CN107475216A

CN107475216A - 重组型耐热dna聚合酶及其应用

Info

Publication number: CN107475216A
Application number: CN201710695807.5A
Authority: CN
Inventors: 史进
Original assignee: Beijing Xinye Qing Department Of Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Tsingke Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: CN107475216B

Abstract

本发明涉及一种重组型耐热DNA聚合酶：包括DNA结合结构域、蛋白结构域连接接头以及无3’‑5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶，DNA结合结构域通过蛋白结构域连接接头连接到无3’‑5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶的N端，其中DNA结合结构域为Sso7d结构域、HMf类蛋白或来自甲烷嗜热菌的DNA拓扑异构酶Ⅴ的HhH结构域；无3’‑5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶为Taq、Tth、Tma、Pfu、Deep、Vent或Tgo DNA聚合酶的缺失突变体。本发明还提供了上述重组型耐热DNA聚合酶在DNA测序中的应用。本发明的重组型耐热DNA聚合酶的续进性和延伸速度明显增强，在PCArg反应测序过程中，节约时间，使用本发明中的测序酶，可以获得更长的读长，以及更高的测序成功率。

Description

重组型耐热DNA聚合酶及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程领域，尤其涉及一种重组型耐热DNA聚合酶及其应用。

背景技术

在测序应用上需要提高聚合酶的效率。通常DNA测序依靠生成四种不同类型的单链 DNA片段库来实现，单链DNA片段的一端是确定不变的，而另一端终止于不同的核苷酸(鸟嘌呤核苷酸G，腺嘌呤核苷酸A，胸腺嘧啶核苷酸T，胞嘧啶核苷酸C)。四种不同类型的DNA片段基于长度大小而被分离，在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上呈现不同的条带，每个条带线性地对应DNA序列中的每一个特定的核苷酸，从而鉴定出给定的单核苷酸在序列中的位置。目前DNA测序主要有两种方法：Maxam和Gilbert的化学法和Sanger的双脱氧核苷酸终止法。

天然聚合酶的许多特性不适合DNA测序，测序酶应该具备的特性包括：(1)较高的持续合成能力：持续合成能力是指酶从引物-模板退火复合物上脱离之前链持续延伸的程度。(2) 耐热性：在高温条件下抵抗失活或分解的能力是酶在现代高技术投入循环测序反应中的最重要的因素。(3)核苷酸类似物嵌入染色末端：嵌入类似物的能力对双脱氧链终止法起决定性因素。带每个标记染料末端的终止的效率必须与避免低质量的不均匀峰数据的效率相似。此外，聚合酶经常有3’-核酸外切酶“校正”和/或在DNA复制后切掉引物的5’-核酸外切酶能力。由于这两种能力都不是测序所需的，所以聚合酶的突变体中应将其去除。

自动测序的发展催生了对更好的测序酶的追求，但目前应用于测序反应的酶效率不高，缺失型Taq酶去除了5’-3’外切酶活性，续进性只有2个碱基左右。DNA聚合酶的续进性(Processivity)即每次聚合酶结合引物-模板复合体后催化合成的寡核苷酸的数量，这一性能可通过增强酶-核酸复合体的稳定来实现增强。另外，测序酶过早地脱离模板会导致通过测序反应无法得到可靠的序列信息。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种重组型耐热DNA聚合酶及其应用，本发明的重组型耐热DNA聚合酶的续进性明显增强，具有极快的延伸速度，在PCR反应测序过程中，节约时间，使用本发明中的测序酶，可以获得更长的读长，以及更高的测序成功率。

本发明提供了一种重组型耐热DNA聚合酶，包括DNA结合结构域、蛋白结构域连接接头(linker)以及无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶，DNA结合结构域通过蛋白结构域连接接头连接到无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶的N端，其中

DNA结合结构域为Sso7d结构域、来自耐热菌的HMf类蛋白或来自甲烷嗜热菌的DNA拓扑异构酶Ⅴ的HhH结构域；

无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶缺失突变体、Tth DNA聚合酶缺失突变体、Tma DNA聚合酶缺失突变体、Pfu DNA聚合酶缺失突变体、Deep VentDNA 聚合酶缺失突变体、Vent DNA聚合酶缺失突变体或Tgo DNA聚合酶缺失突变体。优选地， DNA结合结构域为Sso7d结构域。优选地，无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶缺失突变体。

进一步地，Sso7d结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，蛋白结构域连接接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，Taq DNA聚合酶缺失突变体的N端缺失289个氨基酸，且含有R660D和F667Y 两个突变点。Taq DNA聚合酶N端缺失289个氨基酸，因此无5`-3`核酸外切酶活性；且R660D 和F667Y两个突变点降低了野生型Taq DNA聚合酶催化dNTP和ddNTP及荧光类似物的选择性。

进一步地，Taq DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，Tth DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。其N端缺失 289个氨基酸，且含R662D/F669Y突变点。

进一步地，Tma DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。其N端缺失284个氨基酸。

进一步地，Pfu DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。其含D141A/E143A突变，且无外切酶活性。

本发明还提供了一种上述重组型耐热DNA聚合酶在DNA测序中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明的重组型耐热DNA聚合酶耐热温度可高达98℃，在1h内无明显活性变化；续进性明显增强，具有极快的延伸速度，其聚合酶延伸速度可高达20kb/s；在PCR反应测序过程中，节约时间，使用本发明中的测序酶，可以获得更长的读长，以及更高的测序成功率。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明重组型耐热DNA聚合酶的结构示意图；

图2是本发明本发明实施例1中的测序酶与Amplitaq FS在信号易中断测序表现的比较；

附图标记说明：

1-DNA结合结构域；2-蛋白linker；3-无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

如图1所示，一种重组型耐热DNA聚合酶，包括DNA结合结构域1、蛋白结构域连接接头(蛋白linker)2以及无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶3，DNA结合结构域1 通过linker 2连接到无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶3的N端。

在本实施例中，DNA结合结构域1为Sso7d蛋白结构域，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示。蛋白linker 2为Gly-Gly-Gly-Thr-Val氨基酸序列，编码linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。蛋白linker 2的作用为连接两个独立的蛋白或蛋白结构域，同时保持两个连接的蛋白或蛋白结构域保持独立的活性与功能。

在本实施例中，无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶3为Taq DNA聚合酶缺失突变体，其N端缺失289个氨基酸，且含有R660D和F667Y两个突变点。Taq DNA聚合酶缺失突变体(以下简称TaqΔ289 DNA聚合酶)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

Sso7d蛋白结构域通过蛋白linker连接到Taq DNA缺失突变体的N端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白(以下简称Sso7d-TaqΔ289聚合酶)。Sso7d-TaqΔ289 聚合酶的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。Sso7d蛋白结构域赋予融合蛋白非特异性地结合 DNA双链的能力。在聚合酶反应中，聚合酶活性由TaqΔ289 DNA聚合酶提供。

Sso7d蛋白结构域与古生菌Sulfolobus sulfataricus中的染色体结合蛋白Sso7d具有较高的同源性。Sso7d结构域能非特异性地结合到双链DNA上，当Sso7d蛋白结构域融合到TaqΔ 289 DNA聚合酶上时，产生的融合蛋白Sso7d-TaqΔ289 DNA聚合酶的续进性和延伸速度明显增强。)

由于Taq DNA聚合酶N端缺失289个氨基酸，因此无5`-3`核酸外切酶活性；且R660D和F667Y两个突变点降低了野生型Taq DNA聚合酶催化dNTP和ddNTP及荧光类似物的选择性。F667Y突变点降低了测序酶对ddNTP偏爱，使四种碱基的测序信号峰分布更加均匀。而R660D突变点更进一步增强了这一效果。

本实施例中，Sso7d-TaqΔ289聚合酶的合成方法如下：

(1)表达质粒构建及表达菌株转化：

Sso7d-TaqΔ289聚合酶编码DNA序列由人工合成(SEQ ID No.8)，并经限制性内切酶 (Nco I/Nde I)消化，连接进入表达载体pET28a,并转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。

(2)Sso7d-TaqΔ289聚合酶诱导表达与纯化

含pET28a(sso7d-taqΔ289)质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经过夜活化，以1％体积比转接含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养3-4小时至OD₆₀₀达0.6-1.0，加入IPTG(至终浓度1mM)诱导表达。继续培养2-3小时。收集菌体，超声波破碎，并以Ni-NTA亲和纯化蛋白。

纯化后，测定酶的纯度以及活性。对获得的Sso7d-TaqΔ289聚合酶进行续进性、延伸速度和耐热性测试，测试结果如表1所示。

表1 Sso7d-TaqΔ289聚合酶性能

一般来说，野生型Taq DNA聚合酶延伸速度约为1kb/min，续进性为13-18个核苷酸。本实施例的重组型耐热DNA聚合酶，其续进性约为130-160个核苷酸，是野生型Taq DNA聚合酶续进性的6-10倍。同时，Sso7d-TaqΔ289 DNA聚合酶的延伸速度达到了3kb/min，是野生型Taq DNA聚合酶速度的3倍。

图2是本发明本发明实施例1中的测序酶与AmpliTaq FS在信号易中断测序表现的比较。其中，其中a1、a2为RNAi样本，b1、b2为甲基化样本，c1、c2为Poly-A和PolyT结构， d1、d2为Poly-A和PolyG结构，其中，a1、b1、c1、d1代表Amplitaq FS的结果，a2、b2、 c2、d2代表本实施例的Sso7d-TaqΔ289聚合酶的结果。从图2中可看出，本发明的测序酶与AmpliTaqFS相比，能对RNAi及甲基化样本有更好的延伸，从而成功获得测序结果；对 AT-Rich样本，本发明的测序酶更不易发生信号中断，能获得更长的读长，因而本发明的测序酶在使用时不必特殊处理就可应用于困难样本的测序，保证了测序的成功率。

本实施例中的Sso7d-TaqΔ289聚合酶能耐受98℃，1h内无明显活性变化，这比普通野生型Taq DNA聚合酶有更优良的耐热性(94℃)。通常Taq DNA聚合酶的缺失体(如Klentaq) 的耐热性要好于野生型聚合酶。本实施例中的重组型Taq DNA聚合酶的耐热性较其他Taq DNA聚合酶更好，因而在测序反应中可以使用更高的变性温度(98℃)，酶活性损失也最小。

本实施例中的重组型Taq DNA聚合酶具有极好的延伸能力。Sso7d结构域增强了酶-模板 -引物复合物的稳定性，使酶具备了更强的持续合成能力。在测序反应中，体现在测序结果读长(read length)的长度上，以及复杂结构(AT/GC-Rich，Hairpin)测序成功率。使用本发明中的测序酶，可以获得更好的数据质量，更长的读长，以及高的测序成功率。

实施例2

一种重组型耐热DNA聚合酶，包括HMf类蛋白，HMf类蛋白通过蛋白linker连接到Taq Δ289 DNA聚合酶上，其中，蛋白linker 2为Gly-Gly-Gly-Thr-Val氨基酸序列，TaqΔ289 DNA 聚合酶的N端缺失289个氨基酸，且含有R660D和F667Y两个突变点。

以上重组型耐热DNA聚合酶的制备方法如下：

(1)表达质粒构建及表达菌株转化：

Hmf蛋白编码序列人工合成，氨基酸序列见SEQ ID NO.7。并经限制性内切酶NcoI/Spe I连接入pET28a(sso7d-taqΔ289)，构建表达质粒pET28a(hmf-taqΔ289)，目的基因序列见 SEQ ID NO.9。并转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。

(2)Hmf-TaqΔ289聚合酶诱导表达与纯化

含pET28a pET28a(hmf-taqΔ289)质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经过夜活化，以1％体积比转接含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养3-4小时至OD600达0.6-1.0，加入IPTG (至终浓度1mM)诱导表达。继续培养2-3小时。收集菌体，超声波破碎，并以Ni-NTA亲和纯化蛋白。

实施例3

一种重组型耐热DNA聚合酶，包括Sso7d蛋白结构域，Sso7d蛋白结构域通过蛋白linker 连接到无3`-5`核酸外切酶活性的Tth聚合酶突变体上，其中，蛋白linker 2为Gly-Gly-Gly-Thr- Val氨基酸序列，Tth聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，目的基因序列见SEQ ID NO.10。

以上重组型耐热DNA聚合酶的制备方法如下：

(1).表达质粒构建及表达菌株转化：

TthΔ289聚合酶编码DNA序列克隆自Thermus thermophilus HB8基因组DNA(购自TAKAArgA,3071)，基因序列见SEQ ID NO.4。并经同源重组替换TaqΔ289同源序列，构建表达质粒pET28a(sso7d-tthΔ289),并转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。

(2)Sso7d-TthΔ289聚合酶诱导表达与纯化

含pET28a pET28a(sso7d-tthΔ289)质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经过夜活化，以1％体积比转接含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养3-4小时至OD₆₀₀达0.6-1.0，加入IPTG(至终浓度1mM)诱导表达。继续培养2-3小时。收集菌体，超声波破碎，并以Ni-NTA亲和纯化蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京擎科新业生物技术有限公司

<120> 重组型耐热DNA聚合酶及其应用

<160> 4

<170> Patent In version 3.3

<210> 1

<211> 63

<212> 氨基酸序列

<213> Sso7d结构域

<400> 1

Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val

35 40 45

Ser Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys

50 55 60

Gln Lys Lys

63

<210> 2

<211> 5

<212> 氨基酸序列

<213> 蛋白结构域连接接头

<400> 2

Gly Gly Gly Thr Val

5

<210> 3

<211> 544

<212> 氨基酸序列

<213> Taq DNA聚合酶缺失突变体

<400> 3

Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

5 10 15

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala

20 25 30

Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg

35 40 45

Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg

50 55 60

Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly

65 70 75

Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu

80 85 90

Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr

95 100 105

Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser

110 115 120

Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu

125 130 135

Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala

140 145 150

Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala

155 160 165

Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg

170 175 180

Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu

185 190 195

Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly

200 205 210

Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr

215 220 225

Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val

230 235 240

Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

245 250 255

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg

260 265 270

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

275 280 285

Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro

290 295 300

Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp

305 310 315

Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu

320 325 330

Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu

335 340 345

Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val

350 355 360

Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Asp Ala Ala Lys Thr

365 370 375

Ile Asn Tyr Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser

380 385 390

Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu

395 400 405

Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys

410 415 420

Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe

425 430 435

Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser

440 445 450

Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln

455 460 465

Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe

470 475 480

Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

485 490 495

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val

500 505 510

Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala

515 520 525

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser

530 535 540

Ala Lys Glu Gly

544

<210> 4

<211> 834

<212> 氨基酸序列

<213> Tth DNA聚合酶缺失突变体

<400> 4

Met Glu Ala Met Leu Pro Let Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu

5 10 15

Leu Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu

20 25 30

Lys Gly Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr

35 40 45

Gly Phe Ala Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr

50 55 60

Lys Ala Val Phe Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg

65 70 75

His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro

80 85 90

Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp

95 100 105

Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp

110 115 120

Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr

125 130 135

Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln Leu Val

140 145 150

Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu Gly His Leu Ile Thr

155 160 165

Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Glu Gln Trp

170 175 180

Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro

185 190 195

Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys

200 205 210

Gly Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Val

215 220 225

Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

230 235 240

Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro

245 250 255

Leu Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly

260 265 270

Leu Arg Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His

275 280 285

Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro

290 295 300

Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg

305 310 315

Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg

320 325 330

Asp Gly Arg Val His Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys

335 340 345

Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val

350 355 360

Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro

365 370 375

Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu

380 385 390

Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Asp Ala Ala

395 400 405

His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg Asn Leu Leu Lys

410 415 420

Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr His Glu Val

425 430 435

Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

440 445 450

Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu Leu

455 460 465

Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val

485 490 495

Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys

500 505 510

Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg

515 520 525

Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu

530 535 540

Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val

545 550 555

His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala

560 565 570

Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn

570 580 585

Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe

590 595 600

Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln

605 610 615

Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu

620 625 630

Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile His Thr Gln Thr Ala

635 640 645

Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu Met

650 655 660

Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met

665 670 675

Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

680 685 690

Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val

695 700 705

Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu

725 730 735

Asn Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala

740 745 750

Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu

755 760 765

Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg

770 775 780

Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln

785 790 795

Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu

800 805 810

Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met

815 820 825

Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Gly

830 834

<210> 5

<211> 610

<212> 氨基酸序列

<213> Tma DNA聚合酶缺失突变体

<400> 5

Met Lys Glu Leu Gln Leu Tyr Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr

5 10 15

Arg Ile Val Lys Asp Leu Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys

20 25 30

Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser

35 40 45

Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile Val Gly Ile Ser Val Ser Phe

50 55 50

Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro Leu His His Arg Asn Ala

65 70 75

Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ile

80 85 90

Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln Asn Leu Lys Phe

95 100 105

Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro Val Pro Pro

110 115 120

Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro Asn Glu

125 130 135

Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly Tyr

140 145 150

Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu

155 160 165

Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn

170 175 180

Tyr Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr

185 190 195

Leu Ser Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr

200 205 210

Lys Ile Glu Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu

215 220 225

Asn Gly Val Tyr Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu

230 235 240

Glu Tyr Gly Lys Lys Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg

245 250 255

Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser

260 265 270

Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr

275 280 285

Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg

305 310 315

Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys

320 325 330

Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala Ser Phe Asn Gln

335 340 345

Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu

350 355 360

Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile Arg Lys

365 370 375

Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala Asp

380 385 390

Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp

395 400 405

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr

410 415 420

Leu Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr

425 430 435

Glu Glu Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile

440 445 450

Tyr Gly Val Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro

455 460 465

Val Lys Glu Ala Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr

470 475 480

Pro Lys Val Arg Asp Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys

485 490 495

Glu Lys Gly Tyr Val Arg Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile

500 505 510

Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu

515 520 525

Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile

530 535 540

Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp Arg Glu Leu Lys Glu Arg

545 550 555

Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val His Asp Glu Leu Val

560 565 570

Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu Val Glu Leu Val

575 580 585

Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val Pro Leu Glu

590 595 600

Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser

605 610

<210> 6

<211> 774

<212> 氨基酸序列

<213> Pfu聚合酶缺失突变体

<400> 6

Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val

5 10 15

Ile Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His

20 25 30

Asp Arg Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp

35 40 45

Ser Lys Ile Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly

50 55 60

Lys Ile Val Arg Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe

65 70 75

Leu Gly Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro

80 85 90

Gln Asp Val Pro Thr Ile Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala

95 100 105

Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr

110 115 120

Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu

125 130 135

Lys Ile Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu

140 145 150

Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu

155 160 165

Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile Asp Leu Pro Tyr

170 175 180

Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu

185 190 195

Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr Tyr Asn

200 205 210

Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Lys Ala Lys Arg Ala Glu Lys

215 220 225

Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys

230 235 240

Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg

245 250 255

Ile His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu

260 265 270

Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys

275 280 285

Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu

290 295 300

Ser Gly Glu Asn Lys Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp

305 310 315

Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Lys Pro Met Glu

320 325 330

Ile Gln Lys Ser Arg Leu Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser

335 340 345

Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys

350 355 360

Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu

365 370 375

Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Thr Gly Gly Phe Val

380 385 390

Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp

395 400 405

Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser

410 415 420

Pro Asp Thr Leu Asn Lys Glu Gly Cys Lys Asn Tyr Asp Ile Ala

425 430 435

Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly Phe Ile

440 445 450

Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys

455 460 465

Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu

470 475 480

Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr

485 490 495

Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys

500 505 510

Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val

515 520 525

Trp Lys Glu Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile

530 535 540

Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu

545 550 555

Glu Ile Lys Lys Lys Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser

560 565 570

Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys

575 580 585

Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu

590 595 600

Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp

605 610 615

Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Thr

620 625 630

Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys

635 640 645

Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys

650 655 660

Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His Glu Tyr Lys

665 670 675

Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala Ala Lys

680 685 690

Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val Lys

695 700 705

Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu

710 715 720

Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu

725 730 735

Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly

740 745 750

Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly

755 760 765

Leu Thr Ser Trp Leu Asn Ile Lys Lys

770 774

<210> 7

<211> 69

<212> 氨基酸序列

<213> Hmf蛋白

<400> 7

Met Gly Glu Leu Pro Ile Ala Pro Ile Gly Arg Ile Ile Lys Asn

5 10 15

Ala Gly Ala Glu Arg Val Ser Asp Asp Ala Arg Ile Ala Leu Ala

20 25 30

Lys Val Leu Glu Glu Met Gly Glu Glu Ile Ala Ser Glu Ala Val

35 40 45

Lys Leu Ala Lys His Ala Gly Arg Lys Thr Ile Lys Ala Glu Asp

50 55 60

Ile Glu Leu Ala Arg Lys Met Phe Lys

65 69

<210> 8

<211> 1875

<212> 核苷酸序列

<213> Serso7d- TaqΔ289聚合酶

<400> 8

ATGGGCAGCA GCGCAACCGT AAAGTTCAAG TACAAAGGCG AAGAAAAAGA GGTAGACATC 60

TCCAAGATCA AGAAAGTATG GCGTGTGGGC AAGATGATCT CCTTCACCTA CGACGAGGGC 120

GGTGGCAAGA CCGGCCGTGG TGCGGTAAGC GAAAAGGACG CGCCGAAGGA GCTGCTGCAG 180

ATGCTGGAGA AGCAGAAAAA GGGCGGCGGT GTCACTAGTC CCAAGGCCCT GGAGGAGGCC 240

CCCTGGCCCC CGCCGGAAGG GGCCTTCGTG GGCTTTGTGC TTTCCCGCAA GGAGCCCATG 300

TGGGCCGATC TTCTGGCCCT GGCCGCCGCC AGGGGGGGCC GGGTCCACCG GGCCCCCGAG 360

CCTTATAAAG CCCTCAGGGA CCTGAAGGAG GCGCGGGGGC TTCTCGCCAA AGACCTGAGC 420

GTTCTGGCCC TGAGGGAAGG CCTTGGCCTC CCGCCCGGCG ACGACCCCAT GCTCCTCGCC 480

TACCTCCTGG ACCCTTCCAA CACCACCCCC GAGGGGGTGG CCCGGCGCTA CGGCGGGGAG 540

TGGACGGAGG AGGCGGGGGA GCGGGCCGCC CTTTCCGAGA GGCTCTTCGC CAACCTGTGG 600

GGGAGGCTTG AGGGGGAGGA GAGGCTCCTT TGGCTTTACC GGGAGGTGGA GAGGCCCCTT 660

TCCGCTGTCC TGGCCCACAT GGAGGCCACG GGGGTGCGCC TGGACGTGGC CTATCTCAGG 720

GCCTTGTCCC TGGAGGTGGC CGAGGAGATC GCCCGCCTCG AGGCCGAGGT CTTCCGCCTG 780

GCCGGCCACC CCTTCAACCT CAACTCCCGG GACCAGCTGG AAAGGGTCCT CTTTGACGAG 840

CTAGGGCTTC CCGCCATCGG CAAGACGGAG AAGACCGGCA AGCGCTCCAC CAGCGCCGCC 900

GTCCTGGAGG CCCTCCGCGA GGCCCACCCC ATCGTGGAGA AGATCCTGCA GTACCGGGAG 960

CTCACCAAGC TGAAGAGCAC CTACATTGAC CCCTTGCCGG ACCTCATCCA CCCCAGGACG 1020

GGCCGCCTCC ACACCCGCTT CAACCAGACG GCCACGGCCA CGGGCAGGCT AAGTAGCTCC 1080

GATCCCAACC TCCAGAACAT CCCCGTCCGC ACCCCGCTTG GGCAGAGGAT CCGCCGGGCC 1140

TTCATCGCCG AGGAGGGGTG GCTATTGGTG GCCCTGGACT ATAGCCAGAT AGAGCTCAGG 1200

GTGCTGGCCC ACCTCTCCGG CGACGAGAAC CTGATCCGGG TCTTCCAGGA GGGGCGGGAC 1260

ATCCACACGG AGACCGCCAG CTGGATGTTC GGCGTCCCCC GGGAGGCCGT GGACCCCCTG 1320

ATGCGCGATG CGGCCAAGAC CATCAACTAC GGGGTCCTCT ACGGCATGTC GGCCCACCGC 1380

CTCTCCCAGG AGCTAGCCAT CCCTTACGAG GAGGCCCAGG CCTTCATTGA GCGCTACTTT 1440

CAGAGCTTCC CCAAGGTGCG GGCCTGGATT GAGAAGACCC TGGAGGAGGG CAGGAGGCGG 1500

GGGTACGTGG AGACCCTCTT CGGCCGCCGC CGCTACGTGC CAGACCTAGA GGCCCGGGTG 1560

AAGAGCGTGC GGGAGGCGGC CGAGCGCATG GCCTTCAACA TGCCCGTCCA GGGCACCGCC 1620

GCCGACCTCA TGAAGCTGGC TATGGTGAAG CTCTTCCCCA GGCTGGAGGA AATGGGGGCC 1680

AGGATGCTCC TTCAGGTCCA CGACGAGCTG GTCCTCGAGG CCCCAAAAGA GAGGGCGGAG 1740

GCCGTGGCCC GGCTGGCCAA GGAGGTCATG GAGGGGGTGT ATCCCCTGGC CGTGCCCCTG 1800

GAGGTGGAGG TGGGGATAGG GGAGGACTGG CTCTCCGCCA AGGAGGGGGG TTCTCATCAT 1860

CATCATCATC ATTGA 1875

<210> 9

<211> 1881

<212> 核苷酸序列

<213> Hmf TaqΔ289聚合酶

<400> 9

ATGGGTGAGT TACCAATTGC CCCAATCGGA AGAATCATAA AAAACGCTGG TGCTGAAAGA 60

GTTAGTGACG ATGCAAGAAT TGCATTAGCA AAAGTTTTAG AAGAAATGGG CGAAGAAATA 120

GCTTCAGAAG CTGTGAAATT AGCAAAACAT GCGGGAAGAA AAACAATAAA GGCAGAAGAC 180

ATTGAATTAG CTCGAAAAAT GTTCAAAGGC GGCGGTGTCA CTAGTCCCAA GGCCCTGGAG 240

GAGGCCCCCT GGCCCCCGCC GGAAGGGGCC TTCGTGGGCT TTGTGCTTTC CCGCAAGGAG 300

CCCATGTGGG CCGATCTTCT GGCCCTGGCC GCCGCCAGGG GGGGCCGGGT CCACCGGGCC 360

CCCGAGCCTT ATAAAGCCCT CAGGGACCTG AAGGAGGCGC GGGGGCTTCT CGCCAAAGAC 420

CTGAGCGTTC TGGCCCTGAG GGAAGGCCTT GGCCTCCCGC CCGGCGACGA CCCCATGCTC 480

CTCGCCTACC TCCTGGACCC TTCCAACACC ACCCCCGAGG GGGTGGCCCG GCGCTACGGC 540

GGGGAGTGGA CGGAGGAGGC GGGGGAGCGG GCCGCCCTTT CCGAGAGGCT CTTCGCCAAC 600

CTGTGGGGGA GGCTTGAGGG GGAGGAGAGG CTCCTTTGGC TTTACCGGGA GGTGGAGAGG 660

CCCCTTTCCG CTGTCCTGGC CCACATGGAG GCCACGGGGG TGCGCCTGGA CGTGGCCTAT 720

CTCAGGGCCT TGTCCCTGGA GGTGGCCGAG GAGATCGCCC GCCTCGAGGC CGAGGTCTTC 780

CGCCTGGCCG GCCACCCCTT CAACCTCAAC TCCCGGGACC AGCTGGAAAG GGTCCTCTTT 840

GACGAGCTAG GGCTTCCCGC CATCGGCAAG ACGGAGAAGA CCGGCAAGCG CTCCACCAGC 900

GCCGCCGTCC TGGAGGCCCT CCGCGAGGCC CACCCCATCG TGGAGAAGAT CCTGCAGTAC 960

CGGGAGCTCA CCAAGCTGAA GAGCACCTAC ATTGACCCCT TGCCGGACCT CATCCACCCC 1020

AGGACGGGCC GCCTCCACAC CCGCTTCAAC CAGACGGCCA CGGCCACGGG CAGGCTAAGT 1080

AGCTCCGATC CCAACCTCCA GAACATCCCC GTCCGCACCC CGCTTGGGCA GAGGATCCGC 1140

CGGGCCTTCA TCGCCGAGGA GGGGTGGCTA TTGGTGGCCC TGGACTATAG CCAGATAGAG 1200

CTCAGGGTGC TGGCCCACCT CTCCGGCGAC GAGAACCTGA TCCGGGTCTT CCAGGAGGGG 1260

CGGGACATCC ACACGGAGAC CGCCAGCTGG ATGTTCGGCG TCCCCCGGGA GGCCGTGGAC 1320

CCCCTGATGC GCGATGCGGC CAAGACCATC AACTACGGGG TCCTCTACGG CATGTCGGCC 1380

CACCGCCTCT CCCAGGAGCT AGCCATCCCT TACGAGGAGG CCCAGGCCTT CATTGAGCGC 1440

TACTTTCAGA GCTTCCCCAA GGTGCGGGCC TGGATTGAGA AGACCCTGGA GGAGGGCAGG 1500

AGGCGGGGGT ACGTGGAGAC CCTCTTCGGC CGCCGCCGCT ACGTGCCAGA CCTAGAGGCC 1560

CGGGTGAAGA GCGTGCGGGA GGCGGCCGAG CGCATGGCCT TCAACATGCC CGTCCAGGGC 1620

ACCGCCGCCG ACCTCATGAA GCTGGCTATG GTGAAGCTCT TCCCCAGGCT GGAGGAAATG 1680

GGGGCCAGGA TGCTCCTTCA GGTCCACGAC GAGCTGGTCC TCGAGGCCCC AAAAGAGAGG 1740

GCGGAGGCCG TGGCCCGGCT GGCCAAGGAG GTCATGGAGG GGGTGTATCC CCTGGCCGTG 1800

CCCCTGGAGG TGGAGGTGGG GATAGGGGAG GACTGGCTCT CCGCCAAGGA GGGGGGTTCT 1860

CATCATCATC ATCATCATTG A 1881

<210> 10

<211> 1890

<212> 核苷酸序列

<213> Sso7d- TthΔ289聚合酶

<400> 10

ATGGGCAGCG CAACCGTAAA GTTCAAGTAC AAAGGCGAAG AAAAAGAGGT AGACATCTCC 60

AAGATCAAGA AAGTATGGCG TGTGGGCAAG ATGATCTCCT TCACCTACGA CGAGGGCGGT 120

GGCAAGACCG GCCGTGGTGC GGTAAGCGAA AAGGACGCGC CGAAGGAGCT GCTGCAGATG 180

CTGGAGAAGC AGAAAAAGGG CGGCGGTGTC ACTAGTGGGG GCCTCCTGGA GGCCCCCGCC 240

CCCCTGGAGG AGGCCCCCTG GCCCCCGCCG GAAGGGGCCT TCGTGGGCTT CGTCCTCTCC 300

CGCCCCGAGC CCATGTGGGC GGAGCTTAAA GCCCTGGCCG CCTGCAGGGA CGGCCGGGTG 360

CACCGGGCAG CAGACCCCTT GGCGGGGCTA AAGGACCTCA AGGAGGTCCG GGGCCTCCTC 420

GCCAAGGACC TCGCCGTCTT GGCCTCGAGG GAGGGGCTAG ACCTCGTGCC CGGGGACGAC 480

CCCATGCTCC TCGCCTACCT CCTGGACCCC TCCAACACCA CCCCCGAGGG GGTGGCGCGG 540

CGCTACGGGG GGGAGTGGAC GGAGGACGCC GCCCACCGGG CCCTCCTCTC GGAGAGGCTC 600

CATCGGAACC TCCTTAAGCG CCTCGAGGGG GAGGAGAAGC TCCTTTGGCT CTACCACGAG 660

GTGGAAAAGC CCCTCTCCCG GGTCCTGGCC CACATGGAGG CCACCGGGGT ACGGCGGGAC 720

GTGGCCTACC TTCAGGCCCT TTCCCTGGAG CTTGCGGAGG AGATCCGCCG CCTCGAGGAG 780

GAGGTCTTCC GCTTGGCGGG CCACCCCTTC AACCTCAACT CCCGGGACCA GCTGGAAAGG 840

GTGCTCTTTG ACGAGCTTAG GCTTCCCGCC TTGGGGAAGA CGCAAAAGAC AGGCAAGCGC 900

TCCACCAGCG CCGCGGTGCT GGAGGCCCTA CGGGAGGCCC ACCCCATCGT GGAGAAGATC 960

CTCCAGCACC GGGAGCTCAC CAAGCTCAAG AACACCTACG TGGACCCCCT CCCAAGCCTC 1020

GTCCACCCGA GGACGGGCCG CCTCCACACC CGCTTCAACC AGACGGCCAC GGCCACGGGG 1080

AGGCTTAGTA GCTCCGACCC CAACCTGCAG AACATCCCCG TCCGCACCCC CTTGGGCCAG 1140

AGGATCCGCC GGGCCTTCGT GGCCGAGGCG GGTTGGGCGT TGGTGGCCCT GGACTATAGC 1200

CAGATAGAGC TCCGCGTCCT CGCCCACCTC TCCGGGGACG AAAACCTGAT CAGGGTCTTC 1260

CAGGAGGGGA AGGACATCCA CACCCAGACC GCAAGCTGGA TGTTCGGCGT CCCCCCGGAG 1320

GCCGTGGACC CCCTGATGCG CCGGGCGGCC AAGACGGTGA ACTTCGGCGT CCTCTACGGC 1380

ATGTCCGCCC ATAGGCTCTC CCAGGAGCTT GCCATCCCCT ACGAGGAGGC GGTGGCCTTT 1440

ATAGAGCGCT ACTTCCAAAG CTTCCCCAAG GTGCGGGCCT GGATAGAAAA GACCCTGGAG 1500

GAGGGGAGGA AGCGGGGCTA CGTGGAAACC CTCTTCGGAA GAAGGCGCTA CGTGCCCGAC 1560

CTCAACGCCC GGGTGAAGAG CGTCAGGGAG GCCGCGGAGC GCATGGCCTT CAACATGCCC 1620

GTCCAGGGCA CCGCCGCCGA CCTCATGAAG CTCGCCATGG TGAAGCTCTT CCCCCGCCTC 1680

CGGGAGATGG GGGCCCGCAT GCTCCTCCAG GTCCACGACG AGCTCCTCCT GGAGGCCCCC 1740

CAAGCGCGGG CCGAGGAGGT GGCGGCTTTG GCCAAGGAGG CCATGGAGAA GGCCTATCCC 1800

CTCGCCGTGC CCCTGGAGGT GGAGGTGGGG ATGGGGGAGG ACTGGCTTTC CGCCAAGGGT 1860

GGGGGTTCTC ATCATCATCA TCATCATTGA 1890

Claims

1.一种重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：包括DNA结合结构域、蛋白结构域连接接头以及无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶，所述DNA结合结构域通过所述蛋白结构域连接接头连接到所述无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶的N端，其中

所述DNA结合结构域为Sso7d结构域、来自耐热菌的HMf类蛋白或来自甲烷嗜热菌的DNA拓扑异构酶Ⅴ的HhH结构域；

所述无3’-5’核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶缺失突变体、Tth DNA聚合酶缺失突变体、Tma DNA聚合酶缺失突变体、Pfu DNA聚合酶缺失突变体、Deep DNA聚合酶缺失突变体、Vent DNA聚合酶缺失突变体或Tgo DNA聚合酶缺失突变体。

2.根据权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述Sso7d结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述蛋白结构域连接接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述Taq DNA聚合酶缺失突变体的N端缺失289个氨基酸，且含有Arg660D和F667Y两个突变点。

5.根据权利要求1或4所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述Taq DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述Tth DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述Tma DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.根据权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶，其特征在于：所述Pfu DNA聚合酶缺失突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

9.权利要求1所述的重组型耐热DNA聚合酶在DNA测序中的应用。