JP2014511693A - 非特異的活性が低下したSso7ポリメラーゼコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年4月8日付で出願された米国仮特許出願第61/473,682号および2011年6月22日付で出願された米国仮特許出願第61/499,873号の優先権の恩典を主張し、各出願は参照により組み入れられる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような核酸増幅反応は一般に、標的核酸の別々の相補鎖を過剰の二種類のオリゴヌクレオチドプライマーで処理することによって所望の核酸配列が増幅される鋳型依存的な反応である。プライマーは伸長して相補的なプライマー伸長産物を形成し、これが所望の核酸配列を合成するための鋳型として働く。そのような過程で、各DNA鎖上のプライマー間の核酸配列が選択的に増幅される。
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸がリジン(K)ではなく; かつ/または
SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸がアルギニン(R)ではない、
Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質を提供し、ここで、該コンジュゲートタンパク質は、SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸がリジン(K)でありかつSEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸がアルギニン(R)であること以外は同一である対照コンジュゲートタンパク質と比べて、低下した非特異的増幅活性を有する。
a. 少なくとも一つのプライマー; および
b. 上記のまたは本明細書の他の箇所に記述のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質
を含む反応混合物中で、標的核酸を、該プライマーによる該標的核酸の増幅を可能とする条件の下でインキュベートし、それによって該標的核酸を増幅させる段階
を含む。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者が通常理解するのと同じ意味を一般に有する。一般的に、本明細書において用いられる専門用語ならびに以下に記述される細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野において周知とされ通常利用されるものである。核酸およびペプチド合成には標準的な技術が用いられる。その技術および手順は、当技術分野における従来の方法、および本書の全体にわたって示される各種一般的な参考文献(一般的に、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる)に従って一般に行われる。本明細書において用いられる専門用語ならびに以下に記述される分析化学および有機合成における実験手順は、当技術分野において周知とされ通常利用されるものである。
I. 導入
本発明は、野生型Sso7ドメインを含むSso7ポリメラーゼコンジュゲートと比べて低減された非特異的増幅活性を示す変種Sso7ポリメラーゼコンジュゲートを提供する。変種Sso7ポリメラーゼコンジュゲートは、少なくとも、変種Sso7結合ドメインに連結されたポリメラーゼドメインを含む。変種Sso7 DNA結合ドメインは、二つの位置(SEQ ID NO:2におけるK28および/またはR43に対応する)の一方または両方に、その位置の野生型アミノ酸と比べてアミノ酸の変化を含む。実施例において実証されるように、野生型からのこの位置でのいくつかの異なるアミノ酸の置換が、非特異的ポリメラーゼ活性を低減することが示された。非特異的ポリメラーゼ活性は、ハイブリダイズしたプライマーの鋳型特異的な伸長によるもの以外に行われる核酸の増幅を含む。
本発明のポリメラーゼコンジュゲートは、天然(野生型) Sso7d配列と比べてアミノ酸の置換を有するSso7ポリペプチド配列を含む。Sso7dは、超好熱古細菌スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来の小型の(63アミノ酸、約7 kdのMW)塩基性染色体タンパク質である。このタンパク質は、リジンに富み、高い熱安定性、酸安定性、および化学安定性を有する。このタンパク質は、配列非依存的にDNAに結合し、結合時に、ある条件の下でDNAのTmを40℃まで増大する(McAfee et al., Biochemistry 34:10063-10077, 1995)。Sso7dおよびその相同体は、典型的には、高温でゲノムDNAをパッケージングすること、およびゲノムDNAを安定化させることに関与すると考えられている。Sso7dタンパク質配列は、SEQ ID NO:2に記載されている。
概して、本質的に任意のポリメラーゼを本発明の変種Sso7タンパク質配列に連結させて、本発明のSso7-ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質を形成させ、それにより、ポリメラーゼのさまざまな活性を改善させられるものと考えられる。一つの例示的な態様において、Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質はPfuおよびDeep Ventのような、二つの親ポリメラーゼに由来するポリメラーゼドメインを含む。そのようなポリメラーゼは、例えば、米国特許出願公開第20040219558号; 同第20040214194号; 同第20040191825号; 同第20030162173号に記述されており、これらはそれぞれ、全ての目的のために、具体的には、ハイブリッドポリメラーゼに関連する全ての教示のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:34またはSEQ ID NO:61と実質的に(例えば、少なくとも60、70、80、85、90、または95%)同一である。
当業者に周知の方法によって、Sso7 DNA結合ドメインとポリメラーゼを連結して、Sso7-ポリメラーゼコンジュゲートを形成する。これらの方法は化学的手段および/または組換え手段の両方を含む。
本明細書において論じられるように、本発明は、核酸増幅反応で用いるためのコンジュゲートタンパク質を提供する。そのような増幅反応には非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNAリガーゼ連鎖反応(LCR)、QベータRNAレプリカーゼ、およびRNA転写に基づく(TASおよび3SRなどの)増幅反応、ならびに当業者に公知の他の方法が含まれる。本明細書において記述される組成物を用いて行うことができるポリメラーゼ連鎖反応には非限定的に、逆転写PCR (rt-PCR)および定量的PCR (qPCR)が含まれる。
本発明はまた、本発明のSso7-ポリメラーゼコンジュゲートを含む反応混合物を提供する。任意で、抗体がポリメラーゼと複合体化されてもよい。反応混合物は任意で、一種もしくは複数種のdNTP、一つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、標的核酸を含む生物学的サンプル、および/または二本鎖DNA結合色素、またはPCRもしくはプライマー伸長反応に有用な他の試薬を含んでもよい。
一つの局面において、本発明は、核酸増幅反応を行うためのキットを提供する。いくつかの態様において、そのようなキットは、Sso7-ポリメラーゼコンジュゲート、および任意でdNTP、および少なくとも一種類の緩衝液(例えば、Trissまたは20℃〜37℃の場合に1℃あたり0.027 pH単位未満の変化を有する緩衝液(例えば、HEPESまたはPOPSO))を含む。そのようなキットは、プライマー、プローブ、安定剤および増幅反応の効率を高めるための他の添加物(例えば、アルギニン、スペルミジン、スペルミン、ヘパリン、および/またはサルコシン)を含んでもよい。そのようなキットは、一つまたは複数のプライマーと、キットの構成要素を用いて核酸増幅反応を行うための使用説明書とを含んでもよい。
ポリメラーゼドメインについてはSEQ ID NO:2に基づき、かつSso7dドメインとしてはSEQ ID NO:3に基づき、一連のSso7d-ポリメラーゼコンジュゲートを作出した。Sso7dドメインは位置番号28 (野生型K)または43 (野生型R)で変異させた。得られたコンジュゲートは、鋳型DNA分子を増幅させることにより、および得られた産物を融解温度分析を用いてSYBR GREENで検出することにより試験した。HeLa細胞由来のcDNA 1 ngを鋳型として用い、二段階PCRを行って18sアンプリコン(18s68)を増幅させた。各増幅サイクルにおいて95℃で5秒の変性段階、その後に61℃で30秒のアニール・伸長段階を伴う常用の2段階PCRプロトコルを用い、Bio-Rad CFX96 qPCR機器にてqPCRを行った。40サイクルのPCR増幅を行い、その後、各段階ごとに5秒の保持を伴う0.5℃の温度増分により融解曲線分析を行った。融解曲線分析は、温度(Tm)の増加とともに二本鎖DNA(dsDNA)から一本鎖DNA (ssDNA)に移行する際の、その解離(融解)挙動に基づいてdsDNAを特徴付ける技法であり、その融解曲線分析を用いてPCR特異性を評価した。概して、融解曲線分析の前にPCRによって標的配列を増幅させた。PCR産物の融解は、ヌクレオチド配列、長さ、GC含量および鎖相補性に従って、特定の融解温度の単一のピークを与える。それゆえ、単一の融解ピークは、一つの特異的PCR産物を示す。複数のピークは、特異的産物に加えて非特異的産物の存在を示す。
[本発明1001]
ポリメラーゼに連結されたSso7ドメインを含み、
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸がリジン(K)ではなく; かつ/または
SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸がアルギニン(R)ではない、
Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質であって、
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸がリジン(K)でありかつSEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸がアルギニン(R)であること以外は同一である対照コンジュゲートタンパク質と比べて、低下した非特異的増幅活性を有する、前記Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1002]
Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質の非特異的増幅活性が、対照コンジュゲートタンパク質の非特異的増幅活性と比べて少なくとも10%低減している、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1003]
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、リジン(K)ではない、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1004]
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、セリン(S)、トレオニン(T)、シトシン(C)、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、バリン(V)、トリプトファン(W)、およびチロシン(Y)からなる群より選択される、本発明1003のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1005]
SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、アルギニン(R)ではない、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1006]
SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、アラニン(A)、シトシン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、およびプロリン(P)からなる群より選択される、本発明1005のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1007]
ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1008]
Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2の最初の58個もしくは60個のアミノ酸とまたはSEQ ID NO:2の全長と実質的に(例えば、少なくとも60、75、80、85、90、または95%)同一である、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1009]
Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2と少なくとも90%同一である、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1010]
ポリメラーゼが、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:61と実質的に(例えば、少なくとも60、75、80、85、90、または95%)同一である、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1011]
ポリメラーゼが、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:61を含む、本発明1010のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1012]
ポリメラーゼドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する、本発明1001のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1013]
ポリメラーゼドメインが、ファミリーAポリメラーゼドメインである、本発明1012のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1014]
ポリメラーゼドメインが、ΔTaqポリメラーゼドメインである、本発明1013のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1015]
ポリメラーゼドメインが、ファミリーBポリメラーゼドメインである、本発明1012のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1016]
ポリメラーゼドメインが、パイロコッカス属(Pyrococcus)由来である、本発明1015のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
[本発明1017]
本発明1001〜1016のいずれかのSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質を含む、反応混合物。
[本発明1018]
一つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一つもしくは複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、緩衝液、ヌクレオシド三リン酸、塩、DNA結合色素、または安定剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、本発明1017の反応混合物。
[本発明1019]
本発明1001〜1016のいずれかのSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質を含む、キット。
[本発明1020]
コンジュゲートタンパク質を含有する容器と同じまたは異なる容器の中に、一つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一つもしくは複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、緩衝液、ヌクレオシド三リン酸、塩、DNA結合色素、または安定剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、本発明1019のキット。
[本発明1021]
a. 少なくとも一つのプライマー; および
b. 本発明1001〜1016のいずれかのSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質
を含む反応混合物中で、標的核酸を、該プライマーによる該標的核酸の増幅を可能とする条件の下でインキュベートし、それによって該標的核酸を増幅させる段階
を含む、サンプル中の標的核酸を増幅する方法。
[本発明1022]
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
本発明1001〜1016のいずれかのSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
[本発明1024]
本発明1023のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを含む、細胞。
Claims (24)
- ポリメラーゼに連結されたSso7ドメインを含み、
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸がリジン(K)ではなく; かつ/または
SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸がアルギニン(R)ではない、
Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質であって、
SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸がリジン(K)でありかつSEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸がアルギニン(R)であること以外は同一である対照コンジュゲートタンパク質と比べて、低下した非特異的増幅活性を有する、前記Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。 - Sso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質の非特異的増幅活性が、対照コンジュゲートタンパク質の非特異的増幅活性と比べて少なくとも10%低減している、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、リジン(K)ではない、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- SEQ ID NO:2のK28に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、セリン(S)、トレオニン(T)、シトシン(C)、プロリン(P)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、バリン(V)、トリプトファン(W)、およびチロシン(Y)からなる群より選択される、請求項3記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、アルギニン(R)ではない、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- SEQ ID NO:2のR43に対応するSso7ドメインのアミノ酸が、アラニン(A)、シトシン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、およびプロリン(P)からなる群より選択される、請求項5記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼが、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2の最初の58個もしくは60個のアミノ酸とまたはSEQ ID NO:2の全長と実質的に(例えば、少なくとも60、75、80、85、90、または95%)同一である、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- Sso7ドメインが、SEQ ID NO:2と少なくとも90%同一である、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼが、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:61と実質的に(例えば、少なくとも60、75、80、85、90、または95%)同一である、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼが、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:61を含む、請求項10記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する、請求項1記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼドメインが、ファミリーAポリメラーゼドメインである、請求項12記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼドメインが、ΔTaqポリメラーゼドメインである、請求項13記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼドメインが、ファミリーBポリメラーゼドメインである、請求項12記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- ポリメラーゼドメインが、パイロコッカス属(Pyrococcus)由来である、請求項15記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質を含む、反応混合物。
- 一つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一つもしくは複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、緩衝液、ヌクレオシド三リン酸、塩、DNA結合色素、または安定剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項17記載の反応混合物。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質を含む、キット。
- コンジュゲートタンパク質を含有する容器と同じまたは異なる容器の中に、一つもしくは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、一つもしくは複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、緩衝液、ヌクレオシド三リン酸、塩、DNA結合色素、または安定剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項19記載のキット。
- a. 少なくとも一つのプライマー; および
b. 請求項1〜16のいずれか一項記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質
を含む反応混合物中で、標的核酸を、該プライマーによる該標的核酸の増幅を可能とする条件の下でインキュベートし、それによって該標的核酸を増幅させる段階
を含む、サンプル中の標的核酸を増幅する方法。 - ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項21記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のSso7ポリメラーゼコンジュゲートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
- 請求項23記載のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットを含む、細胞。
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