CN101875924A

CN101875924A - 改善的ss07-聚合酶偶联蛋白质

Info

Publication number: CN101875924A
Application number: CN2010101571257A
Authority: CN
Inventors: 王焱
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2003-10-20
Publication date: 2010-11-03
Also published as: CA2502335A1; US7666645B2; DK1660650T3; CN1720324A; AU2003284265B2; WO2004037979A2; EP1660650A4; CA2502335C; EP1660650B1; US8445249B2; WO2004037979A3; EP1660650A2; JP2010166918A; US20100279360A1; US20040081963A1; AU2003284265A1; DE60332774D1; ATE469211T1; JP4505331B2; JP2006503580A

Abstract

本发明提供在聚合酶反应中活性改善的Sso7-聚合酶偶联物。该偶联蛋白质包含与连接于聚合酶结构域的SEQ ID NO：2相同性至少为60％的Sso7结构域，在此Sso7结构域中通过参比SEQ ID NO：2所确定的某表面残基位点的氨基酸用不同氨基酸置换；其中该表面残基的置换导致其加工能力低于野生型Sso7-聚合酶融合物的加工能力但高于未融合Sso7d结构域时该聚合酶结构域的加工能力。

Description

改善的SS07-聚合酶偶联蛋白质

本申请是国际申请号为PCT/US2003/032954、国际申请日为2003年10月20日、进入中国国家阶段的申请号为200380105035.1、发明名称为“改善的SSO7-聚合酶偶联蛋白质”的中国专利申请的分案申请。

发明背景

可通过将一序列非特异性双链核酸结合域与酶或其催化结构域相连接而改进聚合酶的活性(参见WO0192501)。这样修饰的聚合酶与未修饰酶相比显示出加工能力提高。然而，在一些情况中，可采用其它方法修饰这些改进的聚合酶的加工能力。例如，当进行长模板的聚合酶链式反应(PCR)时，采用高加工能聚合酶通常会导致产量更低。因此，需要调节聚合酶的加工能力以最优化该酶用于特定目的，例如长PCR。

此外，在一些情况中，用序列非特异性双链核酸结合域修饰聚合酶会减少聚合酶区分错配的引物/模板与适配引物/模板的能力。因此，也可能需要提高聚合酶对引物模板的特异性。

本发明针对了这两种需要，即调节聚合酶的加工能力和引物/模板结合特异性。本发明提供一种聚合酶偶联物，该偶联物包含有一个聚合酶或聚合酶催化结构域连接的突变的DNA结合域如Sso7d、Sac7d或与相关结构域。该突变的结合域在DNA结合域多肽序列表面残基(face residue)处含有1个或多个氨基酸取代。这些取代的融合性聚合酶在聚合酶反应中，例如聚合酶链式反应(PCR)中性能提高。

发明概述

本发明提供的聚合酶具有改进的加工能力。在一些实施方案中，该聚合酶也表现出增强的引物/模板结合特异性。具体说本发明提供一种Sso7-聚合酶偶联蛋白质，此蛋白质含有与连接于聚合酶结构域的SEQ ID NO：2相同性至少为60％的Sso7结构域，在此Sso7结构域中通过参比SEQ ID NO：2所确定的某表面残基位点的氨基酸被不同的氨基酸所取代；其中该表面残基的置换导致其加工能力低于野生型Sso7-聚合酶融合物但高于未融合Sso7d结构域的该聚合酶结构域的加工能力。通常，与含SEQ ID NO：2的Sso7聚合酶融合性蛋白相比，该表面残基的置换，也增加了该聚合酶的引物/模板结合特异性。

在一些实施方案中，该表面残基位点选自位点24的色氨酸残基、位点26的缬氨酸残基、位点29的甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，该表面残基位点是位点24的色氨酸残基，置换氨基酸残基是除了Asp、Glu、Arg、Lys或Pro之外的任何氨基酸。一般，置换氨基酸残基是甘氨酸、缬氨酸或丙氨酸。

在较佳实施方案中，该物的聚合酶结构域具有热稳定性聚合酶活性。该聚合酶结构域可以是家族A聚合酶结构域如栖热菌(Thermus)聚合酶结构域或家族B聚合酶结构域如火球菌(Pyrococcus)聚合酶结构域。通常该聚合酶结构域是ΔTaq聚合酶结构域。

在其它实施方案中，Sso7结构域包含SEQ ID NO：2，其中其表面残基位点的氨基酸被一个不同氨基酸所取代。例如，在一些实施方案中，Sso7结构域包含SEQ ID NO：2中位点24的色氨酸残基，被选自甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的氨基酸残基所取代。

另一方面，本发明提供一种调节对溶液中存在的靶核酸进行聚合酶反应的方法，该方法包括：(a)使该靶核酸接触Sso7聚合酶蛋白，此偶联蛋白质包含与连接于聚合酶结构域的SEQ ID NO：2相同性至少为60％的Sso7d结构域，Sso7d结构域中通过参比SEQ ID NO：2所确定的某表面残基位点有一氨基酸被野生型Sso7蛋白该表面残基位没有的氨基酸残基所取代；其中该表面残基的置换导致其加工能力高于未融合Sso7结构域的该聚合酶结构域的加工能力；其中所述溶液是一种组合物，能使该结合域结合靶核酸和使该聚合酶结构域可延伸与靶核酸序列杂交的引物；(b)在聚合酶可延伸引物的条件下孵育溶液。通常，与含SEQ ID NO：2的Sso7聚合酶融合蛋白质相比，该表面残基的置换可提高该聚合酶的引物/模板结合特异性。

本发明还提供产生本文所示聚合酶偶联物和利用其调节聚合酶反应的方法。

附图的简要说明

图1描述比较Sso7d(G)-ΔTaq与野生型融合蛋白Sso7d-ΔTaq的PCR反应的结果。最终PCR产物在1％琼脂糖凝胶上作分析以评估相对产量。

图2显示Sac7e(SEQ ID NO：10)和Sso7d(SEQ ID NO：9)的排列对比。共有肽＝SEQ ID NOS：11-14。

发明详述

定义

术语“Sso7”或“Sso7DNA结合域”或“Sso7样DNA结合域”指核酸和多肽的多态变体、等位基因、突变体和种间同源物：它们(1)具有的氨基酸序列与SEQID NO：2的Sso7序列氨基酸序列相同性大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸序列相同性，优选某区域有至少约15、25、35、50或更多氨基酸相同；(2)能结合抗体，例如针对含SEQ ID NO：2氨基酸序列的免疫原和其保守性修饰变体的多克隆抗体；(3)在严谨杂交的条件下能与SEQ ID NO：1的Sso7核酸序列和其保守性修饰变体特异性杂交；(4)具有的核酸序列与SEQ ID NO：1的核酸序列相同性大于约50％，优选大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选某区域有至少约50、100、150或更多核苷酸相同上；或(5)被能在严谨杂交条件下与引物组，如5’GCAACAGTAAAGTTCAAGTACAAAGG 3’(SEQ ID NO：15)(正向)和5’CTAACATTTGTAGTAGTTCTTTTGGAGCG 3’(SEQ ID NO：16)(反向)相同的序列特异性杂交的引物所扩增。该术语包括全长Sso7多肽和具有序列非特异性双链DNA结合活性的多肽的片段。

“结构域”指蛋白或蛋白复合体中的一个单元，该单元包括一多肽序列、一完整的多肽序列或多个有明确功能的单元的多肽序列。功能应理解为广义功能可以是配基结合、催化活性或对蛋白结构有稳定作用。

本文中关于2种核酸或多肽序列的术语“相同”指排列进行最大相应性对比时，2种序列中相同的残基，如用下节题为“根据同源性鉴定Sso7结构域”(Identification of Sso7 domains based on homology)所述的“序列比较算法”测量的那样。

“野生型Sso7”指天然产生的Sso7蛋白。“野生型Sso7氨基酸序列”指天然产生的氨基酸序列。

“Sso7聚合酶偶联物”指一种修饰的聚合酶，其包含与聚合酶结构域或聚合酶结构域的催化亚基相连接的至少1个Sso7 DNA结合域。“取代的Sso7聚合酶物”所指该偶联物中至少有1个表面位点的氨基酸残基被天然Sso7序列该位点中没有的氨基酸残基所取代。“Sso7聚合酶物”可包括多个Sso7结合域。

本文中关于本发明核酸修饰酶的“效率”指该酶在特定反应条件下行使其催化功能的能力。通常，本文定义的“效率”可由在特定反应条件下生成的产物量来表示。

本文中酶的“提高”指改进酶活性，即增加每单位酶每单位时间的产物量。

“融合”指通过共价键连接。

当用于指某蛋白质的部分时，“异源性”表示该蛋白质含有2个或多个在天然蛋白质中没有发现相同关系的结构域。这种蛋白如融合蛋白包含2个或多个来自不相关蛋白的结构域，因而产生了一种新的功能性蛋白质。

“连接”指本领域用于功能性连接蛋白质结构域的任何已知方法，包括但不限于有或没有中间结构域内含肽介导的融合、非共价结合和共价结合，包括二硫键结合；氢键结合；静电结合；构象结合，如抗体-抗原和生物素-抗生物素蛋白的结合所产生的重组融合物。

侧链体积小于色氨酸侧链体积的氨基酸残基，指侧链比色氨酸小的氨基酸残基。这种侧链一般体积小于约

“聚合酶”指能进行模板引导的核苷酸合成的酶。该术语涵盖具有聚合酶活性的全长多肽或某结构域。

“加工能力”指聚合酶保持结合于模板或底物并进行DNA合成的能力。加工能力可通过每次结合所发生的催化活动的数量来测量。

如本文所用，“热稳定性聚合酶”指能用DNA或RNA作为模板，通过在核苷酸链上加入核苷酸单位来催化多核苷酸合成，且在45℃以上温度时有最优活性的酶。

“栖热菌聚合酶”指从任何栖热菌属分离得到的家族ADNA聚合酶，包括但不限于栖热水生菌(Thermus aquaticus)、Thermus brockianus和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；从栖热菌属衍生获得的任何重组酶和其功能性衍生物，无论是通过遗传修饰或化学修饰或是本领域其它已知方法产生的。

术语“扩增反应”指任何增加靶核酸序列拷贝的体外方法。这种方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、DNA连接酶链式反应(参见美国专利4,683,195和4,682,202；《PCR操作：方法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications)(Innis等编辑，1990))，(LCR)、QBeta RNA复制酶和以RNA转录为基础(如TAS和3SR)的扩增反应，以及本领域技术人员已知的其它方法。

“扩增”指如果所有反应成分完整使溶液经历的条件足以扩增多核苷酸的步骤。扩增反应的组分包括例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常指靶核酸“是指数式”增加。然而，如本文所用，“扩增”也可指所选靶核酸序列数量呈线性增加，如用循环测序所获得的那样。

术语“扩增反应混合物”指含有用于扩增靶核酸的各种试剂的水溶液。这些试剂包括酶、水缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。根据上下文，该混合物可以是完整或不完整的扩增反应混合物。

“聚合酶链式反应”或“PCR”指以等比级数扩增靶双链DNA特定区段或亚序列的方法。PCR是本领域技术人员熟知的；参见例如美国专利4,683,195和4,682,202；《PCR操作：方法和应用指南》，Innis等编辑，1990。典型PCR反应条件一般包括二或三步循环。二步循环包括变性步骤，接着是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，接着是杂交步骤，然后是分别延伸步骤。

“长PCR”指扩增5kb或更长长度的DNA片段。长PCR通常用特别适合的聚合酶或聚合酶混合物进行(参见例如美国专利5,436,149和5,512,462)，与常规用于扩增较短产物的聚合酶不同。

“引物”指能与靶核酸上的某段序列杂交并用作核酸合成起始点的一种多核苷酸序列。引物可以是不同长度，通常长度不到50个核苷酸，例如长12-30个核苷酸。用于PCR的引物长度和序列可根据本领域技术人员已知原理设计，参见例如Innis等，同上。

“温度设定”指PCR或循环测序反应的变性、退火和/或延伸步骤的温度和时间长度。PCR或循环测序反应的温度一般由类似或相同的较短温度设定的10到60个重复组成；这些较短的设定通常各可确定为一种二步骤或三步骤循环。选择温度设定系根据本领域技术人员已知的各种考虑，参见例如Innis等，同上。在本文所述的长PCR反应中，获得5kb或更长的扩增产物所需的延伸时间比常规聚合酶混合物要少。

PCR的“敏感性”指扩增低浓度存在的靶核酸的能力。“低浓度”指核酸样品中待扩增的靶序列每微升有10⁴个，通常是10³、10²、10¹个或更低。

如本文所用，术语“聚合酶引物/模板结合特异性”指Sso7融合聚合酶区分正确匹配的引物/模板与错配的引物/模板的能力。在本文中，“提高聚合酶引物/模板结合特异性”指本发明的Sso7变异性融合聚合酶区分匹配的引物/模板的能力，比含SEQ ID NO：2的野生型Sso7聚合酶融合蛋白提高。

“模板”指一种双链多核苷酸序列，其包含待扩增的侧接有引物杂交位点的多核苷酸。因此，“靶模板”包括侧接有5’引物和3’引物杂交位点的的靶多核苷酸序列。

“改善的聚合酶”包括连接有聚合酶或聚合酶结构域的一种序列非特异性双链DNA结合域。“未改善的聚合酶”或“未修饰的聚合酶”是没有序列非特异性双链DNA结合域的聚合酶。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”本文可互换使用指一种氨基酸残基的聚合物。这些术语所应用的氨基酸聚合物中，有1个或多个氨基酸残基是对应天然产生氨基酸的人工化学模拟物，该术语也用于天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸以及作用方式类似于天然产生氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及后来经过修饰的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羟基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指基本化学结构，即结合氢的α碳、羧基、氨基和R基团与天然产生氨基酸相同的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲锍。这种类似物含有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然产生氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸一般化学结构，但作用方式类似于天然产生氨基酸的化合物。

本文中氨基酸可由它们通用的已知三字母符号表示或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母符号表示。同样，核苷酸可由它们普遍接受的单字母码表示。

“保守性修饰的变体”可用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，保守性修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸。由于遗传密码子的简并性，许多功能相同的核酸可编码一种给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在某密码子指定丙氨酸的每个位点，可将其密码子变成所述任一相应的密码子而不会改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，它们是保守性修饰变异的一种种类。本文编码某多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每个可能的沉默变异。技术人员知道可修饰核酸中的各密码子(除了甲硫氨酸通常只有一个密码子AUG和色氨酸通常只有一个密码子TGG)以产生功能相同的分子。因此，在各所述序列中指出了编码某多肽的核酸的各种沉默性变异。

关于氨基酸序列，技术人员知道可在核酸、肽、多肽或蛋白序列中进行单个取代、缺失或添加而改变、在编码序列中加入或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸，是一种“保守性修饰的变体”，其中这种改变导致某氨基酸被化学性质类似的氨基酸所取代。提供功能类似氨基酸的保守性取代表是本领域熟知的。这种保守性修饰的变体除外或不包括本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。

例如，可进行以下取代，其中脂肪族氨基酸(G、A、I、L或V)用该组的另一个成员取代。类似的，脂肪族极性-不带电基团的氨基酸如C、S、T、M、N或Q可用该另一个成员取代；碱性氨基酸残基如K、R或H可彼此取代。在一些实施方案中，含酸性侧链的氨基酸E或D可分别用其不带电的对应物Q或N取代；反之亦然。下列8组各包含彼此可保守性取代的其它示范氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)

(参见例如Creighton，《蛋白》(Proteins)(1984))。

引言

本发明提供的变异性Sso7聚合酶偶联物，与野生型Sso7融合聚合酶相比，表现出调整的加工能力和/或增加的特异性。这些聚合酶反应与未修饰的聚合酶或野生型Sso7融合聚合酶相比，通常更有效且产生更多产物。该变异性融合聚合酶包含有与Sso7结合域相连的聚合酶结构域。Sso7结合域包含的Sso7中表面位点的氨基酸被取代成在已知野生型Sso7中该位点所没有的氨基酸。

本领域技术人员知道可将能调节加工能力的取代引入某聚合酶的核酸结合域中，该聚合酶包含Sso7以外的一种异源性序列非特异性双链核酸结合域。例如，可将1种或多种取代引入某嵌合性聚合酶的DNA结合域的特定位点(如能与DNA相互作用的位点)中，该嵌合性聚合酶含有与该聚合酶结构域相融合的序列非特异性螺旋-发夹-螺旋(HhH)结合域(例如Pavlov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：13510-13515，2002)。

聚合酶

DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的。它们包括DNA依赖性聚合酶和RNA依赖性聚合酶如逆转录酶。已知至少有5个DNA依赖性DNA聚合酶家族，尽管大部分属于家族A、B和C。不同家族间的结构或序列相似性很小或没有。大部分家族A聚合酶是单链蛋白质，能含有多种酶功能，包括聚合酶、3’到5’核酸外切酶活性和5’到3’核酸外切酶活性。家族B聚合酶通常含有一种催化结构域，与聚合酶和3’到5’核酸外切酶活性以及辅助因子。家族C聚合酶一般是具有聚合作用和3’到5’核酸外切酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌(E.coli)中，发现了3种DNA聚合酶：DNA聚合酶I(家族A)、II(家族B)和III(家族C)。在真核细胞中，有3种不同的家族B聚合酶：DNA聚合酶α、δ和ε参与核复制，和家族A聚合酶，聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。

类似的，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II、III和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性和RNA依赖性。

在具体实施方案中，将Taq聚合酶结构域掺入到该融合蛋白中。在具体的聚合酶变体中如Δtaq它是标准Taq DNA聚合酶的遗传修饰形式，缺乏5’到3’核酸外切酶活性(Lawyer等，J Biol Chem 264：6427-6437(1989))，常用于构建本发明的融合的聚合酶。也可采用其它的家族A聚合酶，它们的作用类似于Taq，例如与Taq聚合酶有约90％相似性的Thermus brockianus聚合酶，以及黄色栖热菌(Thermus flavus)聚合酶和具有逆转录酶活性的嗜热栖热菌聚合酶。另外，嗜热性较差的聚合酶如来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的家族A聚合酶可能证明有用，嗜温聚合酶如大肠杆菌Pol I和其缺失衍生物也如此。

家族B聚合酶如火球菌聚合酶例如Pfu聚合酶，也可用作与取代的Sso7结构域相融合的聚合酶结构域。

可用本领域技术人员熟知的试验测定聚合酶的活性。例如，测定酶的加工活性如聚合酶活性，可通过测定反应如聚合酶链式反应中合成的核酸量而进行。测定酶的相对效率时可将采用含序列非特异性双链DNA结合域的聚合酶获得的产物量，与用正常聚合酶所得产物量作比较，这在下文和实施例中有更详细描述。

适用于本发明的聚合酶结构域可以是酶本身或催化结构域，例如Taq聚合酶或具有聚合酶活性的Taq结构域。催化结构域可包括额外的氨基酸和/或可以是含氨基酸取代、缺失或添加的变体，但仍保留酶活性。

Sso7蛋白

本发明的聚合酶包含在表面残基位点有氨基酸取代的Sso7多肽序列。Sso7d是一种小的(63个氨基酸，约7000kd MW)、碱性染色性蛋白质，来自嗜高热古细菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)。此蛋白富含赖氨酸-具有高温、酸和化学稳定性。它以序列非依赖性方式结合DNA，结合时在一些条件下能提高DNA的T_M高至40℃(McAfee等，Biochemistry34：10063-10077，1995)。通常认为，Sso7d和其同源物在升高温度时参与包装基因组DNA和稳定基因组DNA。该蛋白的序列列于SEQ ID NO：2。

已有几种已知的Sso7d样蛋白(也称为Sso7蛋白)，包括但不限于：Sso7a、Sso7b、Sso7d和Sso7e来自嗜高热古细菌嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)；Ssh7a和Ssh7b来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)。这些蛋白与Sso7d的相同性范围为78％-98％。其它用于本发明的Sso7结构域也可如下所述鉴定。

Sso7蛋白的表面残基位点可参比SEQ ID NO：2所列Sso7d序列来确定。表面残基是暴露于蛋白表面，能与DNA双螺旋碱基相互作用的残基。这些残基系通过Sso7d的结构研究所鉴定(参见例如Gao等，Nature Struct.Biol.5：782-786，1998)。SEQ ID NO：2的表面氨基酸Trp24、Val26、Met29、Ser31、Arg43和Ala45是表面残基，通常在本发明的融合性聚合酶中已被取代。应理解这种位点指定本身不表示本发明权利要求分子的氨基酸编号，但表示当将权利要求分子的序列与SEQID NO：2进行最大程度排列对比时权利要求分子中的残基。排列对比可用手工进行或利用下述比较算法。例如，取代的Sso7蛋白在SEQ ID NO：4中所列融合性聚合酶序列的N末端具有取代天然色氨酸残基的甘氨酸。此取代发生在SEQ IDNO：4的第29个氨基酸残基处。然而，参比SEQ ID NO：2，该取代发生在Trp24位点。根据所述排列对比，下列残基通常存在于野生型Sso7蛋白的表面位点：24-Trp；26-Val；29-Met；43-Arg和45-Ala。

排列对比Sso7蛋白Sac7e与SEQ ID NO：2和鉴定表面残基位点的例子见图2。用NCBI BLAST程序和默认参数获得对比结果(参见例如Altschul等，Nucl.AcidsRes.25：3389-3402，1997)。Sac7e与SEQ ID NO：2有80％的相同性。在图2中，没有显示位点1的Sso7d起始甲硫氨酸。因此，尽管Ala残基在图2中显示为Sso7d序列的第1个残基，但它对应于SEQ ID NO：2的位点2。如上所指出，Sso7d的表面残基位点24为Trp、位点26为Val、位点29为Met、位点31为Ser、位点43为Arg和位点45为Ala。当参比SEQ ID NO：2来确定时，Sac7e的相应表面残基是位点24为Trp(Sac7e序列中编号23的残基)；位点26为Val(Sac7e序列中编号25的残基)；位点29为Met(Sac7e序列编号28的残基)；位点31为Ser(Sac7e序列编号30的残基)；位点43为Arg(Sac7e序列编号41的残基)和位点45为Ala(Sac7e序列编号43的残基)。

由于这些残基的侧链能与小沟槽中的碱基直接相互作用，可利用将这些残基变成野生型氨基酸以外的残基来修改与DNA相互作用的强度，而不破坏Sso7结构域的结构、降低其热稳定性或大幅降低该结构域在本发明中发挥作用的能力。此外，一组表面残基Trp24、Val26、Met29和Ala45能与DNA螺旋扭结的位点相互作用。因此，可利用这些位点之一的突变来减少Sso7结构域对含扭结位点附近错配的DNA的亲和性。

表面残基可用多种氨基酸残基取代。通常，取代用的残基是任何其它天然产生Sso7蛋白中该位点所没有的残基。通常该取代残基占据的体积比天然序列中的氨基酸残基小。例如，色氨酸侧链占据了天然产生氨基酸的最大体积。因此，可用更小的氨基酸取代色氨酸，具体是这些残基是占据更少空间的残基如丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸。此外，通常应避免引入主要结构变化到多肽中的残基如脯氨酸或能引入这种变化的残基如半胱氨酸作为表面取代残基。

取代氨基酸时，也要考虑电荷和疏水性。Sso7d表面是高度碱性的，含2个精氨酸和14个赖氨酸。例如，需要选择中性或弱正电荷的氨基酸残基。将任何表面氨基酸变成强酸性的Glu或Asp，预计不能产生功能性蛋白质。

因此，表面残基通常用Ala、Gly、His、Iso、Leu、Met、Phe、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys或Val取代。此外，选择插入本发明融合性多肽以取代所需表面残基的氨基酸，常常是在天然产生的Sso7多肽该表面残基位点中没有的残基。

根据同源性鉴定其它Sso7结构域

用于本发明的其它适合Sso7DNA结合域可根据它们与Sso7d的序列同源性作鉴定。一般，本发明中可采用与已知的序列非特异性双链核酸结合蛋白有约60％氨基酸序列相同性，任选约70％、75、80、85、90或95-98％氨基酸序列相同性的结构域，比较窗口约为30个氨基酸，任选约50-70个氨基酸，或整个蛋白的全长。在比较窗口中，或在指定区域中比较并排列对比序列的最大对应性，如用下列序列比较算法之一或用手工排列对比和目视检查测量。对于本专利的目的，用BLAST默认参数确定氨基酸相同性百分比。

为了序列比较，通常一种序列作为参比序列，将测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如果需要，指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定另外的参数。序列比较算法以程序参数为基础随后计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分比。

比较窗口包括涉及连任何一种数目毗位点的区段，该毗连位点数目选自20-600，通常约50-200，更常约100-150，其中可在二序列最佳排列后将一序列与毗连位点数目相同的参比序列作比较。于排列比较序列的方法是本领域熟知的。例如可通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性排列算法、Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法、用计算机执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过手工排列和目视检查(参见例如《分子生物学的当前程序》(Current Protocols in MolecularBiology)(Ausubel等编辑.1995增刊))来进行序列的最佳排列对比。

适合测定序列相同性和序列相似性百分比的算法例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。进行BLAST分析的软件可通过生物技术信息国家中心公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括通过鉴定查询序列中长度为W的短字(short words)，与数据库序列中的相同长度字排列对比时，它们是否匹配或满足一些正域值分数T来首先鉴定高评分序列对(HSPs)。T称为邻近字的评分域值(Altschul等，同上)。这些初始邻近字的命中可作为种子，起动搜索以发现含有它们的更长HSPs。将字命中以2个方向沿着各序列延伸，直到累积排列对比评分可能增加。计算核苷酸序列的累积评分，采用参数M(匹配残基对的奖赏分；总是＞0)和N(错配残基对的罚分；总是＜0)。对于氨基酸序列，利用评分矩阵来计算累积评分。当：累积排列评分从其达到的最大值下降数量x时；由于累积了1个或多个负记分残基排列对比，或到达任一序列末端，该累积评分降到零或之下；各方向的字命中延伸暂停。BLAST算法参数W、T和X决定了排列对此的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认值的字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并比较2条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认值的字长为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))的默认值字长(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并比较2条链。

BLAST算法也进行2条序列间相似性的统计学分析(参见例如Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，它表示2条核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001时，认为测试核酸与参比序列相似。

根据对Sso7特异性抗体的交叉反应结合鉴定Sso7蛋白

用于本发明的Sso7 DNA蛋白也可通过交叉反应性鉴定，该鉴定采用的抗体优选能结合已知Sso7结合域多克隆抗体。多克隆抗体可用本领域普通技术人员熟知的方法产生(参见例如Coligan，《免疫学的当前操作》(Current Protocols inImmunology)(1991)；Harlow&Lane，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A LaboratoryManual)(1988))。这些蛋白是免疫交叉反应性结合蛋白，可通过多种试验方法检测。对于可使用的多种模式和条件的描述，参见例如《细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体》(Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology)，37卷(Asai编辑，1993)，Coligan，同上和Harlow&Lane，同上。

有用的免疫试验模式包括样品蛋白被固定于固体支持物上的试验。例如，交叉反应性结合蛋白可用免疫印迹分析，如蛋白质印迹鉴定。蛋白质印迹技术一般包括凝胶电泳根据分子量分离样品蛋白，将分离的蛋白转移至适当的固体支持物(如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生的尼龙滤膜)上，用能结合该序列非特异性双链核酸结合域的抗体孵育样品。该抗体能特异性结合固体支持物上交叉反应性多肽。该抗体可直接标记或随后另外用标记能特异性结合抗结合域抗体的的抗体(如标记的羊抗小鼠抗体)检测。其它免疫印迹试验如重组蛋白质文库分析也可用于鉴定适用于本发明的蛋白质。

在指定的免疫试验条件下用此方法，可能鉴定到免疫交叉反应性蛋白质，此蛋白能结合特定抗体，至少是背景的2倍或更高，通常是背景的10倍以上，同时基本上不显著结合样品中存在的其它蛋白。

竞争性结合模式的免疫试验也能用于确定交叉反应性。例如，产生针对已知的Sso7结构域如Sso7d的多克隆抗血清。然后可将靶抗原固定于固体支持物。在此试验中加入交叉反应性极小(如果存在)的非靶抗原可改进血清的选择性。将所加入蛋白与固定蛋白竞争与抗血清结合的能力，与Sso7蛋白本身的竞争能力相比较。采用标准算法计算出上述蛋白质的交叉反应性百分比。选择与加入蛋白交叉反应性小于10％的那些抗血清并合并。也可从合并的抗血清中去除与非靶抗原起交叉反应的抗体，方法是用非靶抗原作免疫吸收。用此方法也可制成能特异性结合本发明特定核酸结合域的抗体。

然后将免疫吸收和合并的抗血清用于上述竞争性结合免疫试验以比较第2种蛋白与免疫原蛋白，这第2种蛋白也许是已知Sso7结合域的等位基因、多态变体或同源物，例如另一种动物的同源物。为进行这种比较，分别测试广泛浓度范围的2种蛋白，确定各蛋白抑制抗血清与固定蛋白发生50％结合所需的量。如果抑制50％结合所需的第2种蛋白量比抑制50％结合所需的核酸结合域蛋白的量小10倍，则认为第2种蛋白能特异性结合产生的针对Sso7d免疫原的多克隆抗体。

该序列非特异性双链核酸结合域的活性可用多种上述试验评估，例如见WO0192501中所述。在本发明中，Sso7结构域至少有1个表面残基被取代。当其连接于聚合酶时，该取代的Sso7结构域表现出加工能力的调整和/或引物/模板结合特异性的增强。本发明的Sso7偶联聚合酶可用本领域熟知的试验鉴定，这些试验在本文中将进一步描述。

连接Sso7 DNA结合域与聚合酶

本发明偶联蛋白质的Sso7 DNA结合域和聚合酶结构域如Sso7d和Taq聚合酶，可用本领域技术人员熟知的方法相连接。这些方法包括化学和重组方法。

连接Sso7蛋白和聚合酶的化学方法描述见例如《生物偶联技术》(BioconjugateTechniques)，Hermanson编辑.，Academic Press(1996)。它们包括通过蛋白质化学领域熟知的方法例如衍生法使2种蛋白或直接或经接头化合物彼此连接。例如，在一个化学偶联实施方案中，连接催化结构域与核酸结合域的方法，包括采用异双功能-偶联试剂，此试剂最终能在两部分之间形成分子间二硫键。描述了用于在本发明此种能力的其它种类偶联试剂，例如美国专利4,545,985中所述。另外，各部分的天然产生或通过遗传工程插入的半胱氨酸之间易形成分子间二硫键。连接两部分的方法也可用异双功能交联试剂之间的硫醚键或特定低pH可切割的交联接头或特定蛋白酶可切割的接头或其它可切割或不能切割的连接键。

连接Sso7与该偶联蛋白的聚合酶结构域的方法也可包括在用标准肽合成化学或重组方法分别合成的两部分之间形成肽键，偶联蛋白质本身也可用化学方法产生，用于合成完整或部分氨基酸序列。例如，可用固相技术，如Merrifield的固相合成方法来合成肽，此方法中将氨基酸依次加到增长的氨基酸链上(参见Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2146)。自动合成多肽的设备可从供应商处购买到，如PE公司(Foster City，CA)，一般可根据厂商说明书操作。随后将合成的肽从树脂上切下来并纯化，如通过制备性高效液相层析纯化(参见Creighton，《蛋白结构和分子原理》(Proteins Structures and Molecular Principles)，50-60(1983))。合成多肽或多肽亚片段的组成可通过氨基酸分析或测序验证(例如埃德曼降解方法；参见Creighton，《蛋白结构和分子原理》，34-49页(1983))。

另外，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物引入该序列作为取代或添加残基。非经典氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基-脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和大体上的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。

在另一个实施方案中，Sso7和聚合酶结构域经一连接基团相连接。该连接基团可以是化学交联剂，包括例如琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。该连接基团也可以是其它氨基酸序列，包括例如聚丙氨酸、聚甘氨酸或类似的连接基团。

在一个特定实施方案中，该融合蛋白中各多肽的编码序列在其氨基-或羧基-末端直接经肽键以任何顺序连接。或者，可利用氨基酸接头序列将第1和第2种多肽成分分开足够的距离以确保各多肽能折叠成其二级和三级结构。将这种氨基酸接头序列加入该融合蛋白中，所用的标准技术是本领域熟知的。适当的肽接头序列可根据下列因素选择：(1)它们能采取可弯曲延伸的构象；(2)它们不会采取可能与第1和第2种多肽上的功能性抗原表位相互作用的二级结构；(3)缺乏可能与该多肽功能性抗原表位反应的疏水或带电残基。典型的肽接头序列包含Gly、Ser、Val和Thr残基。该接头序列中也可用其它近中性的氨基酸如Ala。可用作接头的氨基酸序列包括Maratea等(1985)Gene 40：39-46；Murphy等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262；美国专利号4,935,233和4,751,180中所示的序列。接头序列一般长1到约50个氨基酸，如长3、4、6或10个氨基酸，但可以是100或200个氨基酸长度。当第1和第2种多肽含有可用于分隔功能性结构域和防止空间位阻干扰的非必需N末端氨基酸区域时，可能不需要接头序列。

其它化学接头包括碳水化合物接头、脂类接头、脂肪酸接头、聚醚接头如PEG等。例如，聚(乙二醇)接头可获自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama。这些接头任选含有酰胺键、巯键或异双功能键。

其它连接Sso7和聚合酶结构域的方法包括通过表达的负电荷和正电荷尾部的离子结合，以及通过抗体和链霉亲和素-生物素相互作用的间接结合(参见例如《生物偶联技术》，同上)也可将结构域通过中间的相互作用序列连接在一起。例如，可将Sso7d-相互作用序列(即结合Sso7d的序列)连接于聚合酶。所得融合蛋白随后可能与Sso7d非共价结合产生Sso7d-聚合酶偶联物。

用重组技术产生融合蛋白

在一个典型实施方案中，本发明的偶联Sso7-聚合酶蛋白是通过重组表达编码该蛋白的核酸而产生的，此技术在本领域中是标准的实施技术。可通过本领域已知方法使编码所需氨基酸序列的适当核酸序列在合适的编码框中彼此连接，并表达产物来制备这种融合产物。

可用重组遗传学领域的常规技术获得待掺入本发明融合蛋白的结构域的编码核酸。说明本发明所用一般方法的基础课本包括Sambrook和Russel，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，(第3版，2001)；Kriegler，《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer and Expression：A LaboratoryManual)(1990)；《分子生物学的当前程序》(Ausubel等编辑.1994-1999)。

编码Sso7和聚合酶多肽的核酸序列可用多种方法之一获得。在一些实施方案中，编码该多肽的核酸序列可通过与探针杂交从cDNA和基因组DNA文库中克隆，或采用寡核苷酸引物进行扩增技术分离得到。利用DNA或RNA模板扩增技术更常用于扩增和分离Sso7和聚合酶序列，(参见例如Dieffenfach&Dveksler，《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A Laboratory Manual)(1995))。另外，可合成产生重叠的寡核苷酸并连接以产生1个或多个结构域。用抗体作为探针编码催化性或双链核酸结合域的核酸也可从表达文库中分离得到。

在一个用PCR获得编码Sso7或聚合酶结构域的核酸的例子中，用PCR扩增该核酸序列或亚序列，采用了含有一个限制性位点的有义引物和含有另一个限制性位点的反义引物。这会生成编码所需结构域序列或亚序列且含有末端限制性位点的核酸。然后不难将此核酸连入含编码第2个结构域的核酸和具有适当的相应限制性位点的核酸中，可将该结构域直接连接或可通过一接头或其它蛋白序列隔开。本领域技术人员可利用GenBank或其它来源提供的序列信息确定适当的PCR引物。也可将适当的限制性位点通过定点诱变加入编码该蛋白或蛋白亚序列的核酸中。将含该结构域编码核苷酸序列或亚序列的质粒用适当限制性核酸内切酶切割，然后连入合适的载体中用标准方法扩增和/或表达。

足以通过体外扩增方法指导技术人员的技术例子见Berger、Sambrook和Ausubel以及Mullis等，(1987)美国专利号4,683,202；《PCR操作：方法和应用指南》(Innis等编辑)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim&Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem.，35：1826；Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene 4：560；Barringer等(1990)Gene 89：117。

可将特定核酸表达的多肽的其它物理性质与Sso7多肽或聚合酶性质相比较，以提供另一种鉴定适当核酸的方法。

技术人员也知道可对Sso7和聚合酶结构域进行另外修饰而不减少其生物活性。可进行一些修饰以促进结构域的克隆、表达或掺入到融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员熟知的，包括例如在编码该结合域的多核苷酸两末端之一加入密码子，例如在氨基末端加入甲硫氨酸提供起始位点，或在两末端之一放置额外的氨基酸(如聚组氨酸)，产生容易定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。

也可修饰1个或多个结构域以促进2个结构域的联接，获得编码本发明融合多肽的多核苷酸。因此，通过这些方法修饰的Sso7和聚合酶结构域也是发明的一部分。例如，可将半胱氨酸残基的密码子置于结构域任一末端，使该结构域通过例如二硫键连接。可采用重组或化学方法进行这种修饰(参见例如Pierce化学公司目录，Rockford IL)。

该重组融合蛋白的Sso7和聚合酶结构域常通过接头结构域连接，常用的多肽序列包括如上所述的Gly、Ser、Ala和Val。在一些实施方案中，将脯氨酸残基掺入该接头以防止接头形成显著的二级结构元件。

在一些实施方案中，修饰编码本发明蛋白质的重组核酸以提供优选密码子，可提高此核酸在所选生物体中的翻译(例如将酵母优选密码子取代到编码核酸中，用于酵母中的表达)。

用于表达该融合多肽的表达盒和宿主细胞

有许多本领域普通技术人员已知的表达系统可产生该融合多肽(参见例如《基因表达系统》(Gene Expression Systems)，Fernandex和Hoeffler编辑，AcademicPress，1999；Sambrook&Russel，同上和Ausubel等，同上)。通常，将编码该融合多肽的多核苷酸置于在所需宿主细胞中有功能的启动子控制下。可购到极其多种的启动子，可用于本发明的表达载体中，这取决于具体应用。选择启动子一般取决于该启动子在宿主细胞中是否有活性。也可任选包括其它表达控制序列如核糖体结合位点、转录终止位点等。包括1种或多种这些控制序列的构建物称为“表达盒”。因此，可掺入编码该连接多肽的核酸以在所需宿主细胞中高水平表达。

适用于特定宿主细胞的表达控制序列常通过克隆可在该细胞中表达的基因来获得。本文定义的常用原核控制序列包括用于转录起始的启动子，任选含有操纵子，连同核糖体结合位点序列，包括常用启动子如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Change等，Nature(1977)198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，Nucleic Acids Res.(1980)8：4057)、tac启动子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)；λ-衍生的P_L启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等，Nature(1981)292：128)。具体的启动子系统对本发明不是关键，可采用任何在原核生物中能发挥功能的可买到的启动子。标准的细菌表达载体包括质粒如pBR322类质粒，例如pBLUESCRIPT^TM、pSKF、pET23D、λ-噬菌体衍生的载体，以及融合表达系统如GST和LacZ。也可在重组蛋白中加入抗原表位标记以提供方便的分离方法，如c-myc、HA-标记、6-His(SEQ ID NO：17)标记、麦芽糖结合蛋白、VSV-G标记、抗DYKDDDDK(SEQ ID NO：18)标记或任何这类标记，许多这些标记是本领域技术人员熟知的。

为在在大肠杆菌以外的原核细胞中表达融合多肽，需要在具体原核生物种类中能发挥功能的启动子。这种启动子可获自从这些种类生物克隆的基因，或可采用异源启动子。例如，除了大肠杆菌外，杂合trp-lac启动子在杆菌(Bacillus)中也能发挥功能。这些和其它适当的细菌启动子是本领域熟知的并在例如Sambrook等和Ausubel等文章中有所描述。用于表达本发明蛋白质的细菌表达系统可在例如大肠杆菌、芽胞杆菌属和沙门菌(Salmonella)中(Pavla等，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302：543-545(1983))得到。这种表达系统的试剂盒可商业购买到。

用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域熟知的且可商业购买到。在酵母中，载体包括酵母整合质粒(如Yip5)和酵母复制质粒(Yrp毓质粒)和pGPD-2。含有真核病毒调节元件的表达载体通常用于真核表达系统，例如SV40载体、乳突瘤病毒载体和获自EB病毒的载体。其它示范性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和任何其它能表达蛋白的载体，表达是在CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳房肿瘤病毒启动子、罗氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它显示对真核细胞中表达有效的启动子的指导下。

可将组成型或调节启动子用于本发明。调节启动子可能有优点，因为宿主细胞可在诱导该融合多肽表达前生长到高密度。在一些情况中，高水平表达异源蛋白会减缓细胞生长。可诱导性启动子是能指导基因表达的启动子，其中表达水平可因环境或发育因素而改变，例如温度、pH、厌氧或需氧条件、光、转录因子和化学物质。

对于大肠杆菌和其它细菌宿主细胞，可诱导性启动子是本领域技术人员已知的。它们包括例如lac启动子、噬菌体λP_L启动子、杂合trp-lac启动子(Amann等(1983)Gene 25：167；de Boer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21)、和噬菌体T7启动子(Studier等(1986)J.Mol.Biol.；Tabor等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：1074-8)。这些启动子和它们的凶Sambrook等，(同上)所述。

其它生物的可诱导性启动子也是本领域技术人员熟知的。它们包括例如金属硫蛋白启动子、热激启动子以及许多其它启动子。

可利用翻译偶联来提高表达。此策略采用短的上游开放读框和核糖体结合位点，开放读框衍生自该翻译系统的天然高表达基因，置于该启动子下游，而核糖体结合位点后几个氨基酸密码子之后跟随着终止密码子。就在终止密码子之前是第2个核糖体结合位点，终止密码子之后是翻译起始的启动密码子。该系统融合了RNA中的二级结构，可有效启动翻译。参见Squires等(1988)，J.Biol.Chem.263：16297-16302。

构成多核苷酸构建物一般需要使用能在细菌中复制的载体。这种载体是本领域普遍使用的。有许多的试剂盒可商业购买到，用于从细菌中纯化质粒(例如EasyPrepJ、FlexiPrepJ，产自Pharmacia Biotech；StrataCleanJ产自Stratagene；和QIAexpress表达系统，(Qiagen)。随后可进一步操作分离和纯化的质粒以产生其它质粒用于转化细胞。

该融合多肽可在细胞内表达，或可从细胞中分泌。胞内表达通常产量高。如果需要，可溶性的活性多肽的量可通过再重叠过程而增加(参见例如Sambrook等，同上；Marston等，Bio/Technology(1984)2：800；Schoner等，Bio/Technology(1985)3：151)。本发明的融合多肽可在多种宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母、多种高等真核细胞如COS、CHO和HeLa细胞系及骨髓瘤细胞系。宿主细胞可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞或微生物，例如酵母细胞、细菌细胞或真菌细胞。

一旦表达，该重组融合多肽可根据本领域的标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(一般参见R.Scopes，《蛋白纯化》(ProteinPurification)，Springer-Verlag，N.Y.(1982)，Deutscher，《酶学方法182卷：蛋白纯化指南》((Methods in Enzymology Vol.182：Guide to Protein Purification)，AcademicPress，Inc.N.Y.(1990))。优选至少约90-95％均一性的充分纯化组合物，最优选98-99％或更高均一性。一旦部分纯化后或达到所需的均一性，随后可使用此多肽(如作为免疫原用于产生抗体)。

为促进本发明融合蛋白的纯化，编码该融合多肽的核酸也可包含亲和结合试剂可利用的抗原表位或“标记”的编码序列。适当抗原表位的例子包括myc和V-5报告基因；用于重组产生含有这些抗原表位的融合多肽的表达载体可商业购买到(例如Invitrogen(Carlsbad CA)载体pcDNA3.1/Myc-His和pcDNA3.1/V5-His适于在哺乳动物细胞中表达)。适于将标记附着于本发明融合蛋白的其它表达载体和相应的检测系统是本领域技术人员已知的，一些可商业购买到(例如FLAG”(Kodak，Rochester NY)。另一个适当标记的例子是聚组氨酸序列，它能结合金属螯合亲和配基。通常，使用6个毗连的组氨酸，尽管可采用多于或小于6个。可用作聚组氨酸结合部分的适当金属螯合亲和配基，包括次氮基三乙酸(NTA)(Hochuli，E.(1990)“用金属螯合吸收剂纯化重组蛋白”(Purification of recombinant proteinswith metal chelating absorbents)，《遗传工程：原理和方法》(Genetic Enginerering：Principles and Methods)，J.K.Setlow编辑，Plenum Press，NY；可从Qiagen(SantaClarita，CA)商业购买到)。

将突变引入Sso7序列中

本发明的Sso7序列包含表面残基的取代。技术人员知道有许多产生这些改变或给定核酸序列变体的方法。这种熟知的方法包括定点诱变、利用简并寡核苷酸的PCR扩增、化学合成所需寡核苷酸(例如结合连接和/或克隆以产生大核酸)和其它熟知的技术。参见Giliman&Smith，Gene 8：81-97(1979)，Roberts等，Nature328：731-734(1987)和Sambrook，Innis和Ausubel(都同上)。

在一个产生本发明Sso7序列的例子中，用定点诱变使氨基酸残基取代表面残基。通过合成含突变的寡核苷酸引物取代该核酸序列。该引物能与Sso7核酸如SEQID NO：l杂交；扩增新序列。然后将含该突变的扩增产物连入表达载体中。

多肽序列最常如上改变，即通过改变对应的核酸序列和表达多肽。然而，多肽序列也可用商业购买的肽合成仪合成产生，用于产生所需多肽(参见Merrifield和Stewart&Young，同上)。

最后，评估该取代的Sso7序列，可采用如下所述的技术来鉴定该融合性聚合酶，是否显示出引物/模板识别特异性增加和/或加工能力相对于未修饰聚合酶有所增强。取代的融合蛋白的加工能力通常小于野生型Sso7融合聚合酶。

调节聚合酶活性

本发明的融合性聚合酶表现出活性调整，包括加工能力相对未修饰聚合酶增强和引物/模板结合特异性改进。这些活性可用本领域标准技术测量。

本发明的融合性聚合酶常表现出引物/模板特异性比含野生型Sso7序列如SEQ ID NO：2的融合性聚合酶有所增加。引物/模板特异性是酶区分匹配的引物/模板双螺旋与错配的引物/模板双螺旋的能力。例如可通过比较2种反应的相对产量，1种使用匹配引物，1种使用错配引物来测定特异性。区分能力增加的酶用匹配引物的产量高于用错配引物，即利用匹配引物的反应相对用错配引物的反应的产量比率约为1或以上。后能可将此比率采用含野生型Sso7结构域的融合性聚合酶的平行组的反应所得产量相比较。本发明的融合蛋白相对于野生型融合聚合酶显示该比率一般增加至少2倍，通常3倍或更高。

特异性也可用例如实时PCR测量，此PCR中可利用完全互补的引物/模板和错配引物/模板之间的Ct(循域)值(ΔC_t)差异来测量不同酶的引物/模板结合特异性。Ct值代表产生可检测量DNA所需的循环次数(‘可检测’的DNA量一般高于背景2X，通常5X、10X、100x或更高)。特异性提高的聚合酶能在较少循环次数中产生可检测的DNA量，更密切接近PCR的理论上最高扩增效率。

聚合酶的加工能力可用本领域普通技术人员已知的多种方法测量。聚合酶加工能力一般定义为在修饰酶的在一次结合中所能掺入匹配模板的核苷酸数量。例如，5’FAM-标记的引物退火结合环状或线性ssM13mp18DNA形成引导模板(primed template)。在测量加工能力时，引导模板常以显著超过存在的聚合酶摩尔量，从而最大程度减少了引导模板被聚合酶延伸1次以上的机会。然后在存在缓冲液和dNTPs时将该引导模板与聚合酶以比例如4000：1(引导的DNA：DNA聚合酶)混合。加入MgCl₂以启动DNA合成。启动后不同时间样品淬灭，在测序凝胶上分析。然后将本发明蛋白质，即含有与聚合酶催化结构域相融合的取代的Sso7核酸结合域的取代的融合聚合酶的加工能力，与无此结合域的酶(未修饰聚合酶)和含野生型Sso7序列的融合性聚合酶的加工能力相比较。本发明的取代的融合性聚合酶显示其加工能力，比未修饰的聚合酶有所增强，但通常加工能力比野生型Sso7融合性聚合酶减少。

效率的提高也可通过测量酶生成产物的能力增加来证明。这种分析通过测定反应所得产物的量，间接测量该双链核酸双螺旋的稳定性。例如，可用PCR试验测量所得PCR产物的量，用短的如12个核苷酸长度的引物，在提高的温度如50℃下退火。在此分析中，效率提高是通过在PCR反应中采用12个核苷酸的引物50℃退火当其连接于取代的Sso7d序列时相较未修饰聚合酶可产生更多产物的能力来显示。

可采用长PCR作为证明效率提高的另一种方法。例如，与相对效率更低的酶比较，效率提高的酶一般在较短延伸时间内能扩增长的扩增子(＞5kb)。

也可采用例如盐敏感性试验来证明本发明核酸修饰酶加工效率的改善。当聚合酶融合于本发明的Sso7序列时，表现出对高盐浓度的耐受性提高，即加工能力增加的加工酶可在较高盐浓度下产生更多产物。例如，可进行PCR分析来测定采用取代的Sso7融合性Taq聚合酶的反应中所得产物的量与未修饰的Taq聚合酶在高盐如80mM反应条件下的产物量作比较。

评估本发明改善的聚合酶效率提高的其它方法，可由本领域普通技术人员，采用给定修饰酶的标准酶活性试验来确定。

实施例

实施例1：突变Sso7-ΔTaq融合物的构建

采用连续PCR在SEQ ID NO：2所列野生型Sso7d-Δtaq的编码W24密码子处引入点突变。在第1轮PCR中，采用引物对M13R(5’GCGGATAACAATTTCACACAGG 3’；SEQ ID NO：19)和W24T(5’ATCTCCAAGATCAAGAAATAGNGCGTGTGGGCAAGATG 3’；SEQ ID NO：20)和引物对W24AEVG-B(5’CTACTTTCTTGATCTTGGAGAT 3’；SEQ ID NO：21)和1008R(5’GAGGGCTTTATAAGGCTCG 3’；SEQ ID NO：22)扩增pYW1的相应区域(参见PCT出版物WO 01/92501)。纯化第1次PCR的产物并在第2轮PCR中与引物M13R和1008R混合以产生400bp片段。将此片段用限制性酶EcoRI和BstXI消化并插入pYW1的相应位点中。引物W24-T包含5’末端位点23的简并核苷酸，从而最终的寡核苷酸将是此位点含G、T、A、C各25％的混合群。结果，密码子GNG编码该突变融合蛋白中以下的4种氨基酸之一，Gly(GGG)(SEQ IDNO：3，粗体且加下划线)；Val(GTG)(SEQ ID NO：5，粗体且加下划线)；Glu(GAG)(SEQ ID NO：7，粗体且加下划线)或Ala(GCG)。

实施例2：错配引物试验

根据结构研究(Gao等，Nature Struct.Biol.5：782-786，1998)，野生型Sso7d中的W24残基参与将碱基锚定在其不堆积位点。此实施例显示该位点的突变可导致该融合蛋白的引物-模板结合特异性增加。

采用2对引物评估PCR酶区分匹配引物与错配引物的能力。匹配引物57F(5’TCCGTTCTTCTTCGTCATAACT 3’；SEQ ID NO：23)与λDNA充分互补。错配引物57F5/6(5’TCCGCCCTTCTTCGTCATAACT 3’；SEQ ID NO：24)包含2个与λDNA模板不互补的碱基(在5’末端的位点5和6)。采用相同的匹配反向引物732R(5’CCTGACTGTTCGATATATTCACTC 3’；SEQ ID NO：25)与57F或57F5/6一起来产生657bp扩增子。所用循环程序是：94℃-1分钟，20轮(94℃-10秒，50-74℃-30秒，72℃-1分钟)，72℃-10分钟。定量测定PCR产物的最终产量，采用TE缓冲液配的PicoGreen稀释液(1∶200PicoGreen∶TE)和荧光平板读数器。对于各酶，进行2次PCR扩增，一次使用引物57F和732R，另一次使用引物57F5/6和732R。

酶区分错配引物与匹配引物的能力可通过比较2种反应的相对产量来测定。区分能力更高的酶用匹配引物的相对产量应高于用错配引物。表1显示在64℃退火温度下分析的结果。野生型融合蛋白对匹配与错配引物的区分能力最差。3种突变蛋白显示比野生型融合蛋白提高2.5-14倍。

表1.比较PCR中的匹配与错配区分

酶	产量比例 (匹配/错配)	相对于Sso7d-Δtaq
酶	产量比例 (匹配/错配)	相对于Sso7d-Δtaq	Taq	7.7	8.4x
Sso7d-Δtaq	0.92	1x	Taq	7.7	8.4x
Sso7d-Δtaq	0.92	1x	Sso7d(G)-Δtaq	3.3	3.6x
Sso7d(V)-Δtaq	2.3	2.5x	Sso7d(G)-Δtaq	3.3	3.6x
Sso7d(V)-Δtaq	2.3	2.5x	Sso7d(E)-Δtaq	12.8	14x

实施例3：野生型与突变融合蛋白的加工能力比较

由于Sso7d与dsDNA之间的结合相互作用对提高该融合蛋白加工能力很重要，引入突变可去除这种提高。采用加工能力测定试验(参见PCT出版物WO01/92501)来测量在Sso7d的残基W24处含突变的融合蛋白的加工能力，结果小结于表2中。3种突变蛋白中的2种即W24G和W24V与未修饰的蛋白Δtaq相比仍保持高2倍的加工能力。含W24E变化的突变蛋白显示与未修饰蛋白相同的加工能力。这些结果提示此位点的不同突变对融合蛋白的加工能力可能有不同作用。

表2.加工能力比较

酶	加工能力
酶	加工能力	ΔTaq	4-6个核苷酸
Taq	13-18个核苷酸	ΔTaq	4-6个核苷酸
Taq	13-18个核苷酸	Sso7d-ΔTaq	31-39个核苷酸
Sso7d(G)-ΔTaq	8-10个核苷酸	Sso7d-ΔTaq	31-39个核苷酸
Sso7d(G)-ΔTaq	8-10个核苷酸	Sso7d(V)-ΔTaq	7-11个核苷酸
Sso7d(E)-ΔTaq	4-6个核苷酸	Sso7d(V)-ΔTaq	7-11个核苷酸

实施例4：突变蛋白在PCR扩增后期循环中更有效

在PCR应用中将突变蛋白与野生型蛋白作比较。比较采用了2种标准，一种是qPCR应用中的域循环(Ct)值，它反映酶在扩增早期循环中的效率，另一种是PCR产物的最终产量，它反映酶在扩增后期循环中的效率。采用以SYBR green为基础的qPCR反应来扩增2种人基因组DNA的β-肌动蛋白扩增子BA481和BA203，。该反应包含最终浓度的1xSYBR Green I和2mM MgCl2。采用55.8℃-72.1℃的退火梯度。Ct值小结于表3中。野生型融合蛋白和Sso7d(G)融合蛋白获得很相似的Ct值，提示早期循环中2种酶之间的效率没有显著差异。

将最终PCR产物在1％琼脂糖凝胶上作分析以评估相对产量。如图1所示，使用突变蛋白Sso7d(G)-ΔTaq时BA481和BA203扩增子的最终产量均显著高于使用野生型融合蛋白时的产量，这与突变蛋白在扩增后期循环中更有效相一致。

表3.比较65℃退火温度时的Ct值

酶(10U/ml)	BA481	BA203
酶(10U/ml)	BA481	BA203	Sso7d-Δtaq	25	24.2
Sso7d(G)-Δtaq	25.8	23.7	Sso7d-Δtaq	25	24.2

理解本文所述实施例和实施方案仅用于阐述目的据此本领域技术人员可提出多种修饰和变化均包括在本专利申请的精神和范围及所附权利要求范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请的内容纳入供参考，用于各种目的。

Sso7d和Sso7d融合序列表

SEQ ID NO：1

ATGGCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAGGCGAAGAAAAAGAGGTAGACATCTCCAAGATCAAGAAAGT

ATGGCGTGTGGGCAAGATGATCTCCTTCACCTACGACGAGGGCGGTGGCAAGACCGGCCGTGGTGCGG

TAAGCGAAAAGGACGCGCCGAAGGAGCTGCTGCAGATGCTGGAGAAGCAGAAAAAG

SEQ ID NO：2

MATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELL

QMLEKQKK

SEQ ID NO：3编码Sso7d(G)-ΔTaq的DNA序列

ATGATTACGAATTCGAGCGCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAGGCGAAGAAAAAGAGGTAGACATCTC

CAAGATCAAGAAAGTA

CGTGTGGGCAAGATGATCTCCTTCACCTACGACGAGGGCGGTGGCAAGA

CCGGCCGTGGTGCGGTAAGCGAAAAGGACGCGCCGAAGGAGCTGCTGCAGATGCTGGAGAAGCAGAAA

AAGGGCGGCGGTGTCACTAGTCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTT

CGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGG

GGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTT

CTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCAT

GCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGG

AGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGG

CTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGC

CCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCG

AGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGG

GACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGG

CAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCC

TGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCC

AGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGA

TCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCATCGCCG

AGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCC

GGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGAT

GTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGG

TCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCC

TTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAGGAGGG

CAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGG

TGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGAC

CTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCA

GGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGG

AGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGG

CTCTCCGCCAAGGAGGGCATTGATGGCCGCGGCGGAGGCGGGCATCATCATCATCATCATTAATGAGA

TCT

SEQ ID NO：4融合蛋白Sso7d(G)-ΔTaq的氨基酸序列

粗体、加下划线的残基表示相对野生型Sso7d-ΔTaq的氨基酸取代

MITNSSATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQK

KGGGVTSPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGL

LAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGR

LEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSR

DQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHP

RTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLS

GDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQA

FIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAAD

LMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDW

LSAKEGIDGRGGGGHHHHHH

SEQ ID NO：5编码Sso7d(V)-ΔTaq的DNA序列

ATGATTACGAATTCGAGCGCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAGGCGAAGAAAAAGAGGTAGACATCTC

CAAGATCAAGAAAGTA

CGTGTGGGCAAGATGATCTCCTTCACCTACGACGAGGGCGGTGGCAAGA

CCGGCCGTGGTGCGGTAAGCGAAAAGGACGCGCCGAAGGAGCTGCTGCAGATGCTGGAGAAGCAGAAA

AAGGGCGGCGGTGTCACTAGTCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTT

CGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGG

GGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTT

CTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCAT

GCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGG

AGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGG

CTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGC

CCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCG

AGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGG

GACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGG

CAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCC

TGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCC

AGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGA

TCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCATCGCCG

AGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCC

GGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGAT

GTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGG

TCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCC

TTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAGGAGGG

CAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGG

TGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGAC

CTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCA

GGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGG

AGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGG

CTCTCCGCCAAGGAGGGCATTGATGGCCGCGGCGGAGGCGGGCATCATCATCATCATCATTAATGAGA

TCT

SEQ ID NO：6融合蛋白Sso7d(V)-ΔTaq的氨基酸序列

MITNSSATVKFKYKGEEKEVDISKIKKV

RVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQK

KGGGVTSPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGL

LAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGR

LEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSR

DQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHP

RTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLS

GDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQA

FIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAAD

LMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDW

LSAKEGIDGRGGGGHHHHHH

SEQ ID NO：7编码Sso7d(E)-ΔTaq的DNA序列

ATGATTACGAATTCGAGCGCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAGGCGAAGAAAAAGAGGTAGACATCTC

CAAGATCAAGAAAGTACGTGTGGGCAAGATGATCTCCTTCAC CTACGACGAGGGCGGTGGCAAGA

CCGGCCGTGGTGCGGTAAGCGAAAAGGACGCGCCGAAGGAGCTGCTGCAGATGCTGGAGAAGCAGAAA

AAGGGCGGCGGTGTCACTAGTCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTT

CGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGG

GGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTT

CTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCAT

GCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGG

AGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGG

CTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGC

CCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCG

AGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGG

GACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGG

CAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCC

TGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCC

AGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGA

TCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCATCGCCG

AGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCC

GGGGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGAT

GTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGG

TCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCC

TTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAGGAGGG

CAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGG

TGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGAC

CTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCA

GGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGG

AGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGG

CTCTCCGCCAAGGAGGGCATTGATGGCCGCGGCGGAGGCGGGCATCATCATCATCATCATTAATGAGA

TCT

SEQ ID NO：8融合蛋白Sso7d(E)-ΔTaq的氨基酸序列

MITNSSATVKFKYKGEEKEVDISKIKKV

RVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQK

KGGGVTSPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGL

LAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGR

LEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSR

DQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHP

RTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLS

GDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQA

FIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAAD

LMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDW

LSAKEGIDGRGGGGHHHHHH

序列表

<110>王焱(Wang，Yan)

MJ生物工程股份有限公司(MJ Bioworks，Inc.)

<120>改善的SSO-7聚合酶偶联蛋白质

<130>020130-001200PC

<140>未知

<141>未知

<150>US 10/280,139

<151>2002-10-23

<160>25

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>192

<212>DNA

<213>硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)

<220>

<223>Sso7d蛋白

<400>1

atggcaaccg taaagttcaa gtacaaaggc gaagaaaaag aggtagacat ctccaagatc 60

aagaaagtat ggcgtgtggg caagatgatc tccttcacct acgacgaggg cggtggcaag 120

accggccgtg gtgcggtaag cgaaaaggac gcgccgaagg agctgctgca gatgctggag 180

aagcagaaaa ag 192

<210>2

<211>64

<212>PRT

<213>硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)

<220>

<223>Sso7d蛋白

<400>2

Met Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210>3

<211>1907

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d(G)-ΔTaq取代的融合聚合酶

<400>3

atgattacga attcgagcgc aaccgtaaag ttcaagtaca aaggcgaaga aaaagaggta 60

gacatctcca agatcaagaa agtagggcgt gtgggcaaga tgatctcctt cacctacgac 120

gagggcggtg gcaagaccgg ccgtggtgcg gtaagcgaaa aggacgcgcc gaaggagctg 180

ctgcagatgc tggagaagca gaaaaagggc ggcggtgtca ctagtcccaa ggccctggag 240

gaggccccct ggcccccgcc ggaaggggcc ttcgtgggct ttgtgctttc ccgcaaggag 300

cccatgtggg ccgatcttct ggccctggcc gccgccaggg ggggccgggt ccaccgggcc 360

cccgagcctt ataaagccct cagggacctg aaggaggcgc gggggcttct cgccaaagac 420

ctgagcgttc tggccctgag ggaaggcctt ggcctcccgc ccggcgacga ccccatgctc 480

ctcgcctacc tcctggaccc ttccaacacc acccccgagg gggtggcccg gcgctacggc 540

ggggagtgga cggaggaggc gggggagcgg gccgcccttt ccgagaggct cttcgccaac 600

ctgtggggga ggcttgaggg ggaggagagg ctcctttggc tttaccggga ggtggagagg 660

cccctttccg ctgtcctggc ccacatggag gccacggggg tgcgcctgga cgtggcctat 720

ctcagggcct tgtccctgga ggtggccgag gagatcgccc gcctcgaggc cgaggtcttc 780

cgcctggccg gccacccctt caacctcaac tcccgggacc agctggaaag ggtcctcttt 840

gacgagctag ggcttcccgc catcggcaag acggagaaga ccggcaagcg ctccaccagc 900

gccgccgtcc tggaggccct ccgcgaggcc caccccatcg tggagaagat cctgcagtac 960

cgggagctca ccaagctgaa gagcacctac attgacccct tgccggacct catccacccc 1020

aggacgggcc gcctccacac ccgcttcaac cagacggcca cggccacggg caggctaagt 1080

agctccgatc ccaacctcca gaacatcccc gtccgcaccc cgcttgggca gaggatccgc 1140

cgggccttca tcgccgagga ggggtggcta ttggtggccc tggactatag ccagatagag 1200

ctcagggtgc tggcccacct ctccggcgac gagaacctga tccgggtctt ccaggagggg 1260

cgggacatcc acacggagac cgccagctgg atgttcggcg tcccccggga ggccgtggac 1320

cccctgatgc gccgggcggc caagaccatc aacttcgggg tcctctacgg catgtcggcc 1380

caccgcctct cccaggagct agccatccct tacgaggagg cccaggcctt cattgagcgc 1440

tactttcaga gcttccccaa ggtgcgggcc tggattgaga agaccctgga ggagggcagg 1500

aggcgggggt acgtggagac cctcttcggc cgccgccgct acgtgccaga cctagaggcc 1560

cgggtgaaga gcgtgcggga ggcggccgag cgcatggcct tcaacatgcc cgtccagggc 1620

accgccgccg acctcatgaa gctggctatg gtgaagctct tccccaggct ggaggaaatg 1680

ggggccagga tgctccttca ggtccacgac gagctggtcc tcgaggcccc aaaagagagg 1740

gcggaggccg tggcccggct ggccaaggag gtcatggagg gggtgtatcc cctggccgtg 1800

cccctggagg tggaggtggg gataggggag gactggctct ccgccaagga gggcattgat 1860

ggccgcggcg gaggcgggca tcatcatcat catcattaat gagatct 1907

<210>4

<211>632

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d(G)-ΔTaq取代的融合聚合酶蛋白

<400>4

Met Ile Thr Asn Ser Ser Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu

1 5 10 15

Glu Lys Glu Val Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Gly Arg Val Gly

20 25 30

Lys Met Ile Ser Phe Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg

35 40 45

Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu

50 55 60

Glu Lys Gln Lys Lys Gly Gly Gly Val Thr Ser Pro Lys Ala Leu Glu

65 70 75 80

Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu

85 90 95

Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala

100 105 110

Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg

115 120 125

Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu

130 135 140

Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala

165 170 175

Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala

180 185 190

Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu

195 200 205

Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala

210 215 220

Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr

225 230 235 240

Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu

245 250 255

Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg

260 265 270

Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile

275 280 285

Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu

290 295 300

Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr

305 310 315 320

Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp

325 330 335

Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr

340 345 350

Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn

355 360 365

Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile

370 375 380

Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu

385 390 395 400

Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val

405 410 415

Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe

420 425 430

Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys

435 440 445

Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser

450 455 460

Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg

465 470 475 480

Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu

485 490 495

Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg

500 505 510

Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala

515 520 525

Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp

530 535 540

Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met

545 550 555 560

Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala

565 570 575

Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met

580 585 590

Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile

595 600 605

Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu Gly Ile Asp Gly Arg Gly Gly

610 615 620

Gly Gly His His His His His His

625 630

<210>5

<211>1907

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d(V)-ΔTaq取代的融合聚合酶

<400>5

atgattacga attcgagcgc aaccgtaaag ttcaagtaca aaggcgaaga aaaagaggta 60

gacatctcca agatcaagaa agtagtgcgt gtgggcaaga tgatctcctt cacctacgac 120

gagggcggtg gcaagaccgg ccgtggtgcg gtaagcgaaa aggacgcgcc gaaggagctg 180

ctgcagatgc tggagaagca gaaaaagggc ggcggtgtca ctagtcccaa ggccctggag 240

gaggccccct ggcccccgcc ggaaggggcc ttcgtgggct ttgtgctttc ccgcaaggag 300

cccatgtggg ccgatcttct ggccctggcc gccgccaggg ggggccgggt ccaccgggcc 360

cccgagcctt ataaagccct cagggacctg aaggaggcgc gggggcttct cgccaaagac 420

ctgagcgttc tggccctgag ggaaggcctt ggcctcccgc ccggcgacga ccccatgctc 480

ctcgcctacc tcctggaccc ttccaacacc acccccgagg gggtggcccg gcgctacggc 540

ggggagtgga cggaggaggc gggggagcgg gccgcccttt ccgagaggct cttcgccaac 600

ctgtggggga ggcttgaggg ggaggagagg ctcctttggc tttaccggga ggtggagagg 660

cccctttccg ctgtcctggc ccacatggag gccacggggg tgcgcctgga cgtggcctat 720

ctcagggcct tgtccctgga ggtggccgag gagatcgccc gcctcgaggc cgaggtcttc 780

cgcctggccg gccacccctt caacctcaac tcccgggacc agctggaaag ggtcctcttt 840

gacgagctag ggcttcccgc catcggcaag acggagaaga ccggcaagcg ctccaccagc 900

gccgccgtcc tggaggccct ccgcgaggcc caccccatcg tggagaagat cctgcagtac 960

cgggagctca ccaagctgaa gagcacctac attgacccct tgccggacct catccacccc 1020

aggacgggcc gcctccacac ccgcttcaac cagacggcca cggccacggg caggctaagt 1080

agctccgatc ccaacctcca gaacatcccc gtccgcaccc cgcttgggca gaggatccgc 1140

cgggccttca tcgccgagga ggggtggcta ttggtggccc tggactatag ccagatagag 1200

ctcagggtgc tggcccacct ctccggcgac gagaacctga tccgggtctt ccaggagggg 1260

cgggacatcc acacggagac cgccagctgg atgttcggcg tcccccggga ggccgtggac 1320

cccctgatgc gccgggcggc caagaccatc aacttcgggg tcctctacgg catgtcggcc 1380

caccgcctct cccaggagct agccatccct tacgaggagg cccaggcctt cattgagcgc 1440

tactttcaga gcttccccaa ggtgcgggcc tggattgaga agaccctgga ggagggcagg 1500

aggcgggggt acgtggagac cctcttcggc cgccgccgct acgtgccaga cctagaggcc 1560

cgggtgaaga gcgtgcggga ggcggccgag cgcatggcct tcaacatgcc cgtccagggc 1620

accgccgccg acctcatgaa gctggctatg gtgaagctct tccccaggct ggaggaaatg 1680

ggggccagga tgctccttca ggtccacgac gagctggtcc tcgaggcccc aaaagagagg 1740

gcggaggccg tggcccggct ggccaaggag gtcatggagg gggtgtatcc cctggccgtg 1800

cccctggagg tggaggtggg gataggggag gactggctct ccgccaagga gggcattgat 1860

ggccgcggcg gaggcgggca tcatcatcat catcattaat gagatct 1907

<210>6

<211>632

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d(V)-ΔTaq取代的融合聚合酶蛋白

<400>6

Met Ile Thr Asn Ser Ser Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu

1 5 10 15

Glu Lys Glu Val Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Val Arg Val Gly

20 25 30

Lys Met Ile Ser Phe Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg

35 40 45

Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu

50 55 60

Glu Lys Gln Lys Lys Gly Gly Gly Val Thr Ser Pro Lys Ala Leu Glu

65 70 75 80

Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu

85 90 95

Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala

100 105 110

Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg

115 120 125

Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu

130 135 140

Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala

165 170 175

Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala

180 185 190

Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu

195 200 205

Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala

210 215 220

Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr

225 230 235 240

Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu

245 250 255

Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg

260 265 270

Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile

275 280 285

Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu

290 295 300

Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr

305 310 315 320

Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp

325 330 335

Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr

340 345 350

Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn

355 360 365

Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile

370 375 380

Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu

385 390 395 400

Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val

405 410 415

Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe

420 425 430

Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys

435 440 445

Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser

450 455 460

Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg

465 470 475 480

Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu

485 490 495

Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg

500 505 510

Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala

515 520 525

Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp

530 535 540

Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met

545 550 555 560

Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala

565 570 575

Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met

580 585 590

Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile

595 600 605

Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu Gly Ile Asp Gly Arg Gly Gly

610 615 620

Gly Gly His His His His His His

625 630

<210>7

<211>1907

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d(E)-ΔTaq取代的融合聚合酶

<400>7

atgattacga attcgagcgc aaccgtaaag ttcaagtaca aaggcgaaga aaaagaggta 60

gacatctcca agatcaagaa agtagagcgt gtgggcaaga tgatctcctt cacctacgac 120

gagggcggtg gcaagaccgg ccgtggtgcg gtaagcgaaa aggacgcgcc gaaggagctg 180

ctgcagatgc tggagaagca gaaaaagggc ggcggtgtca ctagtcccaa ggccctggag 240

gaggccccct ggcccccgcc ggaaggggcc ttcgtgggct ttgtgctttc ccgcaaggag 300

cccatgtggg ccgatcttct ggccctggcc gccgccaggg ggggccgggt ccaccgggcc 360

cccgagcctt ataaagccct cagggacctg aaggaggcgc gggggcttct cgccaaagac 420

ctgagcgttc tggccctgag ggaaggcctt ggcctcccgc ccggcgacga ccccatgctc 480

ctcgcctacc tcctggaccc ttccaacacc acccccgagg gggtggcccg gcgctacggc 540

ggggagtgga cggaggaggc gggggagcgg gccgcccttt ccgagaggct cttcgccaac 600

ctgtggggga ggcttgaggg ggaggagagg ctcctttggc tttaccggga ggtggagagg 660

cccctttccg ctgtcctggc ccacatggag gccacggggg tgcgcctgga cgtggcctat 720

ctcagggcct tgtccctgga ggtggccgag gagatcgccc gcctcgaggc cgaggtcttc 780

cgcctggccg gccacccctt caacctcaac tcccgggacc agctggaaag ggtcctcttt 840

gacgagctag ggcttcccgc catcggcaag acggagaaga ccggcaagcg ctccaccagc 900

gccgccgtcc tggaggccct ccgcgaggcc caccccatcg tggagaagat cctgcagtac 960

cgggagctca ccaagctgaa gagcacctac attgacccct tgccggacct catccacccc 1020

aggacgggcc gcctccacac ccgcttcaac cagacggcca cggccacggg caggctaagt 1080

agctccgatc ccaacctcca gaacatcccc gtccgcaccc cgcttgggca gaggatccgc 1140

cgggccttca tcgccgagga ggggtggcta ttggtggccc tggactatag ccagatagag 1200

ctcagggtgc tggcccacct ctccggcgac gagaacctga tccgggtctt ccaggagggg 1260

cgggacatcc acacggagac cgccagctgg atgttcggcg tcccccggga ggccgtggac 1320

cccctgatgc gccgggcggc caagaccatc aacttcgggg tcctctacgg catgtcggcc 1380

caccgcctct cccaggagct agccatccct tacgaggagg cccaggcctt cattgagcgc 1440

tactttcaga gcttccccaa ggtgcgggcc tggattgaga agaccctgga ggagggcagg 1500

aggcgggggt acgtggagac cctcttcggc cgccgccgct acgtgccaga cctagaggcc 1560

cgggtgaaga gcgtgcggga ggcggccgag cgcatggcct tcaacatgcc cgtccagggc 1620

accgccgccg acctcatgaa gctggctatg gtgaagctct tccccaggct ggaggaaatg 1680

ggggccagga tgctccttca ggtccacgac gagctggtcc tcgaggcccc aaaagagagg 1740

gcggaggccg tggcccggct ggccaaggag gtcatggagg gggtgtatcc cctggccgtg 1800

cccctggagg tggaggtggg gataggggag gactggctct ccgccaagga gggcattgat 1860

ggccgcggcg gaggcgggca tcatcatcat catcattaat gagatct 1907

<210>8

<211>632

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d(E)-ΔTaq取代的融合聚合酶蛋白

<400>8

Met Ile Thr Asn Ser Ser Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu

1 5 10 15

Glu Lys Glu Val Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Glu Arg Val Gly

20 25 30

Lys Met Ile Ser Phe Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg

35 40 45

Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu

50 55 60

Glu Lys Gln Lys Lys Gly Gly Gly Val Thr Ser Pro Lys Ala Leu Glu

65 70 75 80

Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu

85 90 95

Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala

100 105 110

Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg

115 120 125

Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu

130 135 140

Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala

165 170 175

Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala

180 185 190

Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu

195 200 205

Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala

210 215 220

Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr

225 230 235 240

Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu

245 250 255

Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg

260 265 270

Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile

275 280 285

Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu

290 295 300

Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr

305 310 315 320

Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp

325 330 335

Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr

340 345 350

Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn

355 360 365

Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile

370 375 380

Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu

385 390 395 400

Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val

405 410 415

Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe

420 425 430

Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys

435 440 445

Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser

450 455 460

Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg

465 470 475 480

Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu

485 490 495

Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg

500 505 510

Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala

515 520 525

Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp

530 535 540

Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met

545 550 555 560

Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala

565 570 575

Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met

580 585 590

Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile

595 600 605

Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu Gly Ile Asp Gly Arg Gly Gly

610 615 620

Gly Gly His His His His His His

625 630

<210>9

<211>63

<212>PRT

<213>硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)

<220>

<223>未显示起始甲硫氨酸的Sso7d

<400>9

Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Ile

1 5 10 15

Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe Thr

20 25 30

Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys

35 40 45

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210>10

<211>64

<212>PRT

<213>噬酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)

<220>

<223>Sso7d样蛋白Sac7e

<400>10

Ala Lys Val Arg Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr

1 5 10 15

Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Val Ser Phe Thr

20 25 30

Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp

35 40 45

Ala Pro Lys Glu Leu Met Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Lys Lys Lys

50 55 60

<210>11

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d和Sac7e排列对比共有肽

<400>11

Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10

<210>12

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d和Sac7e排列对比共有肽

<400>12

Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met

1 5 10

<210>13

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d和Sac7e排列对比共有肽

<400>13

Ser Phe Thr Tyr Asp

1 5

<210>14

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Sso7d和Sac7e排列对比共有肽

<400>14

Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp Ala Pro

1 5 10 15

Lys Glu Leu

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：正向扩增引物

<400>15

gcaacagtaa agttcaagta caaagg 26

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反向扩增引物

<400>16

ctaacatttg tagtagttct tttggagcg 29

<210>17

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：6-His的表位标记

<400>17

His His His His His His

1 5

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：抗-DYKDDDDK的表位标记

<400>18

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：顺序PCR第1轮扩增引物M13R

<400>19

gcggataaca atttcacaca gg 22

<210>20

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：顺序PCR第1轮扩增引物W24T

<220>

<221>modified_base

<222>(23)

<223>n＝g、a、c或t

<400>20

atctccaaga tcaagaaagt agngcgtgtg ggcaagatg 39

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：顺序PCR第1轮扩增引物W24AEVG-B

<400>21

ctactttctt gatcttggag at 22

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：顺序PCR第1轮扩增引物1008R

<400>22

gagggcttta taaggctcg 19

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：匹配的引物57F

<400>23

tccgttcttc ttcgtcataa ct 22

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：匹配的引物57F5/6

<400>24

tccgcccttc ttcgtcataa ct 22

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：匹配的反向引物732R

<400>25

cctgactgtt cgatatattc actc 24

Claims

1.一种Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，该偶联蛋白质包含与连接于聚合酶结构域的SEQ ID NO：2相同性至少为60％的Sso7结构域，在此Sso7结构域中通过参比SEQ ID NO：2所确定的某表面残基位点的氨基酸用不同氨基酸置换；

其中该表面残基的置换导致其加工能力低于野生型Sso7-聚合酶融合物的加工能力但高于未融合Sso7d结构域时该聚合酶结构域的加工能力。

2.如权利要求1所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述表面残基位点选自位点24的色氨酸残基、位点26的缬氨酸残基、位点29的甲硫氨酸残基。

3.如权利要求2所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述表面残基位点是位点24的色氨酸残基，置换的氨基酸残基是除了Asp、Glu、Arg、Lys或Pro的此外任何氨基酸。

4.如权利要求3所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述置换的氨基酸残基选自甘氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

5.如权利要求4所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述置换的氨基酸残基是甘氨酸。

6.如权利要求4所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述氨基酸残基是缬氨酸。

7.如权利要求1、2、3、4、5或6所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域具有热稳定聚合酶活性。

8.如权利要求7所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。

9.如权利要求8所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域是ΔTaq聚合酶结构域。

10.如权利要求7所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域是聚合酶B家族成员。

11.如权利要求10所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域是火球菌聚合酶结构域。

12.如权利要求1所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述Sso7结构域包含SEQ ID NO：2，其中某表面残基位点的氨基酸被不同的氨基酸置换。

13.如权利要求1所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，Sso7结构域包含SEQ ID NO：2，其中位点24的色氨酸残基被选自甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的氨基酸残基置换。

14.如权利要求1所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，与含SEQ ID NO：2的Sso7聚合酶融合蛋白相比，该表面残基的置换增加了该聚合酶的引物/模板结合特异性。

15.如权利要求14所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述表面残基位点选自位点24的色氨酸残基、位点26的缬氨酸残基和位点29的甲硫氨酸残基。

16.如权利要求15所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，所述表面残基位点是位点24的色氨酸残基，所述置换氨基酸残基是除了Asp、Glu、Arg、Lys或Pro以外的任何氨基酸。

17.如权利要求16所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述置换氨基酸残基选自甘氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

18.如权利要求17所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述置换氨基酸残基是甘氨酸。

19.如权利要求17所述的Sso7聚合酶偶联蛋白质，其特征在于，其中的氨基酸残基是缬氨酸。

20.如权利要求14、15、16、17、18或19中任一项所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域具有热稳定聚合酶活性。

21.如权利要求20所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。

22.如权利要求21所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，所述聚合酶结构域是ΔTaq聚合酶结构域。

23.如权利要求14所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，Sso7结构域包含SEQ ID NO：2，其中某表面残基位点的氨基酸被不同的氨基酸置换。

24.如权利要求14所述的Sso7聚合酶蛋白，其特征在于，Sso7结构域包含SEQ ID NO：2，其中位点24的色氨酸残基被选自甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的氨基酸残基置换。

25.一种调节溶液中存在的靶核酸上的聚合酶反应的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)使该靶核酸接触Sso7聚合酶蛋白，此偶联蛋白质包含与连接于聚合酶结构域的SEQ ID NO：2相同性至少为60％的Sso7结构域，在此Sso7结构域中通过参比SEQ ID NO：2所确定的某表面残基位点的氨基酸被野生型Sso7蛋白该表面残基位点没有的氨基酸残基置换；其中该表面残基的置换导致其加工能力高于未融合Sso7结构域的该聚合酶结构域的加工能力；

其中所述溶液是能使该结合域结合靶核酸和使该聚合酶结构域可延伸与靶核酸序列杂交的引物的组合物。

(b)在聚合酶可延伸该引物的条件下孵育此溶液。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，与含SEQ ID NO：2的Sso7聚合酶融合蛋白质相比，所述表面残基的置换增加了该聚合酶的引物/模板结合特异性。

27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述表面残基选自位点24的色氨酸残基、位点26的缬氨酸残基和位点29的甲硫氨酸残基。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述表面残基是位点24的色氨酸残基，所述置换残基是中性或带正电荷残基，其侧链体积小于色氨酸侧链体积。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述氨基酸残基选自甘氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述氨基酸残基是甘氨酸。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述氨基酸残基是缬氨酸。

32.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述聚合酶结构域具有热稳定聚合酶活性。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述聚合酶结构域是家族B聚合酶结构域。

35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述聚合酶结构域是ΔTaq聚合酶结构域。

36.如权利要求25所述的方法，其特征在于，Sso7结构域包含SEQ ID NO：2，其中位点24的色氨酸残基被选自甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的氨基酸残基置换。