化至大肠杆菌中，发酵生产cGAS酶。合成腺苷（鸟苷）5’-α硫代（硒代）磷酸三磷酸作为底物，用所述cGAS酶催化生产硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP。该等现有技术的缺点在于，使用重组微生物制备环化酶，仍需购买或合成大量底物，而且需要先将所产生的酶从培养物中提取出来，并且需要反应设备使酶催化底物反应，才能获得最终产物环二核苷酸。步骤仍较繁琐，且成本较高。
因此，业内需要简单、经济且高效的环二核苷酸制备方法。
发明内容
为满足上述需求，本发明提供一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法。
本发明的技术方案为，一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，包含以下步骤：
1）构建重组载体，使用目的基因和质粒构建重组载体；
2）转化，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中；
3）阳性克隆验证，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌克隆；
4）诱导，添加诱导剂，诱导所述转化成功的重组大肠杆菌发酵产生所述环二核苷酸；
5）分离纯化，从所述重组大肠杆菌培养物中（菌体或培养基）分离所述环二核苷酸并纯化。
所述环二核苷酸分别是2’3’-环鸟苷酸-腺苷酸(2’3’-cGAMP)、环二鸟苷酸(c-di-GMP)和3’3’-环鸟苷酸-腺苷酸(3’3’-cGAMP)，均属于天然存在的环二核苷酸信号分子。所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)或BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株。
在一个方面中，所述环二核苷酸为2’3’-cGAMP，所述目的基因为鼠源环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）合成酶cGAS酶基因。所述质粒为pet28a质粒，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将所述鼠源cGAS酶基因构建至所述pet28a质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株。
对于2’3’-cGAMP，所述诱导是在LB培养基和改良M9极限培养基中进行的。所述改良M9极限培养基是如下制备的：将Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、NH4Cl和去离子水以约34:6:1:2:400（质量比）混合形成5×M9盐溶液。之后将5×M9盐溶液、1mol/L MgSO4、0.1mol/LCaCl2、20%葡萄糖溶液、1mol/L FeSO4和去离子水灭菌后以约200:5:1:40:0.01:760（体积比）混合，制得改良M9极限培养基。
对于2’3’-cGAMP，所述分离纯化包括以下步骤：
a) 取培养上清液，抽滤，酸化，抽滤；
b) 使用大孔吸附树脂柱对步骤a)所得产物进行层析，获得第一2’3’-cGAMP粗品；
c) 使用离子交换树脂柱对所述第一2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第二2’3’-cGAMP粗品；
d) 使用C18柱对所述第二2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第三2’3’-cGAMP粗品；
e) 使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第三2’3’-cGAMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯2’3’-cGAMP。
在另一方面中，所述环二核苷酸为c-di-GMP，所述目的基因为海栖热袍杆菌(Thermotoga maritime)的二鸟苷酸环化酶tDGC R158A基因tDGCm和人源干扰素刺激基因STINGCTD。所述质粒为经改造pet15b和pet30a质粒，所述pet15b的N端的凝血蛋白酶位点被PPase蛋白酶位点取代，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将所述tDGCm基因构建至所述pet15b质粒中，且使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述STINGCTD基因构建至所述pet30a质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)菌株。
对于c-di-GMP，所述分离纯化包括以下步骤：
a) 取培养物，加入双蒸水重悬菌体，加热、混匀并离心；
b) 取上清液，加入冷乙醇，混匀后静置，离心；
c) 取上清液，加入NaCl和EDTA，混匀后静置，离心；
d) 弃去上清液，用双蒸水重悬沉淀，使用氨基丙柱进行层析，获得第一c-di-GMP粗品；
e) 使用C18柱对所述第一c-di-GMP粗品进行层析，获得第二c-di-GMP粗品；
f) 使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第二c-di-GMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯c-di-GMP。
在另一方面中，所述环二核苷酸为3’3’-cGAMP，所述目的基因为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)鸟苷酸激酶GMK全长基因、大肠杆菌(Escherichia coli)核苷二磷酸激酶NDK基因和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的DncV二核苷酸环化酶vc0179 1-419截短体基因DncVt。所述质粒为paCYCDuet-1和pet22b质粒，使用限制性酶切位点BamHI和HindIII将所述NDK基因构建至所述paCYCDuet-1质粒中，使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述GMK基因构建至所述paCYCDuet-1质粒中，且使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述DncVt基因构建至所述pet22b质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)菌株。
对于3’3’-cGAMP，所述分离纯化包括以下步骤：
a) 取培养物，加入含有EDTA和NaCl的缓冲液重悬菌体，混匀，加热并离心；
b) 取上清液，加入乙醇和NaCl，混匀后静置；
c) 抽滤，用乙醇洗涤沉淀，然后在双蒸水中稀释重悬，使用离子交换柱进行层析，获得第一3’3’-cGAMP粗品；
d) 使用C18柱对所述第一3’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第二3’3’-cGAMP粗品；
e) 使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第二3’3’-cGAMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯3’3’-cGAMP。
本发明的有益效果在于，发明人通过大量实验发现了适合在大肠杆菌细胞中高效产生目标环二核苷酸的目的基因及其配套工艺，使得可通过微生物发酵的方式直接生产目标环二核苷酸。与现有的化学合成和酶合成工艺相比，本发明方法的步骤较少，所需原材料和设备较少，从而显著降低生产成本。且与使用转基因微生物产生酶来催化反应产生环二核苷酸的现有技术相比，无需购买或合成反应底物，可减少所需原材料、步骤和设备。本发明方法的环二核苷酸产率为28%-38%，与使用转基因微生物产生酶来提取细胞中的环二核苷酸的现有工艺相比显著较高。
另外，本发明中自大肠杆菌培养物分离纯化环二核苷酸产品的方法可获得高纯度(96.1%-99.6%)的环二核苷酸，提高产品品质。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
材料
大肠杆菌感受态细胞：BL21-CodonPlus (DE3)-RIL，产品编号ST1025，AgilentTechnologies；BL21(DE3)，产品编号200131，Agilent Technologies；
鼠源cGAS酶基因、海栖热袍杆菌tDGCm基因、人源STINGCTD基因、金黄色葡萄球菌GMK基因和大肠杆菌NDK基因：由Beijing AuGCT DNA-SYN Biotechnology合成；
霍乱弧菌DncVt基因：以霍乱弧菌O1 biovar E1 Tor Strain N16961基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得；
pet28a质粒：pET-28a-SUMO，上海北诺生物科技有限公司；
pet15b质粒：69661-3，EMD Biosciences (Novagen)；
pet30a质粒：69909-3，EMD Biosciences (Novagen)；
pet22b质粒：69744-3，EMD Biosciences (Novagen)；
paCYCDuet-1质粒：71147-3，EMD Biosciences (Novagen)；
氨苄青霉素钠：生工生物工程(上海)；
硫酸卡那霉素：生工生物工程(上海)；
氯霉素：生工生物工程(上海)；
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：生工生物工程(上海)；
氨基键合硅胶：40-60μm，上海博势生物科技有限公司；
LiChroprep RP-18：40-63μm，Merck；
Sephadex G10：17-0010-01，GE Healthcare；
Dowex 1X2：100-200目，Sigma-Aldrich；
Diaion SP207：Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan
实施例1
本实施例提供一种使用重组大肠杆菌发酵制备2’3’-环鸟苷酸-腺苷酸(2’3’-cGAMP)的方法，包含以下步骤：
1）构建重组载体
通过常规重组质粒构建方法，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将鼠源cGAS酶基因构建至pET-28a-SUMO质粒中，形成pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒。
2）转化
取100 μl BL21-CodonPlus (DE3)-RIL大肠杆菌感受态细胞置于1.5ml小管中，将小管迅速置于冰上，使之除管盖外都埋在冰中，冰浴2-3min。之后轻弹管壁，使细胞重悬。将1 μl 100 ng/μl的pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒加入感受态细胞中，轻微摇动混合，之后继续冰浴。冰浴30 min后，在42℃下热激90s，再次冰浴2min。加入400 μl无抗LB液体培养基，混匀后在37℃下以200 rpm振荡培养40-60 min。取100 μl培养液，均匀涂布在LB固体培养基上，在37℃下倒置培养12-16h。
3）阳性克隆验证
从上述LB固体培养基平板上挑取3个单菌落分别接种到含有3 ml LB液体培养基的10 ml摇菌管中，在37℃下以200 rpm振荡培养6-7h。取每个菌落的培养液到2个1.5ml EP管中，每个EP管加入500 μl培养液。其中一个EP管加入终浓度为0.1 mM的IPTG，另一EP管不加IPTG。在37℃下诱导2h后，以12000 rpm离心2 min。弃去上清液，在沉淀中加入20 μl水重悬。加入6.6 μl 4×上样缓冲液，振荡混匀，在100℃下加热10 min，离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色，用考马斯亮蓝脱色液脱色，观察cGAS酶蛋白表达情况。如果电泳结果显示某菌落表达cGAS酶蛋白，则说明该菌落转化成功，选择该菌落进行下一步骤。将该菌落的10 ml摇菌管摇动12-16h，20%甘油保甘油菌。
4）诱导
将86g Na2HPO4·12H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl和5g NH4Cl溶于去离子水中，最终体积为1L，得到5×M9盐溶液。将所得5×M9盐溶液在15 psi高压下蒸汽灭菌20 min。将5ml1mol/L MgSO4、1ml 0.1 mol/L CaCl2和40 ml 20%葡萄糖溶液高压灭菌，将10 μl 1mol/LFeSO4用0.22 μm过滤器过滤除菌。取200 ml灭菌5×M9盐溶液，加入760 ml无菌去离子水中，再加入经灭菌的MgSO4、CaCl2、FeSO4和葡萄糖溶液，制得1L改良M9极限培养基。
取BL21 (DE3)/pET28a-Sumo-mcGAS甘油菌接种到15 ml LB液体培养基，在37℃下以200 rpm振荡培养过夜。取1 ml培养液在4℃下以3700 rpm离心5 min，用5×M9盐溶液洗涤两次，再用1 ml 5×M9盐溶液重悬。将其接种至1 L改良M9极限培养基，摇菌约10h至OD值0.8-0.9，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在37℃下以200 rpm振荡培养36h。以4500 rpm离心30 min，取上清液保存在-80℃下。
5）分离纯化
a) 取500 ml上一步骤所得上清液，抽滤去除杂质，加入终浓度为24 mM的浓盐酸酸化，之后抽滤去除杂质。
b) 使用Diaion SP207柱（25 cm × 2.2 cm）对所述上清液进行层析。用88 mM冰醋酸平衡后上样，上样后用300 ml 88mM冰醋酸冲洗柱子以除去盐离子。之后用500 ml 30%乙醇洗脱，获得第一2’3’-cGAMP粗品。
c) 用旋转蒸发仪蒸干第一2’3’-cGAMP粗品，加入200 ml水溶解，并用氨水调节pH7.0左右。使用Dowex 1X2柱进行层析，上样后用10倍柱体积的水洗除未结合物质，然后用10mM HCl/3M LiCl两步梯度法（0-50% 50 min，50% 30 min）洗脱，获得第二2’3’-cGAMP粗品。
d) 将第二2’3’-cGAMP粗品旋蒸至干燥，加90 ml水溶解，加入35 mM HAc和10 mM的44% NH4Ac调pH4.0左右。使用C18柱(XK16，58 ml柱体积，15g LiChroprep RP-18基质，GEHealthcare)进行层析，上样后用缓冲液(25%乙醇，20mM NH4HCO3)以5 ml/min的速度进行线性梯度洗脱（0-50%），获得第三2’3’-cGAMP粗品。
e) 将第三2’3’-cGAMP粗品用氨水调pH至中性，旋蒸干燥，用5 ml 5‰（v/v）氨水溶解，在16℃下以16000g离心15 min。使用Sephadex G10柱（XK60，228 ml柱体积，GEHealthcare）进行层析，用水平衡并洗脱，收集主峰位置的洗脱液，旋蒸至2 ml，用真空冷冻干燥机干燥，得到纯2’3’-cGAMP。产率为38.2%，纯度为99.6%。
实施例2
本实施例提供一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二鸟苷酸(c-di-GMP)的方法，包含以下步骤：
1）构建重组载体
通过常规重组质粒构建方法，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将海栖热袍杆菌tDGCm基因构建至pet15b质粒中，形成pET15b-tDGCm重组质粒。所述pet15b质粒N端的凝血蛋白酶位点被PPase蛋白酶位点取代。使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将人源干扰素刺激基因STINGCTD构建至所述pet30a质粒中，形成pET30a-STINGCTD重组质粒。
2）转化
取100 μl BL21 (DE3)大肠杆菌感受态细胞置于1.5 ml小管中，将小管迅速置于冰上，使之除管盖外都埋在冰中，冰浴2-3 min。之后轻弹管壁，使细胞重悬。将1 μl 100ng/μl的pET15b-tDGCm重组质粒和1 μl 100 ng/μl的pET30a-STINGCTD重组质粒加入感受态细胞中，轻微摇动混合，之后继续冰浴。冰浴30 min后，在42℃下热激90s，再次冰浴2 min。加入400 μl无抗LB液体培养基，混匀后在37℃下以200 rpm振荡培养40-60 min。取100 μl培养液，均匀涂布在含有100 μg/ml氨苄青霉素钠与50 μg/ml硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃下倒置培养12-16 h。
3）阳性克隆验证
从上述LB固体培养基平板上挑取3个单菌落分别接种到含有3 ml LB液体培养基（100 μg/ml氨苄青霉素钠，50 μg/ml硫酸卡那霉素）的10 ml摇菌管中，在37℃下以200 rpm振荡培养6-7h。取每个菌落的培养液到2个1.5ml EP管中，每个EP管加入500 μl培养液。其中一个EP管加入终浓度为0.1 mM的IPTG，另一EP管不加IPTG。在37℃下诱导2h后，以12000rpm离心2 min。弃去上清液，在沉淀中加入20 μl水重悬。加入6.6 μl 4×上样缓冲液，振荡混匀，在100℃下加热10 min，离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色，用考马斯亮蓝脱色液脱色，观察二鸟苷酸环化酶tDGC R158A和STINGCTD蛋白的表达情况。如果电泳结果显示某菌落表达该等蛋白质，则说明该菌落转化成功，选择该菌落进行下一步骤。将该菌落的10 ml摇菌管摇动12-16h，20%甘油保甘油菌。
4）诱导
取BL21 (DE3)/(pET15b-tDGCm + pET30a-STINGCTD)甘油菌接种到15 ml含抗生素LB液体培养基（100 μg/ml氨苄青霉素钠，50 μg/ml硫酸卡那霉素）中，在37℃下以200 rpm振荡培养过夜。将过夜培养的菌液1:100接种至1L含抗生素LB液体培养基（100 μg/ml氨苄青霉素钠，50 μg/ml硫酸卡那霉素），在37℃下以200 rpm振荡培养约4h至OD600为约0.8-0.9。加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在37℃下以200 rpm振荡培养20h。在4℃下以4500 rpm离心30 min。收集菌体，保存在-80℃下。
5）分离纯化
a) 取500ml上一步骤所得菌体，加入90 ml双蒸水重悬，振荡混匀后，沸水浴15min，期间涡旋振荡。冷却后，在16℃下以9000 rpm离心50 min。
b) 取上清液，加入终浓度为70%的冷乙醇（-80℃预冷）混匀，在4℃下静置20 min后，在4℃下以9000 rpm离心20 min。
c) 取上清液，加入终浓度为0.4M的NaCl和1mM EDTA，混匀后在-20℃下静置1-2h，之后在4℃下以9000 rpm离心50min。
d) 弃去上清液，用90ml双蒸水重悬沉淀。使用氨基丙柱（氨基键合硅胶，25 cm x2.2 cm）进行层析，上样后依次用500 ml的80%甲醇/2%HAc和200 ml ddH2O冲洗。之后用500ml 80%甲醇/4%NH3洗脱，获得第一c-di-GMP粗品。
e) 将第一c-di-GMP粗品旋蒸至干燥，加90 ml水溶解，用35 mM HAc和10 mM 44%NH4Ac调pH4.0左右。使用C18柱（XK16，58 ml柱体积，15 g LiChroprep RP-18基质，GEHealthcare)进行层析，上样结束后，用缓冲液(25%乙醇，20 mM NH4HCO3)以5 ml/min的速度线性梯度洗脱（0%-50%），获得第二c-di-GMP粗品。
f) 将第二c-di-GMP粗品用氨水调pH至中性，旋蒸干燥，用5 ml 5‰（v/v）氨水溶解，在16℃下以16000g离心15 min。使用Sephadex G10柱（XK60，228 ml柱体积，GEHealthcare）进行层析，用水平衡并洗脱样品，收集主峰位置的洗脱液，旋蒸至2ml，用真空冷冻干燥机干燥，得到纯c-di-GMP。产率为35.2%，纯度为99.1%。
实施例3
本实施例提供一种使用重组大肠杆菌发酵制备3’3’-环鸟苷酸-腺苷酸(3’3’-cGAMP)的方法，包含以下步骤：
1）构建重组载体
通过常规重组质粒构建方法，使用限制性酶切位点BamHI和HindIII将大肠杆菌NDK基因构建至paCYCDuet-1质粒中，使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将金黄色葡萄球菌GMK基因构建至paCYCDuet-1质粒中，形成paCYCduet-1-NDK-GMK重组质粒。使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将霍乱弧菌DncVt基因构建至pet22b质粒中，形成pET22b-DncVtm重组质粒。
2）转化
取100 μl BL21 (DE3)大肠杆菌感受态细胞置于1.5 ml小管中，将小管迅速置于冰上，使之除管盖外都埋在冰中，冰浴2-3 min。之后轻弹管壁，使细胞重悬。将1 μl 100ng/μl的paCYCduet-1-NDK-GMK重组质粒和1 μl 100 ng/μl的pET22b-DncVtm重组质粒加入感受态细胞中，轻微摇动混合，之后继续冰浴。冰浴30 min后，在42℃下热激90s，再次冰浴2min。加入400 μl无抗LB液体培养基，混匀后在37℃下以200 rpm振荡培养40-60 min。取100μl培养液，均匀涂布在含有100 μg/ml氨苄青霉素钠与25 μg/ml氯霉素的LB固体培养基上，在37℃下倒置培养12-16 h。
3）阳性克隆验证
从上述LB固体培养基平板上挑取3个单菌落分别接种到含有3 ml LB液体培养基（100 μg/ml氨苄青霉素钠，25 μg/ml氯霉素）的10 ml摇菌管中，在37℃下以200 rpm振荡培养6-7h。取每个菌落的培养液到2个1.5ml EP管中，每个EP管加入500 μl培养液。其中一个EP管加入终浓度为0.1 mM的IPTG，另一EP管不加IPTG。在37℃下诱导2h后，以12000 rpm离心2 min。弃去上清液，在沉淀中加入20 μl水重悬。加入6.6 μl 4×上样缓冲液，振荡混匀，在100℃下加热10 min，离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色，用考马斯亮蓝脱色液脱色，观察金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶、大肠杆菌核苷二磷酸激酶和霍乱弧菌DncV二核苷酸环化酶的表达情况。如果电泳结果显示某菌落表达该等蛋白质，则说明该菌落转化成功，选择该菌落进行下一步骤。将该菌落的10 ml摇菌管摇动12-16h，20%甘油保甘油菌。
4）诱导
取BL21 (DE3)/（pET22b-DncVtm和paCYCduet-1-NDK-GMK）甘油菌接种到15ml含抗生素LB液体培养基（100 μg/ml氨苄青霉素钠，25 μg/ml氯霉素）中，在37℃下以200 rpm振荡培养过夜。将过夜培养的菌液1:100接种至1L含抗生素LB液体培养基（100 μg/ml氨苄青霉素钠，50 μg/ml氯霉素），在37℃下以200 rpm振荡培养约5h至OD600为约1.1-1.2。冷却至18℃，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在18℃下以200 rpm振荡培养20h。在4℃下以4500 rpm离心30 min。收集菌体，保存在-80℃下。
5）分离纯化
a) 取500 ml上一步骤所得菌体，加入90 ml缓冲液（1mM EDTA，0.4M NaCl）重悬，振荡混匀后，沸水浴20 min，期间涡旋振荡。冷却后，在16℃下以9000 rpm离心50 min。
b) 取上清液，加入终浓度为70%的冷乙醇（-80℃预冷），加入终浓度为0.2M的NaCl，混匀后，在-20℃下静置1-2h。
c) 抽滤，用70%的乙醇洗涤沉淀，旋蒸至100 ml，用双蒸水稀释至1000 ml重悬，用0.45 μm滤膜过滤。使用Dowex 1X2柱进行层析，上样后用10倍柱体积的水洗除未结合物质。然后用10 mM HCl/1M NaCl梯度洗脱，获得第一3’3’-cGAMP粗品。
d) 将第一3’3’-cGAMP粗品旋蒸至干燥，加90 ml水溶解，用35 mM HAc和10 mM44%NH4Ac调pH4.0左右。使用C18柱（XK16，58 ml柱体积，15 g LiChroprep RP-18基质，GEHealthcare)进行层析，上样结束后，用缓冲液(25%乙醇，20 mM NH4HCO3)以5 ml/min的速度线性梯度洗脱（0%-50%），获得第二3’3’-cGAMP粗品。
e) 将第二3’3’-cGAMP粗品用氨水调pH至中性，旋蒸干燥，用5 ml 5‰（v/v）氨水溶解，在16℃下以16000g离心15 min。使用Sephadex G10柱（XK60，228 ml柱体积，GEHealthcare）进行层析，用水平衡并洗脱样品，收集主峰位置的洗脱液，旋蒸至2ml，用真空冷冻干燥机干燥，得到纯3’3’-cGAMP。产率为28.6%，纯度为96.1%。
本发明的上述实施例仅为较佳实施例，并非对本发明的范围加以任何限制。本领域的普通技术人员可根据上述实施例领会本发明的精神，并做出多种不同修改和变化。在不脱离本发明的精神的情况下，所有该等修改和变化都在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种使用重组大肠杆菌发酵制备2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）构建重组载体，使用目的基因和质粒构建重组载体，所述目的基因为鼠源cGAS酶基因；
2）转化，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株；
3）阳性克隆验证，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌克隆；
4）诱导，添加诱导剂，诱导所述转化成功的重组大肠杆菌发酵产生2’3’-cGAMP；
5）分离纯化，所述分离纯化包括以下步骤：
a) 取培养上清液，抽滤，酸化，抽滤；
b) 使用大孔吸附树脂柱对步骤a)所得产物进行层析，获得第一2’3’-cGAMP粗品；
c) 使用离子交换树脂柱对所述第一2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第二2’3’-cGAMP粗品；
d) 使用C18柱对所述第二2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第三2’3’-cGAMP粗品；
e) 使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第三2’3’-cGAMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯2’3’-cGAMP。
2.根据权利要求1所述的使用重组大肠杆菌发酵制备2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，所述质粒为pet28a质粒，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将鼠源cGAS酶基因构建至所述pet28a质粒中。
3.一种使用重组大肠杆菌发酵制备c-di-GMP的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）构建重组载体，使用目的基因和质粒构建重组载体，所述目的基因为海栖热袍杆菌Thermotoga maritima的二鸟苷酸环化酶tDGC R158A基因tDGCm和人源干扰素刺激基因STINGCTD；
2）转化，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)菌株；
3）阳性克隆验证，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌克隆；
4）诱导，添加诱导剂，诱导所述转化成功的重组大肠杆菌发酵产生c-di-GMP；
5）分离纯化，所述分离纯化包括以下步骤：
a) 取培养物，加入双蒸水重悬菌体，加热、混匀并离心；
b) 取上清液，加入冷乙醇，混匀后静置，离心；
c) 取上清液，加入NaCl和EDTA，混匀后静置，离心；
d) 弃去上清液，用双蒸水重悬沉淀，使用氨基丙柱进行层析，获得第一c-di-GMP粗品；
e) 使用C18柱对所述第一c-di-GMP粗品进行层析，获得第二c-di-GMP粗品；
f) 使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第二c-di-GMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯c-di-GMP。
4.根据权利要求3所述的使用重组大肠杆菌发酵制备c-di-GMP的方法，其特征在于，所述质粒为经改造pet15b和pet30a质粒，所述pet15b的N端的凝血蛋白酶位点被PPase蛋白酶位点取代，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将所述tDGCm基因构建至所述pet15b质粒中，且使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述STINGCTD基因构建至所述pet30a质粒中。
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