CN112375807A - 一种随机打断dna的方法 - Google Patents
一种随机打断dna的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112375807A CN112375807A CN202011289430.1A CN202011289430A CN112375807A CN 112375807 A CN112375807 A CN 112375807A CN 202011289430 A CN202011289430 A CN 202011289430A CN 112375807 A CN112375807 A CN 112375807A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- concentration
- random
- library
- dnase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 19
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 13
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 11
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims description 10
- 101100116999 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) sso7d gene Proteins 0.000 claims description 9
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 4
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 7
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 5
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- -1 10mU DNaseI Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001443980 Oplophoridae Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000172776 Ranunculus sieboldii Species 0.000 description 1
- 101000844752 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) DNA-binding protein 7d Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种随机打断DNA的方法，其包括：在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。通过本发明的方法能够有效提高二代测序文库构建的效率。
Description
本案是申请日为2017年12月30日，发明名称为一种随机打断DNA的方法，申请号为201711486034.6的案件的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种随机打断DNA的方法。
背景技术
随着高通量测序(NGS)技术的发展与成熟，在科研、诊断、体检各市场领域应用范围不断扩大。除了市场的扩大之外，测序技术本身开发放慢速度，制约技术扩大应用的瓶颈渐渐显露出来。如今，样品制备在NGS中的瓶颈效应越来越明显，新试剂、新仪器不断涌现，以缩短时间，提高通量。同时，新方法也在不断开发，以处理更少的样本起始量等。
目前，常用的染色体脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，简称DNA)分子片段化方法主要有四种，分别为：DNA限制性酶切法，水动力剪切法，超声波断裂法，喷射雾化法，每种方法各有利弊。对长链DNA(通常指生物染色体DNA)片段化的主要原因是短的DNA片段有利于进行DNA分子快速杂交和高灵敏目标探测，另外在NGS文库构建的过程中，片段化是一个无法避开的过程。随着研究的不断深入，专注于DNA片段化技术的科研人员对更小、更快、更高效及低污染的实时检测体系的需求变得越来越大，因此针对DNA片段化技术的要求也越来越高。DNA分子双螺旋结构，是通过内侧氢键形成的碱基对使两条脱氧核苷酸长链稳固地并联起来，同时碱基对之间纵向的相互作用力也进一步提高了DNA分子的稳定性，所以DNA分子的双螺旋结构是一种相对稳定的结构。当前，寻找新型有效的DNA片段化技术是很有研究意义但是极具挑战性的课题。
发明内容
基于水动力剪切法，超声波断裂法的片段化方法，是Illumina官方最早推荐的DNA分子片段化方法。但相应的仪器配套的需求和限制，成为了该方法推广和提高通量的瓶颈。另外由于DNA分子的本身的特异性，例如甲基化修饰程度等，会提高分子本身的特性，使用机械方法这种区域会与其它区域有不同的断裂比例(几率)，这样一定程度上引入了机械打断的偏好性。
近年，在NGS文库构建配套试剂盒的市场上陆续出现了新的非限制性内切酶处理的随机片段化方法，这大大降低了对仪器的依赖程度。但也具有一定的局限，主要体现在酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性上。例如，Illumina公司基于Tn5转座酶体现出的缺点是酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性；NEB公司基于T7 Dna内切酶体现出的缺点是酶本身的稳定性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性；KAPA公司基于Shrimp Dnase的体系体现出的缺点是提高了对样本纯度与对起始量的要求上。
因此，鉴于上述情况，本发明要解决的问题，是使用更低成本的非限制性内切酶方法，摆脱打断仪器的限制，建立适用于普通分子生物学实验室和高通量NGS文库构建实验室的DNA打断方法。
本发明主要涉及以下具体的方案：
1.一种随机打断DNA的方法，其包括：
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。
2.根据项1所述的方法，其中，
所述二价阳离子为选自钙离子、镁离子中的一种或两种以上。
3.根据项1或2所述的方法，其中，
所述随机DNA双链结合蛋白质为sso7d蛋白质。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂为选自TritonX-100、Tween-20、Tween-80中的一种或两种以上。
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，
所述一价盐中的金属离子为选自钠离子、钾离子中的一种或两种以上。
6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，
所述二价阳离子的使用浓度为0.01mM～2mM，优选为0.05mM～1mM，进一步优选为0.05mM～0.5mM。
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，
所述随机DNA双链结合蛋白质的使用浓度为0ng/μL～6ng/μL，优选为3ng/μL～6ng/μL，进一步优选为4ng/μL～6ng/μL。
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂的使用浓度为0.001％～1％，优选为0.005％～0.5％，进一步优选为0.01％～0.2％。
9.根据项1～8中任一项所述的方法，其中，
所述一价盐的使用浓度为0mM～500mM，优选为20mM～200mM。进一步优选为50mM～100mM。
10.根据项1～9中任一项所述的方法，其中，
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，使用非限制性内切酶随机对DNA进行打断。
11.根据项10所述的方法，其中，
所述非限制性内切酶为选自DNAse I、不耐热虾DNAse、HL-dsDNase、dsDNase中的一种或两种以上。
12.一种随机打断DNA的方法，其包括：
在二价阳离子、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。
13.根据项12所述的方法，其中，
所述二价阳离子为选自钙离子、镁离子中的一种或两种以上。
14.根据项12或13所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂为选自TritonX-100、Tween-20、Tween-80中的一种或两种以上。
15.根据项12～14中任一项所述的方法，其中，
所述一价盐中的金属离子为选自钠离子、钾离子中的一种或两种以上。
16.根据项12～15中任一项所述的方法，其中，
所述二价阳离子的使用浓度为0.01mM～2mM，优选为0.05mM～1mM，进一步优选为0.05mM～0.5mM。
17.根据项12～16中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂的使用浓度为0.001％～1％，优选为0.005％～0.5％，进一步优选为0.01％～0.2％。
18.根据项12～17中任一项所述的方法，其中，
所述一价盐的使用浓度为0mM～500mM，优选为20mM～200mM。进一步优选为50mM～100mM。
19.根据项12～18中任一项所述的方法，其中，
在二价阳离子、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，使用非限制性内切酶随机对DNA进行打断。
20.根据项19所述的方法，其中，
所述非限制性内切酶为选自DNAse I、不耐热虾DNAse、HL-dsDNase、dsDNase中的一种或两种以上。
21.一种随机打断DNA的方法，其包括：
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、以及非离子表面活性剂的存在下，对DNA分子进行打断。
22.根据项21所述的方法，其中，
所述二价阳离子为选自钙离子、镁离子中的一种或两种以上。
23.根据项21或22所述的方法，其中，
所述随机DNA双链结合蛋白质为sso7d蛋白质。
24.根据项21～23中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂为选自TritonX-100、Tween-20、Tween-80中的一种或两种以上。
25.根据项21～24中任一项所述的方法，其中，
所述二价阳离子的使用浓度为0.01mM～2mM，优选为0.05mM～1mM，进一步优选为0.05mM～0.5mM。
26.根据项21～25中任一项所述的方法，其中，
所述随机DNA双链结合蛋白质的使用浓度为0ng/μL～6ng/μL，优选为3ng/μL～6ng/μL，进一步优选为4ng/μL～6ng/μL。
27.根据项21～26中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂的使用浓度为0.001％～1％，优选为0.005％～0.5％，进一步优选为0.01％～0.2％。
28.根据项21～27中任一项所述的方法，其中，
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、以及非离子表面活性剂的存在下，使用非限制性内切酶随机对DNA进行打断。
29.根据项28所述的方法，其中，
所述非限制性内切酶为选自DNAse I、不耐热虾DNAse、HL-dsDNase、dsDNase中的一种或两种以上。
发明的效果
通过采用上述本发明的方法，不需要使用价值昂贵的DNA打断仪，只使用普遍在分子生物学实验室都有的PCR仪等温浴设备就可以进行高效均一的片段化反应，处理时间短至10分钟左右，在节省成本的同时大大提高了处理通量。
通过使用本发明的方法打断的DNA末端产物，不同于现有技术中的机械打断的方法产生的随机末端，通过本发明打断的DNA片段的5'端为磷酸基团，3'端为羟基，而现有技术中的方法无法实现对末端的控制，从而节省了在NGS文库构建中重新对单链末端进行修复的步骤，另外减少了高度甲基化的基因组区域的过分断裂丢失，提高了文库构建的效率(即成功率)。
本发明的方法对纯化后的DNA分子结构不敏感，能够使用同样的操作条件高通量的处理不同物种、组织来源的样本，高效无偏好性地获得分子量范围比较窄的产物，完全满足下游NGS文库构建的需求。降低了样本准入的纯度标准。
在片段化反应后，和片段化反应进行的同时，能够直接进行下游的NGS建库操作，不需要增加体系置换或DNA纯化分离的操作，终止反应只需要升高温度进行热灭活。进一步提高了整个文库构建过程的流畅程度。
附图说明
图1示出调整离子浓度降低位点偏好性。
图2示出加入随机DNA双链结合蛋白降低位点偏好性。
图3示出加入随机DNA双链结合蛋白后的目标区域的平均湿度。
图4示出非离子型表面活性剂提高打断均一性的结果。
图5示出增加一价盐浓度提高打断稳定性的结果。
图6示出利用本发明的打断方法构建文库所得到的文库浓度。
图7示出利用本发明的打断方法构建文库的未检出位点数。
图8示出利用本发明的打断方法构建文库的重复无用的判读数。
图9示出利用本发明的打断方法构建文库的捕获目标区域的覆盖度。
图10示出利用本发明的打断方法构建文库的比对到基因组上的判读数。
图11使用另一种内切酶HL-dsDNase打断后构建文库的caliper峰图。
图12示出利用另一种一价盐KCL打断方法构建文库的calipe峰图。
图13DnaseI文库caliper峰图。
图14KAPA文库caliper峰图。
具体实施方式
非限制性内切酶处理的随机片段化方法，需要克服酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性上。在本发明中选择使用了一个来源广泛的非限制性内切酶，这样就不需要考虑位点本身分布的随机性问题，毕竟通常需要使用在来自于广泛物种来源的DNA上，这样的不同物种的限制性位点偏好性位点有着非常大的差异。另外不倾向于使用T7DNA内切酶这种以单链为底物的有热力学偏好的酶，会造成对DNA分子区域GC含量的偏好性。
在本发明中，选择使用了有单双链活性的非限制性内切酶，例如可以列举但不限于：DNAse I、不耐热虾DNAse(thermolabile shrimp DNAse)、HL-dsDNase、dsDNase等。在传统的缓冲液系统下，这种类型的DNase表现出切割位点的偏好性。本发明通过对缓冲体系的调整和添加剂的加入克服酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性等问题。
DNase I(Deoxyribonuclease I)，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。在镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；降低Ca2+活化的DNase I与DNA分子位点的比例，由此可以降低位点偏好性；另外一种降低偏好性的手段是加入随机DNA双链结合蛋白按一定的饱和度覆盖DNA分子，DNAse I只能无偏好的进入无覆盖的区域发生作用。
不耐热虾DNAse(thermolabile shrimp DNAse)，是一种南极深海来源的虾提取出来的脱氧核糖核酸酶。
dsDNase是一种新型的双链特异性DNase是一种经过设计的虾DNA酶，用于快速和安全的去除RNA样品中的基因组DNA。它是一种可以在DNA中裂解磷酸二酯键的核酸酶，从而产生寡核苷，5'-磷酸和3'-hyd。
HL-dsDNase(Heat-Labile Double Stranded DNase)是dsDNase的基因工程加工品，可在中等的温度下(55℃，pH大于8.0)快速地完全失活。可完美地适用于从RNA中清除DNA污染(可在镁离子存在下)。
由于DNA的分子结构开放性，很大程度上影响了上述非限制性内切酶的活性。DNA分子被酶切割的过程中，构型发生急剧的变化，容易留下某些三级结构稳定的区域，这影响了上述非限制性内切酶分子的进入与退出，进而屏蔽了整个DNA分子被均匀切割的能力。因此，为了促进酶的快速出入这些区域，本发明使用了非离子型的表面活性剂。另外，不同的提取方法得到的DNA样本，虽然会尽量避免，但是还是会有不同程度的蛋白质、盐份以及糖类的残留。这也一定程度上影响了DNA分子的构型和表面开放性，使用表面活性剂，能促进蛋白质从DNA分子上迅速解离而不阻碍上述非限制性内切酶的作用。50-100mM以上盐浓度均对上述非限制性内切酶有显著抑制作用，主要来源于三级结构的增加。但低浓度盐对活性的影响并不稳定，本发明主动提高了缓冲体系里的一价盐中金属离子的浓度，用提高酶投入量的方法缓冲低浓度盐带来的切割不稳定。
Sso7d蛋白质是双链DNA序列非特异性结合蛋白质。
本发明需要与后续NGS文库构建步骤的兼容，通过时间控制反应程度，需要一个中断片段化的手段。热灭活片段化酶是操作步骤最少的首选的手段，而文库构建第一步的反应通常是一个聚合酶的反应环境，包含各种聚合酶反应所必须的底物。例如上述非限制性内切酶正好是一个能够热灭活的，又能在各种聚合酶体系下正常发挥作用的酶。
实施例
以下通过实施例对本发明进行详细说明。在以下实施例中，如无特别说明，所用的各材料均可以通过商购获得，如无特别说明，所用的方法为本领域的常规方法。如无特别说明，百分比表示重量百分比。
首先列举在实施例中涉及的反应中的buffer组分的成分
1×Blue Buffer(购买自Enzymatics):
10mM Tris-Hcl
10mM MgCl2
50mM Nacl
1mM DTT
PH7.9 at 25℃
0.1×DnaseI Buffer(购买自NEB):
1mM Tris-HCl
0.25mMMgCl2
0.05mM CaCl2
PH7.6 at 25℃
实施例1调整离子浓度降低位点偏好性
打断反应操作流程
取200ng人唾液基因组DNA作为起始样本，在反应体系中加入0.02～8×DnaseIBuffer，1×Blue Buffer，2.5mU DNaseI，补充ddH2O至10μL。PCR仪反应程序设定为37℃、60min，反应结束后加入5mM EDTA终止反应。反应完成后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测打断片段的大小，电泳仪设定电压为120V，时间30min。图1示出了上述电泳结果，图1上方给出了不同泳道中钙离子的浓度，根据图1显示的结果可以知道，0.05mM Ca2+可以满足打断需求，并且减少了过度打断而损失的DNA。
实施例2加入随机DNA双链结合蛋白降低位点偏好性
打断反应及文库构建操作流程
取天根提取试剂盒和英芮城提取试剂盒提取的400ng人唾液基因组DNA作为起始样本，在反应体系中加入0.1×DNaseI Buffer，1×Blue Buffer，0-120ng sso7d，5mUDNaseI，补充ddH2O至20μL。PCR仪反应程序设定为37℃、60min，反应结束后加入5mM EDTA终止反应。反应完成后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测打断片段大小，电泳仪设定电压为120V，时间30min。
取上述打断产物100ng作为起始样本，按传统小片段建库流程进行文库制备，PCR反应程序设定为：94℃2min；94℃15s，62℃30s，72℃30s的循环重复10次；72℃10min；保持在4℃。扩增完成后进行PCR产物纯化：使用0.9×Ampure Beads回收纯化反应体系中的DNA，用25μL EB洗脱。小片段文库构建完成。文库检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库产量，使用qPCR定量检测文库产量。打断反应结果如图2所示。数据比对结果如图3所示，图3显示了三个样品(3个样本为独立的3个样本，为3个生物学重复)的目标区域的平均深度。从图3的结果可以发现120ng-0ng，相同位点的检测深度下降。
实施例3使用非离子型表面活性剂提高打断均一性
打断反应操作流程
取5个不同来源的人唾液基因组DNA 200ng作为起始样本，在反应体系中加入0.1×DnaseI Buffer，1×Blue Buffer，0.1％TritonX-100或者0.01％Tween-20，2.5mUDNaseI，补充ddH2O至10μL。PCR仪反应程序设定为37℃、60min，反应结束后加入5mM EDTA终止反应。反应完成后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测打断片段大小，电泳仪设定电压为120V，时间30min。打断反应结果如图4所示，根据图4的结果可知，加入0.1％的TritonX-100或者0.01％Tween-20，均提高了打断均一性。
实施例4增加一价盐中金属离子的浓度提高打断稳定性
打断反应操作流程
取400ng人唾液基因组DNA作为起始样本，在反应体系中加入0.1×DnaseIBuffer，1×Blue Buffer，0-50mM NaCl，0.1％TritonX-100，120ng sso7d，10mU DNaseI，补ddH2O至40μL。PCR仪反应程序设定为37℃10min，反应结束后加入5mM EDTA终止反应。反应完成后使用2％琼脂糖凝胶电泳检测打断片段大小，电泳仪设定电压为120V，时间30min。打断反应结果如图5所示，根据实验结果，使用50mM Na+提高打断反应的稳定性。
实施例5
打断反应操作流程：
取12个美基试剂盒提取的唾液样本基因组DNA 200ng作为起始样本，每个样本平行进行DnaseI酶切打断和超声打断，超声打断体系设置为400ng DNA，75μL，打断条件：30秒钟打开/30秒钟关闭，17循环。在DnaseI酶切打断反应体系中加入0.1×DnaseI Buffer，1×Blue Buffer，50mM NaCl，0.1％TritonX-100，120ng sso7d，10mU DNaseI，补ddH2O至40μL，PCR仪反应程序设定为37℃10min，75℃20min。不纯化直接取酶切打断产物100ng和超声打断200ng，按传统小片段建库流程进行建库，使用Qubit进行定量杂交，进行测序数据分析，测序平台：Nextseq550，测序类型：PE150，数据量要求0.4G clean data。
实验结果如下所述，图6示出了依据上述方法构建文库所得到的文库浓度。根据图6中的文库浓度显示，使用超声打断产物200ng建库和使用酶切打断产物100ng建库，酶切打断建库效率明显高于超声打断，间接说明酶切产物。根据测序结果显示(图7～图10)，各项测序指标酶切打断优于超声打断。采用本发明的方法得到的效果显著优于现有技术的超声打断。
实施例6
(1)改变内切酶种类：
打断反应操作流程
取3个200ng人唾液基因组DNA作为起始样本，在反应体系中加入0.1×DnaseIBuffer，1×Blue Buffer，50mM NaCl，0.1％TritonX-100，120ng sso7d，20mU HL-dsDnase，补ddH2O至40μL，PCR仪反应程序设定为37℃10min，75℃20min。按传统小片段建库流程进行建库，使用Caliper检测文库峰图，如图11所示。
在这个酶切体系下使用另外一种内切酶HL-dsDNase(Heat-Labile DoubleStranded DNase)进行打断，打断效果稳定。
(2)改变一价盐：
打断反应操作流程
取3个200ng人唾液基因组DNA作为起始样本，在反应体系中加入0.1×DnaseIBuffer，1×Blue Buffer，50mM KCl，0.1％TritonX-100，120ng sso7d，10mU DnaseI，补ddH2O至40μL，PCR仪反应程序设定为37℃10min，75℃20min。按传统小片段建库流程进行建库，使用Caliper检测文库峰图，如图12所示。在这个打断体系下使用KCl进行打断，打断效果稳定。
对比例1
打断反应操作流程：
取NA12878标准品100ng作为起始样本，平行进行DnaseI打断建库和KAPA试剂盒打断建库，设置3个技术重复。在DnaseI酶切打断反应体系中加入0.1×DnaseI Buffer，1×Blue Buffer，50mM NaCl，0.1％TritonX-100，120ng sso7d，10mU DNaseI，补ddH2O至40μL，PCR仪反应程序设定为37℃10min，75℃20min。不纯化直接取酶切打断产物100ng，按传统小片段建库流程进行建库，结果图13所示。KAPA试剂盒体系按照试剂盒操作说明进行建库，结果如图14所示。
实验结果表示，DnaseI打断片段大小稳定性强于KAPA试剂盒，文库浓度高于KAPA试剂盒。
Claims (13)
1.一种随机打断DNA的方法，其包括：
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述二价阳离子为选自钙离子、镁离子中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述随机DNA双链结合蛋白质为sso7d蛋白质。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂为选自TritonX-100、Tween-20、Tween-80中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述一价盐中的金属离子为选自钠离子、钾离子中的一种或两种以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述二价阳离子的使用浓度为0.01mM～2mM，优选为0.05mM～1mM，进一步优选为0.05mM～0.5mM。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述随机DNA双链结合蛋白质的使用浓度为0ng/μL～6ng/μL，优选为3ng/μL～6ng/μL，进一步优选为4ng/μL～6ng/μL。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
所述非离子表面活性剂的使用浓度为0.001％～1％，优选为0.005％～0.5％，进一步优选为0.01％～0.2％。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
所述一价盐的使用浓度为0mM～500mM，优选为20mM～200mM。进一步优选为50mM～100mM。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，使用非限制性内切酶随机对DNA进行打断。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，
所述非限制性内切酶为选自DNAse I、不耐热虾DNAse、HL-dsDNase、dsDNase中的一种或两种以上。
12.一种随机打断DNA的方法，其包括：
在二价阳离子、非离子表面活性剂、以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。
13.一种随机打断DNA的方法，其包括：
在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、以及非离子表面活性剂的存在下，对DNA分子进行打断。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011289430.1A CN112375807B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011289430.1A CN112375807B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
| CN201711486034.6A CN109988817B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711486034.6A Division CN109988817B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112375807A true CN112375807A (zh) | 2021-02-19 |
| CN112375807B CN112375807B (zh) | 2023-02-21 |
Family
ID=67110479
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711486034.6A Active CN109988817B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
| CN202011289430.1A Active CN112375807B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711486034.6A Active CN109988817B (zh) | 2017-12-30 | 2017-12-30 | 一种随机打断dna的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN109988817B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111020018B (zh) * | 2019-11-28 | 2021-09-14 | 天津金匙医学科技有限公司 | 一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080038782A1 (en) * | 2006-01-06 | 2008-02-14 | Stratagene California | Reaction buffer composition for nucleic acid replication with packed DNA polymerases |
| WO2010080910A1 (en) * | 2009-01-08 | 2010-07-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for improving efficiency of nucleic acids amplification reactions |
| CN101875924A (zh) * | 2002-10-23 | 2010-11-03 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 改善的ss07-聚合酶偶联蛋白质 |
| CN101967684A (zh) * | 2010-09-01 | 2011-02-09 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种测序文库及其制备方法、一种末端测序方法和装置 |
| CN102534811A (zh) * | 2010-12-16 | 2012-07-04 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种dna文库及其制备方法、一种dna测序方法和装置 |
| CN102643792A (zh) * | 2011-02-17 | 2012-08-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | Rna断裂试剂及其应用 |
| CN102643793A (zh) * | 2011-02-18 | 2012-08-22 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种稳定双链dna的方法及双链dna稳定剂 |
| CN104153003A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-19 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种基于illumina测序平台的大片段DNA文库的构建方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3260557A1 (en) * | 2011-05-27 | 2017-12-27 | Life Technologies Corporation | Methods for manipulating biomolecules |
| CN104630205B (zh) * | 2015-01-26 | 2018-01-16 | 江南大学 | 一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法 |
-
2017
- 2017-12-30 CN CN201711486034.6A patent/CN109988817B/zh active Active
- 2017-12-30 CN CN202011289430.1A patent/CN112375807B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875924A (zh) * | 2002-10-23 | 2010-11-03 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 改善的ss07-聚合酶偶联蛋白质 |
| US20080038782A1 (en) * | 2006-01-06 | 2008-02-14 | Stratagene California | Reaction buffer composition for nucleic acid replication with packed DNA polymerases |
| WO2010080910A1 (en) * | 2009-01-08 | 2010-07-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for improving efficiency of nucleic acids amplification reactions |
| CN102272319A (zh) * | 2009-01-08 | 2011-12-07 | 伯乐实验室公司 | 用于提高核酸扩增反应效率的方法和组合物 |
| CN101967684A (zh) * | 2010-09-01 | 2011-02-09 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种测序文库及其制备方法、一种末端测序方法和装置 |
| CN102534811A (zh) * | 2010-12-16 | 2012-07-04 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种dna文库及其制备方法、一种dna测序方法和装置 |
| CN102643792A (zh) * | 2011-02-17 | 2012-08-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | Rna断裂试剂及其应用 |
| CN102643793A (zh) * | 2011-02-18 | 2012-08-22 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种稳定双链dna的方法及双链dna稳定剂 |
| CN104153003A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-19 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种基于illumina测序平台的大片段DNA文库的构建方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BARTLETT,MICHAEL S.等: "Comparison of two methods of generating random DNA fragments for cloning and sequencing.", 《UNIVERSITY OF ILLINOIS AT URBANA CHAMPAIGN》 * |
| GALEN HOSTETTER等: "Random DNA fragmentation allows detection of single-copy, single-exon alterations of copy number by oligonucleotide array CGH in clinical FFPE samples.", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
| KENTARO MIYAZAKI等: "Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling.", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
| 张伸: "DNA调节片段及其结合蛋白的筛选与鉴定", 《中国优秀博士论文全文数据库》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112375807B (zh) | 2023-02-21 |
| CN109988817B (zh) | 2020-12-04 |
| CN109988817A (zh) | 2019-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7405485B2 (ja) | 部位特異的核酸を用いた核酸濃縮と続いての捕捉方法 | |
| US11384383B2 (en) | In vitro isolation and enrichment of nucleic acids using site-specific nucleases | |
| CN108138364B (zh) | 一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂 | |
| US11326201B2 (en) | Method for removing non-target RNA from RNA sample | |
| US20180298421A1 (en) | Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins | |
| JP2021521786A (ja) | 核酸を結合、修飾、および切断する物質の基質選択性および部位のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの高感度アッセイ | |
| US20230115861A1 (en) | Methods and compositions relating to covalently closed nucleic acids | |
| WO2020099675A1 (en) | Optimization of in vitro isolation of nucleic acids using site-specific nucleases | |
| US20240271328A1 (en) | Rapid library construction for high throughput sequencing | |
| CN109988817B (zh) | 一种随机打断dna的方法 | |
| JP2017534297A (ja) | トランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法及び試薬 | |
| CA2962254C (en) | Composition and method for processing dna | |
| WO2023085232A1 (ja) | 改良されたライブラリー調製方法 | |
| KR20180096034A (ko) | 표적 핵산 분자를 생성하는 방법 및 조성물 | |
| KR20230114423A (ko) | DNaseⅠ을 이용한 DNA 라이브러리 제작용 효소 조성물 및 이를 이용한 DNA 라이브러리 제작 방법 | |
| US20180080092A1 (en) | One-stop treatment method for breaking nucleic acid by means of transposase, and reagent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230116 Address after: 322000 1st floor, building 9, standard workshop, No.10 Gaoxin Road, Houjiang street, Yiwu City, Jinhua City, Zhejiang Province Applicant after: ZHEJIANG ANNOROAD BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant after: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Address before: Room 701, unit 2, building 8, yard 88, Kechuang 6th Street, Daxing District, Beijing 100176 Applicant before: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240426 Address after: Room 701, Unit 2, Building 8, No. 88 Kechuang 6th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing, 100176 Patentee after: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: BEIJING ANNOROAD MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd. Address before: 322000 1st floor, building 9, standard workshop, No.10 Gaoxin Road, Houjiang street, Yiwu City, Jinhua City, Zhejiang Province Patentee before: ZHEJIANG ANNOROAD BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |