CN115820597A - 一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法 - Google Patents
一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115820597A CN115820597A CN202211575029.3A CN202211575029A CN115820597A CN 115820597 A CN115820597 A CN 115820597A CN 202211575029 A CN202211575029 A CN 202211575029A CN 115820597 A CN115820597 A CN 115820597A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- enzyme
- molecular
- protoplast
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 85
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 15
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 102100022786 Creatine kinase M-type Human genes 0.000 claims description 2
- 101710175503 Creatine kinase M-type Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N diethyl sulfate Chemical compound CCOS(=O)(=O)OCC DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940008406 diethyl sulfate Drugs 0.000 description 9
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical group C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000318927 Shrimp white spot syndrome virus Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及分子检测领域,更具体地说,它涉及一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。改性分子酶的制备方法:枯草芽孢杆菌的制备;枯草芽孢杆菌置于DES溶液中/紫外环境下处理得到待用菌溶液A/B;将待用菌溶液A、B混合,加助溶剂,离心、弃上清;将其做成pH6.0‑12.0梯度斜面培养皿,将存活原生质体涂布于庆大霉素的梯度斜面培养,挑选存活菌落、进行发酵培养,收集菌液,提取分子酶,制得分子酶溶液;取EDC、NHS溶液加入到分子酶溶液;离心、去上清,用MES复溶,加入PEG‑聚精氨酸;加封闭液旋转封闭;离心,去上清,得到改性分子酶。本申请具有简化操作、提高效率优点。
Description
技术领域
本申请涉及分子检测领域,更具体地说,它涉及一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。
背景技术
分子免疫层析检测是近年来快速发展的一种快速免疫检测技术。目前检测病毒一般是通过检测试剂盒检测的,检测方法是先加入裂解液将人体或动物样本中的核酸提取出来,然后通过吸附、洗脱等纯化核酸,再往核酸中加入酶进行等温扩增后,加入试剂盒中检测。
由于只有在强碱条件下,才能让组织中的病毒破坏,从而释放核酸片段。前期为了提高灵敏度需要进行对核酸进行提取纯化,再进行等温扩增,是提取核酸和等温扩增两步同等重要,缺一不可,并且核酸的提取物以及纯化操作通常都比较复杂。这样无疑增加整个检测时间;因此,如何进一步简化操作、提高效率成了需要解决的问题。
发明内容
为了简化操作、提高效率,本申请提供一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。
第一方面,本申请提供一种改性分子酶的制备方法,采用如下的技术方案:
一种改性分子酶的制备方法,包括以下步骤:
枯草芽孢杆菌制备,得到原生质体;
将原生质体置于硫酸二乙酯(DES)溶液中处理,得到待用菌溶液A;
将原生质体置于紫外环境下处理,得到待用菌溶液B;
将待用菌溶液A、待用菌溶液B混合,加入助溶剂共混,离心后弃去上清液,清洗后得到待筛选原生质体;
将待筛选原生质体放入再生培养基中,做成pH6.0-12.0的梯度坡面培养皿,取存活原生质体;然后再将存活原生质体涂布于25-50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上,培养18-25天,挑选存活的菌落进行培养;
从培养的菌落放到发酵培养基中进行发酵培养,得到菌液,从菌液中提取分子酶将分子酶与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液混合,配置成分子酶溶液,分子酶溶液的浓度为20-200mg/ml;
按体积份数,取15-25份EDC溶液和35-45份NHS溶液,加入到分子酶溶液中反应;
离心,去上清,离心得到的剩余部分用MES溶液复溶,并加入PEG-聚精氨酸(Poly-L-Arginine),避光反应;
加入封闭液,旋转封闭反应;
离心,去上清,得到改性分子酶;
分子酶为μvsX酶、μvsY酶、GP32酶、Bsμ酶、Nfo酶、Creatine kinase M-type酶中的一种。
本申请是对等温扩增酶的进行改性,使其具有抗碱性以及耐热稳定性。在检测时,无需对样本进行核酸提取,在恶劣的核酸裂解环境中所使用等温扩增酶全部依旧具备很好的活性,能实现核酸的等温扩增,从而使得核酸的提取以及等温扩增可以同步反应,只需直接加入释放剂以及酶,在室温下放置5-10分钟即可完成。可以有效简化操作的步骤,缩短检测时间,提高效率。
具体的,对分子酶的改性主要是通过修改酶结果中的酸性氨基酸变成碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸),用精氨酸取代酶表面的苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺实现的,可以达到提高酶的热稳定性的效果。
选用特定的EDC溶液对酶进行活化,在酸性条件下,有利于提高活化反应的效率,促使酶中的-COOH(羧基)与聚精氨酸偶联。在EDC溶液和NHS溶液的共同配合下,活化反应可以更加稳定进行,定向促使酶活化。
优选的,所述待用菌溶液A的处理包括以下步骤:
取原生质体,配置成原生质体悬浮液;
将DES溶液与原生质体悬浮液混合,配置至DES终浓度为0.7-1.0%;
混合均匀后,置于35-42℃处理30-120min,得到待用菌溶液A。
通过采用上述技术方案,将原生质体悬浮液置于DES溶液中,对其进行诱导反应,该处理方法简单、效率高,可以得到大量符合要求、具有良好抗碱效果的菌群。
优选的,所述待用菌溶液B的处理包括以下步骤:
取原生质体配置成原生质体悬浮液;
在10-25W、250-300nm的条件下对原生质体悬浮液进行紫外处理,处理时间为90-160s,避光,得到待用菌溶液B。
通过采用上述技术方案,在特定功率、特定波长的紫外照射下对原生质体悬浮液进处理,诱变DNA使其发生特殊的改变。
优选的,取所述EDC溶液和NHS溶液加入到分子酶溶液中反应时,EDC溶液和NHS溶液的体积比为1:(2-3)。
通过采用上述技术方案,进一步限定EDC溶液和NHS溶液之间的使用比例,提高活化酶的效率,促使目标蛋白酶可以往特定的方向进行偶联。
优选的,所述助溶剂为硝酸钠、聚乙二醇、二甲亚砜中的一种。
优选的,所述助溶剂为聚乙二醇。
通过采用上述技术方案,加入助溶剂促使原生质体融合。助溶剂使分离的原生质体彼此黏附,导致紧密黏着,产生融合。
发明人在经过多次试验之后,发现当助溶剂为聚乙二醇时,所制得改性分子酶的效果最好。
第二方面,本申请提供一种分子免疫层析检测方法,采用如下的技术方案:
一种分子免疫层析检测方法,包括以下步骤:
将1-3g待测样品加入到95-105μl核酸释放剂,在95-100℃下处理2-5min,得到待检测模板;然后将2×10-4-3×10-4μmol/l的改性分子酶和1-2μl待检测模板混合,混合均匀后加入0.8-1.5μl激活剂,在35-40℃下反应20-45min,得到反应产物;
将反应产物用反应缓冲液稀释45-50倍,插入试剂,观察结果。
溶解剂为PB缓冲液,反应缓冲剂包括10mmol/L磷酸肌酸钠、0.3mg/mL BSA、3%甲酰胺、10mmol/L DTT、150μmol/L dATP、150μmol/LdTTP、150μmol/L dCTP、150μmol/L dGTP、150μmol/L dUTP,激活剂为20mM醋酸镁,反应缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.85% NaCl、0.5% Tween20。
本方法是一种新型核酸等温扩增技术,该技术无需温度循环,通过模拟生物体内DNA复制,短时间内即可完成对目的片段的核酸扩增,具有特异性高、敏感性强、反应程序简单和不依赖复杂仪器的优点。
具体的,在实际检测时,如果检测体系中有目标基因存在,则PCR聚合酶便会以目标基因为模板引物与之大量扩增生成两端带有生物素和羧基荧光素基团的扩增子。这些扩增子上的羧基荧光素基团能够与核酸试剂样品垫上喷涂的抗羧基荧光素抗体与胶体金复合物偶联。当试剂被插入展开缓冲液后,由于毛细作用,缓冲液会带着样品垫上的偶联物向吸收垫方向流动,当偶联物另一端的生物素基团与检测线上喷涂的链霉亲和素相结合时,扩增子与免疫胶金体的复合物便在检测线处大量沉积产生暗红色沉淀,最终呈现红色检测线的阳性结果。未结合的胶体金抗体流过T线被指控线(C线)的二抗捕获并形成可见的C线。
优选的,所述核酸释放剂包括以下组分:90-110mmol/LTris-HCl溶液、18-23mmol/LEDTA-Na、0.65-0.9% NaCl溶液、0.03-0.06% SDS。
通过采用上述技术方案,该核酸释放剂可以维持核酸结构的稳定,同时通过使蛋白质变性、破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。
优选的,插入所述试剂后,在沸水水浴中进行1-3min,观察结果。
通过沸水水浴来加快反应的进行,提高检测效率。由于经过改性的分子酶具有良好的耐高温性,即使使用沸水处理也不会影响其活性。
优选的,所述改性分子酶被制成冻干粉,冻干粉与溶解剂、反应缓冲剂共同混合后,再与待检测模板混合。
优选的,冻干粉的反应体系为50μL,反应体系包括2.0-3.0μL上下游引物(8-12μmol/L)、25-30μL缓冲液(8-12μmol/L改性分子酶、8-12mmol/L磷酸肌酸钠)、10-15μL 6%海藻糖、6-10μL 5%甘露醇。将反应体系直接冻干,得到冻干粉。
优选的,所述溶解剂、反应缓冲剂的体积比例为(8-12):(10-15)。
原料酶处于冻干状态时,若是溶解不好会导致效率偏低。
通过采用上述技术方案,进一步限定三者之间的使用比例,使原来冻干酶活性重新溶解,处于具有良好活性的状态。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1、本申请是对等温扩增酶的进行改性,使其具有抗碱性以及耐热稳定性。在检测时,无需对样本进行核酸提取,在恶劣的核酸裂解环境中依旧具备很好的活性,依旧能实现核酸的等温扩增,从而使得核酸的提取以及等温扩增只需直接加入核酸释放剂以及酶,在室温下放置5-10分钟即可完成,操作简单方便。
2、对分子酶的改性主要是通过修改酶结果中的酸性氨基酸变成碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸),用精氨酸取代酶表面的苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺实现的,可以达到提高酶的热稳定性的效果。
3、本方法是一种新型核酸等温扩增技术,该技术无需温度循环,通过模拟生物体内DNA复制,短时间内即可完成对目的片段的核酸扩增,具有特异性高、敏感性强、反应程序简单和不依赖复杂仪器的优点。
附图说明
图1是样品采集部位示意图。检测样品为虾,为清楚表明采集位置,使用箭头进行标注。
图2是组织样品提取图。
图3是使用实施例1的方法所得到的检测结果图。
本次检测为海洋动物项目病毒检测,检测是否含有WSSV病毒。
左边为检测结果为阴性的样品,右边为检测结果阳性的样品。
图4是检测结果图。位于上方的试剂纸为实施例1的检测结果,位于下方的试剂纸为对比例1的检测结果。
图5是检测结果图。自左向右依次为实施例1、实施例4、实施例7、对比例2、实施例5、实施例6。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
以下实施例及对比例中所用的原料均为市售产品。
实施例
实施例1
一种改性分子酶的制备方法,包括以下步骤:
步骤A:枯草芽孢杆菌制备,得到原生质体。
步骤B:待用菌溶液A的处理:
步骤B1):取原生质体,配置成原生质体悬浮液;
步骤B2):将DES溶液混合于原生质体悬浮液试管内,配置至DES终浓度为0.9%,轻轻摇匀。
步骤B3):混合均匀后,置于37℃的恒温水浴锅中保温处理60min。反应终止后,得到待用菌溶液A。
步骤C:待用菌溶液B的处理:
步骤C1):取原生质体,配置成原生质体悬浮液。
步骤C2):将原生质体悬浮液分别倒在3个无菌培养皿中,每个无菌培养皿中有2ml原生质体悬浮液。
在超净工作台无可见光条件下,打开皿盖,将无菌培养皿放置在距离紫外灯30cm处。
调整紫外线灯功率为15W、波长为270nm,对3个无菌培养皿分别照射120s。
步骤C3):照射结束后,关闭紫外灯,盖上皿盖,用黑纸将无菌培养皿包裹。得到待用菌溶液B。
步骤D:枯草芽孢杆菌的融合:
步骤D1):取0.1ml的待用菌溶液A和0.1ml的待用菌溶液B,投入培养基中混合,并加入PEG(聚乙二醇4000)溶液助溶,在37℃条件下保温反应30min。
具体的,PEG溶液选用M4000、40%(w/v)的。
步骤D2):将步骤D1)得到的溶液在3500r/min的条件下离心反应5min。弃去上清液,连续用培养基稳定液清洗5次。得到待筛选原生质体。
步骤E:将待筛选原生质体放入再生培养基中,做成pH6.0、pH8.0、pH10.0、pH12.0的梯度斜面培养皿,取存活原生质体。
步骤F:将存活原生质体涂布于25mg/ml、50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上,在37℃下培养20天。
培养箱内放入水盆,使箱内保持一定的湿度,防止培养基干裂。
步骤G:挑选存活的菌落接入斜面培养基进行培养,具体包括以下步骤:
步骤G1):制备培养基:培养基包括以下成分,详见表1。将各种原料按照用量投入到水中混合均匀即可,最终的pH为7.0±0.2。
表1
成分 | 用量 |
L-谷氨酰胺 | 146g/L |
胎牛血清 | 10000mg/L |
NaHC0<sub>3</sub> | 1176mg/L |
L-苯丙氨酸 | 32mg/L |
D-葡萄糖 | 1802mg/L |
L-色氨酸 | 10mg/L |
HEPES | 5958g/L |
青霉素G钠盐 | 10kU/ml |
酚红指示剂 | 1.2mg/L |
硫酸链霉素 | 10mg/ml |
蛋白胨 | 10.0g/L |
色素 | 2.7g/L |
酵母膏粉 | 3.0g/L |
琼脂 | 12.0g/L |
氯化钠 | 5.0g |
步骤G2):制备发酵原料:按照大豆粉74%、MgSO4 10%、葡萄糖8%、K2HPO4 8%、水补充至100%的使用量进行混合。
步骤G3):将存活的菌落在培养基中培养一周,然后再加入发酵原料中发酵20天。
步骤G4):将发酵培养后的枯草芽孢杆菌采用超声波破碎法处理,得到培养液。
步骤H:从培养液中提取出分子酶,进行改性。
分子酶为μvsX酶、μvsY酶、GP32酶、Bsμ酶、Nfo酶、creatine kinase M-type酶中的一种。
步骤I:分子酶的改性:
步骤I1):取1mg分子酶,与适量的EDC溶液、NHS溶液混合,配置成分子酶浓度为50mg/ml的分子酶溶液。
步骤I2):再往分子酶溶液中加入20μl的EDC溶液和40μl的NHS溶液,震荡混合反应20min。
步骤I3):在4℃、15000rpm/min的条件下离心15min,去上清。
步骤I4):将步骤3)中的剩余部分用0.5ml MES溶液复溶,并超声打散,同时在打散的时候加入0.1mg PEG-聚精氨酸混合反应。然后避光震荡反应2h。
MES溶液采用50mmol/L、pH为6.5的。
步骤I5):加入1ml的封闭液,旋转封闭1h。
封闭液采用10%PEG溶液。
步骤I6):在4℃、15000rpm/min的条件下离心15min,去上清,得到改性分子酶。
参照图1-3,本申请实施例还公开一种分子免疫层析检测方法,包括以下步骤:
步骤01):将1g待测样品加入到100μl核酸释放剂,在100℃下处理3min,得到待检测模板。
其中,核酸释放剂中各组分的浓度如下:100mmol/L Tris-HCl、20mmol/L EDTA-Na、0.85%NaCl、0.05%SDS。
Tris-HCl采用pH为8.0的。
步骤02):将改性分子酶制成冻干粉。具体的,冻干粉的反应体系为50μL,反应体系包括2.5μL上下游引物(10μmol/L)、27.5μL缓冲液(10μmol/L改性分子酶、10mmol/L磷酸肌酸钠)、10-15μL 6%海藻糖、6-10μL 5%甘露醇。将反应体系直接冻干,得到冻干粉。
步骤03):将冻干粉与10μl溶解剂、12.5μl反应缓冲剂混合。
溶解剂为PB缓冲液,反应缓冲剂包括10mmol/l磷酸肌酸钠、0.3mg/mL BSA、3%甲酰胺、10mmol/L DTT、150μmol/L dATP、150μmol/L dTTP、150μmol/L dCTP、150μmol/LdGTP、150μmol/L dUTP。
步骤04):继续往步骤03)中的溶液中加入2μl待检测模板,混合均匀后加入1.2μl激活剂,在37℃下反应30min,得到反应产物。
激活剂为20mmol/L醋酸镁。
步骤05):将反应产物用反应缓冲液稀释50倍,插入试剂纸,观察结果。
反应缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.85% NaCl、0.5% Tween20。
步骤06):反应进行时,会看到深红色的条带在试剂纸中间的结果窗中移动。
步骤07):5-10分钟内读取结果。
当分子酶为μvsX酶时,其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
当分子酶为μvsY酶时,其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
当分子酶为GP32酶时,其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
当分子酶为Bsμ酶时,其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
当分子酶为Nfo酶时,其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。
当分子酶为creatine kinase M-type酶时,其改性后所得到的改性分子酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示。
关于检测结果的解释:
阳性:结果窗出现两条红色线,即在检测区(T)及质控区(C)各出现一条红色反应线,说明病毒是存在。
阴性:一条红色线,即仅在质控区(C)出现一条红色反应线。
无效:质控区(C)无红色线出现,即检测无效。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果100%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线清晰出现,可达10分(满分10分)。
具体结果详见图3、4。
实施例2
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,
步骤B2)中至DES终浓度为1.0%。
步骤B3)的处理条件为42℃、30min。
步骤C2)的处理条件为25W、300nm,处理90s。
步骤F)中培养18天。
一种分子免疫层析检测方法,与实施例1的不同之处在于,
核酸释放剂中各组分的浓度如下:110mmol/L Tris-HCl、23mmol/L EDTA-Na、0.9%NaCl、0.03%SDS。
步骤03)中将冻干粉与8μl溶解剂、10μl反应缓冲剂混合。
步骤04)中待检测模板的使用量为2μl,激活剂的使用量为1.5μl,在40℃下反应20min。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果85%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线出现较为清晰,可达7分(满分10分)。
实施例3
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,
步骤B2)中至DES终浓度为0.7%。
步骤B3)的处理条件为35℃、120min。
步骤C2)的处理条件为10W、250nm,处理160s。
步骤F)中培养25天。
一种分子免疫层析检测方法,与实施例1的不同之处在于,
核酸释放剂中各组分的浓度如下:90mmol/L Tris-HCl、18mmol/L EDTA-Na、0.65%NaCl、0.06%SDS。
步骤03)中将冻干粉与12μl溶解剂、15μl反应缓冲剂混合。
步骤04)中待检测模板的使用量为1μl,激活剂的使用量为0.8μl,在35℃下反应45min。
步骤05)中稀释至45倍。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果90%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线出现较为清晰,可达7分(满分10分)。
实施例4
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,步骤I2)中EDC溶液为25μl,NHS溶液为35μl。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果100%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线出现较为清晰,可达8分(满分10分)。
具体检测结果详见图5。
实施例5
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,步骤I2)中EDC溶液为15μl,NHS溶液为45μl。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果100%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线出现较为清晰,可达8.5分(满分10分)。
具体检测结果详见图5。
实施例6
一种分子免疫层析检测方法,与实施例1的不同之处在于,步骤03):将冻干粉与5μl溶解剂、25μl反应缓冲剂混合。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果95%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线出现较为清晰,可达8分(满分10分)。
具体检测结果详见图5。
实施例7
一种分子免疫层析检测方法,与实施例1的不同之处在于,
步骤04)插入试剂纸后,在沸水水浴中进行3min,观察结果。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法可以出现阳性或阴性的结果,检测结果100%稳定出现。
目测试剂纸上的检测结果,反应线快速、清晰出现,可达10分(满分10分)。
具体检测结果详见图5。
对比例
对比例1
一种分子免疫层析检测方法,与实施例1的不同之处在于,将步骤02)中的改性分子酶替换为市售的分子酶。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法无法出现阳性或阴性的结果。
具体结果详见图4,质控区(C)无红色线出现,检测无效。
对比例2
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,步骤I2)中,EDC溶液和NHS溶液的体积比为1:1,即EDC溶液为20μl,NHS溶液为20μl。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法出现阳性或阴性的结果不稳定,仅有50%的试剂纸可出现结果。
目测试剂纸上的检测结果,反应线较模糊,可达4分(满分10分)。
具体检测结果详见图5。
对比例3
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,省略步骤B。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法无法出现阳性或阴性的结果,质控区(C)无红色线出现,检测无效。
对比例4
一种改性分子酶的制备方法,与实施例1的不同之处在于,省略步骤C。
试验证明,使用该改性分子酶进行的分子免疫层析检测方法无法出现阳性或阴性的结果,质控区(C)无红色线出现,检测无效。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种改性分子酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
枯草芽孢杆菌制备,得到原生质体;
将原生质体置于DES溶液中处理,得到待用菌溶液A;
将原生质体置于紫外环境下处理,得到待用菌溶液B;
将待用菌溶液A、待用菌溶液B混合,加入助溶剂促融合,离心后弃去上清液,清洗后得到待筛选原生质体;
将待筛选原生质体放入再生培养基中,做成pH6.0-12.0的梯度坡面培养皿,取存活原生质体;
然后再将存活原生质体涂布于25-50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上,培养18-25天,挑选存活的菌落进行培养;
培养的菌落进行发酵培养后从菌液中提取分子酶;
将分子酶与EDC溶液、NHS溶液混合,配置成分子酶溶液,分子酶溶液的浓度为20-200mg/ml;
按体积份数,取15-25份EDC溶液和35-45份NHS溶液,加入到分子酶溶液中反应;
离心,去上清,离心得到的剩余部分用MES溶液复溶,并加入PEG-聚精氨酸,避光反应;
加入封闭液,旋转封闭反应;
离心,去上清,得到改性分子酶;
分子酶为μvsX酶、μvsY酶、GP32酶、Bsμ酶、Nfo酶、creatine kinase M-type酶中的一种。
2.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法,其特征在于:所述待用菌溶液A的处理包括以下步骤:
取原生质体,配置成原生质体悬浮液;
将DES溶液与原生质体悬浮液混合,配置至DES终浓度为0.7-1.0%;
混合均匀后,置于35-42℃处理30-120min,得到待用菌溶液A。
3.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法,其特征在于:所述待用菌溶液B的处理包括以下步骤:
取原生质体,配置成原生质体悬浮液;
在10-25W、250-300nm的条件下对原生质体悬浮液进行紫外处理,处理时间为90-160s,避光,得到待用菌溶液B。
4.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法,其特征在于:取所述EDC溶液和NHS溶液加入到分子酶溶液中反应时,EDC溶液和NHS溶液的体积比为1:(2-3)。
5.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法,其特征在于:所述助溶剂为硝酸钠、聚乙二醇、二甲亚砜中的一种。
6.一种分子免疫层析检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
将1-3g待测样品加入到95-105μl核酸释放剂,在95-100℃下处理2-5min,得到待检测模板;
然后将2×10-4-3×10-4μmol/L的改性分子酶和1-2μl待检测模板混合,混合均匀后加入0.8-1.5μl激活剂,在35-40℃下反应20-45min,得到反应产物;
将反应产物用反应缓冲液稀释45-50倍,插入试剂,观察结果;
改性分子酶由权利要求1-5任一项所述的改性分子酶的制备方法制备而成。
7.根据权利要求6所述的分子免疫层析检测方法,其特征在于:所述核酸释放剂包括以下组分:90-110mmol/L Tris-HCl溶液、18-23mmol/L EDTA-Na、0.65-0.9% NaCl溶液、0.03-0.06% SDS。
8.根据权利要求6所述的分子免疫层析检测方法,其特征在于:插入所述试剂后,在沸水水浴中进行1-3min,观察结果。
9.根据权利要求6所述的分子免疫层析检测方法,其特征在于:所述改性分子酶被制成冻干粉,冻干粉与溶解剂、反应缓冲剂共同混合后,再与待检测模板混合。
10.根据权利要求9所述的分子免疫层析检测方法,其特征在于:所述溶解剂、反应缓冲剂的体积比例为(8-12):(10-15)。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211575029.3A CN115820597A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法 |
CN202311122129.5A CN117143969A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶在分子免疫层析检测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211575029.3A CN115820597A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311122129.5A Division CN117143969A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶在分子免疫层析检测中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115820597A true CN115820597A (zh) | 2023-03-21 |
Family
ID=85545494
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311122129.5A Pending CN117143969A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶在分子免疫层析检测中的应用 |
CN202211575029.3A Pending CN115820597A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311122129.5A Pending CN117143969A (zh) | 2022-12-08 | 2022-12-08 | 一种改性分子酶在分子免疫层析检测中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN117143969A (zh) |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2358758A1 (de) * | 2008-11-28 | 2011-08-24 | Zetascience GmbH | Bioaktives hydrogel |
CN102559635A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-11 | 南京工业大学 | 一种功能化离子液体修饰的脂肪酶及其修饰方法 |
CN102631678A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-08-15 | 北京大学 | 一种含聚精氨酸的三嵌段聚合物载体及制备方法和用途 |
CN103087967A (zh) * | 2013-02-20 | 2013-05-08 | 杭州贝姿生物技术有限公司 | 一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
CN103827318A (zh) * | 2011-05-27 | 2014-05-28 | 生命技术公司 | 用于操作生物分子的方法 |
CN103983634A (zh) * | 2008-07-22 | 2014-08-13 | 普罗美加公司 | 基于adp检测的发光磷酸转移酶或atp水解酶测定 |
CN104531670A (zh) * | 2015-01-22 | 2015-04-22 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 一种肌苷生产菌的复合诱变方法 |
CN107002063A (zh) * | 2014-11-25 | 2017-08-01 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 精氨酸提高聚合酶储存稳定性 |
CN107201315A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-09-26 | 徐州工程学院 | 一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用 |
CN107988122A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-05-04 | 江苏龙蟠科技股份有限公司 | 枯草芽孢杆菌lpb-3、脂肽类生物表面活性剂及生物降解环保型玻璃清洗液 |
CN109055611A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 深圳市芯思微生物科技有限公司 | 用于检测hpv的试剂盒 |
-
2022
- 2022-12-08 CN CN202311122129.5A patent/CN117143969A/zh active Pending
- 2022-12-08 CN CN202211575029.3A patent/CN115820597A/zh active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103983634A (zh) * | 2008-07-22 | 2014-08-13 | 普罗美加公司 | 基于adp检测的发光磷酸转移酶或atp水解酶测定 |
EP2358758A1 (de) * | 2008-11-28 | 2011-08-24 | Zetascience GmbH | Bioaktives hydrogel |
CN103827318A (zh) * | 2011-05-27 | 2014-05-28 | 生命技术公司 | 用于操作生物分子的方法 |
CN102559635A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-07-11 | 南京工业大学 | 一种功能化离子液体修饰的脂肪酶及其修饰方法 |
CN102631678A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-08-15 | 北京大学 | 一种含聚精氨酸的三嵌段聚合物载体及制备方法和用途 |
CN103087967A (zh) * | 2013-02-20 | 2013-05-08 | 杭州贝姿生物技术有限公司 | 一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
CN107002063A (zh) * | 2014-11-25 | 2017-08-01 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 精氨酸提高聚合酶储存稳定性 |
CN104531670A (zh) * | 2015-01-22 | 2015-04-22 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 一种肌苷生产菌的复合诱变方法 |
CN107201315A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-09-26 | 徐州工程学院 | 一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用 |
CN107988122A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-05-04 | 江苏龙蟠科技股份有限公司 | 枯草芽孢杆菌lpb-3、脂肽类生物表面活性剂及生物降解环保型玻璃清洗液 |
CN109055611A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 深圳市芯思微生物科技有限公司 | 用于检测hpv的试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DEUPER L等: "creatine kinase M-type [Mus musculus]", GENBANK DATABASE, pages 031736 * |
GENBANK DATABASE: "MULTISPECIES: deoxyribonuclease IV [Enterobacteriaceae]", NCBI, pages 000873894 * |
NCBI: "MULTISPECIES: DNA polymerase I [Bacillus]", GENBANK DATABASE, pages 069322811 * |
李飞等: "木聚糖酶XynB分子Ser/Thr平面导入精氨酸对酶热稳定性的影响", 南京林业大学学报, vol. 38, no. 4 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117143969A (zh) | 2023-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102649950B1 (ko) | 세포주로부터 랍도바이러스를 탐지 및 제거하는 방법 | |
CN103756974B (zh) | 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 | |
Gould et al. | The complete nucleotide sequence of rabbit haemorrhagic disease virus (Czech strain V351): use of the polymerase chain reaction to detect replication in Australian vertebrates and analysis of viral population sequence variation | |
CN107815441A (zh) | 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用 | |
KR20080066727A (ko) | Rna의 추출방법 및 rna의 검출방법 | |
CN109680026B (zh) | 重组ca16病毒样颗粒的纯化、在疫苗中的应用及疫苗 | |
CN106636012B (zh) | 一种猪盖他病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
CN104857510B (zh) | 一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用 | |
CN112921005B (zh) | 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 | |
CN112979826B (zh) | 一种乙型脑炎病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
CN103923887A (zh) | 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 | |
Yang et al. | Isolation and characterization of a new porcine epidemic diarrhea virus variant that occurred in Korea in 2014 | |
CN102212623A (zh) | 一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒 | |
CN115820597A (zh) | 一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法 | |
CN109959789B (zh) | 一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法 | |
CN110551694B (zh) | 塞尼卡谷病毒svv/ch/zz/2016 | |
CN113564129B (zh) | 一种狐狸逆转录病毒毒株及其应用 | |
CN104017779A (zh) | 表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒及其应用 | |
CN109943507B (zh) | 一种兽用a型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用 | |
CN107326038B (zh) | 一种用于检测猕猴桃溃疡病菌psa3的多克隆抗体及其应用 | |
CN110878379A (zh) | 一种类nadc30 prrsv减毒活疫苗配套鉴别检测方法及其应用 | |
KR101857417B1 (ko) | 효소면역기법을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법 | |
CN109652590A (zh) | 一种甲型肝炎病毒的负链rna分子生物学检测方法及应用 | |
CN109897832B (zh) | 一株猪圆环病毒3型病毒毒株及其应用 | |
US20220193220A1 (en) | Immunogenic compositions for novel reassortant mammalian ortheovirus from pigs |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |