CN103983634A - 基于adp检测的发光磷酸转移酶或atp水解酶测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于测定或检测酶活性的组合物和方法，所述酶包括磷酸转移酶例如激酶(例如蛋白激酶、脂质激酶和糖激酶)和ATP水解酶(例如ATP酶，例如HSP90)，所述方法使用ATP作为底物而形成ADP作为产物通过监测ADP的变化来测定或检测酶活性。

Description

基于ADP检测的发光磷酸转移酶或ATP水解酶测定

本申请为分案申请，原申请的申请日为2009年7月20日，申请号为200980138112.0(PCT/US2009/051170)，发明名称为“基于ADP检测的发光磷酸转移酶或ATP水解酶测定”。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年7月22日申请的美国专利申请顺序号61/082,775和2009年4月17日申请的美国专利申请顺序号61/170,308和2009年5月29日申请的美国专利申请顺序号61/182,372的权益，这些申请的公开内容通过引用结合到本文中

背景

因为转移酶、尤其是激酶的生理相关性、多样性和普遍存在，它们成为生化和医学研究中最重要并被广泛研究的一类酶家族。研究表明蛋白激酶和脂质激酶是许多细胞功能的关键性调节剂，所述功能包括信号转导、转录调节、细胞运动、细胞分裂以及细胞对药物、毒素和病原体的反应。

蛋白激酶在多种细胞事件的调节中起到至关重要的作用。这些酶的作用是通过将磷酸残基转移至某些胞内多肽的氨基酸，使这些蛋白质底物活化并发动包括生长、分化和细胞分裂在内的活化控制事件级联。在肿瘤生物学领域已经深入研究了蛋白激酶。据信，细胞中激酶受控活性的缺失导致形成肿瘤。制药业一直在研究靶向这些激酶的药物，以有助于治疗各种肿瘤。有超过500种蛋白激酶(大约占2-2.5％的人类基因组)涉及细胞功能的调节。它们以跨膜酶和胞质溶胶酶形式存在，并且它们使丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸氨基酸残基磷酸化。根据这样的底物特异性，可将激酶分为2组：丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。

丝氨酸/苏氨酸激酶包括环状AMP和环状GMP依赖型蛋白激酶、钙和磷脂依赖型蛋白激酶、钙和钙调蛋白依赖型蛋白激酶、酪蛋白激酶、细胞周期蛋白激酶等。这些激酶通常是胞质酶或可能通过锚定蛋白与特定细胞部分缔合。

酪氨酸激酶使酪氨酸残基磷酸化。这些特定激酶的存在数量非常少，但在细胞调节中却起到同样重要的作用。这些激酶包括某些可溶性酶例如蛋白激酶src家族和生长因子受体，例如表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生的生长因子受体等。研究表明，许多酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其受体结构域位于胞外，而其激酶结构域在胞内。

脂质激酶在胞内信号转导中也起到重要作用，可以分为4大类。示例性的脂质激酶包括PI3激酶和磷脂酰肌醇4-激酶。

糖激酶和其它磷酸转移酶在细胞代谢、增殖和细胞凋亡中也起到主要作用。

因为磷酸化事件涉及如此之多的细胞功能和疾病，所以鉴定激酶活性就特别重要。目前用于检测激酶活性的测定类型包括荧光共振能量转移(FRET)测定、荧光偏振(FP)测定和基于放射性的测定例如闪烁亲近测定(SPA)。用于检测激酶活性的FRET测定是利用与荧光分子连接的蛋白质或肽底物和另一荧光标记的探针。这两个荧光分子仅当底物被磷酸化并被标记探针识别后，才会邻近。因此，当被激酶磷酸化时，标记的能量通过共振传递给荧光分子(受体)。能量从较高能量供体荧光团直接传递到较低能量受体分子的能力，导致受体分子的敏化荧光并同时猝灭供体荧光。在此情况下，供体荧光因邻近受体被“猝灭”，而供体能量以非放射性方式传递给受体。依照福斯特方程，能量转移效率取决于供体和受体生色团之间的距离。在大多数情况下，在距离大于100埃时，未观察到FRET，因此FRET的存在是邻近的良好指示。因此，在利用与荧光分子连接的蛋白质或肽底物和另一荧光标记的探针而检测激酶活性的FRET测定中，如果激酶被抑制，两个荧光分子仍然分开，则不发生FRET。

基于FRET的测定有很多缺陷，包括大量的假命中，例如因为对所测化合物的荧光干扰、狭窄的动态范围和测定所用抗体相关的表现情况。

FP测定是基于高亲和力结合剂(例如抗体、螯合原子等)与荧光标记分子的结合。例如，与磷酸化荧光标记肽结合、而不与非磷酸化荧光标记肽结合的抗体可用于激酶测定。其它方法利用与ADP(其它激酶反应的产物)结合的荧光标记抗体监测激酶活性。当荧光标记被平面偏振光激发，就以同一偏振面发射光，只要荧光标记在整个激发态保持稳定(激发态的持续时间随荧光团的不同而不同，对于萤光素(fluoroscein)为4毫微秒)。如果偏振光用于激发荧光团，可同时在与偏振面平行的平面(激发面)和与偏振面垂直的平面上监测发射光强度。FP测定需要能够以高特异性与荧光标记分子结合的高亲和性结合剂，例如抗体。当使用抗体时，抗体与特异性荧光标记分子例如肽结合所耗费的时间和成本优化是需要的。另外，在FP测定中，对于磷酸化蛋白和其它反应组分例如脂质和去垢剂而言，具有干扰偏振的潜力。

采用放射性标记的激酶测定包括SPA。在SPA中，修饰的配体特异性分子或配体捕获分子偶联于荧光微球体(fluoromicrosphere)，其是灌注有物质的固相支持颗粒或小珠，所述物质当被放射性标记分子激发时可发射能量。当加入到在含有非磷酸化肽的混合物中的修饰配体例如放射性标记的磷酸肽时，仅磷酸肽被捕获到荧光微球体上，使任何结合的放射性标记肽足够邻近，以允许辐射能发射而激化荧光微球体并发射光能。如果荧光微球体的浓度是优化的，仅来自与靶标结合的放射性标记配体的信号被检测到，而无需对结合配体和游离配体进行任何分离。可在液体闪烁计数器上测量所发射的光能水平，并且该水平表示配体与靶标的结合程度。SPA需要荧光微球体因重力或经离心而沉降，为测定增加了额外的步骤和时间。另外，因为该测定所用³²P的高能量，所以大部分放射性穿过而未被荧光微球体捕获。

也已经开发了其它方法用于检测激酶活性，所述方法是基于发光检测，无论是生物发光还是化学发光。通常，这些方法依赖于特异性底物和抗体、微芯片和荧光标记探针的使用、样品中的底物浓度、多步骤和试剂的使用(美国专利号6,599,711)或局限于特定激酶(Sala-Newby等，1992)。

许多目前可用的激酶测定使用在反应期间消耗大量ATP的酶而运行良好，但对检测ATP量的少量变化而言则不够灵敏，这限制了具有低ATP周转率的激酶，例如生长因子受体激酶。相比之下，可分析这类酶的可用的测定对于激酶亚类是特异性的和/或不够敏感而不能用于大范围的激酶。

发明概述

本发明提供用于测定或检测酶活性的组合物和方法，所述酶包括磷酸转移酶例如激酶(例如蛋白激酶、脂质激酶和糖激酶)和ATP水解酶(例如ATP酶，例如HSP90)，所述方法使用ATP作为底物而形成ADP作为产物通过监测ADP的变化来测定或检测酶活性。为了监测ADP的形成，ADP转化为ATP并使用ATP依赖型生物发光反应例如萤光素酶/萤光素反应，以检测ATP。在需要ATP的生物发光反应例如萤光素酶介导的反应，以及通过核苷酸激酶例如ADP到ATP转化酶催化的ADP到ATP的转化之前，在激酶或ATP酶反应之后的ATP剩余量基本上减少到例如是所形成的ADP或反应混合物最初存在的ATP量的小于2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、0.02％、0.01％、0.001％、0.0001％或以下，或消除。在一个实施方案中，使用腺苷酸环化酶例如细菌腺苷酸环化酶以将剩余ATP转化为cAMP，cAMP是对ADP转化酶反应或ATP依赖型生物发光反应没有作用或没有明显作用的一种产物。一旦剩余ATP减少到最少量或消除时，使用能将ADP转化为ATP的酶例如腺苷酸激酶(肌激酶)、肌酸激酶或丙酮酸激酶等，将激酶或ATP酶反应中所形成的ADP转化为ATP。在某些实施方案中，在将溶液中的ADP转化为ATP或进行生物发光反应之前，将ATP转化为非ADP产物的酶的活性受到抑制。当在此情况下，将ATP转化为非ADP产物的酶将不会干扰从ADP生成ATP或用生物发光反应来检测ATP。然后使用由生物发光反应所生成的光来检测新形成的ATP，例如用发光计来测量。一般而言，将ADP转化为ATP、再将ATP转化为光的方法包括：将包含生物发光产生酶、生物发光底物、ADP到ATP转化酶和任选(如果需要的话)ADP到ATP转化酶的底物的组合物，加入到具有由激酶或ATP酶反应所产生的ADP的反应混合物中；所述生物发光产生酶例如萤光素酶例如天然或重组萤光素酶例如萤火虫或叩头虫的萤光素酶，所述生物发光底物例如作为萤光素酶底物的萤光素或萤光素衍生物，所述ADP到ATP转化酶例如激酶。在使用前，通过将包含并非萤光素酶的试剂的溶液加入到冻干萤光素酶中，来混合所述组合物。在另一个实施方案中，在使用前，通过将包含并非萤光素酶和萤光素或萤光素衍生物的试剂的溶液加入到冻干萤光素酶和冻干萤光素或其衍生物中，来混合所述组合物。

本领域技术人员知道，生物发光反应表明溶液中ADP的存在与否或者提供溶液中ADP的度量。当需要检测溶液中的ADP时，可将生物发光反应结果与一个或多个标准或对照反应进行比较。

本发明也提供用于检测样品中磷酸转移酶活性例如激酶活性或ATP水解酶活性例如ATP酶活性的组合物和试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包含将ATP转化为非ADP底物的分离的酶，例如将ATP转化为cAMP的腺苷酸环化酶和焦磷酸酶。所述试剂盒还可包含一种或多种激酶、激酶的底物、将ADP转化为ATP的酶例如丙酮酸激酶、可被将ADP转化为ATP的酶使用的磷酸供体例如磷酸烯醇式丙酮酸、萤光素酶和/或萤光素酶的底物例如萤光素或其衍生物。

所述试剂盒可任选包含将ATP转化为ADP的磷酸转移酶或ATP水解酶的一种或多种抑制剂、或有效量的腺苷酸环化酶活化剂。

可用于本文所述的方法、试剂盒或组合物的示例性的腺苷酸环化酶包括但不限于：细菌腺苷酸环化酶，例如来自以下细菌的那些：百日咳博德特氏菌(Bortedella pertussis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、大肠杆菌(Escherchia coli)、蛭弧菌(Bdellovibrio spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、耶尔森菌(Yersinia spp.)、欧文氏菌(Erwinia spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)或希瓦氏菌(Shewanellaspp.)或具有腺苷酸环化酶活性的全长细菌腺苷酸环化酶的片段，例如具有腺苷酸环化酶活性的细菌腺苷酸环化酶的重组片段(例如参见图4)；真核生物腺苷酸环化酶，例如钙调蛋白激活的真核腺苷酸环化酶；藻类腺苷酸环化酶，例如钝顶螺旋藻(Spirulina platenis)腺苷酸环化酶；猪、非人类灵长类、狗、牛、啮齿类或人类的腺苷酸环化酶，例如ADCY1、ADCY2、ADCY3、ADCY4、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADCY8、ADCY9或ADCY10或腺苷酸环化酶同种型I、III和VIII(其受Ca²⁺/钙调蛋白的刺激)或同种型V和VI(其被Ca²⁺以钙调蛋白非依赖型方式抑制)，或其具有腺苷酸环化酶活性的片段。

在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种或多种激酶抑制剂。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种或多种ATP酶抑制剂。在另一个实施方案中，如果所述组合物不包含磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的抑制剂时，可通过其它方式使磷酸转移酶或ATP水解酶的活性失活，例如在添加腺苷酸环化酶之前加热。然而，可无需让磷酸转移酶或ATP水解酶失活，以便进行本发明。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含分离的细菌腺苷酸环化酶，例如可被活化剂例如钙调蛋白活化的一种酶。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含分离的钙调蛋白刺激的细菌腺苷酸环化酶、星孢素、焦磷酸酶和任选钙调蛋白。合适的焦磷酸酶包括酵母焦磷酸酶。在另一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种或多种激酶或ATP酶的抑制剂、焦磷酸酶和腺苷酸环化酶活化剂。在一个实施方案中，所述试剂盒可包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含一种或多种激酶或ATP酶的抑制剂、焦磷酸酶和腺苷酸环化酶活化剂，而所述第二组合物包含腺苷酸环化酶。所述试剂盒可在单独容器中装有各种试剂或可在容器中合并两种以上试剂。

还提供包含腺苷酸环化酶抑制剂和任选分离的将ADP转化为ATP的ADP到ATP转化酶的组合物或试剂盒，所述抑制剂即ATP结合位点竞争者例如ATP类似物，或催化结构域抑制剂例如PMEA(9-(2-磷酰甲氧基乙基)-腺嘌呤)或PMEApp类似物。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含活化细菌腺苷酸环化酶的抑制剂，例如钙调蛋白活化的细菌腺苷酸环化酶或其具有腺苷酸环化酶活性的片段的抑制剂，以及至少一个ADP到ATP转化酶、例如腺苷酸激酶、肌酸激酶或丙酮酸激酶。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含腺苷酸环化酶抑制剂和分离的ADP到ATP转化酶的底物。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包含分离的ADP到ATP转化酶。在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包含生物发光酶例如萤光素酶和生物发光酶的底物例如D-萤光素。

另外，本发明提供这样的组合物：所述组合物包含ADP到ATP转化酶、包括去垢剂在内的并能使腺苷酸环化酶失活的有效量的用于生物发光酶介导反应的试剂以及任选的ADP到ATP转化酶的底物。

还提供在包含ADP和ATP的混合物中将ATP转化为cAMP和PPi或cAMP和Pi的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：提供用于将ATP转化为ADP的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的第一反应混合物，所述第一反应混合物包含ATP和怀疑具有磷酸转移酶或ATP水解酶的样品；并且使第一反应混合物与一定量的分离的活性腺苷酸环化酶和焦磷酸酶以及任选的磷酸转移酶或ATP水解酶的一种或多种抑制剂接触，其数量能有效得到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含cAMP、Pi和如果所述样品中存在磷酸转移酶或ATP水解酶的话，ADP。在一个实施方案中，所述方法包括：提供用于将ATP转化为ADP的激酶或ATP酶的第一反应混合物，所述第一反应混合物包含ATP和怀疑具有激酶或ATP酶的样品；并且使第一反应混合物与一定量的分离的活性腺苷酸环化酶和任选的激酶或ATP酶的一种或多种抑制剂接触，其数量能有效得到第二反应混合物，所述第二反应混合物包含cAMP、PPi和如果所述样品中存在激酶或ATP酶的话，ADP。所产生的Pi或PPi的量基本上不抑制ADP到ATP转化酶反应或ATP依赖型生物发光酶反应。在一个实施方案中，使所述第二反应混合物与腺苷酸环化酶抑制剂、ADP到ATP转化酶、任选ADP到ATP转化酶的底物、还任选生物发光酶及其底物接触，而得到第三反应混合物。因此，在加入生物发光酶及其底物例如萤光素酶和萤光素之后，或者在腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶的同时，或者在加入腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶之后，检测第三反应混合物中的发光。在一个实施方案中，将用于将ADP转化为ATP的反应混合物和生物发光酶合并在一个溶液中。对照反应包括不含磷酸转移酶或ATP水解酶的反应。

另外，本发明提供用于将ATP转化为ADP的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的调节剂的鉴定方法。所述方法包括提供第一反应混合物，所述混合物包含一种或多种测试剂、一种或多种将ATP转化为ADP的磷酸转移酶或ATP水解酶例如一种或多种分离的激酶或细胞表达的重组激酶或其裂解物、以及ATP；使第一反应混合物与一定量的至少一种分离的活性腺苷酸环化酶和至少一种焦磷酸酶、和任选一种或多种磷酸转移酶或ATP水解酶的一种或多种抑制剂接触，得到包含cAMP、Pi和ADP的第二反应混合物。使第二反应混合物与腺苷酸环化酶的一种或多种抑制剂、一种或多种ADP到ATP转化酶、生物发光酶及其底物例如萤光素酶和萤光素接触，得到第三反应混合物。因此，在加入生物发光酶及其底物之后，或者在腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶的同时，或者在加入腺苷酸环化酶抑制剂和ADP到ATP转化酶之后，检测第三反应混合物中的发光。在一个实施方案中，将用于将ADP转化为ATP的反应混合物和生物发光酶反应合并在一个溶液中。对照反应包括不含磷酸转移酶或ATP水解酶的反应或者可包含磷酸转移酶或ATP水解酶的已知抑制剂或活化剂的反应。

例如，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性，则在所述方法中测试的试剂就可鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的95％，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％或以下时，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。在还一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性小于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的50％，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的抑制剂。

在另一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的10％，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。在一个实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的20％、30％、40％、50％、75％、100％或200％，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。在又一实施方案中，如果在所述试剂存在时激酶或ATP酶活性大于所述试剂不存在时激酶或ATP酶活性的至少50％，则所测试剂就鉴定为激酶或ATP酶的活化剂。

本发明因此提供用于检测样品中的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶活性的方法、组合物和试剂盒。在某些实施方案中，方法、组合物和试剂盒是不含抗体的，并且本文所述的均质方法是快速、灵敏、简便和非放射性的。所述方法是方便的并可与任何仪器平台一起使用。可以相对容易地设计并可容易地合成所需试剂。所述试剂可便于在许多样品中以高通量模式、长时间测定活性，因为发光反应产生高的信号稳定性，因此无需具有试剂注射器的发光计并且允许以分批模式处理多个样品。

在一个实施方案中，本发明的方法可在多孔板中的单个孔中进行，使其适用于高通量筛选方法。所述方法可在不同反应温度下用于不同量的ATP、激酶或ATP酶、测试剂或其任何组合。本发明的方法可用于检测宽范围的ADP或ATP浓度的活性，通常从大约1μM以下至大约5mM以上的ADP或ATP。在某些实施方案中，采用本文所述的方法、组合物或试剂盒可检测低至0.5μM、0.25μM、0.1μM、0.01μM、1nM、0.1nM、0.01nM、1picoM以下的ADP或ATP浓度。在某些实施方案中，可检测在10micoliters溶液中的20nM ADP(0.2pM ADP)。例如所述方法可用于在通常低于5μM ATP的低浓度ATP以及大约1mM至大约5mM ATP的范围内检测激酶活性。尽管本发明的方法可用于实际含有任何量的ADP或ATP样品。

本发明的试剂盒经设计用于检测和定量检测样品中的磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的活性，或者检测测试剂例如文库例如组合文库中的那些对磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶的活性的作用。在一个实施方案中，用于检测样品中的激酶或ATP酶活性的试剂盒可在一个容器中包含冻干的萤光素酶或冻干的萤光素酶和萤光素，而另一容器含有一种或多种ADP到ATP转化酶或其底物、或腺苷酸环化酶抑制剂或其组合的重配缓冲液。所述试剂盒也可提供镁或其它阳离子例如锰或钙。为了便于使用已知浓度的ADP或ATP或者激酶或ATP酶的对照试验，在所述试剂盒中还可提供装有ADP、ATP、分离的激酶或分离的ATP酶的容器。所述试剂盒也可提供例如在溶液中抑制激酶或ATP酶活性的化合物(例如星孢素)。包含激酶或ATP酶抑制剂的组合物可包含不止一种抑制剂。因此，所述试剂盒可提供一种或多种分离的ADP到ATP转化酶及任选底物，其是磷酸基团供体(例如磷酸肌酸、磷酸烯醇式丙酮酸或多磷酸)或其它分离的酶例如分离的腺苷酸环化酶，或焦磷酸酶。

在一个实施方案中，所述试剂盒包含装有缓冲液的容器，所述缓冲液例如大约pH6.0至大约pH8.0，具有分离的腺苷酸环化酶、任选一种或多种激酶或ATP酶抑制剂和任选焦磷酸酶。所述试剂盒还可额外包含装有冻干萤光素酶的单独容器，或任选包含装有腺苷酸环化酶抑制剂、激酶和任选ADP到ATP转化酶的底物的单独容器。在一个实施方案中，装有冻干萤光素酶的容器还装有作为萤光素酶底物的冻干萤光素或其衍生物。任选所述试剂盒还包含用于测定ADP的试剂盒使用说明书。

附图简述

图1是ADP检测测定方案，其中在检测步骤之前使用腺苷酸环化酶(AC)以除去ADP形成反应之后剩余的ATP。

图2显示AC耗尽反应中存在的所有ATP的效力。

图3显示用两种细菌百日咳博德特氏菌和炭疽芽孢杆菌的AC耗尽ATP。

图4显示重组全长AC(170Kd)和催化结构域(43Kd)具有类似活性。

图5显示4种钙调蛋白拮抗剂对AC的抑制。

图6显示卡米达佐(calmidazolium)对AC的抑制结果。

图7显示在ATP存在下，对检测不同浓度ADP的测定灵敏度。

图8显示在PKA激酶反应之后，当来自两种不同细菌的AC用于ADP检测测定所得的结果。

图9显示激酶或ATP酶抑制剂的任选使用，以终止激酶或ATP酶反应。

图10显示使用本发明组合物的蛋白激酶PKA滴定结果。

图11显示使用本发明组合物的PKA底物(肯普肽(kemptide))滴定结果。

图12显示使用本发明组合物，在PKA激酶反应中的ATP滴定结果。

图13显示不同抑制剂对PKA活性的作用结果。

图14显示使用本发明组合物的脂质激酶PI3滴定结果。

图15显示在使用本发明组合物的PI3脂质激酶反应中的ATP滴定结果。

图16显示使用本发明组合物的PI3脂质激酶底物(磷脂酰肌醇)滴定结果。

图17显示使用本发明组合物，渥曼青霉素(wortmanin)诱导的对PI3脂质激酶抑制的结果。

图18显示使用本发明组合物的鞘氨醇激酶(SPHK)滴定结果。

图19显示使用本发明组合物的受体酪氨酸激酶EGFR滴定结果。

图20显示使用本发明组合物，在EGFR激酶反应中的ATP滴定结果。

图21显示使用蛋白底物(MBP)和本发明组合物的MAP激酶ERK2滴定结果。

图22显示使用葡萄糖作为底物和本发明组合物的糖激酶己糖激酶滴定结果。

图23显示在使用本发明组合物的Hsp70ATP酶反应中的ATP和酶滴定结果。

图24显示在使用本发明组合物的ATP依赖型DNA酶反应中的线状DNA底物滴定研究结果。

图25显示使用本发明组合物的Na+/K+ATP酶滴定研究结果。

图26-27显示使用本发明组合物，在抑制剂和活化剂药物存在下，P-糖蛋白(Pgp)活性滴定研究结果。

图28显示使用本发明组合物的SV40大T抗原固有的解螺旋酶活性滴定的结果。

图29显示在2或3步骤中进行测定的能力并具有类似结果。

图30显示在ADP到ATP转化步骤中，肌酸磷酸激酶的使用。

图31显示在ADP到ATP转化步骤中，腺苷酸激酶(肌激酶)的替代使用。

图32显示本发明的替代使用，以便在检测细胞ATP含量之前，耗尽溶液中污染的游离ATP。

图33提供腺苷酸环化酶的示例性序列(SEQ ID NO：1-9；NCBI检索号.Y00545、M24074、YP016473、NP652900、AP003604、AA01202、P15318和Q57506)，以及ADP到ATP转化酶的示例性序列(SEQ IDNO：10-15；NP_067248、NP_031736、AAC31758、AAF06820和NP_077352)。

发明详述

定义

除非另有说明，否则所有科技术语都具有本发明所属领域的技术人员公知的含义。所有引用的专利和出版物都通过引用全部结合到本文中，除非另有说明。

“分离的”或“纯化的”酶例如腺苷酸环化酶、激酶、ATP酶或萤光素酶是已经鉴定和分离和/或从其天然环境的成分中回收的那些。

本文所用的术语“样品”以其最广泛的含义加以使用。样品是使用本发明来分析的怀疑具有激酶或ATP酶活性的组合物。尽管通常样品是已知含有或怀疑含有激酶或ATP酶活性，任选在生长培养基或细胞裂解物中，但样品也可以是怀疑具有激酶或ATP酶活性的固体表面(例如拭子、膜、滤器、颗粒)。已经提出，对于所述固体样品，通过将固体加入到本发明的试剂组合物或另一种添加本发明试剂组合物的含水溶液中，制备含水样品。

本文所用的术语“检测”是指定量或定性检测样品中某组分的存在与否。

“％氨基酸序列同一性”定义为当两个序列最佳比对时，一个序列中的氨基酸残基与第二序列中的氨基酸残基在重叠区域内的相同、一致或相对的百分数。为了测定％氨基酸同一性，局部比对序列并在必要时引入空位以达到最大％的序列同一性；当计算序列同一性时，保守取代不计。测定％同一性的氨基酸序列比对程序是本领域技术人员众所周知的。公众可得的计算机软件例如BLAST软件(NCBI在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)可用于比对肽序列。本领域技术人员可确定用于测定比对的合适算法和参数，包括得到两个氨基酸序列最佳比对所需的任何算法和参数。

当进行氨基酸序列比对时，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(也可表示为给定氨基酸序列A具有或包括与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性)可计算如下：

％氨基酸序列同一性＝(X/Y)·100

其中X是通过序列比对程序或算法而在A和B最佳比对中记为相同匹配的氨基酸残基数，Y是所比对的总氨基酸位数。

本文所用的术语“发光”包括生物发光(即由活体产生光)、化学发光(当进行化学反应时产生光)和电化学发光。当所涉及的酶为发光而通过自然选择在生物体中进化，或者所涉及的酶是所述酶的突变衍生物时，发光反应也称为“生物发光反应”，所涉及的酶也称为“生物发光酶”。生物发光酶的实例包括但不限于萤火虫萤光素酶、花虫(Renilla)萤光素酶、海萤(Cypridina)萤光素酶、水母(Aequorin)发光蛋白、Gaussia萤光素酶、Oplophorus萤光素酶、奥贝林(Obelin)发光蛋白等。

本文所用的术语“发光分子(luminogenic molecule)”是指能通过化学或生化反应而发光的分子(例如萤光素、腔肠荧光素(coelenterazine)或其功能类似物)。萤光素酶的合适的发光分子或底物包括萤光素、腔肠荧光素以及萤光素和腔肠荧光素的功能类似物。在某些实施方案中，萤光素和腔肠荧光素的功能类似物包括修饰的萤光素和腔肠荧光素，包括这些化合物的衍生物。示例性的化合物包括公开于WO03/040100、WO2004/027378和美国公开申请2009-0075309中的那些。

通常，发光分子是高能分子(例如稳定的二氧杂环丁烷)或它可通过化学反应转化成高能分子。化学反应通常是通过氧、超氧化物或过氧化物的氧化。在每种情况下，发光分子内的能量通过化学反应而释放。尽管这些能量中的至少某些是作为光的光子而释放，能量也可以其它形式例如热的形式释放出来。不发光的发光分子通过通常称为“暗途径”的替代方式而分散其能量。

本文所用的术语“萤光素衍生物”是指具有D-萤光素基本结构并作为萤光素酶底物的一类发光分子或化合物，例如在美国申请顺序号11/444，145，Branchini等(1989)中公开的氨基萤光素或萤光素酶底物，例如在Branchini等(2002)，和Branchini(2000)中公开的萘基和喹啉基衍生物，所述文献的公开内容都通过引用结合到本发明中。

术语“抑制剂”是指能通过包括但不限于直接或间接灭活、抑制、变性或掩蔽等的任何机制而基本上减少或终止样品中的酶活性的分子、化合物或物质。

本文所用的术语“基本上将溶液中的所有ATP减少成非ADP底物”是指溶液中ATP的量减少到这样的量：允许检测溶液中从ADP产生的ATP的存在与否或测定ATP的量。在某些实施方案中，溶液中的ATP量减少到溶液中最初ATP量的不足2％，例如1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、0.02％、0.01％、0.001％或0.0001％或更低。

本文所用的术语“基本上除去所有PPi”是指溶液中PPi的量减少到这样的量：使得生物发光反应可以检测溶液中从ADP产生的ATP的存在与否或测定ATP的量。在某些实施方案中，溶液中的PPi的量减少到溶液中最初PPi量的不足5％，例如4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、0.02％、0.01％、0.001％或0.0001％或更低。在某些实施方案中，用酶例如焦磷酸酶除去PPi。

本发明示例性组合物和方法

本发明提供组合物和使用这些组合物的方法，所述方法在抑制激酶或ATP酶并将任何剩余ATP转化为cAMP之后，通过检测激酶或ATP酶催化的ADP形成，而检测样品中的激酶或ATP酶活性。所形成的ADP再转化为ATP，用于生物发光反应，例如与萤光素酶介导的反应结合，任选在单个步骤中，然后再通过检测所发的光。在一个实施方案中，使用本发明组合物与样品而产生的光具有延长的持续时间，即减少到每小时小于约50％，相对于最后的组合物刚与样品混合之后的发光而言。

用于所述方法的样品可包含细胞、细胞裂解物、裂解物的亚细胞部分例如膜部分，或无细胞样品，并包括生理样品。本发明范围之内的细胞包括原核细胞和真核细胞，包括植物细胞和脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞包括但不限于：人、非灵长类的人类(non-primatehuman)、牛、马、绵羊、猪、山羊、猫、狗、貂、啮齿类或禽类的细胞。包含细胞的样品可经处理，使样品中的细胞渗透或裂解。渗透、裂解或破碎细胞或其亚细胞部分的方法是本领域众所周知的。各种仪器可用于机械破碎，包括超声波仪(超声波发生器)、杜恩斯匀浆器(dounce)、研钵和乳钵、或法式压榨(French press)。可通过渗压振荡，通过例如一系列冻融循环或快速改变环境离子强度等处理，或者通过使用直接破坏细胞膜的试剂(例如溶菌酶等酶，或化学试剂例如去垢剂或表面活性剂例如两性离子型和非离子型去垢剂或阳离子型去垢剂DTAB或CTAB，以及抗菌药物例如多粘菌素B和氯己定)，来破碎细胞(产生细胞裂解物)。

样品中的细胞，例如在包括真核细胞例如酵母细胞、禽类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞在内的样品中的细胞，包括但不限于人、猿、鼠、狗、牛、马、猫、绵羊、山羊或猪的细胞，原核细胞，来自两种以上不同生物体的细胞，或细胞裂解物，可以是未经重组技术的遗传修饰(非重组细胞)，或者可以是重组细胞，其可以是用重组DNA和/或用重组DNA稳定扩增的基因组瞬时转染的细胞，或者其基因组已经修饰以破坏基因例如破坏启动子、内含子或可读框，或用另一DNA片段置换一个DNA片段。重组DNA或置换DNA片段可编码可用本发明方法检测的激酶或ATP酶，改变所检测激酶或ATP酶的水平或活性的一部分，和/或与改变激酶或ATP酶的水平或活性的分子或部分无关的基因产物。

在一个实施方案中，本发明减少到检测样品中的激酶或ATP酶活性所需操作的2步骤，在发光检测之前。在所述方法中，至少一部分激酶或ATP酶反应产物与腺苷酸环化酶和焦磷酸酶反应的必要成分混合，其中在激酶或ATP酶反应之后剩余的ATP转化为cAMP，而且焦磷酸被降解。至少一部分具有cAMP的反应混合物的产物与ADP到ATP转化酶反应和生物发光反应的所有必须成分混合，所述成分例如包括以下在内的成分：腺苷酸环化酶抑制剂、一种或多种ADP到ATP转化酶及其任选底物、和ATP依赖型生物发光产生酶(例如萤光素酶)以及相应发光分子。

在3步法中，至少一部分激酶或ATP酶反应产物(包括ADP和ATP)与腺苷酸环化酶和焦磷酸酶反应的必要成分混合，产生cAMP和磷酸。至少一部分所述反应产物与ADP到ATP转化酶反应的必要成分混合。至少一部分ADP到ATP转化酶反应产物与ATP依赖型生物发光酶介导的反应的必要成分混合。

用于检测、或用于筛选激酶或ATP酶的调节剂的示例性激酶和ATP酶提供如下。

表1.

在一个实施方案中，所检测的或者用于检测其调节剂的测定中的激酶包括但不限于ABL1，ABL2/ARG，AKT1，AKT2，AKT3，ALK，ALK4，ALK5，TGFBR1，ARAF，ARK5，ASK1，Aurora A，Aurora B，Aurora C，AXL，BLK，BMX，BRAF，BRK，BRSK1，BRSK2，BTK，CAMK1a alpha，CAMK1d，CAMKIIa alpha，CAMKIIb beta，CAMKIIddelta，CAMKIIg gamma，CAMK4，CAMKK2，CDK1/周期蛋白B，CDK2/周期蛋白A，CDK2/周期蛋白E，CDK3/周期蛋白E，CDK4-周期蛋白D1，CDK5/p25，CDK5/p35，CDK6/周期蛋白D1，CDK6/周期蛋白D3，CDK7/周期蛋白H/MNAT1，CDK9/周期蛋白K，CDK9/周期蛋白T1，CHK1，CHK2，CK1(酵母)，CK1d(大鼠)，CK1a1alpha，CK1d，CK1e，CK1g1/CSNK1G1，CK1g2，CK1g3/CSNK1G3，CK2alpha，CK2a2，c-试剂盒，CLK1CD，CLK3，c-MER，c-MET，COT1/MAP3K8，CSK，c-SRC，CTK/MATK/HYL，DAPK1，DAPK2，DCAMKL2，DDR2，DMPK，DNA-PK，DRAK1，DYRK1/DYRK1A，DYRK1B，DYRK2，DYRK3，DYRK4，EEF2K，EGFR，EPHA1，EPHA2，EPHA3，EPHA4，EPHA5，EPHA7，EPHA8，EPHB1，EPHB2，EPHB3，EPHB4，ErbB2/HER2，ErbB4/HER4，ERK1，FAK，FER，FES/FPS，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FGR，FLT1/VEGFR-1，FLT3，FLT4，FMS，FRK_PTK5，FYN，GCK/MAP4K2，GRK2，GRK3，GRK4，GRK5，GRK6，GRK7，GSK3a，GSK3B，HCK，HGK/MAP4K4，HIPK1，HIPK2，HIPK3，HIPK4，IGF1R，IKK alpha，IKK beta，IR，IRAK1，IRAK4，IRR，ITK，JAK1，JAK3，JNK1alpha1，JNK2alpha2，JNK3，KDR/VEGFR-2，LCK，LKB1(STK11)，LIMK1，LOK/STK10，LYN，MAPKAPK2，MAPKAPK3，MAPKAPK5/PRAK，MARK1，MARK2，MARK3，MEK1，MELK，MINK，MLCK/MYLK，MLCK2/MYLK2，MLK1，MNK2，MRCKA/CDC42BPA，MRCKB/CDC42BPB，MSK1，MSK2，MSSK1/STK23，MST1，MST2，MST3/STK24，MST4，mTOR，MUSK，NEK1，NEK2，NEK3，NEK4，NEK6，NEK9，NEK11，NIK MAP3K14，NLK，P38alpha，P38beta，P38delta，P38gamma，P70s6k，PAK1，PAK2，PAK3，PAK4，PAK5，PAK6，PASK，PBK/TOPK，PDGFR alpha，PDGFRbeta，PDPK1，PHK gamma2，P13Ka(p110a/p85a)，P13Kb(p110b/p85a)，(p110d/p85a)，P13Kg(p120g)，PIM1，PIM2，PKA，PKC alpha，PKC betal，PKC beta2，PKC delta，PKC epsilon，PKC eta，PKC GAMMA，PKCiota，PKCmu，PKCtheta，PKCzeta(PKCz)，PKD2，PKG1alpha，PCG1beta，PKG2/PRKG2，PKN2/PRK2，PLK1，PLK2，PLK3，PRKD3/PKCnu，PRKX，PYK2，RAF1，RET，RIPK2，ROCK1，ROCK2，RON，ROS，RSK1，RSK2，RSK3，RSK4/RPS6KA6，SGK1，SGK2，SGK3/SGKL，SIK2/SNF1LK2，STK22D，STK33，SRPK1，SRPK2，SYK，TAK1，TAOK2/TAO1，TAOK3/JIK，TBK1，TEC，TIE2，TRKA，TRKB，TRKC，TSSK2，TTK，TYK1/LTK，TYK2，TYRO3_SKY，VRK1，WEE1，WNK2，WNK3，YES，ZAK/MLTK，ZAP70和ZIPK/DAPK3。

例如用于本发明方法的示例性激酶/底物组合包括JNK-1/c-jun、JNK-2/c-jun、MAP激酶-1(ERK-1)/髓磷脂碱性蛋白、MAP激酶-2(ERK-2)/髓磷脂碱性蛋白、PKA/肯普肽、MEK-1/无活性MAP激酶-2(ERK-2)、JNK2α2/ATF-2、JNK2α2/c-jun、SAPK-3/髓磷脂碱性蛋白、SAPK-4/髓磷脂碱性蛋白和raf-1/无活性MEK-1。

用于检测或用于筛选方法的示例性ATP酶包括但不限于F-ATP酶(F1F0-ATP酶)、V-ATP酶(V1V0-ATP酶)、A-ATP酶(A1A0-ATP酶)、P-ATP酶(E1E2-ATP酶)和E-ATP酶。示例性的人ATP酶是Na+/K+转运酶，例如由以下编码的那些：ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B1、ATP1B2、ATP1B3或ATP1B4；Ca++转运酶，例如由以下编码的那些：ATP2A1、ATP2A2、ATP2A3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4或ATP2C1；Mg++转运酶，例如由以下编码的那些：ATP3；H+/K+交换酶，例如由以下编码的那些：ATP4A或ATP4B；H+转运的线粒体酶，例如由以下编码的那些：ATP5A1、ATP5B、ATP5C1、ATP5C2、ATP5D、ATP5E、ATP5F1、ATP5G1、ATP5G2、ATP5G3、ATP5H、ATP5I、ATP5J、ATP5J2、ATP5L、ATP5L2、ATP5O或ATPATP5S；H+转运的溶酶体酶，例如由以下编码的那些：ATP6AP1、ATP6AP2、ATP6V1A、ATP6V1B1、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1C2、ATP6V1D、ATP6V1E1、ATP6V1E2、ATP6V1F、ATP6V1G1、ATP6V1G2、ATP6V1G3、ATP6V1H、ATP6V0A1、ATP6V0A2、ATP6V0A4、ATP6V0B、ATP6V0C、ATP6V0D1、ATP6V0D2或ATP6V0E；Cu++转运酶，例如由以下编码的那些：ATP7A或ATP7B；I类8型酶，例如由以下编码的那些：ATP8A1、ATP8B1、ATP8B2、ATP8B3或ATP8B4；II类9型酶，例如由以下编码的那些：ATP9A或ATP9B；V类10型酶，例如由以下编码的那些：ATP10A、ATP10B或ATP10D；IV类11型酶，例如由以下编码的那些：ATP11A、ATP11B或ATP11C；H+/K+转运的非胃酶，例如由以下编码的那些：ATP12A；和13型酶，例如由以下编码的那些：ATP13A1、ATP13A2、ATP13A3、ATP13A4或ATP13A5。

在本发明方法中可检测或使用例如具有ATP酶活性的任何热激蛋白，例如HSP70或HSP90。对HSP90ATP酶活性的抑制导致所述蛋白质及其相关激酶的降解。因此，开发HSP90的抑制剂是制药业的一个具有活力的研究领域。

在本发明的一个实施方案中，检测激酶活性的方法包括在第一预定时间周期内使怀疑具有激酶的样品与激酶底物和ATP接触，以允许激酶与激酶底物有足够的机会发生相互作用。所述方法可使用各种不同底物，例如氨基酸、肽、蛋白质(包括融合蛋白和其它激酶)、糖和脂质。再使所得激酶反应混合物在第二预定时间周期内与第二组合物接触。第二组合物包含活化腺苷酸环化酶和焦磷酸酶以及任选激酶抑制剂。再使所得第二反应混合物与第三组合物接触，所述第三组合物包含ADP到ATP转化酶、生物发光产生酶、发光分子和任选腺苷酸环化酶抑制剂和/或ADP到ATP转化酶的底物。然后，检测所得第三反应混合物中产生的生物发光。生物发光是由生物发光产生酶例如萤光素酶将发光分子转化为发光化合物而产生的。该方法可用于测定激酶或ATP酶反应的独特终点。在一个实施方案中，试剂组合物允许同时抑制腺苷酸环化酶活性并产生与所存在的ADP量成正比的发光信号。

通常用发光计来测量萤光素酶反应所产生的光，尽管其它检测方式也可使用。大于背景水平的光的存在表明样品中存在ATP。通常在同一基质中、但在样品不存在时，测量光的背景水平。本领域技术人员可以容易地设计合适的对照反应。萤光素酶可允许在一定时间内多次分析一个样品或在一定时间内分析多个样品。任选地，用于本发明组合物和方法的萤光素酶具有增强的热稳定性。

定量测定发射光量也可定量测定ATP的量，因此可定量测定样品中由激酶或ATP酶产生的ADP的量。因此，对ATP的定量测定允许对激酶或ATP酶活性的定量测定。当例如将试验样品所发射的光量(其中通过本发明方法使ADP转化为ATP，所述方法通过将ADP转化成ATP而监测ADP的形成)与对照样品所发射的光量进行比较，或与使用已知量的ATP和同样的萤光素酶和反应条件(即温度，pH等)而测得的标准曲线进行比较时，就可得到定量ATP值。可以理解，定量测定包括减去背景值。当将一个样品所发射的光与另一样品所发射的光进行比较时，就可得到定量ATP值，而无需知道样品中存在的由ADP转化成的ATP的绝对数量，例如在测试剂存在或不存在时比较样品。本领域普通技术人员可以容易地设计许多这样的实验。

可使用激酶或ATP酶的任何抑制剂或抑制剂组合，其数量足以抑制含有样品的反应混合物中激酶或ATP酶活性达至少大约5％，例如至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高或其中任何增量，与没有抑制剂的相应反应相比。ATP酶抑制剂包括但不限于局部麻醉剂、软海绵大环内酰胺提取物(chondropsin)、烟酰胺衍生物、巴佛洛霉素、indole-clase、粘细菌活性物(archazolid)、apicularen、大环二氧化三碳因子、取代的噻吩并[3，4-d]咪唑、以及格尔德霉素及其衍生物。例如格尔德霉素是HSP90的抑制剂，尽管格尔德霉素的衍生物例如17-烯丙基氨基-格尔德霉素(17-AAG)衍生物具有更好的溶解度、口服递送性、有效的活性和药代动力学性质。

示例性的激酶抑制剂包括但不限于AMP、DAPP、二氯乙酸、星孢素、UCN-01和抑激酶素C、4-苯胺基-3-quinolmecarbonitriles、AC220、杂环脲类、NaF、具有带电荷基团的去垢剂例如阳离子型去垢剂(例如DTAB(十二烷基三甲基溴化铵)、CTAB(十六烷基三甲基铵)和BDDABr(苄基二甲基十二烷基溴化铵))、阴离子型去垢剂(例如SDS和脱氧胆酸盐)、两性离子型去垢剂(例如磺基甜菜碱3-10)、咪唑衍生物、AMG706、zactima、MP-412、BAY43-9006、CEP-701(来他替尼)、XL647、XL999、MLN518(以前称为CT53518)、PKC412、ST1571、AMN107、AEE788、OSI-930、OSI-817、SU11248和AG-013736。用于抑制激酶或ATP酶的其它抑制剂包括但不限于SU11248、索拉非尼(sorafenib)、凡德他尼(zactima)、拉帕替尼、伊马替尼、吉非替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、尼罗替尼、拉帕替尼、STI571、达沙替尼、星孢素、Ro31-8220、GW5074、H-89、渥曼青霉素、槲皮素、LY294002、葡萄糖6-磷酸(对于己糖激酶)或D-赤-N，N-二甲基鞘氨醇(对于鞘氨醇激酶)。

示例性的腺苷酸环化酶包括但不限于来自霍乱弧菌(Vibriocholerae)的那些，例如cya，来自炭疽芽孢杆菌或百日咳博德特氏菌的那些，例如百日咳毒素。腺苷酸环化酶的钙调蛋白依赖型部分可以被以下抑制：吩噻嗪和丁酰苯(Levin&Weiss，1976；Gietzen等，1980)、萘磺酰胺(Kobayashi等，1979)、长春花属生物碱(Watanabe等，1979；Gietzen&Bader，1980)、局部麻醉剂(Volpi等，1981)，以前称为R24571的卡米达佐(Gietzen等，1981)和化合物48/80(Gietzen等，1983)(另见Wolff&Brostrom(1976)和Gietzen等(1982a))。通常，在生理pH下，可以认为钙调蛋白依赖型酶的活化剂(钙调蛋白、油酸或磷脂酰-丝氨酸)是阴离子型两亲物，而钙调蛋白拮抗剂则是阳离子型两亲物。酶的钙调蛋白-刺激的发生可通过钙调蛋白与阳离子型两亲拮抗剂通过离子键和疏水性相互作用，作为其互补结构特征的结果而形成复合物(Weiss等，1980)，而且另外，若干钙调蛋白拮抗剂通过与钙调蛋白效应物酶的直接相互作用而发挥其抑制作用(Gietzen等，1982a，b)。此外，几乎所有所述抑制剂都或多或少地具有非特异性，因为它们也抑制钙调蛋白依赖型酶的基础活性。

示例性的腺苷酸环化酶活化剂包括但不限于钙调蛋白、腺苷或环前列腺素类似物(carbacyclin)。

示例性的腺苷酸环化酶抑制剂包括但不限于钙调蛋白拮抗剂例如卡米达佐、N⁶-环己基腺苷、腺苷、2′，5′二脱氧腺苷、E₆小檗胺、三氟拉嗪、化合物48/80、MDL-12、330A、SQ22536、9-环戊基腺嘌呤、焦儿茶酚、2′，5′-二脱氧腺苷3′-一磷酸、2′，5′-二脱氧腺苷3′-二磷酸、2′，5′-二脱氧腺苷3′-三磷酸、2′，5′-二脱氧腺苷或2′/3′-O-(N-甲基氨茴酰基)鸟苷-5′-(γ-硫代)三磷酸三乙基铵盐。

含有一种或多种酶的本发明组合物也可包含酶稳定剂。所述酶稳定剂可以是能使酶稳定的任何化合物，例如免遭降解的化合物。合适的酶稳定剂包括蛋白质(例如牛血清白蛋白、明胶或)或去垢剂(例如非离子型去垢剂，例如THESIT)。

此外，本发明可用于测定小分子(包括有机和无机分子以及合成和天然存在的分子)对激酶或ATP酶活性的作用，这反过来又允许评价小分子是否可起到药物的作用。所述方法可包括对照，其中使样品与对激酶或ATP酶活性的作用是已知的对照物接触。另外，对照可包含样品，其中腺苷酸环化酶、ADP到ATP转化酶或ATP依赖型生物发光酶和测试剂都存在，以确保试剂不直接影响腺苷酸环化酶、ADP到ATP转化酶和ATP依赖型生物发光酶活性。

本领域技术人员知道，本文所述的方法、组合物和试剂盒可用于测定将ATP转化为ADP的酶例如激酶或ATP水解酶的酶活性。另外，所述方法可用于测定有多少酶被已知或推定抑制剂所抑制，尤其是当将所述反应结果与一个或多个标准或对照反应比较时。因此，本发明的方法、组合物和试剂盒可用于鉴定酶的抑制剂。

因此，本发明涉及测定一种或多种测试剂对含有激酶或ATP酶的第一样品的作用的方法，即通过使第一样品与一定浓度的一种或多种测试剂接触，然后再使第一样品与本发明的试剂组合物接触，检测并比较第一样品的发光量与含有激酶或ATP酶的第二样品的发光量。可使第二样品与一定浓度的一种或多种测试剂接触，其浓度小于接触第一样品的浓度或者可以含或不含一种或多种测试剂。与第二样品相比，从第一样品中检测到的较少的发光量就可表示一种或多种测试剂包含抑制剂。这样，就可以发现抑制剂。同样，本发明可用于发现激酶或ATP酶活性的增强剂。使用以上实例，与第一样品相比，从第二样品中检测到的较少的发光量就可表示一种或多种测试剂包含激酶或ATP酶的增强剂。本发明可用于比较相同浓度的不同测试剂对激酶或ATP酶活性的作用。本发明也可用于比较一种或多种测试剂对不同类型的激酶或ATP酶的作用。本领域技术人员可开发许多其它的这类借助于本发明的测定。

在一个实施方案中，本发明提供用于筛选一种或多种测试剂对激酶或ATP酶活性的作用的方法。所述方法包括提供用于筛选的一种或多种测试剂并在有效允许一种或多种激酶或ATP酶将ATP转化为ADP的条件下，孵育第一反应混合物达第一预定时间周期，所述第一反应混合物包含一种或多种激酶或ATP酶、ATP和一种或多种测试剂。再使第一反应混合物与具有一定量的分离的活性腺苷酸环化酶和焦磷酸酶、和任选一定量的激酶或ATP酶的一种或多种抑制剂的第一试剂接触，以形成第二反应混合物，再在有效允许ATP转化为cAMP的条件下，将第二反应混合物孵育达第二预定时间周期。在有效允许生物发光反应的条件下，使第二反应混合物与第二试剂接触达第三预定时间周期而得到第三反应混合物，其中第二试剂包含腺苷酸环化酶的一种或多种抑制剂、一种或多种ADP到ATP转化酶、发光分子和生物发光产生酶。然后，通过测定并比较第三反应混合物相对于不含测试剂的对照混合物的发光，测定一种或多种测试剂对激酶或ATP酶活性的作用。在一个实施方案中，测试一种或多种测试剂对激酶活性的作用，所述激酶活性例如蛋白激酶活性、脂质激酶活性、多核苷酸激酶活性或糖激酶活性。在一个实施方案中，所述发光分子包括D-萤光素或萤光素衍生物，而生物发光酶包括萤光素酶。

在一个实施方案中，在最佳酶反应条件下，用于激酶或ATP酶反应的反应混合物包含测试剂，例如可抑制激酶或ATP酶的物质。将含有例如来自百日咳博德特氏菌的活性腺苷酸环化酶的缓冲液加入到反应混合物中，将剩余ATP转化为cAMP和焦磷酸。任选地，所述缓冲液可含有激酶或ATP酶的抑制剂，以终止激酶或ATP酶反应。还任选地，所述缓冲液可含有焦磷酸酶。在一个实施方案中，焦磷酸酶存在于溶液中，用于将ATP转化为cAMP的反应，而生物发光产生酶是萤光素酶。在这样的反应中，萤光素酶反应所产生的光不受影响，因为焦磷酸已知是萤光素酶的抑制剂。使用ADP到ATP转化酶例如腺苷酸激酶、肌酸激酶、丙酮酸激酶等，将激酶或ATP酶反应中形成的ADP转化为ATP。为了防止腺苷酸环化酶使用新形成的ATP，在腺苷酸环化酶抑制剂例如钙调蛋白拮抗剂存在下，进行ADP到ATP的转化反应。任选地，ADP到ATP的转化反应可含有ADP到ATP转化酶的底物，例如腺苷酸激酶、肌酸激酶或丙酮酸激酶的底物。通过加入用于ATP依赖型生物发光酶介导的反应(例如萤光素酶/萤光素反应)的试剂，测定所形成的ATP。所产生的RLU与激酶或ATP酶反应中所产生的ADP浓度成比例，因此是那些酶活性的度量。

本发明的一种组合物包含一种或多种腺苷酸环化酶抑制剂例如一种或多种去垢剂例如在美国公布号2004/0101922中公开的那些，和一种或多种ADP到ATP转化酶，其任选包括ADP到ATP转化酶的底物并且还任选非内源性ATP依赖型生物发光产生酶及其底物。所述组合物能维持至少大约30％酶活性达至少大约1小时，例如至少大约2小时至大约4小时。在一个实施方案中，所述非内源性ATP依赖型酶是萤光素酶。

萤光素酶产生催化产物，其提供可检测的光产物、灵敏性，并允许容易地测量ATP。然而，任何ATP依赖型的生物发光产生酶都可用于本发明的方法和组合物。

在其最基本水平，萤光素酶按照其产生光的能力来定义。更具体地讲，萤光素酶是催化底物萤光素氧化而产生氧化萤光素(oxiluciferin)和光子的酶。

迄今为止，已经鉴定了5类萤光素酶。其中，甲虫萤光素酶例如普通萤火虫(萤科(Lampyridae))的萤光素酶，构成具有唯一进化起源的独特的一类。甲虫萤光素酶在文献中通常称为萤火虫萤光素酶；然而，萤火虫萤光素酶实际上是甲虫萤光素酶类的一个亚类。甲虫萤光素酶可从甲虫本身的灯笼中纯化或从本领域众所周知的蛋白质表达系统中纯化。

甲虫萤光素酶，尤其是来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的萤火虫萤光素酶是本领域众所周知的。北美萤火虫萤光素酶(LucPpy)是由大约550个氨基酸组成，分子量为61kDa，这是由基因的核苷酸序列所编码的蛋白质求得的。然而，其它萤火虫萤光素酶是已知的，例如宾夕法尼亚萤火虫(Photuris pennsylvanica)萤火虫萤光素酶(LucPpe2；545个氨基酸残基；GenBank2190534)。可以使用源自LucPpe2(例如LucPpe2m78(也称为78-0B10)；LucPpe2m90(也称为90-1B5)；LucPpe2m133(也称为133-1B2)；LucPpe2m146(也称为146-1H2)的突变萤光素酶，然而，满足本文所提出的限制的任何萤光素酶都可用于本发明的组合物、方法和试剂盒。从LucPpe制备突变萤光素酶的方法公开于PCT/US99/30925。

分离的和/或纯化的萤光素酶通常用于本发明。可用于本文所述的方法、组合物和试剂盒的萤光素酶包括以下文献中发现的那些：WO1999/14336、WO2001/20002、WO2004/027378、EP1 124 944、EP1224 294、美国专利号5,837,465、6,171,808、6,132,983和6,265,177。

可从产生萤光素酶的生物标本或从表达能编码所需萤光素酶的外源多核苷酸的细胞中分离萤光素酶。这类技术是本领域技术人员众所周知的(参见美国专利号6,602,677)。

甲虫萤光素酶的天然存在的底物是萤火虫萤光素，一种polytherocyclic有机酸，D-(-)-2-(6′-羟基-2′-苯并噻唑基)-Δ²-噻唑啉-4-羧酸(萤光素)。萤光素可从自然界(例如从萤火虫)分离或可合成。合成萤光素可具有与天然存在的萤光素相同的结构或者可以是衍生的，只要它功能类似。萤光素衍生物的实例包括D-萤光素甲酯和经水解或样品中酯酶作用而得到荧光素的其它萤光素酶的酯类，以及萘基-萤光素和喹啉基-萤光素(Branchini等，1989)。有多个萤光素的商业来源(例如Promega Corp.Madison，Wis.；Molecular Probes，Eugene，Oreg.)。

产生光的甲虫萤光素酶催化的反应(萤光素酶-萤光素反应)包括萤火虫萤光素、三磷酸腺苷(ATP)、镁和分子氧。在起始反应中，萤火虫萤光素和ATP反应形成萤光素基腺苷酸，同时消除无机焦磷酸。萤光素基腺苷酸保持与萤光素酶的催化位点紧密结合。当这种形式的酶暴露给分子氧时，酶结合的萤光素基腺苷酸就被氧化而得到处于电子激发态的氧化萤光素。激发的氧化萤光素发射光并回到基态：

已经提出，ATP类似物(例如dATP)可以执行反应的ATP功能。还提出其它离子可以替代镁离子而起作用(例如Mn²⁺或Ca²⁺)。另外，氧是反应的反应物。因此，所述反应不应在无氧条件下进行。然而，在实施本发明中通常不必提供超过空气中存在的氧。反应可在密闭容器中进行，其中在反应溶液中提供足够氧。

大部分萤光素酶-萤光素反应都产生短暂存在的闪光。然而，用于本发明的某些萤光素酶，例如LucPpe2的突变体例如LucPpe2m146萤光素酶和LucPpe2m90萤光素酶，在本发明条件下产生“辉光型(glow-type)”发光信号，当试剂组合物与样品混合之后，其每小时的发光损失小于50％。

当用于本发明试剂组合物时保留产生发光能力的任何萤光素酶都可用于本发明。

正如本领域技术人员所理解的，本文并包括权利要求书中所述的所有酶反应，特别地或固有地包括所有酶、底物和发生酶促反应所必须的条件，除非另有说明。

变体酶

全长萤光素酶、磷酸转移酶例如激酶或ATP水解酶例如ATP酶、腺苷酸环化酶或ADP到ATP转化酶变体与相应的全长天然萤光素酶、磷酸转移酶或ATP水解酶、腺苷酸环化酶具有至少大约80％氨基酸序列同一性，至少大约81％氨基酸序列同一性，例如至少大约82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性，例如与检索号Y00545或M24074、或ADP到ATP转化酶序列具有至少90％氨基酸序列同一性并分别保留产生光、转移磷酸基团、从ATP形成cAMP或从ADP形成ATP的能力的物质。一般而言，变体片段的长度为至少大约50个氨基酸，通常长度为至少大约60个氨基酸，更通常长度为至少大约70、80、90、100、150、200、300、400、500或550个氨基酸或更多，并保留产生光、转移磷酸基团、从ATP形成cAMP或从ADP形成ATP的能力。全长萤光素酶、磷酸转移酶ATP水解酶、腺苷酸环化酶或ADP到ATP转化酶、其片段或其变体可以与异源氨基酸序列融合并仍然在本发明中具有功能。

例如，用于本发明组合物和方法的全长甲虫萤光素酶、激酶、ATP酶、腺苷酸环化酶或ADP到ATP转化酶、其片段或其变体，可从天然来源而纯化或者通过各种技术来制备，所述技术包括(1)化学合成，(2)萤光素酶的酶解(蛋白酶)消化，和(3)重组DNA方法。化学合成方法是本领域众所周知的，该方法使用蛋白酶来裂解特定位点。为了产生酶、变体酶或其片段，可以制备能编码酶、变体和片段的DNA并在宿主生物例如大肠杆菌中表达。内切核酸酶消化或聚合酶链式反应(PCR)等方法允许本领域技术人员产生无限供应的明确限定的片段。变体或片段的活性可以与其天然酶不同。

任何类型的氨基酸取代、插入或缺失或其组合都可用于产生变体萤光素酶、腺苷酸环化酶、激酶、ATP酶或ADP到ATP转化酶。然而，具有保守氨基酸取代的萤光素酶、腺苷酸环化酶、激酶、ATP酶或ADP转化酶很可能保留活性。有用的保守取代见表A“示例性取代”。一种类型的某氨基酸被同类型的另一氨基酸取代的保守取代落入本发明范围之内，如果所述取代不削弱酶活性的话。

表A

影响以下因素的非保守取代可修饰萤光素酶功能：(1)多肽主链的结构例如β-片层或a-螺旋构象，(2)电荷，或(3)疏水性，或(4)靶位点侧链的松散性。根据共有的侧链性质将残基分组，见表B。非保守取代需要将这一类的成员交换成另一类。

表B

可用本领域已知方法来制备变体萤光素酶、腺苷酸环化酶、激酶、ATP酶或ADP转化酶的基因或基因片段，所述方法例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。在克隆DNA上可进行定点诱变、盒诱变、限制选择诱变、PCR诱变或其它已知技术，以产生变体DNA。

试剂盒

当本发明作为试剂盒提供时，所述组合物的不同成分可以包装在单独容器中并在使用前混合，如本文所述。这样的成分的单独包装允许长期贮存而不损失酶活性。当将所述试剂盒的不同部分混合时，它们形成“试剂组合物”，所述组合物，在一个实施方案中，具有增强的稳定性，即试剂组合物能够维持至少大约30％，更优选至少大约60％活性达至少1小时，甚至更优选维持至少70％、80％、90％、95％、99％或更高活性达至少1小时，例如至少2小时和/或至少4小时，相对于最初(即在开始的1-5分钟内)产生的试剂组合物的活性而言。所述试剂盒内也可装有说明书材料以及可作为标准或对照的材料，这取决于试剂盒的目的。

试剂组合物

在一个实施方案中，可作为单独部分来提供本发明试剂组合物的以下成分并在临用之前混合：1)萤光素酶，2)一种或多种ADP到ATP转化酶，3)任选腺苷酸环化酶抑制剂，4)任选ADP到ATP转化酶的底物，和5)萤光素酶的底物。在一个实施方案中，可作为单独部分来提供试剂组合物的以下成分并在临用之前混合：1)一种或多种ADP到ATP转化酶，2)腺苷酸环化酶抑制剂，和3)任选ADP到ATP转化酶的底物。在一个实施方案中，可作为单独部分来提供试剂组合物的以下成分并在临用之前混合：1)腺苷酸环化酶，2)焦磷酸酶，3)任选一种或多种激酶或ATP酶的抑制剂，和4)任选腺苷酸环化酶的活化剂。萤光素酶成分还可包含萤光素并且在一个实施方案中，是冻干的。萤光素酶成分任选包含冻干用赋形剂、蛋白质(萤光素酶)稳定剂、镁(或替代阳离子)和镁螯合剂(或替代阳离子螯合剂)。所述组合物还可包含缓冲液、二价阳离子金属螯合剂、镁(或替代阳离子)、消泡剂和酶稳定剂(例如THESIT)。可用于所述方法的合适的试剂盒成分、组合物和缓冲液也可得自市售。例如， Plus或Max缓冲液和/或Plus或Max底物，可得自的Plus或Max Luminesecent激酶测定试剂盒可如本文所述而使用。试剂盒成分、组合物和缓冲液也可通过添加合适成分而改良，所述成分包括酶(例如丙酮酸激酶)、成分(例如磷酸烯醇式丙酮酸、盐、螯合剂等)。不同成分可包含这些部分的亚类并且可以任何方式混合，以便于本发明的应用或延长贮存期。

其它试剂盒成分

试剂盒也可在单独容器中装有试剂，以便进行特定试验，例如细胞活力、细胞毒性或细胞增殖。例如，可供应ATP或ADP，从而测定标准曲线或用作内部对照。可包括已知是激酶或ATP酶抑制剂或活化剂的物质，用作激酶或ATP酶活性检测的阳性对照或者用于测定测试剂对激酶或ATP酶活性的作用。所述试剂盒可提供多孔板和/或一种或多种激酶或ATP酶、腺苷酸环化酶或ADP到ATP转化酶。所述试剂盒可任选包含激酶或ATP酶的底物、缓冲液和腺苷酸环化酶的活化剂或抑制剂。

容器或器皿

所述试剂盒中包含的试剂可以在任何种类的容器中提供，使得不同成分的寿命得以保存，并且不会被容器材料吸附或改变。例如，密封玻璃安瓿可装有冻干萤光素酶或缓冲液，它们在中性的非反应性空气例如氮中包装。安瓿可由任何合适的材料组成，所述材料例如玻璃，有机聚合物例如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷材料、金属或通常用于盛装试剂的任何其它材料。合适容器的其它实例包括由类似于安瓿的材料制作而成的简单的瓶子，以及可由铝箔衬里的内层例如铝或合金组成的外套。其它容器包括试管、管形瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可具有无菌接口，例如具有瓶塞并可用皮下注射针头穿孔的瓶子。其它容器可具有由容易移出的膜间隔的两室，所述膜一旦移出就允许两室混合。可移出的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。

说明性材料

试剂盒也可与说明性材料一起提供。说明书可以印刷在纸张或其它基质上和/或可以以可电子阅读的介质例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip disc、录像带、录音带等形式提供。详细说明书可不必物理粘贴在试剂盒上；而是将用户引导到试剂盒制造商或分销商指定的互联网网址上，或以电子邮件形式提供。在一个实施方案中，所述说明书指导用户将萤光素酶与ADP转化酶和腺苷酸环化酶抑制剂混合，然后将所得试剂组合物加入到样品中。

ATP依赖型萤光素酶-萤光素反应的使用

因为甲虫萤光素酶-萤光素反应是ATP依赖型的，所以萤光素酶可用于测定ATP。该反应特别灵敏，允许在含有低至10^-16摩尔ATP或更低的样品中检测ATP。

本发明的方法、组合物和试剂盒提供通过后续ATP形成而简单定性或定量检测从激酶或ATP酶反应中产生的ADP。在一个实施方案中，样品中产生光的简单定性实验表明激酶或ATP酶的存在。使用包含萤光素酶例如LucPpe2突变体的试剂组合物产生光。另外，试剂组合物还可包含一种或多种以下成分：可从冻干制剂重配的萤光素(或者合适的萤光素类似底物)、ADP到ATP转化酶的抑制剂、二价阳离子(例如镁)、酶稳定剂和缓冲液。

本发明的组合物、方法和试剂盒允许用户通过ADP到ATP的转化而定量测定样品中由激酶或ATP酶所产生的ADP的量，或者激酶或ATP酶的存在，并且在加入ATP依赖型生物发光酶之后定量测定所产生的光量。本发明用于目标样品，并且也用于含有已知量的ADP、激酶或ATP酶(对照)的样品。将本发明用于未知ADP、激酶或ATP酶浓度的样品而产生的信号，与内部对照(向样品中加入已知量的ADP、激酶或ATP酶并测定随后的光)或外部标准曲线(通过测定已知ADP、激酶或ATP酶浓度的若干样品的发光并将其绘图而得到)所产生的信号相互关联。所述方法是技术人员已知的。

通过以下非限制性实施例将会进一步描述本发明。

实施例

材料

来自兔肌肉的丙酮酸激酶(Sigma目录号P9136)、来自鸡肌肉的肌激酶(Sigma目录号M5520)、来自兔肌肉的肌激酶(Sigma目录号M3003)、来自牛心的肌酸磷酸激酶(Sigma目录号C7886)、来自兔脑的肌酸磷酸激酶(Sigma目录号C6638)和来自兔肌肉的肌酸磷酸激酶(Sigma目录号C3755)都得自Sigma公司。

方法

腺苷酸环化酶测定和抑制。在30℃，在60mM Tris pH7.5、10mMMgCl₂、40nM钙调蛋白和不同ATP浓度存在下，对多种腺苷酰环化酶(AC)的活性测定30分钟。除了AC滴定相关实验之外，使用100ngAC。当使用时，按照制造商的推荐制备钙调蛋白拮抗剂并直接加入到AC反应中，当评价直接抑制时，或者加入到将ADP转化成ATP的反应中，以评价ATP形成期间AC的抑制。

激酶和ATP酶反应。除非另有说明，否则激酶或ATP酶反应在40μL缓冲液A(40mM Tris pH7.5、20mM MgCl₂和0.1mg/mL BSA)中，在激酶或ATP酶、ATP以及激酶或ATP酶的底物的存在下进行。所用的底物浓度和反应时间按照指示。酪氨酸激酶反应在补充有以下成分的缓冲液A中进行：2mM DTT、2mM MnCl₂和100μM原钒酸钠。鞘氨醇激酶反应在补充有0.5mM DTT的缓冲液A中进行。Hsp70ATP酶反应在补充有7.5mM KCl和100μM DTT的缓冲液A中进行。Na+/K+ATP酶反应在含有以下成分的缓冲液中进行：20mM Tris pH7.8、0.56mM EDTA、5mM MgCl₂、3mM KCl和133mM NaCl。PgpATP酶反应在Pgp缓冲液(Promega Corp)中进行。SV40大T抗原解螺旋酶反应在含有以下成分的缓冲液中进行：20mM Tris pH7.8、10mMMgCl₂、50mM NaCl和1mM DTT。ATP依赖型DNA酶反应在含有以下成分的缓冲液中进行：33mM Tris-乙酸(pH7.8)、66mM乙酸钾、10mM乙酸镁和0.5mM DTT。

ADP检测测定。测定在多孔板中进行，通常有两个步骤：

1)ATP耗尽：将40uL试剂1(120mM Tris pH7.5、40nM钙调蛋白、20U/mL焦磷酸酶、100ng腺苷酸环化酶和任选300-500nM星孢素)加入到激酶反应中并孵育30分钟。当测定PI3脂质激酶、ATP酶、鞘氨醇激酶或己糖激酶的活性时，试剂1中的星孢素任选分别被以下成分取代以终止反应：500nM渥曼青霉素、75μM槲皮素、150μMD-赤-N，N-二甲基鞘氨醇或2mM葡萄糖-6-磷酸。在测定中也使用百日咳博德特氏菌全长AC毒素、仅AC片段或炭疽芽孢杆菌水肿因子进行ATP耗尽测定(图3和图4)。

2)ADP到ATP的转化和检测：将80μL试剂2(800μM磷酸烯醇式丙酮酸和800mU丙酮酸激酶溶于80μLMax(PromegaCorp.))同时加入到激酶或ATP酶反应中并在室温下孵育30-60分钟。用读板发光计(96Microplate发光计)采集数据。

当在3步骤中进行测定时，引入以下改良。在ATP耗尽步骤之后，加入20μL丙酮酸激酶(PK)试剂(40mM Tris pH7.0、335mM KCl、500μM卡米达佐、500μM磷酸烯醇式丙酮酸、15mM EDTA、0.3mg/mL BSA和300-600mU丙酮酸激酶)，将反应孵育5-10分钟，并加入100μLMax(Promega Corp.)以检测所产生的ATP。10分钟孵育之后，在读板发光计(GloMax 96 Microplate发光计；PromegaCorp.)上读板。

除了使用丙酮酸激酶将ADP转化为ATP之外，腺苷酸激酶和磷酸肌酸激酶也用于进行该转化(图29和图30)。对于这些反应，或125mU腺苷酸激酶或500mU肌酸磷酸激酶/250μM磷酸肌酸用于缓冲液B(50mM Tris pH7.5、10mM MgCl₂和500μM卡米达佐)并在室温下与ADP耗尽混合物一起孵育30分钟。

游离ATP耗尽测定。在25μL LB培养基或含有大肠杆菌的LB培养基中制备两倍系列ATP稀释液。将含有或不含100ng AC的25微升ATP耗尽缓冲液加入到ATP-细菌混合物中并孵育40分钟。为了检测剩余的细胞ATP或游离ATP，将50μL BacTiter-Glo(Promega)加入到混合物中并按照制造商的方法记录发光。ATP耗尽缓冲液含有80mM Tris，pH7.5、40nM钙调蛋白、10mM MgCl₂、2U/mL焦磷酸酶和0.1mg/mL BSA。

一个示例性测定进行如下。在提供或进行包含ATP的激酶或ATP酶反应之后，通过加入包含活性腺苷酸环化酶(AC)、一种或多种激酶或ATP酶抑制剂(例如星孢素)(以终止激酶或ATP酶反应)、缓冲液和任选焦磷酸酶(以消除任何所产生的焦磷酸，如果焦磷酸与后续反应例如焦磷酸抑制基于萤光素酶的反应不相容的话)的第一试剂(例如试剂1)并孵育反应物例如大约30分钟，以消除剩余ATP。任选地，第一试剂也可包含未活化的AC。任选地，AC活化剂，例如钙调蛋白，可以加入到第一试剂中或与第一试剂一起。

然后，将激酶或ATP酶反应所产生的ADP转化为ATP，即通过加入第二试剂(例如试剂2，其包含缓冲液、AC抑制剂(例如卡米达佐或另一钙调蛋白拮抗剂)和一种或多种ADP到ATP转化酶)并孵育反应物。任选地，第二试剂可包含ADP到ATP转化酶的底物，例如磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)或磷酸肌酸(PC)。在一个实施方案中，所述ADP到ATP转化酶包括分别使用PEP或PC的丙酮酸激酶或肌酸磷酸激酶。或者，腺苷酸激酶可用于将ADP转化为ATP而无需磷酸供体。

为了测定新形成的ATP，加入包括用于萤光素酶/萤光素反应的组分的第三试剂(例如试剂3)。该反应产生的相对发光单位(relativeluminescence unit，RLU)与所测激酶或ATP酶活性成比例。合并第二和第三试剂可得到与高通量筛选方法高度一致的测定。

结果

图2显示使用本发明组合物，来自百日咳博德特氏菌的AC可将来自激酶或ATP酶反应的ATP耗尽到背景水平。

图3显示用不同来源例如百日咳博德特氏菌和炭疽芽孢杆菌的腺苷酸环化酶进行ATP耗尽。

图4显示用百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶的全长(170kD)或仅催化结构域(43kD)进行ATP耗尽。

图5显示不同钙调蛋白拮抗剂(例如卡米达佐、B6 barbamine、三氟拉嗪和化合物48/80)可用作腺苷酸环化酶抑制剂，当将ADP转化为ATP时。

图6显示AC受到钙调蛋白拮抗剂卡米达佐的抑制。丙酮酸激酶能将ADP转化为ATP，不受卡米达佐的任何显著干扰，甚至在高浓度卡米达佐(calmidozolium)时。

图7显示在ATP存在下，对检测不同浓度ADP的测定灵敏度和线性。

图8显示使用发光可以进行有意义的ADP检测，当在激酶反应之后，在ADP转化和检测之前，用AC进行ATP耗尽时。

图9显示在ATP耗尽期间，激酶或ATP酶抑制剂可任选用于终止反应，而对后续反应没有影响。

图9-22证明使用本发明的组合物和方法可以检测各种激酶和ATP酶的酶活性。

图10-12证明本发明可用于检测蛋白激酶PKA的活性。在PKA激酶反应中ATP的K_M得到的数值类似于先前报道的。

图13证明本发明可用于测定不同激酶抑制剂对蛋白激酶PKA的IC₅₀值。此外，在图13中，在本发明组合物中使用星孢素以抑制激酶反应，不会明显干扰丙酮酸激酶反应。此外，在图13中，所测激酶抑制剂不干扰腺苷酸环化酶、肌酸磷酸激酶或丙酮酸激酶反应。

图14-18证明本发明可用于检测脂质激酶(PI3激酶和鞘氨醇激酶)的活性。

图19-20证明本发明可用于检测受体酪氨酸激酶(EGFR)的活性。

图21显示使用蛋白质作为底物(MBP)，本发明用于检测MAP激酶的活性。

图22显示本发明用于检测糖激酶(己糖激酶)的活性。

图23-28显示本发明用于检测含ATP酶结构域的酶的活性。

图23显示本发明用于检测热激蛋白Hsp70的ATP酶活性。

图24显示本发明通过监测ATP依赖型DNA酶活性用于检测线状DNA水平。图24显示本发明可用于基于质粒DNA的疫苗，其中需要监测质粒制剂的线状DNA污染。

图25-26显示本发明用于检测Na+/K+ATP酶活性。

图27显示本发明可用于检测P-糖蛋白活性，其药物流出泵活性是ATP依赖型的。这对于疾病治疗期间的药物功效和多药耐药性而言是重要的。

图28显示本发明用于检测解螺旋酶的固有ATP酶活性(SV40大T抗原)。图28显示本发明可通过监测病毒解螺旋酶活性而用于诊断病毒性感染。

图29显示本发明可在2步骤(ATP耗尽反应和ADP到ATP的转化/生物发光酶反应)或3步骤(ATP耗尽反应、ADP到ATP转化反应和生物发光酶反应)中进行并得到类似结果。

图30和图31显示不同ADP到ATP转化酶、肌酸磷酸激酶和腺苷酸激酶分别可将ADP转化成ATP，因此可用于本发明。还显示本领域已知的将ADP转化为ATP的任何酶都可用于本发明。

使用丙酮酸激酶、腺苷酸激酶和肌酸磷酸激酶检测PKA激酶(高ATP消耗酶)和EGFR激酶(低ATP消耗的)的活性。该数据显示，本发明可用于检测高或低水平的ADP。

图32显示腺苷酸环化酶可用于在检测胞内ATP水平之前例如在裂解和使用荧光素酶-介导的反应之后，从含细胞的培养基中净化游离ATP。

本文所述的任何实施方案可与本文所述的任何其它合适的实施方案组合，以提供额外的实施方案。

本文所用的单数形式是指单数或复数。在全文中，复数和单数应视为可相互替代，并非指明确数目。

正如本领域技术人员所知，对于任何和所有目的，特别是以书面描述形式提供的，本文所公开的所有范围都包括任何和所有可能的附属范围及其附属范围的组合以及组成所述范围的单个值，尤其是整数值。任何所列举的范围都可容易地理解为足够的描述和使相同范围可被分为至少2、3、4、5、10等的等分。作为非限制性实例，本文所讨论的各范围可容易地分为下、中、上三份等。正如本领域技术人员所知，所有语言例如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”、“超过”、“以上”等包括所列举的数量并指如上所述地可以被随后分成附属范围的范围。同样，本文所公开的所有比率也包括落入更宽比率之内的所有亚比率。

本领域技术人员也容易知道，当成员以通常方式组合在一起例如在马库什(Markush)组中时，本发明不仅包括作为整体的所列举的全组，而且也包括各组的单个成员和主要组的所有可能的亚组。另外，为了所有目的，本发明不仅包括主要组，而且还包括缺失一个或多个该组成员的主要组。本发明在要求保护的本发明中也提出明确排除任何组成员的一个或多个。

正如本领域技术人员所知，所有数字，包括表示成分、性质例如分子量、反应条件等的数量，都是近似值并在任何情况下都理解为被术语“大约”修饰。这些数值可因本领域技术人员利用本发明的描述而希望得到的所需性质的不同而异。还应理解，所述数值固然含有来自其各自测试中存在的标准差所导致的变异性。

对于本申请中的“步骤”或用字母或数字的指示是仅为了方便的目的，并非对本文所提出的本发明进行分类、定义或限制。本文所公开的所有参考文献都分别通过引用全部结合到本文中。

参考文献

Branchini等(Photchem.Photobiol.，49：689(1989).

Branchini等(J.Am.Chem Soc.，124：2112(2002).

Branchini(Meth.Enzymol.，305：188(2000).

Gietzen等，IRCS Med.Sci.，8：396(1980).

Gietzen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，94：674(1980).

Gietzen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，101：418(1981).

Gietzen等，Biochem.J.，207：541(1982a).

Gietzen等，Mol.Pharmacol.，22：413(1982b).

Gietzen等，IRCS Med.Sci.，11：12(1983).

Glaser等，Mol.Microbiol.，2：19(1988).

Hong等，BBRC，335：850(2005).

Kobayashi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，88，1037(1979).

Ladant等，J.Biol.Chem.，264：4015(1989)。

Levin等，Mol.Pharmacol.，12：581(1976).

Sala-Newby等，FEBS Lett.，30：241(1992)。

Volpi等，Mol.Pharmacol.，20：363(1981).

Watanabe等，Experientia，35：1487(1979).

Weiss等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，356：319(1980).

Wolff等，Arch.Biochem.Biophys.，173：720(1976).

尽管以上已经参考所公开的实施方案和实施例描述了具体的实施方案，但这些实施方案和实施例仅仅是说明性的，并非是限制本发明的范围。本领域普通技术人员可以对其进行变动和修改，只要不偏离所附权利要求书定义的更宽方面的本发明。

Claims (14)

1. 用于检测溶液中腺苷二磷酸(ADP)的存在与否或测定其含量的方法，所述方法包括：

(a) 使用将ATP转化为非ADP产物的酶，基本上将溶液中的所有ATP减少成非ADP产物；

(b) 使用能够将ADP转化为ATP和磷酸基团供体的酶，将溶液中的ADP转化为ATP；和

(c) 采用生物发光反应，检测(a)中所产生的ATP的存在与否或测定其含量。

2. 权利要求1的方法，所述方法还包括：

(d) 在(b)或(c)之前，基本上除去(a)中产生的所有焦磷酸(PPi)。

3. 权利要求1或2的方法，所述方法还包括：

(e) 在(b)或(c)之前，抑制将ATP转化为非ADP产物的酶。

4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中通过产生ADP的酶在溶液中产生ADP，而且所述生物发光反应提供对产生ADP的酶的度量。

5. 权利要求4的方法，其中所述产生ADP的酶是将ATP转化为ADP的酶。

6. 权利要求5的方法，其中所述将ATP转化为ADP的酶是激酶或ATP水解酶。

7. 权利要求6的方法，所述方法还包括：

(f) 在(a)之前，在激酶反应或ATP水解酶反应的已知或推定抑制剂的存在或不存在下，进行所述激酶反应或ATP水解酶反应。

8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述将ATP转化为非ADP产物的酶是腺苷酸环化酶。

9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述能够将ADP转化为ATP的酶是丙酮酸激酶。

10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述生物发光反应包含萤光素酶和所述萤光素酶的底物。

11. 权利要求2-10中任一项的方法，其中(d)用焦磷酸酶来进行。

12. 用于检测溶液中的ADP的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i) 将ATP转化为非ADP产物的酶；

(ii) 能够将ADP转化为ATP的酶；

(iii) 磷酸基团供体；

(iv) 萤光素酶；和

(v) 所述萤光素酶的底物。

13. 权利要求12的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种以下成分：(vi) 焦磷酸酶；

(vii) 一种或多种去垢剂；

(viii) 一种或多种缓冲液；和/或

(ix) 一种或多种盐。

14. 权利要求12或13的试剂盒，其中所述将ATP转化为非ADP产物的酶是腺苷酸环化酶，所述能够将ADP转化为ATP的酶是丙酮酸激酶和/或所述磷酸基团供体是磷酸烯醇式丙酮酸。