CN103562410B

CN103562410B - 具有降低的非特异性活性的sso7-聚合酶缀合物

Info

Publication number: CN103562410B
Application number: CN201280026591.9A
Authority: CN
Inventors: 程曼; 王岩; 约翰·苏利文
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2032-02-10
Also published as: EP2694684B1; JP2014511693A; SG194032A1; EP2694684A4; EP2694684A1; CN103562410A; US20140170729A1; WO2012138417A1; US9322002B2; US8697410B2; JP6060447B2; US20120258460A1

Abstract

提供了改进的Sso7‑聚合酶缀合蛋白。本发明提供Sso7聚合酶缀合蛋白，其包含与聚合酶连接的Sso7结构域；其中：所述Sso7结构域的与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)；和／或所述Sso7结构域的与SEQ ID NO：2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)，其中所述缀合蛋白与在其它方面相同的对照缀合蛋白相比具有降低的非特异性扩增活性，在所述对照缀合蛋白中，所述Sso7结构域的与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸是赖氨酸(K)，且所述Sso7结构域的与SEQ ID NO：2的R43对应的氨基酸是精氨酸(R)。

Description

具有降低的非特异性活性的SSO7-聚合酶缀合物

对相关专利申请的交叉引用

本申请要求2011年4月8日提交的美国临时专利申请号61／473,682和2011年6月22日提交的美国临时专利申请号61／499,873的优先权权益，它们各自通过引用并入。

背景技术

核酸扩增反应，诸如聚合酶链反应(PCR)，一般是模板依赖性反应，其中所需的核酸序列通过使用过量的两种寡核苷酸引物处理靶核酸的分离的互补链来扩增。所述引物延伸形成互补引物延伸产物，所述产物起模板作用，以用于合成所需的核酸序列。在这样的过程中，选择性扩增各DNA链上的引物之间的核酸序列。

通过将非序列特异性的双链核酸结合结构域连接至酶或它的催化域，可以提高聚合酶的活性(参见，例如，WO0192501)。这样的经修饰的聚合酶表现出与未修饰的酶相比增加的持续合成能力。

发明内容

本发明提供了Sso7聚合酶缀合蛋白，其包含与聚合酶连接的Sso7结构域；其中：

所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)；和／或

所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)，

其中所述缀合蛋白与在其它方面相同的对照缀合蛋白相比具有降低的非特异性扩增活性，在所述对照缀合蛋白中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸是赖氨酸(K)，且所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的R43对应的氨基酸是精氨酸(R)。

在一些实施方案中，与对照缀合蛋白的非特异性扩增活性相比，所述Sso7聚合酶缀合蛋白的非特异性扩增活性降低至少10％。

在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。

在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的R43对应的氨基酸选自由以下各项组成的组：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。

在一些实施方案中，所述聚合酶基本上没有3’-5’外切核酸酶活性。

在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的前58或60个氨基酸或与SEQID NO：2的全长基本(例如，至少60、75、80、85、90或95％)相同。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2至少90％相同。

在一些实施方案中，所述聚合酶与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95％)相同。在一些实施方案中，所述聚合酶包含SEQ IDNO：33或SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：61。

在一些实施方案中，所述聚合酶结构域具有热稳定的聚合酶活性。在一些实施方案中，所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。在一些实施方案中，所述聚合酶结构域是ΔTaq聚合酶结构域。

在一些实施方案中，所述聚合酶结构域是家族B聚合酶结构域。在一些实施方案中，所述聚合酶结构域得自热球菌属(Pyrococcus)。

本发明也提供了反应混合物，其包含如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸(dNTP)、盐、DNA结合染料或稳定剂。

本发明也提供了试剂盒，其包含如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步在含有所述缀合蛋白的相同或不同的容器中包含下述的至少一种：一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸(dNTP)、盐或稳定剂。

在一些实施方案中，所述组合物包含当在20℃至37℃之间时具有不超过0.027pH单位／℃的变化的缓冲液(当在0.1M浓度测量时)。在一些实施方案中，所述缓冲液选自由以下各项组成的组：HEPES、ACES、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、TES、TAPSO、POPSO、BICINE、TAPS和AMPSO。

本发明也提供了扩增样品中的靶核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括，在允许用引物扩增靶核酸的条件下，在反应混合物中温育所述靶核酸，所述反应混合物包含：

a.至少一种引物；和

b.如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，

由此扩增所述靶核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括聚合酶链反应(PCR)。

本发明也提供了核酸，其包含编码如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。

本发明也提供了包含重组表达盒的细胞，所述表达盒包含与编码如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO：2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQID NO：2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。

附图说明

图1.不同的Sso7氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：2、3、6、4和5)的比对。

定义

除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域中一般技术人员通常理解的相同含义。一般地，本文中使用的术语和下述的细胞培养实验室程序、分子遗传学、有机化学、和核酸活性和杂交是本领域中公知并普遍使用的那些。使用标准技术来进行核酸和肽分析。所述技术和程序通常按照本领域中常规方法和多种一般参考文件(一般参见，Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(分子克隆：实验室手册),第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，ColdSpring Harbor(冷泉港)，N.Y.，其通过引用并入本文)来进行，其在本文全文中提供。本文中使用的术语和下述分析化学、和有机合成的实验室程序是本领域中公知和普通使用的那些。

术语“Sso7”或“Sso7DNA结合结构域”或“Sso7-样DNA结合结构域”或“Sso7结构域”表示这样的核酸和多肽多形变体、等位基因、突变体、种间同源物：(1)其氨基酸序列与SEQID NO：2具有大于约60％氨基酸序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性；(2)其在严格杂交条件下与SEQ ID NO：1的Sso7d核酸序列及其保守修饰的变体特异性地杂交；或(3)其核酸序列与SEQ ID NO：1具有大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的核苷酸序列同一性。该术语包括全长Sso7d多肽和所述多肽的具有序列非特异性双链结合活性的片段。Sso7-样蛋白包括、但不限于：Sso7d、Sac7d和Sac7e。

“结构域”表示蛋白或蛋白复合物的单元，其包括多肽序列、完整多肽序列、或许多多肽序列，其中所述单元具有定义的功能。理解所述功能是广泛定义的，且可以是配体结合、催化活性或可以对蛋白的结构具有稳定作用。

关于蛋白的部分使用的“异源的”表示所述蛋白包括两个或多个在自然界彼此间不以相同关系存在的结构域。这样的蛋白，例如，融合蛋白，含有两个或多个来自被安排形成新的功能性蛋白的无关蛋白的结构域。

“连接”表示本领域中关于功能性连接蛋白结构域的任何已知方法，包括但不限于具有或不具有干扰结构域的重组融合、内含肽-介导的融合、非共价连接、和共价键结合、包括二硫键结合；氢键结合；静电结合；和构象结合，例如，抗体-抗原，和生物素-抗生物素蛋白连接。

本文中使用的“热稳定的聚合酶”表示利用DNA或RNA作为模板，通过将核苷酸单元加入至核苷酸链来催化多核苷酸合成的任何酶，并在高于45℃的温度下具有最佳活性。

“栖热菌属(Thermus)聚合酶”指由任何栖热菌属物种分离的家族ADNA聚合酶，包括但不限于水生栖热菌(Thermus aquaticus)、Thermus brockianus、和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；源自栖热菌属物种的任何重组聚合酶，及其任意功能性衍生物，无论是通过遗传修饰或化学修饰或本领域中已知的其它方法来衍生。

术语“扩增反应”表示用于增加核酸靶序列拷贝的任意体外方法。这样的方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR流程：方法和应用指导)(Innis等编，1990))，(LCR)、QBeta RNA复制酶、和基于RNA转录的(诸如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它方法。

“扩增”表示使溶液经历足以容许扩增多核苷酸的条件的步骤，条件是反应的全部组分是完整的。扩增反应的组分包括，例如，引物，多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”典型地表示靶核酸的“指数”增加。然而，本文中使用的“扩增”还可以表示核酸的选择靶序列数量的线性增加，诸如使用循环测序获得的。

术语“扩增反应混合物”表示包含用于扩增靶核酸的多种试剂的水溶液。这些包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸、和核苷三磷酸。如本文中进一步讨论地，扩增反应混合物还可以进一步包括稳定剂和其它用于最优化效率和特异性的添加剂。根据上下文，所述混合物可以是完全的或不完全的扩增反应混合物。

“聚合酶链反应”或“PCR”表示这样的方法，通过该方法以几何级数扩增靶双链DNA的特定区段或子序列。PCR是本领域技术人员公知的技术；参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR流程：方法和应用指导)，Innis等编，1990。示范性PCR反应条件典型地包括两步骤或三步骤循环。两步骤循环具有变性步骤，随后是杂交／延伸步骤。三步骤循环包括变性步骤，随后是杂交步骤，随后是单独的延伸步骤。

关于核酸扩增使用的术语“特异性”表示，与非特异性扩增产物相比，产生特异性扩增产物的核酸扩增反应的可能性。“特异性扩增产物”表示，通过用正确配对的引物和模板(即，正确靶序列)的扩增产生的多核苷酸。“非特异性扩增产物”表示，通过用错配的引物和模板的扩增产生的多核苷酸。

关于核酸扩增使用的短语“提高特异性”或“改善特异性”表示，与产生的非特异性扩增产物的量相比，在核酸扩增中产生的特异性扩增产物的量的可检测的增加。扩增反应的特异性可以根据任意方法来测量，包括、但不限于解链曲线分析或凝胶分析。在一些实施方案中，如下确定核酸扩增反应的特异性：对比两种产物的相对产率，其中一种产物是具有预期的T_m的特异性产物，且另一种产物是非特异性产物，其具有比特异性产物的T_m更低或更高的T_m。与具有含野生型Sso7结构域的对照聚合酶的反应混合物中的特异性产物相对于非特异性产物的相对产率相比，包含Sso7-聚合酶缀合物(其具有如本文中所述的含K28和／或R43突变的Sso7结构域)的反应混合物将在扩增反应中具有更高的特异性产物相对于非特异性产物的相对产率(即，通过特异性产物的解链峰的高度与非特异性产物的解链峰的高度之比测得的产率之比)。在一些实施方案中，与其中对照聚合酶具有野生型Sso7结构域的反应相比，具有如本文中所述的含K28和／或R43突变的Sso7结构域的Sso7-聚合酶缀合物将具有所述比率增加至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、100％、2倍(200％)、2.5倍(250％)、3倍(300％)或更大的提高的扩增特异性。

“引物”表示与靶核酸上的序列杂交并担当核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以具有不同的长度，且通常长度小于50个核苷酸，例如，长度为12-30个核苷酸。用于PCR中的引物的长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原则来设计，参见，例如，Innis等，见上文。

“模板”表示这样的多核苷酸序列，其包括侧连引物杂交位点的待扩增的多核苷酸。因此，“靶模板”包括侧连关于5’引物和3’引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。

本文中使用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链或更加高度聚集的杂交基序，及其任意化学修饰。修饰包括，但不限于，向核酸配体碱基或向作为整体的核酸配体提供结合另外的电荷、极性、氢键结合、静电相互作用、连接点和功能性的化学基团的那些。这样的修饰包括，但不限于，肽核酸(PNAs)，磷酸二酯基修饰，(例如，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯)，2′-位糖修饰，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，环外胺的修饰，4-硫尿苷的置换，5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的置换；主链修饰，甲基化，不寻常碱基配对组合诸如异碱基(isobase)，异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)等。核酸还可以包括非天然碱基，诸如，例如，硝基吲哚。修饰还可以包括3′和5′修饰诸如用荧光团(例如，量子点)或另一种结构部分加帽。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用，表示氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”表示天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示与天然存在的氨基酸具有相同基础化学结构(即，与氢原子、羧基、氨基、和R基结合的α碳原子)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰肽主链，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物表示具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

氨基酸在本文中可以通过其普遍已知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母密码来提及。

“保守修饰变体”应用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，保守修饰变体表示编码相同或基本相同氨基酸序列，或其中核酸不编码氨基酸序列的那些核酸，基本相同序列。由于遗传密码的简并，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在通过密码子指定丙氨酸的各个位置处，该密码子可以改变为所述相应密码子中任一个，而不改变编码的多肽。这样的核酸变化是“沉默变化”，其是保守修饰变化的一种。本文中编码多肽的各核酸序列也描述各种可能的核酸的沉默变化。本领域技术人员应该认识到，核酸中的各密码子(除AUG(其通常仅编码甲硫氨酸)和TGG(其通常仅编码色氨酸外)可以修饰为产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变化是各所述序列中固有的。

关于氨基酸序列，本领域技术人员应该认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单氨基酸或小比例氨基酸的各置换、缺失或添加核酸、肽、多肽、或蛋白序列是“保守修饰的变体”，其中变化导致氨基酸被化学类似的氨基酸置换。提供功能相似氨基酸的保守置换表是本领域中公知的。这样的保守修饰变体是本发明多形变体、种间同源物、和等位基因以外的，但不排除这些。

术语“编码”表示编码一个或多个氨基酸的多核苷酸序列。该术语不需要起始密码子或终止密码子。氨基酸序列可以以由多核苷酸序列提供的6种不同阅读框中任一种来编码。

术语“启动子”表示位于转录起始上游和／或下游并参与识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白以起始转录的区域或序列。

“载体”表示这样的多核苷酸，其在独立于宿主染色体时，能够在宿主生物体中复制。优选的载体包括质粒，且典型地具有复制起点。载体可以包括，例如，转录和翻译终止子，转录和翻译起始序列，和有效用于调节特定核酸表达的启动子。

“重组体”表示人操作的多核苷酸或人操作的多核苷酸的拷贝或补体。例如，包括与第二多核苷酸可操作连接的启动子的重组表达盒可以包括与所述第二多核苷酸异源的启动子，这是人操作(例如，通过Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold SpringHarbor(冷泉港)，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学方案)第1-3卷，John Wiley & Sons，Inc.(1994-1998)所述的方法)包含表达盒的分离的核酸的结果。在另一个实例中，重组表达盒可以包括以这样的方式组合的多核苷酸，所述方式使得所述多核苷酸极不可能在自然界中找到。例如，人操作的限制位点或质粒载体序列可以使启动子侧连所述第二多核苷酸或使启动子与所述第二多核苷酸分开。本领域技术人员应该认识到，多核苷酸可以以许多方式来操作并不限于以上实例。

“聚合酶”表示进行多核苷酸(例如，DNA和／或RNA)的模板指导的合成的酶。该术语包括具有聚合酶活性的全长多肽和结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员公知的，包括但不限于，由激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)，Thermococcus litoralis，和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)，或其修饰形式分离或来源的DNA聚合酶。它们包括DNA-依赖性聚合物和RNA-依赖性聚合酶(诸如逆转录酶)二者。已知至少5个DNA-依赖性DNA聚合酶家族，尽管大部分属于家族A、B和C。不同家族之间存在很少或不存在序列相似性。大多数家族A聚合酶是单链蛋白，其可以含有多酶功能包括聚合酶、3′至5′外切核酸酶活性和5′至3′外切核酸酶活性。家族B聚合酶典型地具有聚合酶的单催化结构域和3′至5′外切核酸酶活性，以及辅助因子。家族C聚合酶典型地是多亚单元蛋白，其具有聚合和3′至5′外切核酸酶活性活性。在大肠杆菌(E.coli)中，已经发现三种类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I(家族A)、II(家族B)和III(家族C)。在真核细胞中，三种不同的家族B聚合酶，即DNA聚合酶α、δ和ε，参与核复制，且家族A聚合酶，即聚合酶γ，用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA聚合酶典型地包括真核RNA聚合酶I、II和III，和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA-依赖性和RNA-依赖性的。

两个核酸序列或多肽被称为“相同”，如果这两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列在如下所述比对以获得最大对应性时，分别相同。术语“相同”或百分比“同一性”在两个或多个核酸或多肽序列的背景下，表示当比较和比对以在比较窗中获得最大对应性时，相同或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，其如使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察来测量。当序列同一性的百分比关于蛋白或多肽使用时，认为不相同的残基位置通常由于保守氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被置换为具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基并因此不改变该分子的功能特性。当序列在保守置换中不同时，百分比序列同一性可以上调，以校正置换的保守天性。用于进行该调整的手段是本领域技术人员公知的。典型地，这涉及将保守置换作为部分而非完全错配来评分，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸给分为1且非保守置换给分为0时，保守置换给分在0和1之间。保守置换的评分根据例如，Meyers& Miller的算法，Computer Applic.Biol.Sci.(计算机应用生物科学)4：11-17(1988)来计算，例如，如以程序PC／GENE(Intelligenetics，Mountain View,加利福尼亚，USA)进行。

在下述情况下，序列是彼此“基本上相同的”：当比较和比对以在比较窗或特定区域中获得最大对应性时，它们具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在特定区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，其中使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察来测量。

为了序列比较，典型地，一个序列担当参考序列，测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或可以指定备选的参数。序列比较算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

本文中使用的“比较窗”包括选自由20-600，通常约50-约200，更通常约100-约150组成的组的任一连续位置数量的区段，其中当两序列最佳比对后，序列可以与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。比对序列以进行比较的方法是本领域中公知的。用于比较的最佳序列比对可以，例如，通过Smith & Waterman，Adv.Appl Math.(现代应用数学)2：482(1981)的局部同源比对算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48：443(1970)的同源比对算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)85：2444(1988)的相似方法的搜索，通过计算机化执行这些算法(GAP,BESTFIT，FASTA，和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package(威斯康辛州遗传学软件包)，Accelrys中)，或通过人工比对和视觉观察来进行。

适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别记述在Altschul等(Nuc.Acids Res.25：3389-402，1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)中。用于进行BLAST分析的软件可公共地获白国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／)。该算法包括首先通过识别查询序列中长度W的短词来识别高评分序列对(HSPs)，其在与数据库序列中相同长度的词比对时，匹配或满足一些正值阈值评分。T指邻近词评分阈值(Altschul等，见上文)。这些起始邻近词击中(word hits)担当开始搜索的种子，以发现包含它们的较长的HSPs。词击中以两个方向沿各序列延伸，以直至可以增加累积比对评分。词击中在各方向的延伸中以下时刻停止：累积比对评分通过量X由其最大获得值下降；累积评分变为0或以下，这归因于一个或多个负评分残基比对的累积；或达到各序列的末端。BLAST算法参数W，T，和X确定算法的灵敏性和速度。BLAST程序在默认词长(W)11时，使用BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)89：10915(1989))比对(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=-4，和两条链比较。

BLAST算法也进行两序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin &Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个测量值是最小综合可能性(P(N))，其提供两核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的可能性指示。例如，核酸被认为与参考序列相似，条件是测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和可能性小于约0.2，更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001。

术语“严格杂交条件”指这样的条件下，在该条件下，探针与其靶子序列，典型地在核酸的复杂混合物中进行杂交，而不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的且在不同环境中应该不同。较长的序列特别在较高温度下杂交。核酸杂交的广泛指导参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes(生物化学和分子生物学技术——使用核探针的杂交)，″Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays(杂交原理和核酸测定策略综述)″(1993)。一般地，高严格条件被选为比特定序列在确定的离子强度pH下热熔点(T_m)低约5-10℃。低严格条件通常被选为比T_m低约15-30℃。T_m是这样的温度(在确定的离子强度、pH、和核浓度下)，在该温度下，50％的与靶标互补的探针平衡地杂交靶序列(当靶序列过量存在时，在T_m，50％的探针平衡地被占据)。杂交条件典型地是那样的，其中盐浓度在pH7.0-8.3下，低于约1.0M钠离子，典型地约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且温度对于短探针(例如，10-50核苷酸)是至少约30℃且对于长探针(例如，大于50核苷酸)是至少约60℃。严格条件还可以使用添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号是至少两倍背景，优选10倍背景杂交。

在严格条件下不相互杂交的核酸仍然是基本相同的，条件是它们编码的多肽基本相同。这，例如，在使用遗传密码允许的最大密码子简并创建核酸拷贝时发生。在这样的情形中，核酸典型地在中度严格杂交条件下杂交。示范性“中度严格杂交条件”包括在40％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS缓冲液中，在37℃下杂交和在1X SSC，在45℃下洗涤。示范性“严格杂交条件”包括在40％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS缓冲液中，在37℃下杂交和在0.2X SSC，在温度至少约50℃，通常约55℃-约60℃下至少一次20分钟的洗涤，或等价条件。阳性杂交是至少两倍背景。本领域技术人员应该容易认识到，可以使用备选的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。

具体实施方式

I.引言

本发明提供了变体Sso7聚合酶缀合物，其与包含野生型Sso7结构域的Sso7聚合酶缀合物相比，表现出降低的非特异性扩增活性。所述变体Sso7聚合酶缀合物包含至少一个与变体Sso7结合结构域连接的聚合酶结构域。所述变体Sso7DNA-结合结构域包含在2个位置(对应于SEQ ID NO：2中的K28和／或R43)中的一个或两个处的氨基酸变化(相对于该位置处的野生型氨基酸)。如在实施例中所证实的，已经证实在这些位置处的许多相对于野生型的不同氨基酸置换会降低非特异性聚合酶活性。非特异性聚合酶活性包括，由于除杂交引物的模板特异性延伸以外的原因而发生的核酸扩增。

II.本发明的Sso7结构域

本发明的聚合酶缀合物包含与天然(野生型)Sso7d序列相比具有氨基酸置换的Sso7多肽序列。Sso7d是得自超嗜热古细菌硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的小型(63个氨基酸，约7kd MW)碱性染色体蛋白。所述蛋白富含赖氨酸，且具有高热、酸和化学稳定性。它以不依赖于序列的方式结合DNA，并且当结合时，会使DNA的Tm在相同条件下增加至多40℃(McAfee等，Biochemistry(生物化学)34：10063-10077，1995)。通常认为Sso7d和它的同源物参与包装基因组DNA并在升高的温度下稳定基因组DNA。Sso7d蛋白序列显示在SEQ ID NO：2中。

存在几种已知的Sso7d-样蛋白(也被称作“Sso7蛋白”)，包括、但不限于，得自超嗜热古细菌酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7a、Sac7b、Sac7d(SEQ ID NO：4)、Sac7e(SEQ ID NO：5)；得自Sulfolobus tokodaii的Sto7e(SEQ ID NO：6)，以及得自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的Ssh7a和Ssh7b(SEQ ID NO：3)(参见，例如，UniProt数据库登录号：P39476(Sso7d)；O59632(Ssh7b)；P13123(Sac7d)；P13125(Sac7e)；和Q96X56(Sto7e))。这些蛋白与Sso7d具有在78％至98％范围内的同一性。用于本发明中的其它Sso7结构域也可以如下面所述来鉴别。

如本文中所指出的，本发明提供了在与SEQ ID NO：2的K28和／或R43相对应的位置处相对于天然氨基酸的氨基酸变化。应当理解，这样的位置命名不指示要求保护的分子本身的氨基酸的数目，而是指示当要求保护的分子序列与SEQ ID NO：2最大程度地比对时要求保护的分子残基所在的位置。在变体Sso7结构域的背景下，与Sso7-样蛋白序列的“对应”是基于下述惯例：根据特定序列(即，SEQ ID NO：2)的氨基酸位置编号进行编号，然后以使与SEQ ID NO：2的序列同一性百分比最大化的方式与Sso7-样蛋白序列比对。比对可以手工进行，或者使用序列比较算法进行(例如，使用具有默认参数的NCBI BLAST程序(参见，例如，Altschul等，Nucl.Acids Res.25：3389-3402,1997)。与几种含有SEQ ID NO：2的Sso7-样蛋白的比对的一个例子显示在图1中。对应的序列可以总结如下：

可以在与SEQ ID NO：2对应的K28和／或R43位置处置换任意Sso7DNA结合蛋白结构域。因而，例如，在一些实施方案中，所述变体Sso7多肽序列与例如SEQ ID NO：2、3、4、5或6中的任一个基本上(例如，至少60、70、80、85、90或95％)相同，且在与K28对应的氨基酸位置处包含除了K以外的氨基酸。在一些实施方案中，与K28对应的氨基酸位置是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。

在一些实施方案中，所述变体Sso7多肽序列与例如SEQ ID NO：2、3、4、5或6中的任一个基本上(例如，至少60、70、80、85、90或95％)相同，且在与R43对应的氨基酸位置处包含除了R以外的氨基酸。在一些实施方案中，与R43对应的氨基酸位置是丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或脯氨酸(P)。

在一些实施方案中，所述变体Sso7多肽序列与例如SEQ ID NO：2、3、4、5或6中的任一个基本上(例如，至少60、70、80、85、90或95％)相同，且包含在与K28对应的氨基酸位置处的除了K以外的氨基酸和在与R43对应的氨基酸位置处的除了R以外的氨基酸。例如，在一些实施方案中，在位置K28处的氨基酸选自由以下各项组成的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)，且在位置R43处的氨基酸选自由以下各项组成的组：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或脯氨酸(P)。

存在许多产生给定核酸序列的这些改变或变体的方式。众所周知的方法包括，例如，定位诱变、使用简并寡核苷酸的PCR扩增、期望的寡核苷酸的化学合成(例如，与连接和／或克隆结合，以产生大核酸)和其它众所周知的技术。参见，Giliman & Smith，Gene(基因)8：81-97(1979)，Roberts，等，Nature(自然)328：731-734(1987)和Sambrook，Innis,和Ausubel(都见上文)。

在一些实施方案中，所述变体Sso7结构域或多肽序列与SEQ ID NO：7-32中的任一个的氨基酸序列是相同的或基本上相同的(例如，具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域或蛋白具有SEQ ID NO：7-32中的任一个的氨基酸序列。

在产生本发明的Sso7序列的一个实施例中，使用定位诱变来置换氨基酸残基。通过合成含有突变的寡核苷酸引物，置换核酸序列。在一些实施方案中，使所述引物与Sso7核酸(例如，SEQ ID NO：1)杂交，并扩增新序列。然后可以将含有突变的扩增产物连接进表达载体中。

在一些实施方案中，如上改变多肽序列，即，通过改变对应的核酸序列和表达多肽。但是，还可以使用商购可得的肽合成仪来合成地制备多肽序列，以产生期望的多肽(参见，Merrifield,和Stewart & Young，见上文)。

最后，通过使用诸如本文中描述的那些技术评价置换的Sso7序列，以鉴别表现出降低的非特异性聚合酶活性的融合聚合酶。

III.聚合酶

一般而言，认为基本上任意聚合酶可以连接至本发明的变体Sso7蛋白序列以形成本发明的Sso7-聚合酶缀合蛋白，由此提高所述聚合酶的多种活性。在一个示例性实施方案中，所述Sso7聚合酶缀合蛋白包含源自两种亲本聚合酶Pfu和DeepVent的聚合酶结构域。这样的聚合酶记述在例如美国申请公开号20040219558、20040214194、20040191825、20030162173中，将其每一篇特此通过引用整体并入用于所有目的，特别是用于与杂合聚合酶有关的所有教导。在一些实施方案中，所述聚合酶与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34或SEQID NO：61基本上(例如，至少60、70、80、85、90或95％)相同。

多种聚合酶可以用作聚合酶的聚合酶结构域的至少一部分。已知至少 5个家族的DNA依赖性DNA聚合酶，尽管大部分属于家族A、B和C。不同家族之间存在很少或不存在结构或序列相似性。大多数家族A聚合酶是单链蛋白，其可以含有多酶功能包括聚合酶、3′至5′外切核酸酶活性和5′至3′外切核酸酶活性。家族B聚合酶典型地具有单催化结构域、聚合酶和3′至5′外切核酸酶活性，以及辅助因子。家族C聚合酶典型地是多亚单元蛋白，其具有聚合和3′至5′外切核酸酶活性活性。在大肠杆菌(E.coli)中，已经发现三种类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I(家族A)，II(家族B)，和III(家族C)。在真核细胞中，三种不同的家族B聚合酶，即DNA聚合酶α，δ，和ε，参与核复制，且家族A聚合酶，即聚合酶γ，用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。这些聚合酶中任一种，全部或部分这些聚合酶的组合，以及两个或更多所述聚合酶之间的嵌合物或杂合物或它们的等价物可以用于形成本发明的Sso7聚合酶缀合蛋白的一部分或全部聚合酶结构域。

在一个示例性实施方案中，本发明的聚合酶缀合物具有源自两种亲本聚合酶Pth和DeepVent的聚合酶结构域。这样的聚合酶记述在例如美国申请公开号20040219558、20040214194、20040191825、20030162173中，将其每一篇特此通过引用整体并入用于所有目的，特别是用于与杂合聚合酶有关的所有教导。在一些实施方案中，所述聚合酶与SEQ IDNO：34(任选地包括接头诸如SEQ ID NO：62)或SEQ ID NO：33(任选地包括接头诸如SEQ IDNO：62)或SEQ ID NO：61基本上(例如，至少60、70、80、85、90或95％)相同。

此外，在一些实施方案中，非热稳定的聚合酶也可以根据本发明使用。例如，具有突变(D355A，E357A)的大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow)的大片段(Klenow片段)消除3’→5’外切核酸酶活性。该酶或等价酶可以用于例如这样的实施方案中，其中扩增反应不在高温下进行。

在一些实施方案中，本发明的杂合聚合酶包括包含突变的聚合酶结构域，与包含不具有所述突变的聚合酶结构域的Sso7聚合酶缀合蛋白相比，所述突变减少或消除包含所述聚合酶结构域的任何杂合聚合酶外切核酸酶活性。可以将多种突变引入至天然聚合酶结构域中，以减少或消除3’-5’外切核酸酶活性。例如，美国专利号6,015,668、5,939,301和5,948,614描述了在Tma和Tne DNA聚合酶的3′-5′外切核酸酶结构域中金属结合的天冬氨酸向丙氨酸残基的突变。这些突变将这些酶的3′-5′外切核酸酶活性减少至低于可检测水平。类似地，美国专利号5,882,904描述了Thermococcus barossi中的类似的天冬氨酸-至-丙氨酸的突变，和美国专利号5,489,523教导了沃氏热球菌(Pyrococcus wosei)DNA聚合酶的双突变D14lA E143A。这两种突变聚合酶实际上不具有可检测的3’-5’外切核酸酶活性。测定3’-5’外切核酸酶活性的方法是本领域中公知的。参见，例如，Freemont等，Proteins(蛋白)1：66(1986)；Derbyshire等，EMBO J.(EMBO杂志)16：17(1991)和Derbyshire等，Methods in Enzymology(酶学方法)262：36385(1995)。应该理解，尽管上述突变最初在一种聚合酶中识别，但是人们通常可以将该突变引入至其它聚合酶中，以减少或消除外切核酸酶活性。在一个具体实施方案中，本发明的聚合酶在聚合酶结构域中包含双点突变D141A／E143A。与聚合酶氨基酸有关的术语“对应于位置”表示，与参考聚合酶氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2，任选地包括接头诸如SEQ ID NO：62)中的相同氨基酸(例如，D141或E143)比对的氨基酸。序列比较可以利用任何具有默认参数的BLAST(包括BLAST2.2算法)来进行，分别记述在Altschul等，Nuc.Acids Res.(核酸研究)25：3389 3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215：403410(1990)。因而，在一些实施方案中，Sso7聚合酶缀合蛋白在外切核酸酶结构域中包含突变。例如，在一些实施方案中，所述Sso7d聚合酶缀合物与SEQ ID NO：61基本上(例如，至少80％、85％、90％、95％、98％或100％)相同，包含一个或多个在基本上保留聚合酶活性的同时降低外切核酸酶活性的突变，且与如本文中所述的Sso7d DNA结合结构域缀合。在其它实施方案中，这样的Sso7聚合酶缀合蛋白包含根据SEQ ID NO：33(任选地包括接头诸如SEQ ID NO：62)的氨基酸序列。

IV.缀合物

通过本领域技术人员众所周知的方法，可以将Sso7DNA结合结构域和聚合酶连接以形成Sso7-聚合酶缀合物。这些方法包括化学和重组方法。

可以进行Sso7蛋白与聚合酶的化学连接，例如如在Bioconjugate Techniques(生物缀合技术)，Hermanson,编，Academic Press(科学出版社)(1996)中所述。连接可以包括，例如，以通过蛋白化学领域中公知的方法，直接或通过连接化合物，相互连接两种蛋白为目的的衍生化作用。例如，在一个化学缀合实施方案中，连接催化结构域和核酸结合结构域的手段包括异双功能-偶联试剂，其最终促进在两个结构部分之间形成分子间二硫键。在该能力方面有效用于本发明的其它类型的偶联试剂记述在，例如，美国专利4,545,985中。可替换地，分子间二硫键可以方便地在各结构部分中的半胱氨酸之间形成，其天然地发生或通过遗传改造插入。连接结构部分的手段还可以使用异双功能交联试剂之间的硫醚键或特异性低pH可切割交联剂或特异性蛋白酶可切割接头或其它可切割或不可切割化学键。

连接所述缀合蛋白的Sso7和聚合酶结构域的方法还可以包括在通过标准肽合成化学或重组手段分别合成的结构部分之间形成的肽键。缀合蛋白本身也可以利用合成完整或部分氨基酸序列的化学方法来生成。例如，肽可以通过固相技术，诸如，例如，Merrifield固相合成法来合成，其中将氨基酸顺序加入至正在增长的氨基酸链(参见，Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc(美国化学协会杂志)，85：2149-2146)。自动化合成多肽的设备可商购自供应商诸如PE Corp.(Foster City，CA)，并可以根据制造商的说明书来操作。合成的肽可以然后与树脂切割，并例如通过制备高效液相层析法来纯化(参见Creighton，Proteins Structures and Molecular Principles(蛋白结构与分子原理)，50-60(1983))。合成的多肽或所述多肽的子片段的组成可以通过氨基酸分析或测序来验证(例如，Edman降解程序；参见Creighton，Proteins，Structures and Molecular Principles(蛋白、结构与分子原理)，第34-49页(1983))。

另外，可以引入非经典的氨基酸或化学氨基酸类似物作为序列中的置换或添加。非经典的氨基酸包括、但不限于：常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基-脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计者氨基酸诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D型(右旋的)或L型(左旋的)。

在另一个实施方案中，所述Sso7和聚合酶结构域通过接头基团来连接。所述接头基团可以是化学交联剂，包括，例如，琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。接头基团还可以是另外的氨基酸序列，包括，例如，聚丙氨酸，聚甘氨酸或类似地，接头基团。

可替换地，在一些实施方案中，所述融合蛋白中的每个多肽的编码序列在其氨基或羧基端通过肽键以任意顺序直接连接。可替换地，氨基酸接头序列可以用于通过足以确保各多肽折叠为二级和三级结构的距离使第一和第二多肽组分分开。利用本领域中公知的标准技术将这样的氨基酸接头序列引入至融合蛋白中。合适的肽接头序列可以基于以下因素来选择：(1)它们采取柔性延伸构象的能力；(2)它们不能采取能够与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可以与多肽功能性表位相互作用的疏水性或带电残基。典型的肽接头序列包含Gly、Ser、Val和Thr残基。其它接近中性的氨基酸(诸如Ala)也可以用于接头序列中。可以有效用作接头的氨基酸序列包括Maratea等(1985)Gene(基因)40：39-46；Murphy等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)83：8258-8262；美国专利号4,935,233和4,751,180。接头序列通常可以是长度为1-约50个氨基酸，例如，长度为3,4,6,或10个氨基酸，但是长度可以为100或200个氨基酸。当第一和第二多肽具有非必需N端氨基酸区时，可以不需要接头序列，所述非必需N端氨基酸区可以用于分离功能性结构域或防止位阻干扰。一个示例性的肽接头显示在SEQ ID NO：62中。

本发明的示例性缀合物包括这样的缀合物：其包含与SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60中的任一个相同或基本上(例如，至少60、70、80、85、90或95％)相同的多肽，只要所述缀合物在序列中包括非天然的K28或R43氨基酸。

其它化学接头包括糖类接头、脂质接头、脂肪酸接头、聚醚接头，例如，PEG等。例如，聚乙二醇接头可获自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama。这些接头任选地具有酰胺键、巯基键、或异双功能键。

连接Sso7和聚合酶结构域的其它方法包括：通过表达阴性和阳性尾部的离子结合，和通过抗体和抗生蛋白链菌素-生物素相互作用的间接结合。(参见，例如，Bioconjugate Techniques(生物缀合技术)，见上文)。所述结构域也可以通过中间相互作用序列连接在一起。例如，Sso7d-相互作用序列，即结合Sso7d的序列可以与聚合酶连接。然后可以使得到的融合蛋白与Sso7d非共价连接，以生成Sso7d-聚合酶缀合物。

在一些实施方案中，通过编码本发明的缀合物Sso7-聚合酶蛋白的核酸的重组表达来生产所述蛋白。这样的融合产物可以如下制备：通过本领域已知的方法，在适当的编码框中使编码期望的氨基酸序列的适当核酸序列彼此连接，并通过本领域已知的方法表达产物。

编码要掺入本发明融合蛋白中的结构域的核酸可以利用重组遗传学领域中的常规技术来获得。公开本发明中使用的一般方法的基础课本包括Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)(第3版2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(基因转移和表达：实验室手册)(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学方案)(Ausubel等编.，1994-1999)。

使用多种方法中的任一种，可以得到编码Sso7和聚合酶多肽的核酸序列。在一些实施方案中，所述编码多肽的核酸序列通过与探针杂交而从cDNA和基因组DNA文库进行克隆，或使用扩增技术用寡核苷酸引物进行分离。更常见地，使用DNA或RNA模板，使用扩增技术来扩增和分离Sso7和聚合酶序列(参见，例如，Dieffenfach和Dveksler，PCR Primers：ALaboratory Manual(PCR引物：实验室手册)(1995))。可替换地，可以合成地制备重叠寡核苷酸，并连接以产生一个或多个结构域。还可以使用抗体作为探针从表达文库中分离出编码催化或双链核酸结合结构域的核酸。

在使用PCR获得编码Sso7或聚合酶结构域的核酸的一个例子中，使用含有一个限制位点的有义引物和含有另一个限制位点的反义引物，PCR扩增核酸序列或子序列。这将产生编码期望的结构域序列或子序列和具有末端限制位点的核酸。然后可以将该核酸连接进载体中，所述载体含有编码第二结构域且具有适当的对应限制位点的核酸。所述结构域可以直接地连接，或者可以被接头或其它蛋白序列隔开。本领域技术人员使用在GenBank或其它来源中提供的序列信息，可以确定合适的PCR引物。还可以通过定位诱变将适当的限制位点添加至编码蛋白或蛋白子序列的核酸。用适当的限制性内切核酸酶切割含有编码结构域的核苷酸序列或子序列的质粒，然后根据标准方法连接进适当的载体中进行扩增和／或表达。

技术人员还会认识到，可以在不减少其生物学活性的条件下，对Sso7和聚合酶结构域另外进行修饰。可以进行一些修饰，以促进结构域克隆、表达或引入融合蛋白中。这样的修饰是本领域技术人员公知的，且包括，例如，在编码结合结构域的多核苷酸任一端添加密码子以提供，例如，在氨基端添加的甲硫氨酸以提供起始位点，或置于任一端上的另外的氨基酸(例如，聚His)以构建方便定位的限制位点或终止密码子或纯化序列。

还可以修饰一个或多个结构域以促进2个结构域的连接，从而得到编码本发明的融合多肽的多核苷酸。因而，通过这样的方法修饰的Sso7和聚合酶结构域也是本发明的一部分。例如，可以将半胱氨酸残基的密码子置于结构域的任一个末端，使得所述结构域可以通过例如硫化物键相连。可以使用重组或化学方法进行所述修饰(参见，例如，PierceChemical Co.catalog，Rockford IL)。

重组融合蛋白的Sso7和聚合酶结构域可以通过接头结构域连接，所述接头结构域经常是包括Gly、Ser、Ala和Val的多肽序列，诸如上述的那些。在一些实施方案中，将脯氨酸残基掺入接头中以防止所述接头形成显著的二级结构元件。

在一些实施方案中，对编码本发明蛋白的重组核酸进行修饰，以提供增强所述核酸在选定生物体中的翻译的优选密码子(例如，将酵母优选的密码子置换进用于在酵母中表达的编码核酸中)。

可以使用本领域普通技术人员已知的多种表达系统来表达本发明的蛋白缀合物。在一些实施方案中，将编码融合多肽的多核苷酸置于启动子的控制下，所述启动子在期望的宿主细胞中起作用。众多启动子是可获得的，且可以用于本发明的表达载体中，这取决于具体的应用。一般地，所选的启动子取决于其中所述启动子将具有活性的细胞。还任选地包括其它表达控制序列诸如核糖体结合位点、转录终止位点等。包括这些控制序列中的一个或多个的构建体称为“表达盒”。因此，引入编码连接的多肽的核酸，以在所需宿主细胞中获得高水平表达。

适合用于特定宿主细胞中的表达控制序列通常通过克隆在该细胞中表达的基因来获得。常用的原核控制序列，其在本文中定义为包括用于转录起始的启动子，任选地，与操纵子一起，连同核糖体结合位点序列，包括这样的常用启动子，如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Change等，Nature(自然)(1977)198：1056)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)(1980)8：4057)，tac启动子(DeBoer,等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)(1983)80：21-25)；和λ-来源的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等，Nature(自然)(1981)292：128)。特定的启动子系统对于本发明不是关键的，可以使用任何可获得的在原核生物中起作用的启动子。标准细菌表达载体包括质粒诸如基于pBR322的质粒，例如，pBLUESCRIPT、pSKF、pET23D、和融合表达系统诸如GST和LacZ。还可以将表位标签添加至重组蛋白，以提供方便的分离方法。

为了在除大肠杆菌以外的原核细胞中表达融合多肽，需要在特定原核物种中起作用的启动子。这样的启动子可以获自已经有该物种克隆的基因，或可以使用异源启动子。例如，除大肠杆菌外，杂合trp-lac启动子还在芽孢杆菌属(Bacillus)中起作用。这些和其它合适的细菌启动子是本领域中公知的，且记述在，例如，Sambrook等和Ausubel等中。用于表达本发明蛋白的细菌表达系统可以在例如，大肠杆菌、杆菌属物种和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva等，Gene(基因)22：229-235(1983)；Mosbach等，Nature(自然)302：543-545(1983)中获得。用于这样的表达系统的试剂盒可商购。

用于哺乳动物细胞、酵母、和昆虫细胞的真核表达系统是本领域中公知的，且也是可商购的。在酵母中，载体包括酵母整合质粒(例如，YIp5)和酵母复制质粒(YRp系列质粒)和pGPD-2。包含两种真核病毒的调节元件的表达载体典型地用于真核表达载体，例如，SV40载体，乳头瘤病毒载体，和源自EB病毒的载体中。其它示范性真核载体包括pMSG，pAV009／A+，pMTO10／A+，pMAMneo-5，杆状病毒pDSVE,和容许在CMV启动子，SV40早期启动子，SV40晚期启动子，金属硫蛋白启动子，鼠乳腺肿瘤病毒启动子，劳氏肉瘤病毒启动子，多角体蛋白(polyhedrin)启动子，或显示出对在真核细胞中表达有效的其它启动子的指导下表达蛋白的任何其它载体。

组成性或调节性启动子可以用于本发明中。调节性启动子可以是有利的，因为在诱导融合多肽表达前宿主细胞可以生长至高密度。异源蛋白的高水平表达在一些情形中延缓细胞生长。诱导型启动子是在可通过环境或发育因素诸如，例如，温度、pH、无氧或有氧条件、光、转录因子和化学制品改变表达水平的情况下指导基因表达的启动子。

关于大肠杆菌和其它细菌宿主细胞，诱导型启动子是本领域技术人员已知的。这些包括，例如，lac启动子，噬菌体λPL启动子，杂合trp-lac启动子(Amann等(1983)Gene(基因)25：167；de Boer等(1983)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)80：21)，和噬菌体T7启动子(Studier等(1986)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)；Tabor等(1985)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)82：1074-8)。这些启动子及其应用在Sambrook等(见上文)中讨论。

用于其它生物体的诱导型启动子也是本领域技术人员众所周知的。这些包括，例如，金属硫蛋白启动子、热休克启动子、以及许多其它启动子。

翻译偶联可以用于增强表达。该策略使用源自对翻译系统天然的高度表达基因的短上游可读框，其置于启动子的下游，和核糖体结合位点，及随后相隔几个氨基酸密码子的终止密码子。紧挨着终止密码子之前是第二核糖体结合位点，且终止密码子之后是用于起始翻译的起始密码子。该系统溶解RNA中的二级结构，容许翻译的有效起始。参见Squires，等(1988)，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)263：16297-16302。

多核苷酸构建体的构造一般需要使用能够在细菌中复制的载体。这样的载体常用于本领域中。可商购许多试剂盒，以纯化来自细菌的质粒(例如，EasyPrepJ，FlexiPrepJ，来自Pharmacia Biotech(药物生物技术)；StrataCleanJ，来自Stratagene；和，QIAexpress表达系统，Qiagen)。分离的和纯化的质粒可以然后进一步操作，以生成其它质粒，并用于转化细胞。

所述融合多肽可以在细胞内表达，或可以由细胞分泌。细胞内表达通常导致高产率。如果需要，可溶的活性融合多肽的量可以通过执行再折叠程序来增加(参见，例如，Sambrook等，见上文.；Marston等，Bio／Technology(生物／技术)(1984)2：800；Schoner等，Bio／Technology(生物／技术)(1985)3：151)。本发明的融合多肽可以在多种宿主细胞，包括大肠杆菌，其它细菌宿主、酵母和不同高等真核细胞诸如COS，CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系中表达。所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞、或微生物，诸如，例如，酵母细胞、细菌细胞、或真菌细胞。

一旦表达，所述重组融合多肽可以根据本领域的标准程序，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等来纯化(参见，一般地，R.Scopes，Protein Purification(蛋白质纯化)，Springer-Verlag，N.Y.(1982)，Deutscher，Methods in Enzymology(酶学方法)卷182：Guide to Protein Purification.(蛋白质纯化指导)，Academic Press，Inc.(科学出版社)N.Y.(1990))。至少约90-95％的同质性的基本纯组成是优选的，且98-99％以上的同质性是最优选的。一旦部分地纯化或如果需要，纯化至同质，则可以然后使用所述多肽(例如，作为用于抗体生成的免疫原)。

为了促进本发明的融合多肽的纯化，编码所述融合多肽的核酸还可以包括关于表位或“标签”的编码序列，关于所述表位或“标签”可以获得亲和结合试剂。合适的表位的例子包括myc和V-5报告基因；有效用于重组生成具有这些表位的融合多肽的表达载体是可商购的(例如，Invitrogen(Carlsbad CA)载体pcDNA3.1／Myc-His和pcDNA3.1／V5-His适合于在哺乳动物细胞中表达)。适合于使标签与本发明的融合蛋白连接的另外的表达载体和相应的检测系统是本领域技术人员已知的，且许多是可商购的(例如，FLAG″(Kodak，Rochester NY)。合适的标签的另一个实例是多组氨酸序列，其能够结合金属螯合的亲和配体。典型的，使用6个相邻的组氨酸(SEQ ID NO：63)，尽管人们可以使用多于或少于6个。可以担当多组氨酸标签的结合结构部分的合适金属螯合亲和配体包括次氮基三乙酸(NTA)(Hochuli，E.(1990)″Purification of recombinant proteins with metal chelatingadsorbents(使用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白)″，在Genetic Engineering：Principlesand Methods(遗传工程：原理和方法)，J.K.Setlow,编，Plenum Press，NY；可商购自Qiagen(Santa Clarita，加利福尼亚))。

V.方法

如本文所讨论的，本发明提供了用于核酸扩增反应中的缀合蛋白。所述扩增反应包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，DNA连接酶链反应(LCR)，QBeta RNA复制酶，和基于RNA转录的(诸如TAS和3SR)扩增反应以及本领域技术人员已知的其它反应。可以利用本文中所述的组合物进行的聚合酶链反应包括但不限于反转录PCR(rt-PCR)和定量PCR(qPCR)。

如将理解的，本文中所述的不同组分的任意组合属于本发明，利用本发明的不同组分的任意组合的扩增反应也属于本发明。例如，本发明的扩增反应可以利用Sso7聚合酶缀合物，所述Sso7聚合酶缀合物包含一个或多个去除或完全消除外切核酸酶活性、特别是3’-5’外切核酸酶活性的突变。所述扩增反应可以进一步利用与热起始抗体组合的所述突变杂合聚合酶。本发明的一些扩增反应可以利用这样的突变杂合聚合酶，其包含与添加剂诸如肌氨酸或肝素组合的D141A／E143A双点突变。本发明的一些扩增反应还可以利用与热起始抗体和与添加剂诸如肌氨酸或肝素组合的缺乏3’-5’外切核酸酶活性的突变杂合聚合酶。

在一些实施方案中，可以使用基于染料的qPCR检测方法来监测利用本发明组分的扩增反应。这样的检测方法一般依赖于监测由于DNA结合染料与扩增的DNA的结合而引起的荧光信号增加。例如，SYBR Green I，即一种常用的荧光DNA结合染料，结合所有双链DNA并且通过测量整个循环中荧光增加来监测检测。

在其它实施方案中，使用基于探针的qPCR检测方法来监测利用本发明组分的扩增反应。这样的检测方法一般依赖于所需PCR产物的序列特异性检测。与检测全部双链DNA的基于染料的qPCR方法不同，基于探针的qPCR利用荧光标记的靶标特异性探针，其检测扩增DNA中的特定序列。

VI.反应混合物

本发明也提供了反应混合物，其包含本发明的Sso7-聚合酶缀合物。任选地，抗体与聚合酶复合。所述反应混合物可以任选地包含一种或多种dNTP、一种或多种寡核苷酸、包含靶核酸的生物学样品、和／或双链的DNA结合染料或可用于PCR或引物延伸反应的其它试剂。

在一些方面，可能需要包括另外的化合物作为添加剂来提高扩增反应(包括但不限于qPCR)的效率。在一些实施方案中，与缺乏添加剂的对照混合物相比，包含添加剂足以增加聚合酶效率至少5、10、15、20、25、35、40或50％或更多。

在一些实施方案中，所述添加剂是包括在本发明的扩增反应中的渗透剂(osmolyte)，以提高效率。渗透剂家族的成员已经显示出提高蛋白的热稳定性(Santoro，Biochemistry(生物化学)，1992)以及降低DNA双螺旋稳定性(Chadalavada，FEBS Letters(FEBS书信)，1997)。在一些实施方案中，渗透剂是小分子或化合物，其通过有生命的生物体应答环境压力诸如极端温度、脱水、或盐度而产生并且保护它们的细胞组分并帮助维持最佳胞质条件。用于本发明中的渗透剂可以包括但不限于肌氨酸、三甲胺N-氧化物(TMAO)、二甲基磺基丙酯和三甲基甘氨酸。

在一些实施方案中，浓度为约100-约1000mM的渗透剂用于本发明的方法和试剂盒中。在其它实施方案中，浓度为约50-约700，约100-约600，约150-约500，约200-约400mM，和约300-约350mM的渗透剂用于本发明的方法和试剂盒中。在一些实施方案中，本发明的方法、反应混合物、和试剂盒中使用的渗透剂是肌氨酸(任选地，处于以上列出的浓度)。

在一些实施方案中，特别是在低拷贝靶核酸的扩增中，效率降低，这归因于聚合酶与非引物双链核酸靶标的结合。聚合酶与双链靶标的结合会阻止那些靶标变性，与引物杂交，和经历扩增反应。为了提高聚合酶与引物模板的特异性，在一些实施方案中，本发明的反应混合物利用肝素。肝素分子，其带负电，可以包括在反应混合物中，以模拟双链核酸的静电特性。加入肝素可以，在不受作用机制的限制性下，阻止过量聚合酶与双链模板结合直至单链引物模板可以使用。在一些示范性实施方案中，肝素以约50-约750pg/μl的浓度用于本发明的方法和试剂盒中。在其它示范性实施方案中，肝素以约75-约700、约100-约600、约125-约500、约150-约400、约175-约300、和约200-约250pg／μl的浓度用于本发明的方法和试剂盒中。本领域中已知的其它分子可以类似的方式用于阻止聚合酶与非引物双链模板的非特异性结合。

在一些实施方案中，所述反应混合物包含这样的试剂：当在扩增靶核酸分子之前加入扩增反应混合物中时，其会提高核酸扩增的特异性。在一些实施方案中，所述试剂选自精氨酸(例如，L-精氨酸或D-精氨酸)、亚精胺和精胺。在一些实施方案中，所述试剂是精氨酸。

在一些实施方案中，所述提高核酸扩增特异性的试剂以约1mM至约500mM的浓度存在于扩增反应混合物中。在一些实施方案中，所述试剂以约1mM至约100mM、约1mM至约75mM、约1mM至约50mM、约1mM至约25mM、或约5mM至约15mM的浓度存在。

本发明的精氨酸、亚精胺和／或精胺试剂可以作为盐来提供。可适用的盐形式的例子包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如，(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐和苯甲酸盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。也包括碱加成盐诸如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐、或镁盐或类似盐。当本发明的试剂含有相对碱性的官能团时，通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需酸(净的或在合适的惰性溶剂中)，可以获得酸加成盐。可接受的酸加成盐的例子包括源自无机酸的那些以及源自有机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，所述有机酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。在一些实施方案中，精氨酸、亚精胺和／或精胺盐是单盐酸盐、二盐酸盐、三盐酸盐或四盐酸盐。

在一些实施方案中，本发明的扩增反应混合物包含：如本文中所述的聚合酶(例如，聚合酶-Sso7缀合物)，其浓度为约1U／ml至约75U／ml(例如，约1U／ml、5U／ml、10U／ml、15U／ml、20U／ml、25U／ml、30U／ml、35U／ml、40U／ml、45U／ml、50U／ml、55U／ml、60U／ml、65U／ml、70U／ml或75U／ml)；精氨酸、亚精胺或精胺，或其盐，其浓度为约1mM至约100mM(例如，约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM)；dNTP，其浓度为约0.1mM至约10mM(例如，约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM)；镁，例如，MgCl₂，其浓度为约1mM至约20mM(例如，约1 mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM)；(NH₄)₂SO₄，其浓度为约10mM至约100mM(例如，约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM)；钾，例如，KCl，其浓度为约50mM至约200mM(例如，约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM)；缓冲液，例如，浓度为约50mM至约200mM(例如，约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM)的Tris pH8.5-9.5，或当在20℃至37℃之间时具有不超过0.027pH单位／℃的变化的缓冲液(当在0.1M浓度测量时)，其浓度为约5mM至约200mM(例如，约5mM、10mM、25mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM)；二糖，例如，海藻糖，其浓度为约100mM至约500mM(例如，约100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM或500mM)；一种或多种渗透剂，例如，肌氨酸、三甲胺N-氧化物(TMAO)、二甲基磺基丙酯和三甲基甘氨酸，其浓度为约50mM至约200mM(例如，约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM)；吐温-20，其浓度为约0.1％至约0.5％(例如，约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％)；甘油，其浓度为约1％至约10％(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％)；DMSO，其浓度为约1％至约10％(例如，约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％)；荧光素，其浓度为约0.001％至约0.01％(例如，约0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％或0.01％)；和DNA结合染料(例如，花青染料)，其浓度为约0.5X至约5X(例如，约0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1X、1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X、4X、4.5X或5X)。

已经发现，在扩增反应中包括POPSO可以提高扩增特异性，并且基于该发现，认为，当在20℃至37℃之间时具有不超过0.027pH单位／℃的变化的任意缓冲液(例如，POPSO)将具有相同的作用。因而，上面描述的反应混合物可以包括，例如，HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)、MOPSO(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙烷磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)、TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基丙烷磺酸)、POPSO(哌嗪-N,N′-双(2-羟基丙烷磺酸))、BICINE(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、TAPS(N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)或AMPSO(N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸)。

VII.试剂盒

在一个方面，本发明提供了用于进行核酸扩增反应的试剂盒。在一些实施方案中，这样的试剂盒包括Sso7-聚合酶缀合物、和任选的dNTP、和至少一种缓冲液(例如，Triss或当在20℃至37℃之间时具有不超过0.027pH单位／℃的变化的缓冲液(例如，HEPES或POPSO))。这样的试剂盒还可以包括引物、探针、稳定剂和其它添加剂(例如，精氨酸、亚精胺、精胺、肝素和／或肌氨酸)以增加扩增反应的效率。所述试剂盒还可以包括一种或多种引物以及用于利用所述试剂盒的组分进行核酸扩增反应的说明书。

在另一方面，本发明提供包括这样的组分的试剂盒，所述组分提高核酸扩增反应的效率和特异性超过使用常规反应条件和反应物进行的反应。这样的另外的组分在本文中进一步描述，并包括但不限于热起始抗体和／或添加剂诸如肌氨酸和肝素。

实施例

下述实施例意图解释、而不是限制要求保护的发明。

实施例1

基于SEQ ID NO：2(作为聚合酶结构域)和SEQ ID NO：3(作为Sso7d结构域)，制备了一系列Sso7d-聚合酶缀合物。所述Sso7d结构域在位置28(野生型K)或43(野生型R)处发生突变。如下试验得到的缀合物：扩增模板DNA分子，并使用解链温度分析用SYBR GREEN检测得到的产物。使用1ng HeLa细胞衍生出的cDNA作为模板，进行两步PCR以扩增18s扩增子(18s68)。使用以下的常规2-步PCR方案，在Bio-Rad CFX96qPCR仪器上进行qPCR：在每个扩增循环中，在95℃保持5s的变性步骤，随后在61℃保持30s的退火-延伸步骤。进行40个PCR扩增循环，并随后使用0.5℃温度增量进行解链曲线分析，在每个步骤中保持5s。使用解链曲线分析来评价PCR特异性，这是基于它们的解离(解链)行为来表征双链DNA(dsDNA)的技术，因为它们随着温度升高(Tm)而从dsDNA转变为单链DNA(ssDNA)。一般而言，在解链曲线分析之前，通过PCR来扩增靶序列。根据核苷酸序列、长度、GC含量和链互补性，PCR产物的解链将产生特异性的解链温度的单个峰。因此，单个解链峰指示一种特异性的PCR产物。多个峰指示除了特异性产物以外还有非特异性产物存在。

尽管野生型缀合物产生了非常非特异性的产物(即，在解链曲线分析中的2个峰)，许多在与K28对应的位置处的置换会导致提高的活性，即，降低的非特异性聚合酶活性。其中R28改变为S、T、C、P、D、E、N或Q中的任一个的突变体具有比R28野生型提高的活性(特异性)。R28M和R28R没有显著优于野生型。试验的K28变体Sso7d-聚合酶缀合物包括具有根据SEQ ID NO：35-42的序列的那些缀合物。

然后使用1ng HeLa细胞衍生的cDNA作为模板，并在如上所述的相同条件下，进行两步PCR以扩增β-肌动蛋白扩增子(ActB86)，从而评价R43变体Sso7d-聚合酶缀合物的PCR特异性。许多置换导致降低的非特异性聚合酶活性。例如，其中R43改变为G、A、S、T、C、V、L、I、M、F、Y、D、E、N、Q、H、K或W中的任一个的突变体具有比R43野生型提高的活性(特异性)。R43M具有轻微非特异性的肩，但是仍然比野生型显著提高。试验的R43变体Sso7-聚合酶缀合物包括具有根据SEQ ID NO：43-60的序列的那些缀合物。

另外，发现通过向PCR反应混合物中加入试剂也可以降低非特异性聚合酶活性。使用10ng、1ng、100pg和10pg HeLa细胞衍生的cDNA作为模板，进行PCR以扩增18s扩增子(18s68)。使用以下的常规2-步PCR方案进行qPCR：在每个扩增循环中，在98℃保持5s的变性步骤，随后在60℃保持30s的退火-延伸步骤。进行40个PCR扩增，并随后如上所述进行解链曲线分析。L-精氨酸单盐酸盐(10mM)、亚精胺三盐酸盐(5mM)或精胺四盐酸盐(5或10mM)的加入会进一步降低试验的Sso7d-聚合酶缀合物变体的非特异性活性。这在使用含有10mML-精氨酸单盐酸盐的、具有不同模板浓度(从10ng至10pg)的反应混合物的qPCR结果中得到进一步证实。与缺乏游离精氨酸的对照组相比，含有游离精氨酸的对应反应在每种模板浓度具有更多特异性的产物和显著更低的非特异性产物。

接着，试验了精氨酸的增强qPCR试剂混合物的抑制剂耐受性的作用。扩增反应混合物含有终浓度为约24U／ml的、与突变的Sso7d结构域(SEQ ID NO：38)缀合的外切核酸酶缺陷型聚合酶(SEQ ID NO：33)和聚合酶抑制剂(2种不同巧克力(Enlveonet或Tanzanie)之一，常见的PCR抑制剂)。从一组样品中省略精氨酸，并以10mM的浓度加入另一组样品中。巧克力在qPCR反应物中的最终百分比浓度在0-2％范围内。使用1ng HeLa细胞衍生的cDNA作为模板，进行PCR以扩增ADAR扩增子(ADAR_162)。使用以下的常规2-步PCR方案进行qPCR：在每个扩增循环中，在95℃保持5s的变性步骤，随后在60℃保持30s的退火-延伸步骤。进行40个PCR扩增，并随后如上所述进行解链曲线分析。在有不同浓度的抑制剂存在下的成功PCR扩增(由扩增反映，并且也通过Ct值评价)指示反应混合物对PCR抑制剂的耐受程度。对于两种巧克力，在有较高浓度的抑制剂存在下，针对在没有精氨酸存在下的试剂混合物观察到差的扩增或没有扩增。相比而言，即使在有2％抑制剂存在下，补充了精氨酸的试剂混合物仍然表现出良好PCR扩增，从而提示了更高的抑制剂耐受性。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的，并且提示本领域技术人员可以以此为依据进行各种变型或改变，且它们包括在本申请的精神和范围和所附权利要求范围内。本文引述的所有公开文献、专利和专利申请通过参考引用为所有目的整体并入本文。

Claims

1.一种Sso7聚合酶缀合蛋白，其包含与聚合酶结构域连接的Sso7结构域；其中：

所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)；其中所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)，其中所述缀合蛋白与其它方面相同的对照缀合蛋白相比具有降低的非特异性扩增活性，在所述对照缀合蛋白中所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸是赖氨酸(K)。

2.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)。

3.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域基本上没有3’-5’外切核酸酶活性。

4.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7聚合酶缀合蛋白的序列为SEQ ID NO:35-42所示。

5.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域具有热稳定的聚合酶活性。

6.根据权利要求5所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。

7.根据权利要求6所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域是ΔTaq聚合酶结构域。

8.根据权利要求5所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域是家族B聚合酶结构域。

9.根据权利要求8所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域来自热球菌属(Pyrococcus)。

10.一种反应混合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。

11.根据权利要求10所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含以下各项中的至少一种：一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸、盐、DNA结合染料、或稳定剂。

12.一种试剂盒，其包含权利要求1-9中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，在含有所述缀合蛋白的相同或不同容器中，所述试剂盒进一步包含以下各项中的至少一种：一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸、盐、DNA结合染料、或稳定剂。

14.一种扩增样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：在允许用引物扩增靶核酸的条件下，在反应混合物中温育所述靶核酸，所述反应混合物包含：

a.至少一种引物；和

b.权利要求1-9中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，

由此扩增所述靶核酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法包括聚合酶链反应(PCR)。

16.一种核酸，其由编码权利要求1-9中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸组成。

17.一种核酸，其由编码启动子的序列和编码权利要求1-9中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸组成。

18.一种核酸，其由编码权利要求1-9中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸和编码可获得亲和结合试剂的表位或标签的序列组成。

19.一种包含重组表达盒的细胞，所述表达盒包含与权利要求16-18中任一项所述的多核苷酸可操作地连接的启动子。

20.一种Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7聚合酶缀合蛋白的序列为SEQ ID NO:43-60所示。