CN107002063A - 精氨酸提高聚合酶储存稳定性 - Google Patents
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Abstract
提供了包含聚合酶的液体储存溶液。在一些实施方式中,本文提供了用于储存多核苷酸操纵酶(例如,聚合酶或本文所述的其他酶)的液体储存溶液。在一些实施方式中,溶液包含,酶(例如,聚合酶或限制性内切酶);游离精氨酸或其盐或精氨酸衍生物(例如,但不限于精氨酸乙酯,精氨酰胺二盐酸盐)或其盐;和5%或更多的冷冻保护剂。
Description
相关专利申请的交叉参考
本申请要求2014年11月25日提交的美国临时专利申请号62/084,505的优先权,该文通过引用纳入本文。
发明背景
对于各种应用,天然或重组热稳定聚合酶已广泛用于热循环链式反应,例如PCR或qPCR,用于各种应用。对于长期储存稳定性,热稳定聚合酶通常储存在含有一种或多种非离子型洗涤剂,例如NP-40,吐温20,和曲通X的缓冲液中。参见例如美国专利6,127,155。根据美国专利申请2008/0064071 A1和2010/0099150 A1,还发现两性离子洗涤剂如CHAPS,CHAPSO和Surfynol增强聚合酶储存稳定性和活性,尽管以前的出版物表明两性离子洗涤剂,如CHAPS可潜在地造成蛋白质变性(Hielmeland,1980)。
发明内容
在一些实施方式中,本文提供了用于储存多核苷酸操纵酶(例如本文所述的聚合酶或其它酶)的液体储存溶液。在一些实施方式中,所述溶液包含酶(例如聚合酶或限制性内切酶),游离精氨酸或其盐或精氨酸衍生物(例如但不限于精氨酸乙酯,精氨酰胺二盐酸盐)或其盐,和5%或更多的冷冻保护剂。在一些实施方式中,所述冷冻保护剂是二醇,三醇,多元醇,一元醇或亚砜。在一些实施方式中,所述游离精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐的浓度是0.01-5M(例如0.01-2.5M)。
在一些实施方式中,所述储存溶液还包含一种或多种缓冲剂,KCl,乙二胺四乙酸(EDTA),或二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施方式中,所述液体溶液包含缓冲剂并且该缓冲剂是Goods缓冲剂。在一些实施方式中,所述Goods缓冲剂选自下组:MES,BIS-TRIS,ADA,ACES,PIPES,Bis-6Tris丙烷,MOPSO,BES,MOPS,TES,HEPES,DIPSO,MPOS,TAPSO,HEPPSO,POPSO,EPPS,N-三(羟甲基)甲基甘氨酸,TRIS,AMP,重碳酸盐,N-二(羟乙基)甘氨酸,硼酸盐,卡可酸盐,CAPS,CAPSO,CHES,柠檬酸盐,DIPSO,甘氨酸,甘氨酰甘氨酸,磷酸盐,TAPS,TAPSO和TEA。
在一些实施方式中,所述精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐浓度是0.1-1.0M。
在一些实施方式中,所述溶液缺乏足以维持模板多核苷酸的聚合的组分。在一些实施方式中,所述溶液缺乏以下至少一种:模板多核苷酸;或寡核苷酸引物。
在一些实施方式中,所述溶液温度是-80到5℃。在一些实施方式中,所述溶液温度是-30到5℃。在一些实施方式中,所述溶液温度是-80到10℃。在一些实施方式中,所述溶液温度是-80到50℃。在一些实施方式中,所述溶液温度是-80到90℃。在一些实施方式中,所述溶液温度是-80到100℃。
在一些实施方式中,所述溶液不含洗涤剂。在一些实施方式中,所述溶液包含一种或多种洗涤剂。
在一些实施方式中,所述溶液不含三糖。
在一些实施方式中,所述聚合酶是热稳定聚合酶。
在一些实施方式中,所述聚合酶是反转录酶。
在一些实施方式中,所述聚合酶是或包括B家族聚合酶。
还提供了在储存期间保持聚合酶稳定性的方法。在一些实施方式中,所述方法包括提供如以上所述或他处所述的液体溶液;和,储存溶液至少3(例如至少7,14,21,28,50,100)天。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和5℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和10℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和50℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和90℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和100℃之间。在一些实施方式中,所述方法还包括在储存后,在酶促反应中使用该聚合酶。
例如,在一些实施方式中,所述方法包括提供包含所述酶(例如聚合酶或限制性内切酶)和0.01-5.0M精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐的液体溶液;和,储存所述溶液至少3(例如至少7,14,21,28,50,100)天。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和5℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和10℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和50℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和90℃之间。在一些实施方式中,所述储存发生在-80和100℃之间。在一些实施方式中,所述方法还包括:在储存后,在酶促反应中使用该聚合酶。
定义
术语“聚合酶”指进行多核苷酸合成的酶。在一些实施方式中,该聚合酶是模板依赖性聚合酶。在一些实施方式中,所述聚合酶是非模板依赖性聚合酶(例如末端转移酶或多聚A聚合酶)。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的,包括但不限于分离或衍生自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcus litoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶或其修饰版本。它们包括DNA依赖性聚合酶和RNA依赖性聚合酶,如反转录酶。已知至少5个DNA依赖性DNA聚合酶家族,虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间几乎没有或没有序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′核酸外切酶活性和5′到3′核酸外切酶活性)的单链蛋白质。B家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′核酸外切酶活性的单个催化结构域,以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′核酸外切酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中,已经发现了3种类型的DNA聚合酶,DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中,核复制中涉及3种不同的B家族聚合酶,DNA聚合酶α、δ和ε,并且A家族聚合酶,聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。相似地,RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III,和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性和RNA依赖性的。
本文所用的“热稳定聚合酶”或“热稳定性聚合酶”指使用DNA或RNA作为模板通过向核苷酸链中加入核苷酸单元以催化多核苷酸合成的任何酶且该酶在45℃和100℃之间的温度下达到最佳活性。
术语“核酸扩增”或“扩增反应”指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这种方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR),DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202,《PCR方案:方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications)(Innis等编,1990)),(LCR),QBeta RNA复制酶和基于RNA转录(如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它反应。
“扩增”指将溶液置于足以允许多核苷酸扩增的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括,例如,引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语扩增一般是指靶核酸的“指数型”增长。然而,本文所用的扩增也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长,如由循环测序所得。
“寡核苷酸引物”或“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的寡核苷酸序列。引物可以是各种长度并且通常长度小于50个核苷酸,例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列,参见例如Innis等(同上)。
“模板”指包含待扩增的多核苷酸、侧接引物杂交位点的多核苷酸序列。因此,“靶模板”包含侧接5′引物和3′引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸,其是合成的、天然产生的和非天然产生的,其与参比核酸具有相似结合性质,且以与参比核苷酸相似的方式代谢。这种类似物的示例包括但不限于:硫代磷酸(酯)、氨基磷酸(酯)、甲基膦酸(酯)、手性甲基膦酸(酯)、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNAs)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物,以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸,以及作用方式类似于天然产生氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸,以及随后修饰的氨基酸,如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物,即结合于氢、羧基、氨基和R基的α碳,如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽主链,但保留了与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构,但作用方式类似于天然产生氨基酸的化合物。
本文中氨基酸可按IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通常已知的三字母符号或单字母符号表述。核苷酸同样可由其普遍接受的单字母代码表述。
附图的简要说明
图1显示了补充各种洗涤剂的储存缓冲液中DNA聚合酶稳定性的SDS-PAGE分析。泳道1和2是分别在-20℃和55℃储存24小时的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道3是在55℃储存24小时的补充有2×蛋白酶抑制剂混合物的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道4是蛋白质梯标;泳道5和6是分别在-20℃和55℃储存24小时的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道7是在55℃储存24小时的补充有2×蛋白酶抑制剂混合物的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道8和9是分别在-20℃和55℃储存24小时的NP40和吐温20非离子型聚合物洗涤剂储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道10是在55℃储存24小时的补充有2×蛋白酶抑制剂混合物的NP40和吐温20非离子型聚合物洗涤剂储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶。
图2显示了补充各种洗涤剂的储存缓冲液中DNA聚合酶的稳定性和其PCR性能。泳道3和9是分别在-20℃和55℃储存24小时的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道4和10是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷非离子型洗涤剂的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道5和11是分别在-20℃和55℃储存24小时的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道6和12是分别在-20℃和55℃储存24小时的NP40和吐温20非离子型洗涤剂储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道7是100bp DNA梯标;泳道8是使用SciProof DNA聚合酶的PCR对照;*在45℃储存24小时和在35℃储存48小时获得同样的结果(数据未显示)。
图3显示了补充各种洗涤剂的储存缓冲液中DNA聚合酶稳定性的SDS-PAGE分析。每个泳道包含100单位的聚合酶。泳道1和14是蛋白质梯标;泳道2和8是分别在-20℃和55℃储存24小时的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道3和9是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷非离子型洗涤剂的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道4和10是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有SDS离子型洗涤剂的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道5和11是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有CTAB离子型洗涤剂的CHAPS两性离子洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道6和12是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有SDS和CTAB离子型洗涤剂的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道7和13是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有NP40和吐温20非离子型聚合物洗涤剂的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶。
图4显示了包含CHAPS两性离子洗涤剂的补充有各种浓度的L-精氨酸的储存缓冲液中的DNA聚合酶稳定性的SDS-PAGE分析。每个泳道包含25单位的聚合酶。泳道1和2是分别在-20℃和55℃储存72小时的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道3和4是分别在-20℃和55℃储存72小时的补充有0.1ML-精氨酸的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道5和6是分别在-20℃和55℃储存72小时的补充有0.25M L-精氨酸的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道7是蛋白质梯标;泳道8和9是分别在-20℃和55℃储存72小时的补充有0.5M L-精氨酸的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道10和11是分别在-20℃和55℃储存72小时的补充有0.75M L-精氨酸的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道12和13是分别在-20℃和55℃储存72小时的补充有1M L-精氨酸的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶。
图5显示包含NP40/吐温20非离子型聚合物洗涤剂的补充有各种浓度的L-精氨酸的储存缓冲液中的DNA聚合酶稳定性的SDS-PAGE分析。每个泳道包含100单位的聚合酶。泳道1和2是分别在-20℃和55℃储存24小时的储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道3和4是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有0.75M L-精氨酸的储存缓冲液中的Tau DNA聚合酶;泳道5和6是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有1M L-精氨酸的储存缓冲液中的TauDNA聚合酶;泳道7是蛋白质梯标。
图6显示了补充各种添加剂的CHAPS两性离子储存缓冲液中DNA聚合酶稳定性的SDS-PAGE分析。每个泳道包含25单位的聚合酶。泳道1和12是蛋白质梯标;泳道2和3是分别在-20℃和55℃储存24小时的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道4和5是分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有1M L-精氨酸的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道6和7显示了分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有0.1M L-精氨酸的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道8和9显示了分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有50mM氯化铵的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶;泳道10和11显示了分别在-20℃和55℃储存24小时的补充有10mM氯化镁的CHAPS洗涤剂储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶。
发明详述
绪论
发明者惊奇地发现精氨酸和精氨酸衍生物可用于液体储存溶液中以使操纵多核苷酸的酶稳定。例如,发明者已发现精氨酸或精氨酸衍生物可在储存期间稳定聚合酶。在精氨酸和精氨酸衍生物存在下观察到的该酶稳定性在不存在或存在洗涤剂的情况下出现。精氨酸对聚合酶稳定性的影响出人意料地强,产生的溶液与缺乏精氨酸的对照相比可储存至少长九倍的时间。
精氨酸和精氨酸衍生物
游离的精氨酸(例如未连接到另一种氨基酸的L-精氨酸或D-精氨酸)或精氨酸衍生物可用于聚合酶储存溶液中以稳定溶液中的聚合酶。用于储存溶液中的精氨酸或精氨酸衍生物的浓度可以变化并且以提高稳定性的浓度提供。在一些实施方式中,所述浓度是0.01-5M,0.1-2.0M,例如0.1-1.0M,0.5-1.5M,0.6-0.9M等等。
许多精氨酸衍生物是已知的。在一些实施方式中,所述精氨酸衍生物包含精氨酸但包括一个或多个附加部分(例如,精氨酸碳主链中的甲基或羟基(例如5-甲基-精氨酸或c-γ-羟基精氨酸))。其它示例性精氨酸衍生物包括,例如,瓜氨酸。2-氨基-3-胍基丁酸,2-氨基-4-胍基丁酸,芸香碱,高精氨酸,硫代瓜氨酸,L-2-氨基-3-胍基丙酸,4-胍基丁酸,3-胍基丁酸。发明人已表明,例如,包含精氨酸乙酯或精氨酰胺二盐酸化物能提高酶稳定性。
所述精氨酸或精氨酸衍生物可作为盐提供。适用的盐形式的示例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐、或其包括外消旋混合物的混合物)、琥珀酸盐、和苯甲酸盐。这些盐可由本领域技术人员已知的方法制备。还包括碱加成盐如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨盐(organic amino)或镁盐,或类似盐。当本发明的试剂含有相对碱性的官能团时,可通过将该化合物的中性形式接触足量所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)来获得酸加成盐。可接受的酸加成盐的示例包括:衍生自无机酸的盐,所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等,以及衍生自有机酸的盐,所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。在一些实施方式中,精氨酸盐是一盐酸盐,二盐酸盐,三盐酸盐或四盐酸盐。
聚合酶的储存稳定性,和由此相对于对照的储存稳定性的提高可通过例如将聚合酶在55℃下在储存溶液中孵育24小时,然后使用qPCR测量聚合酶扩增模板的能力来测量。储存中的聚合酶的Ct或Cq值的增加表明该聚合酶的活性已经降低,并且Ct或Cq变化的绝对值表明降低的量。稳定性测试也可在环境温度,0℃或更低温度下进行较长时间。相比于缺乏精氨酸或精氨酸衍生物的对照储存溶液,储存溶液中包含精氨酸或精氨酸衍生物将导致Cq或Ct的较小增加。
多核苷酸操纵酶
本发明提供多种多核苷酸操纵酶的稳定化。多核苷酸操纵酶的示例包括但不限于模板依赖性聚合酶,非聚合酶依赖性聚合酶和DNA裂解酶(例如限制性内切酶或DNA酶)。
模板依赖性聚合酶
能够使用多种模板依赖性聚合酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族,虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间几乎没有或没有序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′核酸外切酶活性和5′到3′核酸外切酶活性)的单链蛋白质。B家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′核酸外切酶活性的单个催化结构域,以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′核酸外切酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中,已经发现了3种类型的DNA聚合酶,DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中,核复制中涉及3种不同的B家族聚合酶,DNA聚合酶α、δ和ε,并且A家族聚合酶,聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。这些聚合酶中任一种,这些聚合酶的组合或部分,以及这种聚合酶或其等价物的2种或更多种之间的嵌合物或杂交体均可用于本文所述的储存溶液中。
在一些实施方式中,所述聚合酶具有非天然产生的多肽序列。例如,在一些实施方式中,所述聚合酶包含改善所需聚合酶活性(例如特异性,效率等等)的一种或多种非天然产生的突变或是融合物或嵌合体。在一些实施方式中,所述聚合酶是重组产生的。
在一些实施方式中,所述聚合酶是热稳定的。另外,在一些实施方式中,非热稳定聚合酶也可根据本发明使用。例如,具有突变(D355A,E357A)的大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow)的大片段(Klenow片段)消除了3′-5′核酸外切酶活性。
在一个示例性的实施方式中,所述聚合酶具有衍生自2种亲本聚合酶Pfu和DeepVent的聚合酶结构域。这类聚合酶描述于例如美国申请公开号20040219558;20040214194;20040191825;20030162173,其各自通过引用全文纳入本文用于所有目的且尤其是涉及杂交聚合酶的所有教导。
在一些实施方式中,聚合酶是包括包含突变的聚合酶结构域的聚合酶偶联物的一部分,与包含不具有这种突变的聚合酶结构域的聚合酶相比,所述突变减少或消除包含这种聚合酶结构域的聚合酶的核酸外切酶活性。可以在天然聚合酶结构域中引入各种突变以降低或消除3’-5’核酸外切酶活性。例如,美国专利号6,015,668;5,939,301和5,948,614描述了在Tma和Tne DNA聚合酶的3′-5′核酸外切酶结构域中,金属结合天冬氨酸突变成丙氨酸残基。这种突变将这些酶的3′-5′核酸外切酶活性降低至可检测水平以下。类似地,美国专利号5,882,904描述了白若热球菌(Thermococcus barossi)中类似的天冬氨酸至丙氨酸的突变,并且美国专利号5,489,523教导了沃氏火球菌(Pyrococcus wosei)DNA聚合酶的双重突变体D141A E143A。这些突变体聚合酶实际上均没有可检测的3′-5′核酸外切酶活性。分析3′-5′核酸外切酶活性的方法是本领域熟知的。参见,例如Freemont等,Proteins 1:66(1986);Derbyshire等,EMBO J.16:17(1991)和Derbyshire等,Methods in Enzymology262:363 85(1995)。应理解,虽然上述突变最初在一种聚合酶中鉴定得到,通常可以将这种突变引入到其他聚合酶以降低或消除核酸外切酶活性。本文所用的“核酸外切酶缺陷”指所述聚合酶具有显著降低的核酸外切酶活性(即与野生型集合酶相比少于10%,5%,或1%的3′-5′核酸外切酶活性)或没有核酸外切酶活性。
在一些实施方式中,本发明的核酸扩增方法利用偶联到DNA结合结构域或蛋白质,例如Sso7或Sso7样结构域上的聚合酶多肽或结构域。已知这种聚合酶偶联物显示有提高的处理能力。参见例如美国专利申请号12/683,950,其内容通过引用全文纳入本文用于所有目的且尤其是涉及聚合酶、聚合酶偶联物以及用于制造和使用这种聚合酶的所有方法的所有教导。
Sso7d和Sac7d分别是来自超嗜热古细菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)和嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的小(约7kDa MW)、基本染色体蛋白(例如,参见Choli等,Biochimica et Biophysica Acta 950:193-203,1988;Baumann等,Structural Biol.1:808-819,1994;和Gao等,Nature Struc.Biol.5:782-786,1998)。这些蛋白质以不依赖序列的方式结合DNA,在一些情况下,一旦结合,使得DNA的Tm升高至40℃(McAfee等,Biochemistry 34:10063-10077,1995)。Sso7蛋白质及其同源物通常被认为在升高的温度下参与稳定基因组DNA。Sso7d、Sac7d、Sac7e及相关序列(在这里称为“Sso7蛋白质”或“Sso7结构域”)是本领域已知的(例如,参见UniProt数据库登录号:P39476(Sso7d);O59632(Ssh7b);P13123(Sac7d);P13125(Sac7e)和Q96X56(Sto7e))。在一些实施方式中,通过在Sso7DNA结合结构域中制造一种或多种突变来从野生型Sso7修饰Sso7或Sso7样结构域或蛋白质,参见例如WO 2012/138417。
在一些实施方式中,所述聚合酶包含天然不具有与异源5’-3’核酸外切酶结构域融合的5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶,以生成同时保留聚合酶和5’-3’核酸外切酶活性的融合蛋白。在一些实施方式中,5’-3’核酸外切酶结构域任选通过接头融合至B家族聚合酶的氨基端。
多种具有5’-3’核酸外切酶活性的结构域是已知的且可用于本文所述的融合蛋白中。在一些实施方式中,该5’-3’核酸外切酶结构域是保留5’-3’核酸外切酶活性的侧翼核酸内切酶(FEN1)或其片段。FEN1蛋白通常来自真核生物和古细菌且具有5’-3’核酸外切酶活性。多种FEN1蛋白(以及其活性片段或变体)是已知的(参见例如Williams等,J.Mol.Biol.371(1):34-38(2007))且可用作本文所述的5’-3’核酸外切酶结构域。在一些实施方式中,该FEN1蛋白具有热稳定的5’-3’核酸外切酶活性。热稳定的FEN1蛋白包括但不限于:詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)FEN1蛋白(参见例如Rao等,J.Bacteriol.180(20):5406-5412(1998))、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)FEN1蛋白(参见例如Hosfield等,Cell 95:135-146(1998))或解淀粉类硫还原球菌(Desulfurococcus amylolyticus)FEN1蛋白(参见例如Mase等,Acta CrystallographicaSection F F67:209-213(2011)),以及其活性变体(例如其基本等同的形式)或片段。一种示例性活性FEN1蛋白片段是缺少PCNA相互作用蛋白基序(PIP)盒的FEN1蛋白。PIP盒描述于例如Querol-Audi等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 109(22):8528-8533(2012)。
在一些实施方式中,该5’-3’核酸外切酶结构域来自异源性聚合酶。例如,A家族聚合酶具有5’-3’活性并且因此A家族聚合酶的片段可用作5’-3’核酸外切酶结构域。已描述了大肠杆菌聚合酶(Pol I)的5’-3’核酸外切酶结构域内的保守位点。参见例如,Gutman等,Nucleic Acids Res.21(18):4406-7(1993)。还已鉴定了多种热稳定聚合酶的5’-3’核酸外切酶结构域并以保留的活性单独表达。参见例如Choi等,Biotechnol.Letts.23:1647-52(2001)和Kaiser等,J.Chem.Biol.274(30):21387-21394(1999)。可用于本文所述蛋白融合物的5’-3’核酸外切酶结构域的来源的示例性列表包括但不限于:嗜热栖热菌(Thermusthermophilus(Tth))DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus(Taq))DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana(Tne))DNA聚合酶、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶和栖热袍菌(Thermotoga maritima(Tma))DNA聚合酶,及其突变体和变体(例如其基本等同的形式)和衍生物。
可用于以上所述融合物的示例性聚合酶包括但不限于:极端嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)(例如登录号O59610)、深海火球菌(P.abyssi)(例如登录号P77916)、格氏火球菌(P.glycovorans)(例如登录号CAC12849)、火球菌GE23(Pyrococcussp.GE23)(例如登录号CAA90887)、火球菌GB-D(Pyrococcus sp.GB-D)(例如登录号Q51334)、强烈炽热火球菌(P.furiosus)(例如登录号P61875)、乌兹火球菌(P.woesei)(例如登录号P61876)、鹿儿岛热球菌(Thermococcus kodakaraensis)(例如登录号P77933)、高氏热球菌(T.gorgonarius)(例如登录号P56689)、弗氏热球菌(T.fumicolans)(例如登录号P74918)、热球菌9oN-7(T.sp.9oN-7)(例如登录号Q56366)、超嗜热热球菌NA1(T.onnurineus NA1)(例如登录号ABC11972)、海滨热球菌(T.litoralis)(例如登录号P30317)和聚集热球菌(T.aggregans)(例如登录号O33845),及其保留聚合酶活性的片段和变体(例如其基本等同的形式)。在一些实施方式中,该聚合酶衍生自两种亲本聚合酶,例如Pfu和DeepVent。这种聚合酶在例如美国申请专利公开号20040219558;20040214194;20040191825;20030162173中描述。
在一些实施方式中,该模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。在一些实施方式中,该RNA聚合酶是反转录聚合酶。示例性的反转录酶包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)反转录酶、禽类成髓细胞血症病毒(AMV)反转录酶、呼吸道合胞病毒(RSV)反转录酶、犬感染性贫血病毒(EIAV)反转录酶、劳氏-相关病毒-2(RAV2)反转录酶、SUPERSCRIPT II反转录酶、SUPERSCRIPT I反转录酶、THERMOSCRIPT反转录酶和MMLV RNA酶H-反转录酶。
非模板依赖性聚合酶
在一些实施方式中,所述多核苷酸操纵酶是非模板依赖性聚合酶。示例性非模板依赖性聚合酶包括例如末端转移酶或聚A聚合酶。示例性末端转移酶包括但不限于末端转移酶TdT。示例性聚A聚合酶包括但不限于大肠杆菌聚A聚合酶。
限制性内切酶
在一些实施方式中,所述多核苷酸操纵酶是限制性内切酶。因此,在这些实施方式中,导入基因组DNA的修饰是序列特异性单链(例如切口)或双链切割事件。许多种限制性内切酶是已知的并可用于本发明。
可使用任何类型的限制性内切酶。I型酶在远离其识别序列的位置上随机切割DNA。II型酶在靠近或在其识别序列内的确定的位置切割DNA。一些II型酶在其识别序列内切割DNA。II-S型酶在其识别序列一侧外切割。第三大类II型酶,更适合称为“IV型”,在其识别序列外切割。例如,识别连续序列(例如AcuI:CTGAAG)的酶仅在一侧切割;识别非连续序列(例如BcgI:CGANNNNNNTGC)的酶在两侧切割释放包含识别序列的小片段。III型酶在识别序列外切割并且在相同的DNA分子内相反的方向需要两个这种序列以完成切割。
冷冻保护剂
冷冻保护剂是用来保护酶(例如聚合酶)免受冻害的物质。示例性冷冻保护剂包括但不限于多元醇,包括例如二醇,三醇;多元醇;一元醇;单糖;多糖;或亚砜。示例性二醇冷冻保护剂包括,例如乙二醇,丙二醇和甘油。其它冷冻保护剂包括,例如二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方式中,所述冷冻保护剂以5-80%的浓度,例如10-80%,10-60%,25-70%等等包含在储存溶液中。
其它组分
在一些实施方式中,所述储存溶液是仅具有冷冻保护剂、精氨酸或精氨酸衍生物,和聚合酶的液体溶液。在一些实施方式中,所述储存溶液包含其他组分。
例如,在一些实施方式中,所述储存溶液还包含一种或多种缓冲液。在一些实施方式中,所述缓冲液是“Good”缓冲液(GOOD,N.E.等(1966)Biochemistry 5,467-477;Good,N.E.和Izawa,S.(1972)Methods Enzymol.24,53-68;Ferguson,W.J.等(1980)Anal.Biochem.104,300-310)。示例性Good缓冲液包括例如MES,BIS-TRIS,ADA,ACES,PIPES,Bis-6Tris丙烷,MOPSO,BES,MOPS,TES,HEPES,DIPSO,MPOS,TAPSO,HEPPSO,POPSO,EPPS,N-三(羟甲基)甲基甘氨酸,TRIS,AMP,重碳酸盐,N-二(羟乙基)甘氨酸,硼酸盐,卡可酸盐,CAPS,CAPSO,CHES,柠檬酸盐,DIPSO,甘氨酸,甘氨酰甘氨酸,磷酸盐,TAPS,TAPSO和TEA。
缓冲液可以对酶的最终使用以及提高储存稳定性有用的量包含。根据储存的酶的使用,储存溶液的缓冲液浓缩物可以是使用的浓度或酶的最佳浓度的“母液”浓度,例如10×,50×,100×等等。
在一些实施方式中,所述储存溶液将缺乏一种或多种组分使得该储存溶液在之后不再添加组分的情况下不支持多核苷酸的聚合。例如,在一些实施方式中,所述储存溶液缺乏一种或多种模板多核苷酸或寡核苷酸引物。
在一些实施方式中,所述储存溶液缺乏洗涤剂(例如,不含两性离子洗涤剂,不含非离子洗涤剂)等等。在一些实施方式中,所述储存溶液缺乏三糖。
所述储存溶液可被储存在各种所需的温度下,在一些实施例中期望温度低于4℃。所述储存溶液可被储存在,例如-80到5℃,或-30到5℃的温度下至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周和长达1、2、3、4或5年。
还提供了包含本文所述的稳定聚合酶溶液的试剂盒。
实施例
以下实施例旨在说明但不限于所要求保护的发明。
使用两种热稳定DNA聚合酶Pi和Tau,表明通过在储存缓冲液中补充精氨酸或精氨酸衍生物,例如精氨酸胺和精氨酸乙酯提高聚合酶的稳定性。精氨酸的保护或稳定作用如此突出以至于它的存在显著增加了聚合酶的稳定性并使储存保质期延长了9倍,并且超过了非离子型聚合物洗涤剂或两性离子洗涤剂补充物所达到的稳定性。Pi聚合酶指与Pfu/Vent杂交DNA聚合酶连接的侧翼核酸内切酶(FEN1)的5’-3’核酸外切酶结构域的融合物,Pfu/Vent杂交DNA聚合酶转而与具有K28突变(SEQ ID NO:22)的羧基末端Sso7d结构域融合,然后与聚-His标签融合。Tau聚合酶指与Pfu/Vent杂交DNA聚合酶连接的Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶结构域的融合物,Pfu/Vent杂交DNA聚合酶转而与具有K28突变(SEQ IDNO:22)的羧基末端Sso7d结构域融合,然后与聚-His标签融合。
已经描述非离子型和两性离子洗涤剂以提高热稳定聚合酶的储存稳定性。例如,参见美国专利号6,127155和美国专利申请号2008/0064071。然而,SDS-PAGE分析揭示了DNA聚合酶Pi和Tau在包含任一种洗涤剂的聚合酶储存缓冲液中是不稳定的。如图1所示,当在55℃加热24小时后,Pi和Tau DNA聚合酶在包含CHAPS两性离子洗涤剂或NP40/吐温20非离子型洗涤剂的混合物的储存缓冲液中都不稳定。加热时Pi和Tau储存母液的这种不稳定与蛋白酶活性无关,因为补充有2×蛋白酶抑制剂混合物的储存缓冲液不提供保护。基于实时稳定性测试,包含CHAPS洗涤剂的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶的最大储存稳定性在4℃下仅为39天。
通过使用PCR的功能测试证明了聚合酶储存稳定性和功能活性之间的相关性。如图2所示,当在55℃加热24小时后,Pi和Tau热稳定DNA聚合酶在包含CHAPS或NP40/吐温20洗涤剂的混合物的储存母液中都失去其聚合酶活性。非离子型洗涤剂,辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷的补充对恢复聚合酶活性没有效果。
为了鉴定优良的补充物,我们在包含各种洗涤剂包括非离子型(辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷,NP40,吐温20),离子型(SDS,CTAB)和两性离子型(CHAPS)洗涤剂的储存缓冲溶液中进行聚合酶的SDS-PAGE分析,并将储存缓冲液中升高温度下的聚合酶稳定性与储存在-20℃下的相同缓冲液进行比较。如图3所示,没有一种测试的洗涤剂对热稳定Pi DNA聚合酶显示稳定性增强作用。
我们后来测试了几种添加剂,包括非洗涤剂磺基甜菜碱,聚乙烯吡咯烷酮,多胺,氧化胺,精氨酸和精氨酸衍生物。在所有检测的添加剂中,发现仅精氨酸和其衍生物,包括精氨酸乙酯和精氨酰胺,有效增强Pi和Tau DNA聚合酶的储存稳定性。(表1)
表1
使用补充有精氨酸或其衍生物的CHAPS储存缓冲液中Pi DNA聚合酶的基于qPCR的功能分析显示了从dCq值反映的显著增强的聚合酶活性,dCq值比较了55℃预热的聚合酶母液与储存在-20℃下的母液。精氨酸始终显示突出的稳定性增强作用(表2)。
表2
表2显示了精氨酸和其衍生物对Pi DNA聚合酶稳定性的影响和qPCR性能。通过使用储存在包含CHAPS两性离子洗涤剂的分别补充有0.1M精氨酸,0.1M L-精氨酸乙酯二盐酸盐,或0.1M精氨酰胺二盐酸盐的储存缓冲液中的DNA聚合酶产生该制剂。储存缓冲液中的DNA聚合酶在被用于制剂制备前在55℃预孵育24小时。通过将预热聚合酶制备的制剂与储存在-20℃的聚合酶制备的对照制剂比较得出ΔCq值(dCq)。
精氨酸的聚合酶稳定性增强作用似乎是普遍的并与洗涤剂无关。包含两性离子或非离子型洗涤剂的储存缓冲液中的DNA聚合酶的SDS-PAGE分析的结果表明当在55℃加热超过72小时后精氨酸保护并稳定DNA聚合酶(图4和5)。
为了评估精氨酸对长期储存稳定性的提高,进行了加速稳定性测试。分别在50℃,60℃和70℃孵育补充有0.75M精氨酸的包含CHAPS洗涤剂的储存缓冲液中的Pi DNA聚合酶持续指定时间(表3)。
表3
表3显示了精氨酸对提高Pi DNA聚合酶的长期储存稳定性的影响。稳定性提高通过qPCR性能反映。通过使用储存在补充有(+)或没有(-)0.75M L-精氨酸的包含CHAPS两性离子洗涤剂的储存缓冲液中的DNA聚合酶产生该制剂。储存缓冲液中的DNA聚合酶在被用于制剂制备前以相应温度(50℃,60℃和70℃)和时间(2,3,8,11和12天)预孵育。通过将预热聚合酶制备的制剂与储存在-20℃的聚合酶制备的对照制剂比较得出ΔCq值。与-20℃对照比较的正Cq值指示Cq延迟。
这些预热的聚合酶母液用于qPCR反应,与储存在-20℃的聚合酶母液相比,以评价其功能活性。如表3所示,没有精氨酸补充,预热的Pi热稳定DNA聚合酶母液在所有测试温度下都没有聚合酶活性。相比之下,使用精氨酸补充,预热聚合酶母液的聚合酶活性恢复。该结果表明精氨酸提高热稳定聚合酶在储存条件下的长期储存稳定性。尽管在各种温度下储存溶液延长加热时仍然观察到Cq延迟,但依据Arrhenius方程预测,发现补充有精氨酸的PiDNA聚合酶储存母液的保质期从39天显著延长到1年左右。
我们还检测了包含精氨酸的溶液中的Sso7d-Taq融合物并也已经观察到提高的稳定性(数据未显示)。
表4显示了精氨酸对各种聚合酶的热稳定性提高效果。显示了在相应的温度和持续时间下加热储存在相应的含或不含精氨酸补充物的储存缓冲液中的(a)Sso-Taq融合物DNA聚合酶,(b)MMLV反转录酶和(c)大肠杆菌多聚A聚合酶。加热的聚合酶随后用来构建反应物制剂,其随后根据一般方案说明书用于基于qPCR的性能评估。显示重复的平均Cq值。
表4
a)Sso-Taq DNA聚
合酶
b)MMLv反转录
酶
c)大肠杆菌多聚A聚
合酶
显示平均Cq值
n.d.-未检测到检
测到
NTC 无模板对照
应理解,本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的,本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变,且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
Claims (25)
1.一种用于聚合酶的液体储存溶液,所述溶液包含,
所述聚合酶;
游离精氨酸,或其盐,或精氨酸衍生物或其盐,和
5%或更多的冷冻保护剂。
2.如权利要求1所述的液体溶液,其中所述冷冻保护剂是二醇、三醇、多元醇、一元醇或亚砜。
3.如权利要求1所述的液体溶液,其中所述游离精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐的浓度是0.01-2.5M。
4.如权利要求1所述的液体溶液,其还包含缓冲剂、KCl、乙二胺四乙酸(EDTA)或二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的液体溶液,其中所述液体溶液包含缓冲剂并且所述缓冲剂是Goods缓冲剂。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述Goods缓冲剂选自下组:MES、BIS-TRIS、ADA、ACES、PIPES、Bis-6Tris丙烷、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MPOS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、EPPS、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、TRIS、AMP、重碳酸盐、N-二(羟乙基)甘氨酸、硼酸盐、卡可酸盐、CAPS、CAPSO、CHES、柠檬酸盐、DIPSO、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、磷酸盐、TAPS、TAPSO和TEA。
7.如权利要求1所述的液体溶液,其中所述精氨酸或其盐的浓度是0.1-1.0M。
8.如权利要求1-7中任一种所述的液体溶液,其中所述溶液缺乏足以维持模板多核苷酸的聚合的组分。
9.如权利要求8所述的液体溶液,其中所述溶液缺乏以下至少一种:
模板多核苷酸;或
寡核苷酸引物。
10.如权利要求1所述的液体溶液,其中所述溶液温度是-80℃到5℃。
11.如权利要求1所述的液体溶液,其中所述溶液温度是-30℃到5℃。
12.如前述权利要求中任一项所述的液体溶液,其中所述溶液不含洗涤剂。
13.如前述权利要求中任一项所述的液体溶液,其中所述溶液包含一种或多种洗涤剂。
14.如前述权利要求中任一项所述的液体溶液,其中所述溶液不含三糖。
15.如前述权利要求中任一项所述的液体溶液,其中所述聚合酶是热稳定聚合酶。
16.如前述权利要求中任一项所述的液体溶液,其中所述聚合酶是反转录酶。
17.如前述权利要求中任一项所述的液体溶液,其中所述聚合酶是B家族聚合酶。
18.一种保持储存期间的聚合酶的稳定性的方法,该方法包括,
提供如权利要求1-17中任一项所述的液体溶液;和
在-80℃和5℃之间储存所述溶液至少3(例如至少7、14、21、28、50、100)天。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述储存在-80℃和5℃之间。
20.如权利要求18所述的方法,其中所述储存在-80℃和90℃之间。
21.如权利要求18所述的方法,其还包括,储存后在酶促反应中使用所述聚合酶。
22.一种保持储存期间的聚合酶的稳定性的方法,所述方法包括,
提供包含所述聚合酶和0.01-5.0M精氨酸或其盐的液体溶液;和
储存所述溶液至少3(例如至少7、14、21、28、50、100)天。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述储存在-80℃和5℃之间。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述储存在-80℃和90℃之间。
25.如权利要求22所述的方法,其还包括,储存后在酶促反应中使用所述聚合酶。
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