JP3059435B1 - ｃＡＭＰおよびアデニル酸シクラ―ゼの酵素的蛍光定量アッセイ - Google Patents
ｃＡＭＰおよびアデニル酸シクラ―ゼの酵素的蛍光定量アッセイInfo
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Abstract
【要約】
【課題】 本発明は内因性の非環状アデニンヌクレオ
チド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ量またはアデニ
ル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用することなく
迅速に測定する方法に関する。 【解決手段】内因性アデニル酸シクラーゼによって生成
されるｃＡＭＰと、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびこれ
らの混合物からなる群から選択される内因性の非環状ア
デニンヌクレオチド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ
量またはアデニル酸シクラーゼ活性の測定方法であっ
て、(１)上記試料中のｃＡＭＰ以外の内因性非環状アデ
ニンヌクレオチドおよびグルコース-６-リン酸を酵素的
に除去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼ
およびアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、
(２)ｃＡＭＰをＡＭＰに酵素的に変換し、(３)放射性物
質を用いることなくＡＭＰの量を測定することを特徴と
する方法。
チド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ量またはアデニ
ル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用することなく
迅速に測定する方法に関する。 【解決手段】内因性アデニル酸シクラーゼによって生成
されるｃＡＭＰと、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびこれ
らの混合物からなる群から選択される内因性の非環状ア
デニンヌクレオチド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ
量またはアデニル酸シクラーゼ活性の測定方法であっ
て、(１)上記試料中のｃＡＭＰ以外の内因性非環状アデ
ニンヌクレオチドおよびグルコース-６-リン酸を酵素的
に除去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼ
およびアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、
(２)ｃＡＭＰをＡＭＰに酵素的に変換し、(３)放射性物
質を用いることなくＡＭＰの量を測定することを特徴と
する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＡＴＰから内因性
アデニル酸シクラーゼによって生成されるｃＡＭＰ(サ
イクリックアデノシン３',５'−一リン酸)と、ＡＴＰ
(アデノシン−三リン酸)、ＡＭＰ(アデノシン−一リン
酸))、ＡＤＰ(アデノシン−二リン酸)およびこれらの混
合物からなる群から選択される内因性の非環状アデニン
ヌクレオチド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ量また
はアデニル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用しな
いで測定する方法を提供するものであり、要約すれば、
(１)上記試料中のｃＡＭＰ以外の内因性非環状アデニン
ヌクレオチドおよびグルコース-６-リン酸を酵素的に除
去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよ
びアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、(２)ｃ
ＡＭＰをＡＭＰに酵素的に変換し、(３)放射性物質を用
いることなくＡＭＰの量を測定することを特徴とする方
法に関する。
アデニル酸シクラーゼによって生成されるｃＡＭＰ(サ
イクリックアデノシン３',５'−一リン酸)と、ＡＴＰ
(アデノシン−三リン酸)、ＡＭＰ(アデノシン−一リン
酸))、ＡＤＰ(アデノシン−二リン酸)およびこれらの混
合物からなる群から選択される内因性の非環状アデニン
ヌクレオチド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ量また
はアデニル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用しな
いで測定する方法を提供するものであり、要約すれば、
(１)上記試料中のｃＡＭＰ以外の内因性非環状アデニン
ヌクレオチドおよびグルコース-６-リン酸を酵素的に除
去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよ
びアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、(２)ｃ
ＡＭＰをＡＭＰに酵素的に変換し、(３)放射性物質を用
いることなくＡＭＰの量を測定することを特徴とする方
法に関する。
【０００２】アデニル酸シクラーゼ(アデニリルシクラ
ーゼ、アデニルシクラーゼ、ＥＣ4.6.1.1)は、Ｍｇ2+ま
たはＭｎ2+の存在下で ＡＴＰ → ｃＡＭＰ を触媒する酵素である。
ーゼ、アデニルシクラーゼ、ＥＣ4.6.1.1)は、Ｍｇ2+ま
たはＭｎ2+の存在下で ＡＴＰ → ｃＡＭＰ を触媒する酵素である。
【０００３】アデニル酸シクラーゼは細胞膜に局在して
おり、種々の基本的なホルモンおよび神経伝達物質のシ
グナル形質導入カスケードとして重要な役割を果たして
いる。例えば、アデニル酸シクラーゼ活性を測定するこ
とにより、ヒトの心臓移植や鬱血性心疾患時に現れる生
理学的変化を理解することができる［M.R.Bristow eta
l., New Engl.J.Med., 第307巻, 205頁(1982年)；K.G.L
urie et al., J.Thorac.Cardiovasc.Surg., 第86巻, 19
5頁(1983年)］。
おり、種々の基本的なホルモンおよび神経伝達物質のシ
グナル形質導入カスケードとして重要な役割を果たして
いる。例えば、アデニル酸シクラーゼ活性を測定するこ
とにより、ヒトの心臓移植や鬱血性心疾患時に現れる生
理学的変化を理解することができる［M.R.Bristow eta
l., New Engl.J.Med., 第307巻, 205頁(1982年)；K.G.L
urie et al., J.Thorac.Cardiovasc.Surg., 第86巻, 19
5頁(1983年)］。
【０００４】このアデニル酸シクラーゼ活性は、アデニ
ル酸シクラーゼの触媒作用によりＡＴＰから合成される
ｃＡＭＰ量の変化を測定することによって求めることが
できる。しかし、ｃＡＭＰの組織レベルでの変化をモニ
ターすることが困難であるため制限されている。
ル酸シクラーゼの触媒作用によりＡＴＰから合成される
ｃＡＭＰ量の変化を測定することによって求めることが
できる。しかし、ｃＡＭＰの組織レベルでの変化をモニ
ターすることが困難であるため制限されている。
【０００５】ｃＡＭＰ(サイクリックアデノシン３',５'
−一リン酸)は１９５７年、肝臓においてアドレナリン
およびグルカゴンの血糖上昇作用を仲介する因子として
見出され［E.W.Sutherland et al., J.Am.Chem.Soc.,
第79巻, 3608頁(1957年)］、その後、副腎皮質ホルモン
(ＡＣＴＨ)、黄体形成ホルモン(ＬＨ)、甲状腺刺激ホル
モン(ＴＳＨ)、副甲状腺刺激ホルモン(ＰＴＨ)などの種
々のホルモンやプロスタグランジンなどの生理活性物質
もｃＡＭＰを介して作用が発揮されることが明らかとな
った。すなわち、ｃＡＭＰは、ペプチドホルモンや活性
アミンが分泌されて目標の細胞に到達した際，細胞内で
酵素反応を進めるための情報伝達を担い、いわゆるセカ
ンドメッセンジャーとしての機能を有している。
−一リン酸)は１９５７年、肝臓においてアドレナリン
およびグルカゴンの血糖上昇作用を仲介する因子として
見出され［E.W.Sutherland et al., J.Am.Chem.Soc.,
第79巻, 3608頁(1957年)］、その後、副腎皮質ホルモン
(ＡＣＴＨ)、黄体形成ホルモン(ＬＨ)、甲状腺刺激ホル
モン(ＴＳＨ)、副甲状腺刺激ホルモン(ＰＴＨ)などの種
々のホルモンやプロスタグランジンなどの生理活性物質
もｃＡＭＰを介して作用が発揮されることが明らかとな
った。すなわち、ｃＡＭＰは、ペプチドホルモンや活性
アミンが分泌されて目標の細胞に到達した際，細胞内で
酵素反応を進めるための情報伝達を担い、いわゆるセカ
ンドメッセンジャーとしての機能を有している。
【０００６】ｃＡＭＰは生体内では膜に局在するアデニ
ル酸シクラーゼによってＡＴＰから合成され、ホスホジ
エステラーゼによって５'−ＡＭＰに分解される。細菌
や動物界に広く存在するが、非常に微量である(定常濃
度０.１〜１ｎモル／湿重量)。ｃＡＭＰの定量法として
は、cＡＭＰ結合タンパク質を用いる方法または放射免
疫法が簡便である。cＡＭＰ含量は細胞の栄養、増殖、
分化、適応状態に左右され敏感に変動する。
ル酸シクラーゼによってＡＴＰから合成され、ホスホジ
エステラーゼによって５'−ＡＭＰに分解される。細菌
や動物界に広く存在するが、非常に微量である(定常濃
度０.１〜１ｎモル／湿重量)。ｃＡＭＰの定量法として
は、cＡＭＰ結合タンパク質を用いる方法または放射免
疫法が簡便である。cＡＭＰ含量は細胞の栄養、増殖、
分化、適応状態に左右され敏感に変動する。
【０００７】多種多様な哺乳動物および非哺乳動物の組
織や体液中のｃＡＭＰを測定することは、細胞生存度、
内分泌ホルモン軸機能、アデニル酸シクラーゼ活性およ
びホスホジエステラーゼ活性を評価するための有用な方
法と成り得る。さらに、ｃＡＭＰ測定を利用して、シグ
ナル形質導入、リボソームタンパク質合成、発生期タン
パク質の転位および他の主要な細胞機能で重要な役割を
果たしているＧタンパク質(グアニンヌクレオチド結合
タンパク質)ファミリーをはじめとする、多数のシグナ
ル形質導入タンパク質の活性を評価することができる
［Bourne et al., Nature, 第348巻, 125頁(1990
年)］。
織や体液中のｃＡＭＰを測定することは、細胞生存度、
内分泌ホルモン軸機能、アデニル酸シクラーゼ活性およ
びホスホジエステラーゼ活性を評価するための有用な方
法と成り得る。さらに、ｃＡＭＰ測定を利用して、シグ
ナル形質導入、リボソームタンパク質合成、発生期タン
パク質の転位および他の主要な細胞機能で重要な役割を
果たしているＧタンパク質(グアニンヌクレオチド結合
タンパク質)ファミリーをはじめとする、多数のシグナ
ル形質導入タンパク質の活性を評価することができる
［Bourne et al., Nature, 第348巻, 125頁(1990
年)］。
【０００８】また、ｃＡＭＰの測定は、特定の細胞、組
織、器官または体液中の環状ヌクレオチドの値を変動さ
せる可能性のある他の内因性及び外来性化合物(例え
ば、一酸化二窒素)の評価に使用することができる。
織、器官または体液中の環状ヌクレオチドの値を変動さ
せる可能性のある他の内因性及び外来性化合物(例え
ば、一酸化二窒素)の評価に使用することができる。
【０００９】生物中の主要な調節ホルモン／タンパク質
である、エピネフリン、ノルエピネフリン、アドレノコ
ルチコトロピン(ＡＣＴＨ)、バソプレシン、グルカゴ
ン、チロキシン並びに甲状腺刺激及びメラノサイト刺激
ホルモンをはじめとする多数のホルモンは、セカンドメ
ッセンジャーとしてｃＡＭＰを使用する。これら全ての
ホルモンおよび調節物質の活性は、本発明の測定方法を
適用して組織、血清、体液および全ての細胞培養物(細
胞及び培地)中で測定することができる。これらホルモ
ンの測定は、ホルモン不均衡から特定の病状となる可能
性のある多種多様な疾病状態について実施することがで
きる。
である、エピネフリン、ノルエピネフリン、アドレノコ
ルチコトロピン(ＡＣＴＨ)、バソプレシン、グルカゴ
ン、チロキシン並びに甲状腺刺激及びメラノサイト刺激
ホルモンをはじめとする多数のホルモンは、セカンドメ
ッセンジャーとしてｃＡＭＰを使用する。これら全ての
ホルモンおよび調節物質の活性は、本発明の測定方法を
適用して組織、血清、体液および全ての細胞培養物(細
胞及び培地)中で測定することができる。これらホルモ
ンの測定は、ホルモン不均衡から特定の病状となる可能
性のある多種多様な疾病状態について実施することがで
きる。
【００１０】ホルモンまたは調節タンパク質が特定のレ
セプターと相互作用すると、セカンドメッセンジャー
(ｃＡＭＰ)が、カスケードとして生成される。ｃＡＭＰ
の生成は場合によっては、特定のホルモンシグナル形質
導入経路の一部としてｃＡＭＰの減少を使用するホルモ
ンによって特異的に抑制することもできる。この調節タ
ンパク質またはホルモンとレセプターの相互作用の結果
は、(１)例えば、イオンチャンネルの変化による細胞透
過性の変動、(２)ｃＡＭＰ濃度に感受性の酵素触媒反応
速度の変動、(３)他の酵素の合成および分解を含むタン
パク質合成速度の変動が考えられる。ｃＡＭＰの測定
は、ホルモンまたは調節タンパク質がレセプターと相互
作用した後に、これらの結果を直接および間接的に測定
するために使用することができる。
セプターと相互作用すると、セカンドメッセンジャー
(ｃＡＭＰ)が、カスケードとして生成される。ｃＡＭＰ
の生成は場合によっては、特定のホルモンシグナル形質
導入経路の一部としてｃＡＭＰの減少を使用するホルモ
ンによって特異的に抑制することもできる。この調節タ
ンパク質またはホルモンとレセプターの相互作用の結果
は、(１)例えば、イオンチャンネルの変化による細胞透
過性の変動、(２)ｃＡＭＰ濃度に感受性の酵素触媒反応
速度の変動、(３)他の酵素の合成および分解を含むタン
パク質合成速度の変動が考えられる。ｃＡＭＰの測定
は、ホルモンまたは調節タンパク質がレセプターと相互
作用した後に、これらの結果を直接および間接的に測定
するために使用することができる。
【００１１】具体的には、ｃＡＭＰの測定は、試料中の
ｃＡＭＰの分解を防止することによってアドレナリン作
動性神経系を刺激するアミノフィリンまたはテオフィリ
ンのような医薬品レベルのマーカーとして使用すること
ができる。細胞培養物中のｃＡＭＰの測定を使用して特
定のホルモン、調節タンパク質および医薬品を評価する
ことができ、その際ｃＡＭＰはシグナル形質導入過程で
の生体結合を示す。
ｃＡＭＰの分解を防止することによってアドレナリン作
動性神経系を刺激するアミノフィリンまたはテオフィリ
ンのような医薬品レベルのマーカーとして使用すること
ができる。細胞培養物中のｃＡＭＰの測定を使用して特
定のホルモン、調節タンパク質および医薬品を評価する
ことができ、その際ｃＡＭＰはシグナル形質導入過程で
の生体結合を示す。
【００１２】ｃＡＭＰ測定はまた、特定のホルモンまた
は調節タンパク質の不存在下あるいは存在下で細胞を試
験することによって、細胞の生存度および安定性を評価
するために使用することもできる。例えば、グルカゴン
による肝臓細胞(肝細胞)中のｃＡＭＰを測定することに
より、肝細胞の生存度を評価することができる。これ
は、例えば、器官および／または細胞の移植、例えば心
臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚および脳の細胞移植に
有用である。
は調節タンパク質の不存在下あるいは存在下で細胞を試
験することによって、細胞の生存度および安定性を評価
するために使用することもできる。例えば、グルカゴン
による肝臓細胞(肝細胞)中のｃＡＭＰを測定することに
より、肝細胞の生存度を評価することができる。これ
は、例えば、器官および／または細胞の移植、例えば心
臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚および脳の細胞移植に
有用である。
【００１３】細胞内ｃＡＭＰ値を高めるかまたは低下さ
せる多種多様なホルモン、調節タンパク質および医薬品
で活性化した後の生検試料から得られる細胞の応答性の
測定は、細胞機能を詳細に評価する方法として使用する
ことができる。
せる多種多様なホルモン、調節タンパク質および医薬品
で活性化した後の生検試料から得られる細胞の応答性の
測定は、細胞機能を詳細に評価する方法として使用する
ことができる。
【００１４】特殊な臨床例としては、心筋層の応答を評
価するために心臓生検でｃＡＭＰを測定することが挙げ
られる。心筋症の心臓細胞は、β-アドレナリン作動性
刺激後のｃＡＭＰ含有量が上昇しても応答しない。心疾
患の重篤度および幾つかの医薬品、例えばβ-アドレナ
リン作動性遮断剤およびアンギオテンシン変換酵素イン
ヒビターの有効性の診断は、正常な心臓と心筋症心臓か
ら得られる生検試料の応答性を比較することによって行
うことができる。更に、細胞内または動脈若しくは静脈
循環内へのｃＡＭＰ放出は、虚血、低酸素症または医薬
品若しくはホルモン刺激のような種々の異なる生理学的
および非生理学的ストレスに対する器官および／または
組織の応答のインディケーターとして使用することがで
きる。組織若しくは体液中のｃＡＭＰ値は、この方法を
用いて血球および血小板を含む殆ど全ての哺乳動物細胞
または体液中で測定することができる。幾つかの組織で
は、潜在的腫瘍細胞試料の場合に、腫瘍原性および／ま
たは侵入性に対する指標として特異的な刺激剤に応答す
るｃＡＭＰ値を測定することができる。他の場合には、
ｃＡＭＰ合成または分解を変える可能性のある特異的な
治療法の有効性を決定するためにｃＡＭＰの測定を使用
することができる。
価するために心臓生検でｃＡＭＰを測定することが挙げ
られる。心筋症の心臓細胞は、β-アドレナリン作動性
刺激後のｃＡＭＰ含有量が上昇しても応答しない。心疾
患の重篤度および幾つかの医薬品、例えばβ-アドレナ
リン作動性遮断剤およびアンギオテンシン変換酵素イン
ヒビターの有効性の診断は、正常な心臓と心筋症心臓か
ら得られる生検試料の応答性を比較することによって行
うことができる。更に、細胞内または動脈若しくは静脈
循環内へのｃＡＭＰ放出は、虚血、低酸素症または医薬
品若しくはホルモン刺激のような種々の異なる生理学的
および非生理学的ストレスに対する器官および／または
組織の応答のインディケーターとして使用することがで
きる。組織若しくは体液中のｃＡＭＰ値は、この方法を
用いて血球および血小板を含む殆ど全ての哺乳動物細胞
または体液中で測定することができる。幾つかの組織で
は、潜在的腫瘍細胞試料の場合に、腫瘍原性および／ま
たは侵入性に対する指標として特異的な刺激剤に応答す
るｃＡＭＰ値を測定することができる。他の場合には、
ｃＡＭＰ合成または分解を変える可能性のある特異的な
治療法の有効性を決定するためにｃＡＭＰの測定を使用
することができる。
【００１５】上記のように、ｃＡＭＰはセカンドメッセ
ンジャーとして細胞内情報伝達において、重要な役割を
果たしていると同時に、様々な生理的機能を有している
ことから、アデニル酸シクラーゼの触媒作用によりＡＴ
Ｐから合成されるｃＡＭＰ量を測定し、さらにアデニル
酸シクラーゼ活性を求めたり、ｃＡＭＰの挙動を解明す
ることは、基礎医学研究分野のみならず、臨床医学の分
野においても非常に意義深いことといえる。
ンジャーとして細胞内情報伝達において、重要な役割を
果たしていると同時に、様々な生理的機能を有している
ことから、アデニル酸シクラーゼの触媒作用によりＡＴ
Ｐから合成されるｃＡＭＰ量を測定し、さらにアデニル
酸シクラーゼ活性を求めたり、ｃＡＭＰの挙動を解明す
ることは、基礎医学研究分野のみならず、臨床医学の分
野においても非常に意義深いことといえる。
【００１６】
【従来の技術】アデニル酸シクラーゼ活性の測定は、Ａ
ＴＰを基質として生成したｃＡＭＰを定量することによ
って行う。ｃＡＭＰの定量は、(１)標識されたＡＴＰを
基質とする方法と(２)非標識ＡＴＰを基質として用いる
方法に区別することができる。
ＴＰを基質として生成したｃＡＭＰを定量することによ
って行う。ｃＡＭＰの定量は、(１)標識されたＡＴＰを
基質とする方法と(２)非標識ＡＴＰを基質として用いる
方法に区別することができる。
【００１７】(１)の標識されたＡＴＰを基質とする方法
では、放射性同位元素で標識されたＡＴＰ(例えば［α-
32Ｐ］ＡＴＰ)を基質とし、アデニル酸シクラーゼの作
用により合成された放射性標識ｃＡＭＰ(［32Ｐ］ｃＡ
ＭＰ)をＡＴＰから分離し、その放射活性を測定する
［Y.Salomon et al., Anal.Biochem., 第58巻, 541頁(1
974年)；R.A.Johnson et al., In Method in Enzymolog
y, 第195巻, 3頁(1991年)］。この方法においては、イ
オン交換樹脂および酸化アルミニウムカラムを用いた連
続アフィニティクロマトグラフィーを用いて［α-
32Ｐ］ＡＴＰと［32Ｐ］ｃＡＭＰを分離している。
では、放射性同位元素で標識されたＡＴＰ(例えば［α-
32Ｐ］ＡＴＰ)を基質とし、アデニル酸シクラーゼの作
用により合成された放射性標識ｃＡＭＰ(［32Ｐ］ｃＡ
ＭＰ)をＡＴＰから分離し、その放射活性を測定する
［Y.Salomon et al., Anal.Biochem., 第58巻, 541頁(1
974年)；R.A.Johnson et al., In Method in Enzymolog
y, 第195巻, 3頁(1991年)］。この方法においては、イ
オン交換樹脂および酸化アルミニウムカラムを用いた連
続アフィニティクロマトグラフィーを用いて［α-
32Ｐ］ＡＴＰと［32Ｐ］ｃＡＭＰを分離している。
【００１８】しかし、上記(１)の定量法は高感度である
反面、高価で危険性の高い放射性標識化合物を使用しな
ければならない。
反面、高価で危険性の高い放射性標識化合物を使用しな
ければならない。
【００１９】一方、(２)の非標識ＡＴＰを基質として用
いる方法は、非標識ＡＴＰから生成したｃＡＭＰを放
射性物質で標識したｃＡＭＰと競合的に対応する抗血清
に対して抗原抗体反応させ、結合抗体の放射活性を測定
してｃＡＭＰを定量する、いわゆるラジオイムノアッセ
イと、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼとｃＡＭＰ
の特異的結合を利用し、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナ
ーゼと結合した3Ｈ-ｃＡＭＰの放射能を測定する、プロ
テインバインディングアッセイ［A.G.Gilman et al., P
roc.Natl.Acad.Sci.USA, 第67巻, 305頁(1970年)］に分
類することができる。
いる方法は、非標識ＡＴＰから生成したｃＡＭＰを放
射性物質で標識したｃＡＭＰと競合的に対応する抗血清
に対して抗原抗体反応させ、結合抗体の放射活性を測定
してｃＡＭＰを定量する、いわゆるラジオイムノアッセ
イと、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼとｃＡＭＰ
の特異的結合を利用し、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナ
ーゼと結合した3Ｈ-ｃＡＭＰの放射能を測定する、プロ
テインバインディングアッセイ［A.G.Gilman et al., P
roc.Natl.Acad.Sci.USA, 第67巻, 305頁(1970年)］に分
類することができる。
【００２０】この(２)の非標識ＡＴＰ基質を用いる方法
は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼによるｃＡ
ＭＰの分解を補正できないため、ホスホジエステラーゼ
活性の強い検体には不適当である。
は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼによるｃＡ
ＭＰの分解を補正できないため、ホスホジエステラーゼ
活性の強い検体には不適当である。
【００２１】さらに、安全性及び環境に与える影響を考
慮すれば、このような放射性物質の使用は極力避けるべ
きである。従って、アデニル酸シクラーゼ活性およびそ
の指標となるｃＡＭＰの定量のため高感度の非放射性定
量法の開発が望まれていた。
慮すれば、このような放射性物質の使用は極力避けるべ
きである。従って、アデニル酸シクラーゼ活性およびそ
の指標となるｃＡＭＰの定量のため高感度の非放射性定
量法の開発が望まれていた。
【００２２】しかしながら、大部分の哺乳動物の組織中
において、ｃＡＭＰの濃度は非常に低いため、放射性物
質を用いないで測定することは容易ではない。また、Ａ
ＭＰやＡＤＰ、ＡＴＰなどの試料中の非環状アデニンヌ
クレオチド類が、ｃＡＭＰの数百倍から数十万倍以上の
濃度で共存しており、しかも化学構造が類似しているこ
とから、妨害物質として作用し、ｃＡＭＰの定量を一層
困難なものとしている。特にＡＴＰはｃＡＭＰの１億倍
の濃度で存在していることもあり、このような内因性の
ＡＴＰを完全に除去しない限り、正確なｃＡＭＰの測定
は実質的に不可能であった。
において、ｃＡＭＰの濃度は非常に低いため、放射性物
質を用いないで測定することは容易ではない。また、Ａ
ＭＰやＡＤＰ、ＡＴＰなどの試料中の非環状アデニンヌ
クレオチド類が、ｃＡＭＰの数百倍から数十万倍以上の
濃度で共存しており、しかも化学構造が類似しているこ
とから、妨害物質として作用し、ｃＡＭＰの定量を一層
困難なものとしている。特にＡＴＰはｃＡＭＰの１億倍
の濃度で存在していることもあり、このような内因性の
ＡＴＰを完全に除去しない限り、正確なｃＡＭＰの測定
は実質的に不可能であった。
【００２３】一方、ｃＡＭＰはホスホジエステラーゼの
作用によりＡＭＰに変換されるが、ＡＭＰの測定につい
ては、放射性物質を用いない方法が開示されている。Lo
wryらは、還元型ピリジンヌクレオチドの蛍光を用いた
高感度定量法［O.H.Lowry etal., A Flexible System o
f Enzymatic Analysis， Harcourt Brace Jovanovich，
New York(1972年)；F.M.Matschinsky et al., J.Histoc
hem.Cytochem., 第16巻, 29頁(1968年)］を開示してい
る。これは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸(ＮＡＤＰＨ)の340nmにおける吸光度が0.1mm
olあたり0.617を示すことを利用し、試料の吸光度値か
らＮＡＤＰＨの絶対濃度を求める方法である。
作用によりＡＭＰに変換されるが、ＡＭＰの測定につい
ては、放射性物質を用いない方法が開示されている。Lo
wryらは、還元型ピリジンヌクレオチドの蛍光を用いた
高感度定量法［O.H.Lowry etal., A Flexible System o
f Enzymatic Analysis， Harcourt Brace Jovanovich，
New York(1972年)；F.M.Matschinsky et al., J.Histoc
hem.Cytochem., 第16巻, 29頁(1968年)］を開示してい
る。これは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸(ＮＡＤＰＨ)の340nmにおける吸光度が0.1mm
olあたり0.617を示すことを利用し、試料の吸光度値か
らＮＡＤＰＨの絶対濃度を求める方法である。
【００２４】また、グリコーゲンをグルコース-１-リン
酸に変換する酵素であるグリコーゲンホスホリラーゼが
無機リン酸(Ｐi)の存在下でＡＭＰにより活性化される
ことを利用したＡＭＰの測定も提案されている［E.Helm
reich et al., Biochemistry, 第52巻, 647頁(1964
年)；同上, 第51巻, 131頁(1964年)；M.Trus et al., D
iabetes, 第29巻, 1頁(1980年)］。この方法では、グリ
コーゲンがグルコース-１-リン酸に変換される量からグ
リコーゲンホスホリラーゼ活性を求め、この活性を指標
として、ＡＭＰの量を測定することができる。さらに、
ＡＭＰを高感度に測定する方法は、Lurie等によって開
発されている［K.Lurie et al., Ann.J.Physiol., 第25
3巻, H662頁(1987年)］。
酸に変換する酵素であるグリコーゲンホスホリラーゼが
無機リン酸(Ｐi)の存在下でＡＭＰにより活性化される
ことを利用したＡＭＰの測定も提案されている［E.Helm
reich et al., Biochemistry, 第52巻, 647頁(1964
年)；同上, 第51巻, 131頁(1964年)；M.Trus et al., D
iabetes, 第29巻, 1頁(1980年)］。この方法では、グリ
コーゲンがグルコース-１-リン酸に変換される量からグ
リコーゲンホスホリラーゼ活性を求め、この活性を指標
として、ＡＭＰの量を測定することができる。さらに、
ＡＭＰを高感度に測定する方法は、Lurie等によって開
発されている［K.Lurie et al., Ann.J.Physiol., 第25
3巻, H662頁(1987年)］。
【００２５】ｃＡＭＰやアデニル酸シクラーゼの分析感
度や特異性を高めるために、試料中の非環状アデニンヌ
クレオチド類を酵素分解および／またはクロマトグラフ
ィーにより除去する方法も知られている［N.D.Goldberg
et al., Anal.Biochem., 第28巻, 523頁(1969年)；B.M
cL.Breckenridge, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 第52巻,15
80頁(1964年)］。
度や特異性を高めるために、試料中の非環状アデニンヌ
クレオチド類を酵素分解および／またはクロマトグラフ
ィーにより除去する方法も知られている［N.D.Goldberg
et al., Anal.Biochem., 第28巻, 523頁(1969年)；B.M
cL.Breckenridge, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 第52巻,15
80頁(1964年)］。
【００２６】しかしながら、これらの先行技術において
は、妨害物質である内因性のＡＤＰやＡＴＰを完全には
除去できないためｃＡＭＰの測定は不可能であると結論
されていた。それゆえ、放射性物質を使用することな
く、生物学的試料中のｃＡＭＰ量およびそれに基づくア
デニル酸シクラーゼ活性を高感度に求める手段は実質的
にはなかったことになる。
は、妨害物質である内因性のＡＤＰやＡＴＰを完全には
除去できないためｃＡＭＰの測定は不可能であると結論
されていた。それゆえ、放射性物質を使用することな
く、生物学的試料中のｃＡＭＰ量およびそれに基づくア
デニル酸シクラーゼ活性を高感度に求める手段は実質的
にはなかったことになる。
【００２７】本発明者は、先に、全く新しい観点からア
デニル酸シクラーゼ活性の測定およびｃＡＭＰ量の定量
方法の開発を試み、鋭意検討した結果、妨害物質である
ＡＴＰやＡＤＰ、ＡＭＰなどの試料中の内因性非環状ア
デニンヌクレオチド類やグルコース-６-リン酸を酵素を
用いて選択的に除去した後、試料中のｃＡＭＰをＡＭＰ
に酵素的に変換し、さらにＡＭＰをＡＴＰに変換し、そ
して、フルクトース-６-リン酸を経由してグルコース-
６-リン酸に変換した後、ＮＡＤＰＨに変換し、このＮ
ＡＤＰＨ濃度を蛍光光度法で測定し、ｃＡＭＰ濃度と相
関させることにより、有害な放射性物質を用いることな
く、酵素反応・化学反応のみで、ｃＡＭＰ量およびそれ
に対応するアデニル酸シクラーゼ活性を測定することに
成功した(ＷＯ９４／１７１９８)。
デニル酸シクラーゼ活性の測定およびｃＡＭＰ量の定量
方法の開発を試み、鋭意検討した結果、妨害物質である
ＡＴＰやＡＤＰ、ＡＭＰなどの試料中の内因性非環状ア
デニンヌクレオチド類やグルコース-６-リン酸を酵素を
用いて選択的に除去した後、試料中のｃＡＭＰをＡＭＰ
に酵素的に変換し、さらにＡＭＰをＡＴＰに変換し、そ
して、フルクトース-６-リン酸を経由してグルコース-
６-リン酸に変換した後、ＮＡＤＰＨに変換し、このＮ
ＡＤＰＨ濃度を蛍光光度法で測定し、ｃＡＭＰ濃度と相
関させることにより、有害な放射性物質を用いることな
く、酵素反応・化学反応のみで、ｃＡＭＰ量およびそれ
に対応するアデニル酸シクラーゼ活性を測定することに
成功した(ＷＯ９４／１７１９８)。
【００２８】そして、この方法を用いることで、μgオ
ーダーの生物学的試料中のｃＡＭＰ量をpmolまたはfmol
レベルで正確に定量することが可能となった［A.Sugiya
ma et al., Anal.Biochem., 第218巻, 20頁(1994年)；
A.Sugiyama et al., J.Clin.Lab., 第8巻, 437頁(1994
年)；A.Sugiyama et al., Anal.Biochem., 第225巻, 36
8頁(1995年)；A.Sugiyama et al., Yamanashi Med.J.,
第10巻, 11頁(1995年)参照］。
ーダーの生物学的試料中のｃＡＭＰ量をpmolまたはfmol
レベルで正確に定量することが可能となった［A.Sugiya
ma et al., Anal.Biochem., 第218巻, 20頁(1994年)；
A.Sugiyama et al., J.Clin.Lab., 第8巻, 437頁(1994
年)；A.Sugiyama et al., Anal.Biochem., 第225巻, 36
8頁(1995年)；A.Sugiyama et al., Yamanashi Med.J.,
第10巻, 11頁(1995年)参照］。
【００２９】上記方法の反応式を以下に示す。 工程１：クリーニング反応(試料中の内因性非環状ヌク
レオチド類および内因性グルコース-６-リン酸の除去)
レオチド類および内因性グルコース-６-リン酸の除去)
【化１】 工程２：変換反応１(ｃＡＭＰからＡＭＰへの変換)
【化２】 工程３：変換反応２(ＡＭＰからＡＴＰへの変換)
【化３】 工程４：ＡＴＰ-ＡＤＰサイクル反応による増幅(測定感
度を6000〜１万倍に増幅する)
度を6000〜１万倍に増幅する)
【化４】 工程５：検出反応(ＮＡＤＰＨの蛍光光度測定)
【化５】
【００３０】この方法は、原理的に非常に優れたｃＡＭ
Ｐの定量手段であり、かつ、理論的にも正確なものであ
るが、クリーニング反応に要する時間が長い、サイクル
反応後に加熱による酵素を失活させる際に、試料の白濁
が生じる、などの点で改良の余地があった。
Ｐの定量手段であり、かつ、理論的にも正確なものであ
るが、クリーニング反応に要する時間が長い、サイクル
反応後に加熱による酵素を失活させる際に、試料の白濁
が生じる、などの点で改良の余地があった。
【００３１】
【課題を解決するための手段】本発明は、より簡便で、
迅速なｃＡＭＰ量やアデニル酸シクラーゼ活性の測定手
段であって、しかも放射性物質を使用しない測定方法の
開発を目指して鋭意研究した結果完成されたものであ
る。
迅速なｃＡＭＰ量やアデニル酸シクラーゼ活性の測定手
段であって、しかも放射性物質を使用しない測定方法の
開発を目指して鋭意研究した結果完成されたものであ
る。
【００３２】本発明は、先に本発明者らが開示した酵素
反応および蛍光光度法を採用したアデニル酸シクラーゼ
活性測定法およびｃＡＭＰ定量法(ＷＯ９４／１７１９
８)の改善を図ったものである。即ち、(１)クリーニン
グ反応において、５'-ヌクレオチダーゼの使用を取りや
めることにより、反応時間を１時間から５分乃至10分間
と劇的に短縮することに成功し、(２)サイクル反応にお
いて、反応後の酵素の失活方法を加熱に代えて、ＥＤＴ
Ａなどのキレート剤を用いて試料中のＭｇ2+をキレート
処理して除去し、酵素を失活させることにより、試料の
白濁を防止した。これにより、続いて行う検出反応の精
度が向上した。また、(３)従来２段階であった変換反応
を１段階とすることで、より簡便な操作を可能とした。
そして、(４)検出反応において試薬等の濃度を再検討
し、最適化した。これらの改良を加えることによって、
生物学的試料中のｃＡＭＰ量およびそれに対応するアデ
ニル酸シクラーゼ活性をより迅速、且つ高感度に測定で
きる酵素的蛍光定量アッセイまたは分光光度アッセイを
提供することが可能となった。
反応および蛍光光度法を採用したアデニル酸シクラーゼ
活性測定法およびｃＡＭＰ定量法(ＷＯ９４／１７１９
８)の改善を図ったものである。即ち、(１)クリーニン
グ反応において、５'-ヌクレオチダーゼの使用を取りや
めることにより、反応時間を１時間から５分乃至10分間
と劇的に短縮することに成功し、(２)サイクル反応にお
いて、反応後の酵素の失活方法を加熱に代えて、ＥＤＴ
Ａなどのキレート剤を用いて試料中のＭｇ2+をキレート
処理して除去し、酵素を失活させることにより、試料の
白濁を防止した。これにより、続いて行う検出反応の精
度が向上した。また、(３)従来２段階であった変換反応
を１段階とすることで、より簡便な操作を可能とした。
そして、(４)検出反応において試薬等の濃度を再検討
し、最適化した。これらの改良を加えることによって、
生物学的試料中のｃＡＭＰ量およびそれに対応するアデ
ニル酸シクラーゼ活性をより迅速、且つ高感度に測定で
きる酵素的蛍光定量アッセイまたは分光光度アッセイを
提供することが可能となった。
【００３３】なお、本発明は後述するように、グアニン
調節タンパク質およびｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラ
ーゼの活性を測定するために使用することもできる。
調節タンパク質およびｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラ
ーゼの活性を測定するために使用することもできる。
【００３４】本発明のｃＡＭＰの測定に用いられる反応
を以下に記載する。 ステップ１−クリーニング反応(試料中の内因性非環状
アデニンヌクレオチド類およびグルコース-６-リン酸の
除去)
を以下に記載する。 ステップ１−クリーニング反応(試料中の内因性非環状
アデニンヌクレオチド類およびグルコース-６-リン酸の
除去)
【化６】
【００３５】ステップ１−クリーニングオプション反応
１(フルクトース-６-リン酸の除去)
１(フルクトース-６-リン酸の除去)
【化７】
【００３６】ステップ１−クリーニングオプション反応
２(試料中の内因性グリコーゲンの除去)
２(試料中の内因性グリコーゲンの除去)
【化８】
【００３７】ステップ２−変換反応(ＡＭＰ化反応)
【化９】
【００３８】ステップ２−変換オプション反応１(ＡＴ
Ｐ化反応)
Ｐ化反応)
【化１０】
【００３９】ステップ３−検出反応１(ＮＡＤＰＨの蛍
光光度測定)
光光度測定)
【化１１】
【００４０】ステップ３−検出オプション反応１(６-ホ
スホグルコノラクトンの分解)
スホグルコノラクトンの分解)
【化１２】
【００４１】ステップ３−検出サイクル反応１
【化１３】
【００４２】ステップ３−検出反応２(ＮＡＤＰＨの蛍
光光度測定)
光光度測定)
【化１４】
【００４３】ステップ３−検出サイクル反応２(ＡＴＰ-
ＡＤＰサイクル反応による増幅(測定感度を6000〜１万
倍に増幅する))
ＡＤＰサイクル反応による増幅(測定感度を6000〜１万
倍に増幅する))
【化１５】
【００４４】ステップ３−検出反応３(ＡＴＰの検出)
(ルシフェラーゼ反応)
(ルシフェラーゼ反応)
【化１６】
【００４５】ステップ１−クリーニング反応(試料中の
内因性非環状アデニンヌクレオチド類およびグルコース
−６−リン酸の除去) 本発明は、アピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよび
アルカリホスファターゼの混合物により、試料中のｃＡ
ＭＰ以外の内因性非環状アデニン残基を有する化合物
(アデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ)を酵素的に
除去する工程を含む。そして、好ましくは、アルカリホ
スファターゼを用いて試料中のグルコース-６-リン酸を
グルコースへ酵素的に変換する工程を含む(クリーニン
グ反応)。
内因性非環状アデニンヌクレオチド類およびグルコース
−６−リン酸の除去) 本発明は、アピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよび
アルカリホスファターゼの混合物により、試料中のｃＡ
ＭＰ以外の内因性非環状アデニン残基を有する化合物
(アデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ)を酵素的に
除去する工程を含む。そして、好ましくは、アルカリホ
スファターゼを用いて試料中のグルコース-６-リン酸を
グルコースへ酵素的に変換する工程を含む(クリーニン
グ反応)。
【００４６】本発明のクリーニング反応は、ｃＡＭＰよ
り遙かに高濃度であり、除去しなければ実質的にブラン
クを高めるおそれのある全ての試料中の内因性ＡＴＰ、
ＡＤＰおよびＡＭＰを除去することができる。グルコー
ス-６-リン酸は後に検出反応で生成するので、試料中の
グルコース-６-リン酸をあらかじめ酵素的に除去してお
くことは、本測定方法の精度を向上させるので好まし
い。これらのクリーニング反応は、検出感度の向上のた
めに重要である。
り遙かに高濃度であり、除去しなければ実質的にブラン
クを高めるおそれのある全ての試料中の内因性ＡＴＰ、
ＡＤＰおよびＡＭＰを除去することができる。グルコー
ス-６-リン酸は後に検出反応で生成するので、試料中の
グルコース-６-リン酸をあらかじめ酵素的に除去してお
くことは、本測定方法の精度を向上させるので好まし
い。これらのクリーニング反応は、検出感度の向上のた
めに重要である。
【００４７】しかも本発明では、従来クリーニング反応
に用いられていた４種類の酵素(アピラーゼ、５'-ヌク
レオチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼ)のうち、５'-ヌクレオチダーゼの使用
を取りやめることにより、反応時間が著しく短縮され
た。すなわち、約１時間を要していた反応時間が僅か５
分乃至10分間程度に著しく短縮できることを見出した。
に用いられていた４種類の酵素(アピラーゼ、５'-ヌク
レオチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼ)のうち、５'-ヌクレオチダーゼの使用
を取りやめることにより、反応時間が著しく短縮され
た。すなわち、約１時間を要していた反応時間が僅か５
分乃至10分間程度に著しく短縮できることを見出した。
【００４８】ステップ１−クリーニングオプション反応
１(フルクトース−６−リン酸の除去) また、同様にサイクル反応および検出反応で生成するフ
ルクトース-６-リン酸もアルカリフォスファターゼで加
水分解し、除去しておくのが好ましい。
１(フルクトース−６−リン酸の除去) また、同様にサイクル反応および検出反応で生成するフ
ルクトース-６-リン酸もアルカリフォスファターゼで加
水分解し、除去しておくのが好ましい。
【００４９】ステップ１−クリーニングオプション反応
２(試料中の内因性グリコーゲンの除去) さらに好ましくは、グルコースオキシダーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼを用
いて、グルコース-６-リン酸に変換される試料中の内因
性グリコーゲンを除去する(オプション反応)。これによ
り、ステップ３−検出反応１（ＮＡＤＰＨの蛍光光度測
定）において既知量のグリコーゲンを添加する際の妨害
物質となる内因性グリコーゲンが消失する。
２(試料中の内因性グリコーゲンの除去) さらに好ましくは、グルコースオキシダーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼを用
いて、グルコース-６-リン酸に変換される試料中の内因
性グリコーゲンを除去する(オプション反応)。これによ
り、ステップ３−検出反応１（ＮＡＤＰＨの蛍光光度測
定）において既知量のグリコーゲンを添加する際の妨害
物質となる内因性グリコーゲンが消失する。
【００５０】ステップ２−変換反応(ＡＭＰ化) 次に、クリーニング反応後の試料にホスホジエステラー
ゼを作用させ、ｃＡＭＰをＡＭＰに変換する(変換反
応)。
ゼを作用させ、ｃＡＭＰをＡＭＰに変換する(変換反
応)。
【００５１】ステップ３−検出反応１(ＮＡＤＰＨの蛍
光光度測定) 上記変換反応後、グリコーゲンおよび無機リン酸を添加
し、ＡＭＰがグリコーゲンホスホリラーゼを活性化して
グリコーゲンからグルコース-１-リン酸を生成する程度
を指標として、ＡＭＰを定量する。即ち、グルコース-
１-リン酸は、ホスホグルコムターゼによりグルコース-
６-リン酸に変換され、グルコース−６−リン酸は最終
的に６-ホスホグルコノラクトン、ＮＡＤＰＨ及びＨ+に
酵素的に変換される。最後に、ＮＡＤＰＨ濃度を例えば
Trusらの方法［M.Trus et al., Diabetes, 第29巻, 1頁
(1980年)］に従い、蛍光定量法を用いて測定する。
光光度測定) 上記変換反応後、グリコーゲンおよび無機リン酸を添加
し、ＡＭＰがグリコーゲンホスホリラーゼを活性化して
グリコーゲンからグルコース-１-リン酸を生成する程度
を指標として、ＡＭＰを定量する。即ち、グルコース-
１-リン酸は、ホスホグルコムターゼによりグルコース-
６-リン酸に変換され、グルコース−６−リン酸は最終
的に６-ホスホグルコノラクトン、ＮＡＤＰＨ及びＨ+に
酵素的に変換される。最後に、ＮＡＤＰＨ濃度を例えば
Trusらの方法［M.Trus et al., Diabetes, 第29巻, 1頁
(1980年)］に従い、蛍光定量法を用いて測定する。
【００５２】ステップ３−検出オプション反応１(６−
ホスホグルコノラクトンの分解)また、６-ホスホグルコ
ノラクトンは、水性溶媒中、in vitroで加熱して６-ホ
スホグルコン酸に変換することができ、さらに６-ホス
ホグルコン酸は、ＮＡＤＰ+の存在下でin vitroでＮＡ
ＤＰＨ、およびリブロース-５-リン酸に変換することが
できる。これにより、ＮＡＤＰＨの濃度を高めることが
できる。このＮＡＤＰＨ濃度を上記と同様に例えばTrus
らの方法［M.Trus et al., Diabetes, 第29巻, 1頁(198
0年)］に従い、蛍光定量法を用いて測定する。
ホスホグルコノラクトンの分解)また、６-ホスホグルコ
ノラクトンは、水性溶媒中、in vitroで加熱して６-ホ
スホグルコン酸に変換することができ、さらに６-ホス
ホグルコン酸は、ＮＡＤＰ+の存在下でin vitroでＮＡ
ＤＰＨ、およびリブロース-５-リン酸に変換することが
できる。これにより、ＮＡＤＰＨの濃度を高めることが
できる。このＮＡＤＰＨ濃度を上記と同様に例えばTrus
らの方法［M.Trus et al., Diabetes, 第29巻, 1頁(198
0年)］に従い、蛍光定量法を用いて測定する。
【００５３】ウサギ心臓から得られた同一試料に対す
る、刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性を修正Salomo
n放射活性方法およびアルカリホスファターゼを用いな
い蛍光定量法の両方で測定したところ、測定結果は類似
していた［A.Sugiyama et al.,Anal.Biochem., 第218
巻, 20頁(1994年)；A.Sugiyama et al., Anal.Bioche
m.,第225巻, 368頁(1995年)；A.Sugiyama et al., Yama
nashi Med.J., 第10巻, 11頁(1995年)］。放射活性測定
法と蛍光定量法から得られた結果を比較すると、絶対的
な比活性は異なっているが、アデニル酸シクラーゼの刺
激倍率は類似している。比活性の差異は恐らくアデニル
酸シクラーゼ反応混合物における些細なファクターによ
るものと思われる。即ち、放射活性測定では試料中ホス
ホジエステラーゼによる［32Ｐ］ｃＡＭＰ分解を防ぐた
めに非標識ｃＡＭＰが使用され、一方、蛍光定量法で
は、新たに合成されるｃＡＭＰの試料中ホスホジエステ
ラーゼによる分解を抑制するためにテオフィリンが使用
されている。
る、刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性を修正Salomo
n放射活性方法およびアルカリホスファターゼを用いな
い蛍光定量法の両方で測定したところ、測定結果は類似
していた［A.Sugiyama et al.,Anal.Biochem., 第218
巻, 20頁(1994年)；A.Sugiyama et al., Anal.Bioche
m.,第225巻, 368頁(1995年)；A.Sugiyama et al., Yama
nashi Med.J., 第10巻, 11頁(1995年)］。放射活性測定
法と蛍光定量法から得られた結果を比較すると、絶対的
な比活性は異なっているが、アデニル酸シクラーゼの刺
激倍率は類似している。比活性の差異は恐らくアデニル
酸シクラーゼ反応混合物における些細なファクターによ
るものと思われる。即ち、放射活性測定では試料中ホス
ホジエステラーゼによる［32Ｐ］ｃＡＭＰ分解を防ぐた
めに非標識ｃＡＭＰが使用され、一方、蛍光定量法で
は、新たに合成されるｃＡＭＰの試料中ホスホジエステ
ラーゼによる分解を抑制するためにテオフィリンが使用
されている。
【００５４】さらに、ステップ３−検出サイクル反応２
で示したＡＴＰ-ＡＤＰサイクル反応を使用したアデニ
ル酸シクラーゼの測定によって、絶対的な比活性は放射
活性および蛍光定量法の両方で同一であることが明らか
になった。
で示したＡＴＰ-ＡＤＰサイクル反応を使用したアデニ
ル酸シクラーゼの測定によって、絶対的な比活性は放射
活性および蛍光定量法の両方で同一であることが明らか
になった。
【００５５】本発明の方法は、0.1mg未満の極微量の試
料中のｃＡＭＰ量を測定することができ、そして１fmol
未満のｃＡＭＰ／試料を測定することができる。また、
本発明においては、生物学的試料に既知量のＡＴＰを添
加し、このＡＴＰを試料中のアデニル酸シクラーゼの作
用でｃＡＭＰに変換させ、次にクリーニング反応により
内因性のＡＴＰなどのアデニンヌクレオチド類を全て除
去した後、変換したｃＡＭＰ量を求めることによってア
デニル酸シクラーゼ活性を算出することもできる。
料中のｃＡＭＰ量を測定することができ、そして１fmol
未満のｃＡＭＰ／試料を測定することができる。また、
本発明においては、生物学的試料に既知量のＡＴＰを添
加し、このＡＴＰを試料中のアデニル酸シクラーゼの作
用でｃＡＭＰに変換させ、次にクリーニング反応により
内因性のＡＴＰなどのアデニンヌクレオチド類を全て除
去した後、変換したｃＡＭＰ量を求めることによってア
デニル酸シクラーゼ活性を算出することもできる。
【００５６】クリーニング反応において、アデノシンか
ら生成したアンモニウムイオンは一連のクリーニング反
応を本質的に完了させ、試料中のヌクレオチド類が再形
成するのを妨げる。これらの操作により、これまでの蛍
光定量アッセイからは予期できない顕著な改善効果が得
られる。［Weign et al.，Anal.Biochem., 第208巻,217
頁(1993年)］。
ら生成したアンモニウムイオンは一連のクリーニング反
応を本質的に完了させ、試料中のヌクレオチド類が再形
成するのを妨げる。これらの操作により、これまでの蛍
光定量アッセイからは予期できない顕著な改善効果が得
られる。［Weign et al.，Anal.Biochem., 第208巻,217
頁(1993年)］。
【００５７】
【発明の実施の態様】本発明の方法に従って定量される
生物学的試料は、好ましくは哺乳動物由来のものであ
り、これには組織、血球、骨が含まれ、さらに尿、血
液、髄液などの生物学的流体が含まれる。これらの試料
は、新鮮なものであるか、または冷凍保存されていても
よい［Lowry et al., A Flexible System of Enzymatic
Analysis,Harcourt Brace Jovanovich, New York(1972
年)］。
生物学的試料は、好ましくは哺乳動物由来のものであ
り、これには組織、血球、骨が含まれ、さらに尿、血
液、髄液などの生物学的流体が含まれる。これらの試料
は、新鮮なものであるか、または冷凍保存されていても
よい［Lowry et al., A Flexible System of Enzymatic
Analysis,Harcourt Brace Jovanovich, New York(1972
年)］。
【００５８】好ましい実施態様では本発明は次のような
段階を含んでいる。 ステップ１−クリーニング反応(試料中の内因性非環状
ヌクレオチド類およびグルコース−６−リン酸の除去) ｃＡＭＰ、グルコース-６-リン酸および少なくとも１種
の非環状アデニンヌクレオチド類、即ちＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰまたはこれらの混合物からなる群から選択さ
れるものを含んでいる生物学的試料を、アピラーゼ、ア
デノシンデアミナーゼおよびアルカリホスファターゼの
混合物を含む水性緩衝液と混合して、非環状アデニンヌ
クレオチド類(ＡＴＰ、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰ)お
よびグルコース-６-リン酸を酵素的に変換して除去す
る。
段階を含んでいる。 ステップ１−クリーニング反応(試料中の内因性非環状
ヌクレオチド類およびグルコース−６−リン酸の除去) ｃＡＭＰ、グルコース-６-リン酸および少なくとも１種
の非環状アデニンヌクレオチド類、即ちＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＡＭＰまたはこれらの混合物からなる群から選択さ
れるものを含んでいる生物学的試料を、アピラーゼ、ア
デノシンデアミナーゼおよびアルカリホスファターゼの
混合物を含む水性緩衝液と混合して、非環状アデニンヌ
クレオチド類(ＡＴＰ、ＡＤＰおよび／またはＡＭＰ)お
よびグルコース-６-リン酸を酵素的に変換して除去す
る。
【００５９】「より迅速に」とは、従来約一時間を要し
ていたクリーニング反応が約５〜10分以内に、すなわ
ち、１／１２〜１／６、少なくとも１／６の反応時間に
短縮されることをいう。
ていたクリーニング反応が約５〜10分以内に、すなわ
ち、１／１２〜１／６、少なくとも１／６の反応時間に
短縮されることをいう。
【００６０】ステップ１−クリーニングオプション反応
２ そして任意に、上記反応混合物をグルコースオキシダー
ゼ、グリコーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼと混合して全ての試料中のグリコーゲンを分
解、除去する。これにより、ステップ３−検出反応１
（ＮＡＤＰＨの蛍光光度測定）において既知量のグリコ
ーゲンを添加する際の妨害物質となる内因性グリコーゲ
ンが消失する。このときｃＡＭＰは反応混合物中にその
まま保持される。
２ そして任意に、上記反応混合物をグルコースオキシダー
ゼ、グリコーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼと混合して全ての試料中のグリコーゲンを分
解、除去する。これにより、ステップ３−検出反応１
（ＮＡＤＰＨの蛍光光度測定）において既知量のグリコ
ーゲンを添加する際の妨害物質となる内因性グリコーゲ
ンが消失する。このときｃＡＭＰは反応混合物中にその
まま保持される。
【００６１】ステップ２−変換反応(ＡＭＰ化反応) 上記反応混合物をホスホジエステラーゼと混合して試料
中のｃＡＭＰをＡＭＰに変換する。
中のｃＡＭＰをＡＭＰに変換する。
【００６２】ステップ３−検出反応１(ＮＡＤＰＨの蛍
光光度測定) さらに、グリコーゲンおよび無機リン酸の存在下でグリ
コーゲンホスホリラーゼと接触させてグルコース-１-リ
ン酸を上記反応混合物中で生成させ、上記反応混合物中
でホスホグルコムターゼと反応させ、グルコース-６-リ
ン酸を生成させる。ついで、６-ホスホグルコノラクト
ン、ＮＡＤＰＨ及びＨ+に酵素的に変換し、上記反応混
合物中のＮＡＤＰＨ濃度を蛍光定量法で測定する。そし
て、このＮＡＤＰＨの濃度が上記試料中のアデニル酸シ
クラーゼ活性、ｃＡＭＰ量またはＡＭＰ濃度と相関す
る。
光光度測定) さらに、グリコーゲンおよび無機リン酸の存在下でグリ
コーゲンホスホリラーゼと接触させてグルコース-１-リ
ン酸を上記反応混合物中で生成させ、上記反応混合物中
でホスホグルコムターゼと反応させ、グルコース-６-リ
ン酸を生成させる。ついで、６-ホスホグルコノラクト
ン、ＮＡＤＰＨ及びＨ+に酵素的に変換し、上記反応混
合物中のＮＡＤＰＨ濃度を蛍光定量法で測定する。そし
て、このＮＡＤＰＨの濃度が上記試料中のアデニル酸シ
クラーゼ活性、ｃＡＭＰ量またはＡＭＰ濃度と相関す
る。
【００６３】このｃＡＭＰの測定法は、ｃＡＭＰの３',
５'-ホスホジエステル結合の開裂によって生成するＡＭ
Ｐが、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を刺激するとい
う原理に基づいている。すなわち、ｃＡＭＰおよびアデ
ニル酸シクラーゼ活性の量はｃＡＭＰから生成したＡＭ
Ｐがグリコーゲンホスホリラーゼを活性化し最終的に得
られたＮＡＤＰＨの吸光度に対応する。
５'-ホスホジエステル結合の開裂によって生成するＡＭ
Ｐが、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を刺激するとい
う原理に基づいている。すなわち、ｃＡＭＰおよびアデ
ニル酸シクラーゼ活性の量はｃＡＭＰから生成したＡＭ
Ｐがグリコーゲンホスホリラーゼを活性化し最終的に得
られたＮＡＤＰＨの吸光度に対応する。
【００６４】ＮＡＤＰＨの最終濃度とＡＭＰ濃度の相関
関係は、例えば検量線によって求めることができる(図
２参照)。
関係は、例えば検量線によって求めることができる(図
２参照)。
【００６５】好ましくは、上記ステップ１−クリーニン
グ反応後に、加熱してクリーニング反応で使用した酵素
を不活性化する。
グ反応後に、加熱してクリーニング反応で使用した酵素
を不活性化する。
【００６６】また好ましくは、上記ステップ１−クリー
ニング反応に続いて、ホスホジエステラーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼ、グルコース-１,６-二リン酸、無
機リン酸、グリコーゲン、ＮＡＤＰ+、グルコース-６-
リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコムターゼおよび
Ｍｇ2+からなる液を反応混合物に添加し、上記変換反応
および検出反応の工程をin vitroで連続的に実施する。
ニング反応に続いて、ホスホジエステラーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼ、グルコース-１,６-二リン酸、無
機リン酸、グリコーゲン、ＮＡＤＰ+、グルコース-６-
リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコムターゼおよび
Ｍｇ2+からなる液を反応混合物に添加し、上記変換反応
および検出反応の工程をin vitroで連続的に実施する。
【００６７】ステップ３−検出オプション反応１(６−
ホスホグルコノラクトンの分解) 任意に、ステップ３−検出反応１の反応混合物を加熱し
て６-ホスホグルコノラクトンを順次６-ホスホグルコン
酸に変換し、その後、Ｍｇ2+の存在下でＮＡＤＰ+およ
び６-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼと反応させ、
上記で示されるように、リブロース-５-リン酸、ＮＡＤ
ＰＨ、Ｈ+およびＣＯ2として上記工程(４)で生成される
ＮＡＤＰＨの濃度を高めることもできる。
ホスホグルコノラクトンの分解) 任意に、ステップ３−検出反応１の反応混合物を加熱し
て６-ホスホグルコノラクトンを順次６-ホスホグルコン
酸に変換し、その後、Ｍｇ2+の存在下でＮＡＤＰ+およ
び６-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼと反応させ、
上記で示されるように、リブロース-５-リン酸、ＮＡＤ
ＰＨ、Ｈ+およびＣＯ2として上記工程(４)で生成される
ＮＡＤＰＨの濃度を高めることもできる。
【００６８】ステップ３−検出サイクル反応１ ステップ３−検出反応１で生成するＮＡＤＰＨの有効濃
度は、これをサイクル反応系で使用することによって数
オーダー増加させることができる。即ち、α-ケトグル
タル酸の存在下でＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ+およびグルタ
ミン酸に変換される。ＮＡＤＰ+は順次、添加されたグ
ルコース-６-リン酸を６-ホスホグルコノラクトンおよ
びＮＡＤＰＨに変換する。上記したように、６-ホスホ
グルコノラクトンは加水分解され(Ｈ2Ｏ、加熱)、６-ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびＭg2+の存在下
でリブロース-５-リン酸およびＮＡＤＰＨに変換するこ
とができる［Lowry et al., A Flexible System of Enz
ymatic Analysis, HarcourtBrace Jovanovich, ニュー
ヨーク(1972年)］。
度は、これをサイクル反応系で使用することによって数
オーダー増加させることができる。即ち、α-ケトグル
タル酸の存在下でＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ+およびグルタ
ミン酸に変換される。ＮＡＤＰ+は順次、添加されたグ
ルコース-６-リン酸を６-ホスホグルコノラクトンおよ
びＮＡＤＰＨに変換する。上記したように、６-ホスホ
グルコノラクトンは加水分解され(Ｈ2Ｏ、加熱)、６-ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびＭg2+の存在下
でリブロース-５-リン酸およびＮＡＤＰＨに変換するこ
とができる［Lowry et al., A Flexible System of Enz
ymatic Analysis, HarcourtBrace Jovanovich, ニュー
ヨーク(1972年)］。
【００６９】ステップ２−変換オプション反応１(ＡＴ
Ｐ化) あるいは、ｃＡＭＰから生成するＡＭＰは、痕跡量のＡ
ＴＰの存在下でミオキナーゼと混合することによりＡＤ
Ｐに変換することができる。次に生成したＡＤＰは２-
ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼで
処理することにより、ＡＴＰとピルビン酸に変換され
る。この反応により、１分子のＡＭＰから１分子のＡＴ
Ｐが生成する(ＡＴＰ化反応)。
Ｐ化) あるいは、ｃＡＭＰから生成するＡＭＰは、痕跡量のＡ
ＴＰの存在下でミオキナーゼと混合することによりＡＤ
Ｐに変換することができる。次に生成したＡＤＰは２-
ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼで
処理することにより、ＡＴＰとピルビン酸に変換され
る。この反応により、１分子のＡＭＰから１分子のＡＴ
Ｐが生成する(ＡＴＰ化反応)。
【００７０】上記のｃＡＭＰからＡＭＰ、ＡＤＰを経由
してＡＴＰへ至る、ステップ２−変換反応およびステッ
プ２−変換オプション反応１は、１段階で行うことがで
きる。
してＡＴＰへ至る、ステップ２−変換反応およびステッ
プ２−変換オプション反応１は、１段階で行うことがで
きる。
【００７１】ステップ３−検出反応２(ＮＡＤＰＨの蛍
光光度測定) さらにＡＴＰは、まずフルクトースの存在下でヘキソキ
ナーゼで処理されフルクトース-６-リン酸およびＡＤＰ
に変換される。生成したフルクトース-６-リン酸はホス
ホグルコイソメラーゼの作用によりグルコース-６-リン
酸に変換され、最終的に６-ホスホグルコノラクトン、
ＮＡＤＰＨ及びＨ+に酵素的に変換される。そして、同
様に、ＮＡＤＰＨ濃度をTrusらの方法［M.Trus et al.,
Diabetes,第29巻, 1頁(1980年)］に従い測定する。
光光度測定) さらにＡＴＰは、まずフルクトースの存在下でヘキソキ
ナーゼで処理されフルクトース-６-リン酸およびＡＤＰ
に変換される。生成したフルクトース-６-リン酸はホス
ホグルコイソメラーゼの作用によりグルコース-６-リン
酸に変換され、最終的に６-ホスホグルコノラクトン、
ＮＡＤＰＨ及びＨ+に酵素的に変換される。そして、同
様に、ＮＡＤＰＨ濃度をTrusらの方法［M.Trus et al.,
Diabetes,第29巻, 1頁(1980年)］に従い測定する。
【００７２】ステップ３−検出オプション反応１ さらに同様に、６-ホスホグルコノラクトンを加水分解
して６-ホスホグルコン酸に更に変換し、この６-ホスホ
グルコン酸をＮＡＤＰ+の存在下で、ＮＡＤＰＨ、Ｈ+、
ＣＯ2およびリブロース-５-リン酸に変換してもよい。
して６-ホスホグルコン酸に更に変換し、この６-ホスホ
グルコン酸をＮＡＤＰ+の存在下で、ＮＡＤＰＨ、Ｈ+、
ＣＯ2およびリブロース-５-リン酸に変換してもよい。
【００７３】ステップ３−検出サイクル反応２(ＡＴＰ
−ＡＤＰサイクル反応による増幅) そしてさらにＡＴＰは、ＡＴＰ-ＡＤＰサイクル反応に
供される。即ち、ＡＴＰは、まずフルクトースの存在下
でヘキソキナーゼで処理されフルクトース-６-リン酸お
よびＡＤＰに変換される。次にこのＡＤＰは、ホスホエ
ノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼの作用によ
りＡＴＰおよびピルビン酸となる。ここで生成したＡＴ
Ｐは再びフルクトース-６-リン酸およびＡＤＰに変換さ
れる。この反応が繰り返されることにより、最終的にフ
ルクトース-６-リン酸が蓄積する。
−ＡＤＰサイクル反応による増幅) そしてさらにＡＴＰは、ＡＴＰ-ＡＤＰサイクル反応に
供される。即ち、ＡＴＰは、まずフルクトースの存在下
でヘキソキナーゼで処理されフルクトース-６-リン酸お
よびＡＤＰに変換される。次にこのＡＤＰは、ホスホエ
ノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼの作用によ
りＡＴＰおよびピルビン酸となる。ここで生成したＡＴ
Ｐは再びフルクトース-６-リン酸およびＡＤＰに変換さ
れる。この反応が繰り返されることにより、最終的にフ
ルクトース-６-リン酸が蓄積する。
【００７４】サイクル反応終了時の酵素の不活性化のた
めに、キレート剤を添加する。キレート剤はＥＤＴＡの
ようなポリアミノカルボン酸、クエン酸のようなオキシ
カルボン酸などが用いられる。好ましくは、ＥＤＴＡで
ある。
めに、キレート剤を添加する。キレート剤はＥＤＴＡの
ようなポリアミノカルボン酸、クエン酸のようなオキシ
カルボン酸などが用いられる。好ましくは、ＥＤＴＡで
ある。
【００７５】サイクル反応では、過剰のフルクトースお
よびホスホエノールピルビン酸から得られるフルクトー
ス-６-リン酸は、ホスホグルコースイソメラーゼにより
グルコース-６-リン酸に変換される。このグルコース-
６-リン酸をグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼお
よびＮＡＤＰ+で処理することによって６-ホスホグルコ
ノラクトンおよびＮＡＤＰＨに変換される。そして、Ｎ
ＡＤＰＨ濃度をTrusらの方法［M.Trus et al., Diabete
s, 第29巻, 1頁(1980年)］に従い、測定する(ステップ
３−検出反応２参照)。
よびホスホエノールピルビン酸から得られるフルクトー
ス-６-リン酸は、ホスホグルコースイソメラーゼにより
グルコース-６-リン酸に変換される。このグルコース-
６-リン酸をグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼお
よびＮＡＤＰ+で処理することによって６-ホスホグルコ
ノラクトンおよびＮＡＤＰＨに変換される。そして、Ｎ
ＡＤＰＨ濃度をTrusらの方法［M.Trus et al., Diabete
s, 第29巻, 1頁(1980年)］に従い、測定する(ステップ
３−検出反応２参照)。
【００７６】ステップ３−検出反応３ さらに、本発明においては、上記ステップ２−変換オプ
ション反応１のＡＴＰ化反応で生成したＡＴＰをルシフ
ェラーゼ反応またはホタルルシフェリンを使用する化学
的蛍光分析法を用いて吸光度測定によって検出してもよ
い［Wulff et al., Methods of Enzymatic Analysis,
H.U.Bergmeyer編集, VCH(1985年)］。ＡＴＰの測定値か
ら、ＡＭＰおよびｃＡＭＰ濃度ならびにそれに対応する
アデニル酸シクラーゼ活性を算出することができる。
ション反応１のＡＴＰ化反応で生成したＡＴＰをルシフ
ェラーゼ反応またはホタルルシフェリンを使用する化学
的蛍光分析法を用いて吸光度測定によって検出してもよ
い［Wulff et al., Methods of Enzymatic Analysis,
H.U.Bergmeyer編集, VCH(1985年)］。ＡＴＰの測定値か
ら、ＡＭＰおよびｃＡＭＰ濃度ならびにそれに対応する
アデニル酸シクラーゼ活性を算出することができる。
【００７７】この反応の進行は非常に緩慢であるが、反
応収率(発光した光子数と変換されたＡＴＰ分子数の比
率として定義される)はほぼ100％である。発光強度はＡ
ＴＰ濃度と正比例し、582nmで測定される。
応収率(発光した光子数と変換されたＡＴＰ分子数の比
率として定義される)はほぼ100％である。発光強度はＡ
ＴＰ濃度と正比例し、582nmで測定される。
【００７８】本発明の測定法は、反応系の概念が同一で
あれば、ＡＭＰ以外の物質に適用することができる。例
えば、ＧＭＰに対応する酵素を適応することにより、グ
アニル酸シクラーゼ活性やサイクリックグアノシン-
３',５'-一リン酸(ｃＧＭＰ)およびグアノシン-３',５'
-一リン酸(ＧＭＰ)の定量に用いることもできる。用い
られる反応式を下記に示す。
あれば、ＡＭＰ以外の物質に適用することができる。例
えば、ＧＭＰに対応する酵素を適応することにより、グ
アニル酸シクラーゼ活性やサイクリックグアノシン-
３',５'-一リン酸(ｃＧＭＰ)およびグアノシン-３',５'
-一リン酸(ＧＭＰ)の定量に用いることもできる。用い
られる反応式を下記に示す。
【００７９】ステップ(ｉ)−クリーニング反応
【化１７】
【００８０】ステップ(ii)−変換反応
【化１８】
【００８１】ステップ(iii)−サイクル反応
【化１９】
【００８２】ステップ(iv)−検出反応
【化２０】
【００８３】ステップ(ｉ)−クリーニング反応 即ち、上記式に示したように、アピラーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼおよびグア
ナーゼからなるクリーニング混合物が使用される。アル
カリホスファターゼは、ｃＧＭＰの測定中にブランク値
を高める可能性のある化合物、例えばグルコース-６-リ
ン酸や非環状ヌクレオチドを脱リン酸化にも用いられ得
る(クリーニング反応)。
スファターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼおよびグア
ナーゼからなるクリーニング混合物が使用される。アル
カリホスファターゼは、ｃＧＭＰの測定中にブランク値
を高める可能性のある化合物、例えばグルコース-６-リ
ン酸や非環状ヌクレオチドを脱リン酸化にも用いられ得
る(クリーニング反応)。
【００８４】クリーニング反応では、試料中ＧＴＰはＧ
ＭＰ＋２Ｐiに変換された後、グアノシンとＰiに変換さ
れる。グアノシンはグアニンとリボース-１-リン酸に変
換され、そしてグアニンは、キサンチンとアンモニアに
変換される。ｃＡＭＰの測定におけるクリーニング反応
と同様に、最終クリーニング反応におけるアンモニウム
(またはＮＨ4 +)は、一連のクリーニング反応を本質的に
終了させ、その結果、干渉ヌクレオチドを確実に除去す
る。
ＭＰ＋２Ｐiに変換された後、グアノシンとＰiに変換さ
れる。グアノシンはグアニンとリボース-１-リン酸に変
換され、そしてグアニンは、キサンチンとアンモニアに
変換される。ｃＡＭＰの測定におけるクリーニング反応
と同様に、最終クリーニング反応におけるアンモニウム
(またはＮＨ4 +)は、一連のクリーニング反応を本質的に
終了させ、その結果、干渉ヌクレオチドを確実に除去す
る。
【００８５】好ましくは、クリーニング反応で使用され
る酵素は次のステップ(ii)−変換反応の前に、例えば加
熱によって不活化される。
る酵素は次のステップ(ii)−変換反応の前に、例えば加
熱によって不活化される。
【００８６】ステップ(ii)−変換反応 次に、ホスホジエステラーゼを用いて試料中に存在する
ｃＧＭＰをＧＭＰに変換する。ＧＭＰをグアニンモノホ
スフェートキナーゼの存在下でＡＴＰと混合するとグア
ノシン-５'-二リン酸(ＧＤＰ)とＡＤＰが得られる。
ｃＧＭＰをＧＭＰに変換する。ＧＭＰをグアニンモノホ
スフェートキナーゼの存在下でＡＴＰと混合するとグア
ノシン-５'-二リン酸(ＧＤＰ)とＡＤＰが得られる。
【００８７】ステップ(iii)−サイクル反応 ＧＤＰは、過剰のホスホエノールピルビン酸、スクシニ
ル-ＣoＡおよび無機リン酸(Ｐi)の存在下で一定量のピ
ルビン酸を生じる(サイクル反応)。
ル-ＣoＡおよび無機リン酸(Ｐi)の存在下で一定量のピ
ルビン酸を生じる(サイクル反応)。
【００８８】ステップ(iv)−検出反応 このピルビン酸は、酸の存在下で乳酸およびＮＡＤ+に
変換される既知量のＮＡＤＨを添加して間接的に定量さ
れる。かくして、インジケーター試料の蛍光は、ｃＧＭ
Ｐ、ＧＭＰ又はグアニル酸シクラーゼについてアッセイ
される試料中で生成するピルベートの量に正比例して減
少する。
変換される既知量のＮＡＤＨを添加して間接的に定量さ
れる。かくして、インジケーター試料の蛍光は、ｃＧＭ
Ｐ、ＧＭＰ又はグアニル酸シクラーゼについてアッセイ
される試料中で生成するピルベートの量に正比例して減
少する。
【００８９】本発明では、ステップ(ii)−変換反応にお
いて、グアニンモノホスフェートキナーゼによって分解
するＡＴＰ量を測定して、ＧＭＰ量を求めることもでき
る。ＡＴＰは上記で示したような、公知の方法で測定す
ることができる。
いて、グアニンモノホスフェートキナーゼによって分解
するＡＴＰ量を測定して、ＧＭＰ量を求めることもでき
る。ＡＴＰは上記で示したような、公知の方法で測定す
ることができる。
【００９０】本発明の酵素的手法を用いたアデニル酸シ
クラーゼ活性またはグアニル酸シクラーゼ活性の測定
は、高感度であり、費用も顕著に安く、また短時間で結
果を得ることができる。さらに放射性物質を使用しない
ので、オペレーターにとって安全であり、そして環境に
対しても良好である。
クラーゼ活性またはグアニル酸シクラーゼ活性の測定
は、高感度であり、費用も顕著に安く、また短時間で結
果を得ることができる。さらに放射性物質を使用しない
ので、オペレーターにとって安全であり、そして環境に
対しても良好である。
【００９１】最後に、本発明の測定方法は、生物学的試
料中または外来性のホスホジエステラーゼの量を測定す
るように適合させることも容易である。即ち、ｃＡＭＰ
の予め選択された単一量を未知濃度のホスホジエステラ
ーゼを含有する試料に添加する。この時、ホスホジエス
テラーゼに対する特異的なインヒビターを必要に応じて
添加してもよい。ｃＡＭＰの予め選択された単一の過剰
量を種々の予め選択された既知量のホスホジエステラー
ゼに添加することによって標準曲線が得られる。添加さ
れたｃＡＭＰの幾らかがホスホジエステラーゼによって
ＡＭＰに転換される反応時間(５〜60分)後に、反応を停
止させる。ｃＡＭＰ標準曲線を同時に実施して反応が適
切に進行していることを証明することができる。クリー
ニング反応を開始して、非環状アデニンヌクレオチドを
すべて分解する。残存ｃＡＭＰは天然＋添加ホスホジエ
ステラーゼに反比例する。次に、ｃＡＭＰを通常の方法
でＡＭＰに変換し、測定する。
料中または外来性のホスホジエステラーゼの量を測定す
るように適合させることも容易である。即ち、ｃＡＭＰ
の予め選択された単一量を未知濃度のホスホジエステラ
ーゼを含有する試料に添加する。この時、ホスホジエス
テラーゼに対する特異的なインヒビターを必要に応じて
添加してもよい。ｃＡＭＰの予め選択された単一の過剰
量を種々の予め選択された既知量のホスホジエステラー
ゼに添加することによって標準曲線が得られる。添加さ
れたｃＡＭＰの幾らかがホスホジエステラーゼによって
ＡＭＰに転換される反応時間(５〜60分)後に、反応を停
止させる。ｃＡＭＰ標準曲線を同時に実施して反応が適
切に進行していることを証明することができる。クリー
ニング反応を開始して、非環状アデニンヌクレオチドを
すべて分解する。残存ｃＡＭＰは天然＋添加ホスホジエ
ステラーゼに反比例する。次に、ｃＡＭＰを通常の方法
でＡＭＰに変換し、測定する。
【００９２】具体的には、試料組織をＳＥＴ緩衝液
（０.５ＭのＮａＣｌ、０.０３Ｍのトリス、２ｍＭのＥ
ＤＴＡ）に溶解し、２倍量のＰＤＥ混合物（５０ｍＭの
トリス、５０μＭのｃＡＭＰ）を添加し、３７℃で２０
分間インキュベーションする。この反応混合物を８０℃
で３０分間加熱する。組織に対して４倍量のクリーニン
グ反応混合物を添加し、３７℃で１時間インキュベーシ
ョンする。この反応混合物を８０℃で３０分間加熱す
る。次に組織に対して１０倍量の変換反応混合物を添加
し、室温で１時間インキュベーションした後、検出反応
により、ＮＡＤＰＨの蛍光強度を測定する。
（０.５ＭのＮａＣｌ、０.０３Ｍのトリス、２ｍＭのＥ
ＤＴＡ）に溶解し、２倍量のＰＤＥ混合物（５０ｍＭの
トリス、５０μＭのｃＡＭＰ）を添加し、３７℃で２０
分間インキュベーションする。この反応混合物を８０℃
で３０分間加熱する。組織に対して４倍量のクリーニン
グ反応混合物を添加し、３７℃で１時間インキュベーシ
ョンする。この反応混合物を８０℃で３０分間加熱す
る。次に組織に対して１０倍量の変換反応混合物を添加
し、室温で１時間インキュベーションした後、検出反応
により、ＮＡＤＰＨの蛍光強度を測定する。
【００９３】本発明においては、使用する酵素や緩衝液
等が予めキット化された製剤として提供される。この場
合、クリーニング反応混合物キット、変換反応混合物キ
ット、サイクル反応混合物キット、検出反応混合物キッ
トのように、各反応工程毎にキット化すると便利であ
る。
等が予めキット化された製剤として提供される。この場
合、クリーニング反応混合物キット、変換反応混合物キ
ット、サイクル反応混合物キット、検出反応混合物キッ
トのように、各反応工程毎にキット化すると便利であ
る。
【００９４】本発明に使用する酵素等は、適当なガラス
製またはプラスチック製容器のバイアル、アンプルに、
例えば液剤、凍結乾燥剤または固形剤の形状で充填さ
れ、提供される。
製またはプラスチック製容器のバイアル、アンプルに、
例えば液剤、凍結乾燥剤または固形剤の形状で充填さ
れ、提供される。
【００９５】酵素類は予め緩衝液、電解質液、蒸留水等
で溶解されていてもよい。あるいは、複室容器に酵素と
溶解液を別々に収容しておき、使用直前に混合してもよ
い。
で溶解されていてもよい。あるいは、複室容器に酵素と
溶解液を別々に収容しておき、使用直前に混合してもよ
い。
【００９６】また、適宜、保存剤、安定化剤、着色剤、
賦形剤、ｐＨ調整剤などの添加物を加えることもでき
る。
賦形剤、ｐＨ調整剤などの添加物を加えることもでき
る。
【００９７】本発明の測定方法は、本明細書に記載した
増幅反応を使用する他、適当な自動分析装置を用いて行
ってもよい。
増幅反応を使用する他、適当な自動分析装置を用いて行
ってもよい。
【００９８】
【発明の効果】本発明は、アデニル酸シクラーゼ活性お
よびｃＡＭＰ並びにｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラー
ゼ活性およびＧ調節タンパク質の生物学的活性に関する
非放射性の酵素的蛍光定量法を提供する。また、本発明
は、グアニル酸シクラーゼ活性およびｃＧＭＰの非放射
的測定を提供する。
よびｃＡＭＰ並びにｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラー
ゼ活性およびＧ調節タンパク質の生物学的活性に関する
非放射性の酵素的蛍光定量法を提供する。また、本発明
は、グアニル酸シクラーゼ活性およびｃＧＭＰの非放射
的測定を提供する。
【００９９】本発明の方法は、現在利用されているアデ
ニル酸シクラーゼ活性等の測定方法に比べて幾つかの利
点を有する。即ち、本発明は、Y.Salomonらによって開
示された従来法［Anal.Biochem., 第58巻, 541頁(1974
年)；Adv.Cyclic NucleotideRes., 第10巻, 35頁(1979
年)］と異なり、放射性物質を一切使用しない。加え
て、本発明の測定方法は、従来法に比べ高感度で、操作
がより簡単である。
ニル酸シクラーゼ活性等の測定方法に比べて幾つかの利
点を有する。即ち、本発明は、Y.Salomonらによって開
示された従来法［Anal.Biochem., 第58巻, 541頁(1974
年)；Adv.Cyclic NucleotideRes., 第10巻, 35頁(1979
年)］と異なり、放射性物質を一切使用しない。加え
て、本発明の測定方法は、従来法に比べ高感度で、操作
がより簡単である。
【０１００】さらに、本発明者らが先に開発した酵素反
応を用いた測定方法［A.Sugiyama et al., Anal.Bioche
m., 第218巻, 20頁(1994年)；A.Sugiyama et al., J.Cl
in.Lab., 第8巻, 437頁(1994年)；A.Sugiyama et al.,
Anal.Biochem., 第225巻, 368頁(1995年)；A.Sugiyama
et al., Yamanashi Med.J., 第10巻, 11頁(1995年)］と
比較しても、反応時間が著しく短縮され、操作もより簡
便なものとなっている。また、従来方法では回避できな
かった試料の白濁化をＥＤＴＡなどのキレート剤を用い
ることで解決した。そして、この方法を用いることで、
μgオーダーの生物学的試料中のｃＡＭＰ量をpmolまた
はfmolレベルで正確に定量することが可能である。
応を用いた測定方法［A.Sugiyama et al., Anal.Bioche
m., 第218巻, 20頁(1994年)；A.Sugiyama et al., J.Cl
in.Lab., 第8巻, 437頁(1994年)；A.Sugiyama et al.,
Anal.Biochem., 第225巻, 368頁(1995年)；A.Sugiyama
et al., Yamanashi Med.J., 第10巻, 11頁(1995年)］と
比較しても、反応時間が著しく短縮され、操作もより簡
便なものとなっている。また、従来方法では回避できな
かった試料の白濁化をＥＤＴＡなどのキレート剤を用い
ることで解決した。そして、この方法を用いることで、
μgオーダーの生物学的試料中のｃＡＭＰ量をpmolまた
はfmolレベルで正確に定量することが可能である。
【０１０１】本発明のクリーニング反応は、ｃＡＭＰよ
り遙かに高濃度であり、除去しなければ実質的にブラン
クを高めるおそれのある全ての試料中の内因性ＡＴＰ、
ＡＤＰおよびＡＭＰを除去することができる。さらに、
同様に妨害物質として作用する試料中のグルコース-６-
リン酸およびグリコーゲンも全て除去することができ
る。これらのクリーニング反応は、検出感度の向上のた
めに重要である。
り遙かに高濃度であり、除去しなければ実質的にブラン
クを高めるおそれのある全ての試料中の内因性ＡＴＰ、
ＡＤＰおよびＡＭＰを除去することができる。さらに、
同様に妨害物質として作用する試料中のグルコース-６-
リン酸およびグリコーゲンも全て除去することができ
る。これらのクリーニング反応は、検出感度の向上のた
めに重要である。
【０１０２】しかも本発明では、従来クリーニング反応
に用いられていた４種類の酵素(アピラーゼ、５'-ヌク
レオチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼ)のうち、５'-ヌクレオチダーゼの使用
を取りやめることにより、１時間を要していた反応時間
が僅か５分乃至10分間程度に著しく短縮できることを見
出した。
に用いられていた４種類の酵素(アピラーゼ、５'-ヌク
レオチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼ)のうち、５'-ヌクレオチダーゼの使用
を取りやめることにより、１時間を要していた反応時間
が僅か５分乃至10分間程度に著しく短縮できることを見
出した。
【０１０３】また、サイクル反応後、キレート剤により
Ｍｇ2+をトラップするので、加熱することなく過剰の酵
素が不活性化することができ、試料が白濁しない。
Ｍｇ2+をトラップするので、加熱することなく過剰の酵
素が不活性化することができ、試料が白濁しない。
【０１０４】本発明の測定方法の感度は、反応容量を減
少させることによって高めることもできる。この感度
は、Meinrich等またはE.Helmrich等［E.Helmrich et a
l., Biochemistry, 第52巻, 647頁(1964年)］の方法を
用いることにより、反応混合物中のグリコーゲンおよび
無機リン酸の濃度を変えることによって更に高めること
もできる。本発明は、10μg程度の微量の哺乳動物組織
の膜タンパク質中のアデニル酸シクラーゼ活性を測定す
ることが可能である。
少させることによって高めることもできる。この感度
は、Meinrich等またはE.Helmrich等［E.Helmrich et a
l., Biochemistry, 第52巻, 647頁(1964年)］の方法を
用いることにより、反応混合物中のグリコーゲンおよび
無機リン酸の濃度を変えることによって更に高めること
もできる。本発明は、10μg程度の微量の哺乳動物組織
の膜タンパク質中のアデニル酸シクラーゼ活性を測定す
ることが可能である。
【０１０５】従来の［α-32Ｐ］ｃＡＭＰの比活性およ
びクロマトグラフィー分離などの容量サイズによって感
度が制限される放射活性測定方法とは異なって、本発明
の蛍光定量方法においては、感度を高めることに対して
顕著な障害は存在していない。例えば、ｃＡＭＰは広範
な濃度範囲(１fmol〜１mmol)で測定可能である。
びクロマトグラフィー分離などの容量サイズによって感
度が制限される放射活性測定方法とは異なって、本発明
の蛍光定量方法においては、感度を高めることに対して
顕著な障害は存在していない。例えば、ｃＡＭＰは広範
な濃度範囲(１fmol〜１mmol)で測定可能である。
【０１０６】
【実施例】本発明は、以下の実施例により更に詳細に説
明される。これらの実施例においては使用した酵素、基
質およびコファクターは、Boehringer Mannheim社から
入手した。ただし、アピラーゼおよび５'-ヌクレオチダ
ーゼはSigma社から入手した。［α-32Ｐ］ＡＴＰ、3Ｈ-
ｃＡＭＰおよびアクアゾルシンチレーションカクテルは
New England Nuclear社から購入した。Neutral Chromat
ographic AluminaWN-3はBio-Rad社製を用いた。
明される。これらの実施例においては使用した酵素、基
質およびコファクターは、Boehringer Mannheim社から
入手した。ただし、アピラーゼおよび５'-ヌクレオチダ
ーゼはSigma社から入手した。［α-32Ｐ］ＡＴＰ、3Ｈ-
ｃＡＭＰおよびアクアゾルシンチレーションカクテルは
New England Nuclear社から購入した。Neutral Chromat
ographic AluminaWN-3はBio-Rad社製を用いた。
【０１０７】実施例１ クリーニング反応時間の設定 ３μＬのＡＴＰ標準品(０、10、100、1000および10000p
mol/tube)を10×57のPyrex(商品名)製分析管に加えた。
室温にて、クリーニング反応混合物(100mＭのトリス-Ｈ
Ｃl、ｐＨ8.0；２mＭのＭgＣl2；２Ｕ/mＬのアピラー
ゼ；10Ｕ/mＬのアデノシンデアミナーゼ；40Ｕ/mＬのア
ルカリホスファターゼ)25μＬを各分析管に加えた。こ
の混合物を37℃でインキュベートした(０、５、10、15
および20分間)。以下、ステップ２−変換反応(ＡＭＰ化
反応)および変換オプション反応(ＡＴＰ化反応)、ステ
ップ３−検出サイクル反応２を行い、340nmにおける吸
光度を測定し、ＡＴＰが完全に消失するインキュベーシ
ョン時間を求めた。結果を図１に示す。その結果、少な
くとも10分間のインキュベーションで妨害物質のＡＴＰ
はほぼ消失することが判った。
mol/tube)を10×57のPyrex(商品名)製分析管に加えた。
室温にて、クリーニング反応混合物(100mＭのトリス-Ｈ
Ｃl、ｐＨ8.0；２mＭのＭgＣl2；２Ｕ/mＬのアピラー
ゼ；10Ｕ/mＬのアデノシンデアミナーゼ；40Ｕ/mＬのア
ルカリホスファターゼ)25μＬを各分析管に加えた。こ
の混合物を37℃でインキュベートした(０、５、10、15
および20分間)。以下、ステップ２−変換反応(ＡＭＰ化
反応)および変換オプション反応(ＡＴＰ化反応)、ステ
ップ３−検出サイクル反応２を行い、340nmにおける吸
光度を測定し、ＡＴＰが完全に消失するインキュベーシ
ョン時間を求めた。結果を図１に示す。その結果、少な
くとも10分間のインキュベーションで妨害物質のＡＴＰ
はほぼ消失することが判った。
【０１０８】比較実験 本願発明のクリーニング反応と５'−ヌクレオチダーゼ
を用いたクリーニング反応とを比較するために行われ
た。 ５'−ヌクレオチダーゼを含むクリーニング反応混合物
の調製 トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、ＭｇＣｌ2、５'−ヌク
レオチダーゼ、アピラーゼ、アデノシンデアミナーゼお
よびアルカリホスファターゼに水を加えて全量２５μＬ
とし、表１に示す最終濃度を有するクリーニング反応混
合物を調製した。
を用いたクリーニング反応とを比較するために行われ
た。 ５'−ヌクレオチダーゼを含むクリーニング反応混合物
の調製 トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、ＭｇＣｌ2、５'−ヌク
レオチダーゼ、アピラーゼ、アデノシンデアミナーゼお
よびアルカリホスファターゼに水を加えて全量２５μＬ
とし、表１に示す最終濃度を有するクリーニング反応混
合物を調製した。
【０１０９】このクリーニング反応は以下の式で示すこ
とができる。
とができる。
【化２１】
【０１１０】クリーニング反応時間の設定 上記で調製したクリーニング反応混合物を用い、実施例
１の方法に準じてクリーニング反応を行った。３μＬの
ＡＴＰ標準品（０、１０、１００、１０００および１０
０００pmol/tube）を１０×５７のPyrex製分析管に加え
た。室温にて、上記で調製したクリーニング反応混合物
（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）；２ｍＭ
のＭｇＣｌ2；２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ；２.５Ｕ／ｍＬ
の５'-ヌクレオチダーゼ；０.１Ｕ／ｍＬのアデノシン
デアミナーゼ；２０Ｕ／ｍＬのアルカリホスファター
ゼ）２５μＬを各分析管に加えた。この混合物を３７℃
でインキュベートした。以下、実施例２に記載の変換反
応、サイクル化反応および検出反応を行い、３４０ｎｍ
における吸光度を測定し、ＡＴＰが完全に消失するイン
キュベーション時間を求めた。その結果、ＡＴＰを完全
に消失させるためには、およそ１時間を要した。
１の方法に準じてクリーニング反応を行った。３μＬの
ＡＴＰ標準品（０、１０、１００、１０００および１０
０００pmol/tube）を１０×５７のPyrex製分析管に加え
た。室温にて、上記で調製したクリーニング反応混合物
（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）；２ｍＭ
のＭｇＣｌ2；２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ；２.５Ｕ／ｍＬ
の５'-ヌクレオチダーゼ；０.１Ｕ／ｍＬのアデノシン
デアミナーゼ；２０Ｕ／ｍＬのアルカリホスファター
ゼ）２５μＬを各分析管に加えた。この混合物を３７℃
でインキュベートした。以下、実施例２に記載の変換反
応、サイクル化反応および検出反応を行い、３４０ｎｍ
における吸光度を測定し、ＡＴＰが完全に消失するイン
キュベーション時間を求めた。その結果、ＡＴＰを完全
に消失させるためには、およそ１時間を要した。
【０１１１】実施例２ 組織培養物における酵素的蛍光
定量による微量ｃＡＭＰ測定 (１)試料および反応混合物の調製 Ａ．生物学的試料の調製(心室筋細胞の調製) 初代培養で増殖させた１日齢のラットの心臓から心室筋
細胞を採取した。心臓あたり約500万個の心筋細胞が生
存していた。100mmあたり約100万個の細胞密度で播いた
後、皿細胞を５％ウシ血清細胞を含有するハンクスの平
衡塩類溶液を有する最少必須培地中で増殖させた［Simp
son et al., Cir.Res., 第51巻, 787頁(1982年)］。４
日目に培地を交換した。培養物は90％以上の心筋細胞を
含有しており、細胞数は期間中一定であった［Simpson
et al., Cir.Res., 第51巻, 787頁(1982年)；Rocha-Sin
gh et al., J.Clin.Invest., 第88巻, 204頁(1991年)；
Rocha-Singh et al., J.Clin.Invest., 第88巻, 706頁
(1991年)］。６プレートの筋細胞を２群(ｎ＝３プレー
ト／群)に無作為抽出した。ホスホジエステラーゼイン
ヒビター、３-イソブチル-１-メチルキサンチン(ＩＢＭ
Ｘ)を各群の培地に２μＭの最終濃度となるように添加
した。５分後、一方の群にイソプロテレノールを１μＭ
の最終濃度となるように添加し、刺激群とした。他方の
群には追加的な薬品を加えなかった。５分後、６つの全
プレートの細胞および細胞なしの培養培地プレートを合
計５mＬの100％エタノールで溶出した。各皿から得られ
る溶出物の10分の１(0.5mＬ)を採り、12×75mmのホウケ
イ酸ガラス管中で風乾し、−80℃で貯蔵した。残りの4.
5mＬも同様に風乾し、貯蔵した。測定時に、ペレットを
解凍し、0.5Ｎの過塩素酸100μＬに再度懸濁した。抽出
物を４℃で２分間撹拌し、超音波処理器(Branson Clean
ing Equipment社、A Smith-Kline社、米国)を使用して
１分間超音波処理した。抽出物を25μＬの２Ｎ ＫＯＨ
で中和し、2000gで30分間遠心した後、上清液80μＬを
分析用に採取した。
定量による微量ｃＡＭＰ測定 (１)試料および反応混合物の調製 Ａ．生物学的試料の調製(心室筋細胞の調製) 初代培養で増殖させた１日齢のラットの心臓から心室筋
細胞を採取した。心臓あたり約500万個の心筋細胞が生
存していた。100mmあたり約100万個の細胞密度で播いた
後、皿細胞を５％ウシ血清細胞を含有するハンクスの平
衡塩類溶液を有する最少必須培地中で増殖させた［Simp
son et al., Cir.Res., 第51巻, 787頁(1982年)］。４
日目に培地を交換した。培養物は90％以上の心筋細胞を
含有しており、細胞数は期間中一定であった［Simpson
et al., Cir.Res., 第51巻, 787頁(1982年)；Rocha-Sin
gh et al., J.Clin.Invest., 第88巻, 204頁(1991年)；
Rocha-Singh et al., J.Clin.Invest., 第88巻, 706頁
(1991年)］。６プレートの筋細胞を２群(ｎ＝３プレー
ト／群)に無作為抽出した。ホスホジエステラーゼイン
ヒビター、３-イソブチル-１-メチルキサンチン(ＩＢＭ
Ｘ)を各群の培地に２μＭの最終濃度となるように添加
した。５分後、一方の群にイソプロテレノールを１μＭ
の最終濃度となるように添加し、刺激群とした。他方の
群には追加的な薬品を加えなかった。５分後、６つの全
プレートの細胞および細胞なしの培養培地プレートを合
計５mＬの100％エタノールで溶出した。各皿から得られ
る溶出物の10分の１(0.5mＬ)を採り、12×75mmのホウケ
イ酸ガラス管中で風乾し、−80℃で貯蔵した。残りの4.
5mＬも同様に風乾し、貯蔵した。測定時に、ペレットを
解凍し、0.5Ｎの過塩素酸100μＬに再度懸濁した。抽出
物を４℃で２分間撹拌し、超音波処理器(Branson Clean
ing Equipment社、A Smith-Kline社、米国)を使用して
１分間超音波処理した。抽出物を25μＬの２Ｎ ＫＯＨ
で中和し、2000gで30分間遠心した後、上清液80μＬを
分析用に採取した。
【０１１２】Ｂ．クリーニング反応混合物の調製(ステ
ップ１クリーニング反応参照) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)400μＬ、0.２ＭのＭgＣ
ｌ240μＬ、500Ｕ/mＬのアピラーゼ32μＬ、400Ｕ/mＬ
のアデノシンデアミナーゼ100μＬおよび4000Ｕ/mＬの
アルカリホスファターゼ40μＬに水を加えて全量４mＬ
とし、クリーニング反応混合物を調製した(表２)。
ップ１クリーニング反応参照) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)400μＬ、0.２ＭのＭgＣ
ｌ240μＬ、500Ｕ/mＬのアピラーゼ32μＬ、400Ｕ/mＬ
のアデノシンデアミナーゼ100μＬおよび4000Ｕ/mＬの
アルカリホスファターゼ40μＬに水を加えて全量４mＬ
とし、クリーニング反応混合物を調製した(表２)。
【０１１３】表２：クリーニング反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0) 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ アピラーゼ 4Ｕ/mＬ アデノシンデアミナーゼ 10Ｕ/mＬ アルカリホスファターゼ 40Ｕ/mＬ Ｈ2Ｏ −
【０１１４】実施例２（１）で調製したラット心室筋細
胞調製物を氷冷した後、０.４μＬのステップ１−クリ
ーニングオプション反応混合物（１００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８.０）、３ｍＭのＭｇＣｌ2、３Ｕ／ｍＬの
アピラーゼ、１５０μｇ／ｍＬのアデノシンデアミナー
ゼ、３０Ｕ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ、および
７５μｇ／ｍＬのグリコーゲンホスフォリラーゼ−α）
を加えて、すべての内因性アデニンヌクレオチド、グリ
コーゲン、およびグルコース−６−リン酸を除去した。
３７℃で１時間インキュベーションした後、８０℃で３
０分間加熱して、酵素を不活性化した。
胞調製物を氷冷した後、０.４μＬのステップ１−クリ
ーニングオプション反応混合物（１００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８.０）、３ｍＭのＭｇＣｌ2、３Ｕ／ｍＬの
アピラーゼ、１５０μｇ／ｍＬのアデノシンデアミナー
ゼ、３０Ｕ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ、および
７５μｇ／ｍＬのグリコーゲンホスフォリラーゼ−α）
を加えて、すべての内因性アデニンヌクレオチド、グリ
コーゲン、およびグルコース−６−リン酸を除去した。
３７℃で１時間インキュベーションした後、８０℃で３
０分間加熱して、酵素を不活性化した。
【０１１５】Ｃ．変換反応混合物の調製(ステップ２−
変換反応およびステップ２−変換オプション反応参照) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)400μＬ、0.2ＭのＭgＣ
ｌ240μＬ、４％のウシ血清アルブミン10μＬ、１Ｍの
ＫＣｌ600μＬ、0.1Ｍのジチオトレイトール80μＬ、0.
1μＭのＡＴＰ16μＬ、0.5Ｍのホスホエノールピルビン
酸24μＬ、２Ｕ/mＬのホスホジエステラーゼ24μＬ、72
0Ｕ/mＬのミオキナーゼ24μＬおよび2000Ｕ/mＬのピル
ビン酸キナーゼ160μＬに水を加えて全量４mＬとし、変
換反応混合物を調製した(表３)。
変換反応およびステップ２−変換オプション反応参照) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)400μＬ、0.2ＭのＭgＣ
ｌ240μＬ、４％のウシ血清アルブミン10μＬ、１Ｍの
ＫＣｌ600μＬ、0.1Ｍのジチオトレイトール80μＬ、0.
1μＭのＡＴＰ16μＬ、0.5Ｍのホスホエノールピルビン
酸24μＬ、２Ｕ/mＬのホスホジエステラーゼ24μＬ、72
0Ｕ/mＬのミオキナーゼ24μＬおよび2000Ｕ/mＬのピル
ビン酸キナーゼ160μＬに水を加えて全量４mＬとし、変
換反応混合物を調製した(表３)。
【０１１６】表３：変換反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0) 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ ウシ血清アルブミン 0.01％ ＫＣｌ 150mＭ ジチオトレイトール 2mＭ ＡＴＰ 40nＭ ホスホエノールピルビン酸 3mＭ ホスホジエステラーゼ 12mＵ/mＬ ミオキナーゼ 4.5Ｕ/mＬ ピルビン酸キナーゼ 80Ｕ/mＬ Ｈ2Ｏ −
【０１１７】Ｄ．サイクル反応混合物の調製(ステップ
３−検出サイクル反応２) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)400μＬ、0.2ＭのＭgＣl
240μＬ、４％のウシ血清アルブミン10μＬ、0.1Ｍのフ
ルクトース30μＬおよび1500Ｕ/mＬのヘキソキナーゼに
水を加えて全量４mＬとし、サイクル反応混合物を調製
した(表４)。
３−検出サイクル反応２) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)400μＬ、0.2ＭのＭgＣl
240μＬ、４％のウシ血清アルブミン10μＬ、0.1Ｍのフ
ルクトース30μＬおよび1500Ｕ/mＬのヘキソキナーゼに
水を加えて全量４mＬとし、サイクル反応混合物を調製
した(表４)。
【０１１８】表４：サイクル反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0) 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ ウシ血清アルブミン 0.01％ フルクトース 3mＭ ヘキソキナーゼ 60mＭ Ｈ2Ｏ −
【０１１９】Ｅ．検出反応混合物の調製(ステップ３−
検出反応２参照) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)2000μＬ、0.2ＭのＥＤ
ＴＡ320μＬ、0.1ＭのＮＡＤＰ+120μＬ、3500Ｕ/mＬの
ホスホグルコイソメラーゼ６μＬおよび1750Ｕ/mＬのグ
ルコース-６-リン酸デヒドロゲーゼ６μＬに水を加えて
全量４mＬとし、検出反応サイクルを調製した(表５)。
検出反応２参照) １Ｍのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)2000μＬ、0.2ＭのＥＤ
ＴＡ320μＬ、0.1ＭのＮＡＤＰ+120μＬ、3500Ｕ/mＬの
ホスホグルコイソメラーゼ６μＬおよび1750Ｕ/mＬのグ
ルコース-６-リン酸デヒドロゲーゼ６μＬに水を加えて
全量４mＬとし、検出反応サイクルを調製した(表５)。
【０１２０】表５：検出反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0) 100mＭ ＥＤＴＡ 3.2mＭ ＮＡＤＰ+ 0.01％ ホスホグルコイソメラーゼフルクトース 1Ｕ/mＬ グルコース-６-リン酸デヒドロゲーゼ 0.5Ｕ/mＬ Ｈ2Ｏ −
【０１２１】(２)組織培養物における酵素的蛍光定量に
よる微量ｃＡＭＰ測定 Ａで調製した心室筋細胞調製物を試料とし、クリーニン
グ反応、変換反応、サイクル反応および検出反応からな
る一連の酵素的蛍光定量法によりｃＡＭＰを求めた。
よる微量ｃＡＭＰ測定 Ａで調製した心室筋細胞調製物を試料とし、クリーニン
グ反応、変換反応、サイクル反応および検出反応からな
る一連の酵素的蛍光定量法によりｃＡＭＰを求めた。
【０１２２】１)クリーニング反応(ステップ１−クリー
ニング反応) 中和した３μＬ容量の筋細胞抽出物(100mmプレートから
得られる総溶出物の2.4％または0.24％のいずれか)また
は３μＬのｃＡＭＰ標準品(０、3.6、7.2、14.4、21.6
および28.8pmol/20μＬ)を10×57のPyrex製分析管(岩城
硝子製)に加えた。室温にて、Ｂで調製した25μＬのク
リーニング反応混合物(100mＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.
0)；２mＭのＭgＣｌ2；２Ｕ/mＬのアピラーゼ；10Ｕ/m
Ｌのアデノシンデアミナーゼ；40Ｕ/mＬのアルカリホス
ファターゼ)を各分析管に加えた。この混合物を37℃で1
0分間インキュベートした。次に、90℃で30分間加熱し
て酵素を不活化した。同様に内部組織ブランクを調製し
た。
ニング反応) 中和した３μＬ容量の筋細胞抽出物(100mmプレートから
得られる総溶出物の2.4％または0.24％のいずれか)また
は３μＬのｃＡＭＰ標準品(０、3.6、7.2、14.4、21.6
および28.8pmol/20μＬ)を10×57のPyrex製分析管(岩城
硝子製)に加えた。室温にて、Ｂで調製した25μＬのク
リーニング反応混合物(100mＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.
0)；２mＭのＭgＣｌ2；２Ｕ/mＬのアピラーゼ；10Ｕ/m
Ｌのアデノシンデアミナーゼ；40Ｕ/mＬのアルカリホス
ファターゼ)を各分析管に加えた。この混合物を37℃で1
0分間インキュベートした。次に、90℃で30分間加熱し
て酵素を不活化した。同様に内部組織ブランクを調製し
た。
【０１２３】２)変換反応(ステップ２−変換反応(ＡＭ
Ｐ化反応)および −変換オプション反応(ＡＴＰ化反応)) クリーニング反応の各分析管に、Ｃで調製した変換反応
混合物(100mＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)；２mＭのＭg
Ｃl2；0.01％のウシ血清アルブミン; 150mＭのＫＣｌ；
２mＭのジチオトレイトール；40nＭのＡＴＰ；３mＭの
ホスホエノールピルビン酸；12mＵ/mＬのホスホジエス
テラーゼ；4.5Ｕ/mＬのミオキナーゼ；80Ｕ/mＬのピル
ビン酸キナーゼ)25μＬを添加した。室温で一晩インキ
ュベーションした。分析管を90℃で５分間加熱して反応
を終了させた。
Ｐ化反応)および −変換オプション反応(ＡＴＰ化反応)) クリーニング反応の各分析管に、Ｃで調製した変換反応
混合物(100mＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)；２mＭのＭg
Ｃl2；0.01％のウシ血清アルブミン; 150mＭのＫＣｌ；
２mＭのジチオトレイトール；40nＭのＡＴＰ；３mＭの
ホスホエノールピルビン酸；12mＵ/mＬのホスホジエス
テラーゼ；4.5Ｕ/mＬのミオキナーゼ；80Ｕ/mＬのピル
ビン酸キナーゼ)25μＬを添加した。室温で一晩インキ
ュベーションした。分析管を90℃で５分間加熱して反応
を終了させた。
【０１２４】３)サイクル反応(ステップ３−検出サイク
ル反応２) 変換反応の各分析管に、Ｄで調製したサイクル反応混合
物(100mＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)；２mＭのＭgＣ
l2；0.01％のウシ血清アルブミン；３mＭのフルクトー
ス；60Ｕ/mＬのヘキソキナーゼ)25μlを添加した。反応
当たりの酵素濃度が高いことを考慮して、これらの反応
物を０℃にセットして全てのアッセイ管の開始時間を確
実に同一にすることが重要であった。37℃で２時間イン
キュベート(およそ4000〜10000サイクル)した。
ル反応２) 変換反応の各分析管に、Ｄで調製したサイクル反応混合
物(100mＭのトリス-ＨＣｌ(ｐＨ8.0)；２mＭのＭgＣ
l2；0.01％のウシ血清アルブミン；３mＭのフルクトー
ス；60Ｕ/mＬのヘキソキナーゼ)25μlを添加した。反応
当たりの酵素濃度が高いことを考慮して、これらの反応
物を０℃にセットして全てのアッセイ管の開始時間を確
実に同一にすることが重要であった。37℃で２時間イン
キュベート(およそ4000〜10000サイクル)した。
【０１２５】４)検出反応(ステップ３−検出反応２) サイクル反応の各分析管に、Ｅで調製した検出反応混合
物(100mＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ8.0；3.2mＭのＥＤＴ
Ａ；0.6mＭのＮＡＤＰ+；１Ｕ/mＬのホスホグルコイソ
メラーゼ；0.5Ｕ/mＬのグルコース-６-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ)125μＬを添加した。室温で20分間反応後、フ
ルオロメーター(Optical Technology Devises社、ニュ
ーヨーク)を使用してＮＡＤＰＨの最終濃度を測定し
た。フルオロメーターは、10蛍光単位の読み取りが緩衝
液(50mＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ8.0)900μＬ中１nmolの
ＮＡＤＰＨと等価になるようにセットした。なお、個々
の分析過程は、既知濃度の適当な基質を使用する内部対
照を同時に分析することにより確認した（例えば、クリ
ーニング反応をチェックするためにＡＴＰを追加して使
用し、変換反応を評価するためにＡＭＰ標準直線を使用
し、サイクル反応を評価するためにはＡＴＰ標準直線を
使用した)。
物(100mＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ8.0；3.2mＭのＥＤＴ
Ａ；0.6mＭのＮＡＤＰ+；１Ｕ/mＬのホスホグルコイソ
メラーゼ；0.5Ｕ/mＬのグルコース-６-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ)125μＬを添加した。室温で20分間反応後、フ
ルオロメーター(Optical Technology Devises社、ニュ
ーヨーク)を使用してＮＡＤＰＨの最終濃度を測定し
た。フルオロメーターは、10蛍光単位の読み取りが緩衝
液(50mＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ8.0)900μＬ中１nmolの
ＮＡＤＰＨと等価になるようにセットした。なお、個々
の分析過程は、既知濃度の適当な基質を使用する内部対
照を同時に分析することにより確認した（例えば、クリ
ーニング反応をチェックするためにＡＴＰを追加して使
用し、変換反応を評価するためにＡＭＰ標準直線を使用
し、サイクル反応を評価するためにはＡＴＰ標準直線を
使用した)。
【０１２６】５)測定結果 340nmでの蛍光測定によってｃＡＭＰ標準品(０、3.6、
7.2、14.4、21.6および28.8pmol/20μＬ)から図２に示
される標準ｃＡＭＰ直線が得られた。
7.2、14.4、21.6および28.8pmol/20μＬ)から図２に示
される標準ｃＡＭＰ直線が得られた。
【０１２７】また、（１）のＡで調製した試料につい
て、追加的な薬剤を加えなかった対照群およびイソプロ
テレノール刺激群中のｃＡＭＰ含量を、各試料のプレー
トの１／１０の溶離液に関し、得られた標準cＡＭＰ直
線(図２)を用いて測定し、cＡＭＰ６８０pmol/100mmプ
レートの実測値を得た。
て、追加的な薬剤を加えなかった対照群およびイソプロ
テレノール刺激群中のｃＡＭＰ含量を、各試料のプレー
トの１／１０の溶離液に関し、得られた標準cＡＭＰ直
線(図２)を用いて測定し、cＡＭＰ６８０pmol/100mmプ
レートの実測値を得た。
【０１２８】本発明の方法、免疫比色キット（アマシャ
ム・インターナショナル製）および放射免疫測定キット
（アマシャム・インターナショナル製）を用いて測定し
た結果を図３に示す。ｃＡＭＰ含量の測定結果は、公知
の方法の放射活性測定法により得られた結果とよく一致
しており、その差は通常の５％以下であった。
ム・インターナショナル製）および放射免疫測定キット
（アマシャム・インターナショナル製）を用いて測定し
た結果を図３に示す。ｃＡＭＰ含量の測定結果は、公知
の方法の放射活性測定法により得られた結果とよく一致
しており、その差は通常の５％以下であった。
【０１２９】さらに、ｃＡＭＰの定量結果からアデニル
酸シクラーゼ活性を、本発明の方法、放射免疫測定法、
およびSalomon法により求めた。その結果を図４に示
す。アデニル酸シクラーゼ活性は、１分間あたりのタン
パク質１mgにおけるｃＡＭＰの生成量（pmol）で示し
た。
酸シクラーゼ活性を、本発明の方法、放射免疫測定法、
およびSalomon法により求めた。その結果を図４に示
す。アデニル酸シクラーゼ活性は、１分間あたりのタン
パク質１mgにおけるｃＡＭＰの生成量（pmol）で示し
た。
【０１３０】実施例２ １Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）、0.2ＭのＭｇＣｌ2、
１ＭのＫ2ＨＰＯ4、0.1ＭのＡＭＰ、4000Ｕ/mＬのアル
カリホスファターゼ、および10mg/mＬのグリコーゲンホ
スホリラーゼの適量を採り、水を加えて最終濃度が以下
になるように、クリーニング反応混合液を調製した。 クリーニング反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0） 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ Ｋ2ＨＰＯ4 5mＭ ＡＭＰ 0.1mＭ アルカリホスファターゼ 20Ｕ/mＬ グリコーゲンホスホリラーゼ 10μg/mＬ Ｈ2Ｏ −
１ＭのＫ2ＨＰＯ4、0.1ＭのＡＭＰ、4000Ｕ/mＬのアル
カリホスファターゼ、および10mg/mＬのグリコーゲンホ
スホリラーゼの適量を採り、水を加えて最終濃度が以下
になるように、クリーニング反応混合液を調製した。 クリーニング反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0） 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ Ｋ2ＨＰＯ4 5mＭ ＡＭＰ 0.1mＭ アルカリホスファターゼ 20Ｕ/mＬ グリコーゲンホスホリラーゼ 10μg/mＬ Ｈ2Ｏ −
【０１３１】１Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）、0.1Ｍ
のＭｇＣｌ2、１ＭのＫ2ＨＰＯ4、0.1ＭのＡＭＰ、0.1
Ｍのジチオトレイトール、１mＭのグルコース−１，６
−二リン酸、４％のウシ血清アルブミン、0.1ＭのＮＡ
ＤＰ、10mg/mＬのグリコーゲンホスホリラーゼ、10mg/m
Ｌのホスホグルコムターゼ、および５mg/mＬのグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの適量を採り、水を加
えて最終濃度が以下となるように、変換反応混合物を調
製した。 変換反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0） 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ Ｋ2ＨＰＯ4 5mＭ ＡＭＰ 0.1mＭ ジチオトレイトール 1mＭ グルコース−１，６−二リン酸 4μＭ ウシ血清アルブミン 0.01％ ＮＡＤＰ 0.2mＭ グリコーゲンホスホリラーゼ 20μg/mＬ ホスホグルコムターゼ 4μg/mＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 2μg/mＬ Ｈ2Ｏ −
のＭｇＣｌ2、１ＭのＫ2ＨＰＯ4、0.1ＭのＡＭＰ、0.1
Ｍのジチオトレイトール、１mＭのグルコース−１，６
−二リン酸、４％のウシ血清アルブミン、0.1ＭのＮＡ
ＤＰ、10mg/mＬのグリコーゲンホスホリラーゼ、10mg/m
Ｌのホスホグルコムターゼ、および５mg/mＬのグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの適量を採り、水を加
えて最終濃度が以下となるように、変換反応混合物を調
製した。 変換反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0） 100mＭ ＭｇＣｌ2 2mＭ Ｋ2ＨＰＯ4 5mＭ ＡＭＰ 0.1mＭ ジチオトレイトール 1mＭ グルコース−１，６−二リン酸 4μＭ ウシ血清アルブミン 0.01％ ＮＡＤＰ 0.2mＭ グリコーゲンホスホリラーゼ 20μg/mＬ ホスホグルコムターゼ 4μg/mＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 2μg/mＬ Ｈ2Ｏ −
【０１３２】１）クリーニング反応（ステップ１−クリ
ーニングオプション反応２） 206μＭのグリコーゲンを含有するグリコーゲン溶液を
調製し、12本のPyrex製分析管（岩城硝子製：10×57m
m）に分注し（０、20、40および80μＬを各３本）、蒸
留水を加えて全量を80μＬとした。室温にて、500μＬ
のクリーニング反応混合液（100mＭのトリス-ＨＣｌ
（ｐＨ8.0）；2mＭのＭｇＣｌ2；5mＭのＫ2ＨＰＯ4；0.
1mＭのＡＭＰ；20Ｕ/mＬのアルカリホスファターゼ；10
μg/mＬのグリコーゲンホスホリラーゼ）を各分析管に
加えた。この混合物を37℃で60分間インキュベートし
た。
ーニングオプション反応２） 206μＭのグリコーゲンを含有するグリコーゲン溶液を
調製し、12本のPyrex製分析管（岩城硝子製：10×57m
m）に分注し（０、20、40および80μＬを各３本）、蒸
留水を加えて全量を80μＬとした。室温にて、500μＬ
のクリーニング反応混合液（100mＭのトリス-ＨＣｌ
（ｐＨ8.0）；2mＭのＭｇＣｌ2；5mＭのＫ2ＨＰＯ4；0.
1mＭのＡＭＰ；20Ｕ/mＬのアルカリホスファターゼ；10
μg/mＬのグリコーゲンホスホリラーゼ）を各分析管に
加えた。この混合物を37℃で60分間インキュベートし
た。
【０１３３】２）検出反応（ステップ３−検出反応１） クリーニング反応の各分析管に、変換反応混合物（100m
Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）；2mＭのＭｇＣｌ2；5m
ＭのＫ2ＨＰＯ4；0.1mＭのＡＭＰ；1mＭのジチオトレイ
トール；4μＭのグルコース−１，６−二リン酸；0.01
％のウシ血清アルブミン；0.2mＭのＮＡＤＰ；20μg/m
Ｌのグリコーゲンホスホリラーゼ；4μg/mＬのホスホグ
ルコムターゼ；2μg/mＬのグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ）500μＬを添加した。37℃で30分間イン
キュベーションした。各分析管につき励起波長340nmに
おける460nmの蛍光波長を測定した。その結果、グリコ
ーゲン溶液中のグリコーゲンがすべてクリーニング反応
により消失していることを確認した。
Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）；2mＭのＭｇＣｌ2；5m
ＭのＫ2ＨＰＯ4；0.1mＭのＡＭＰ；1mＭのジチオトレイ
トール；4μＭのグルコース−１，６−二リン酸；0.01
％のウシ血清アルブミン；0.2mＭのＮＡＤＰ；20μg/m
Ｌのグリコーゲンホスホリラーゼ；4μg/mＬのホスホグ
ルコムターゼ；2μg/mＬのグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ）500μＬを添加した。37℃で30分間イン
キュベーションした。各分析管につき励起波長340nmに
おける460nmの蛍光波長を測定した。その結果、グリコ
ーゲン溶液中のグリコーゲンがすべてクリーニング反応
により消失していることを確認した。
【０１３４】実施例４ キレート剤による白濁防止効果 実施例２のサイクル反応後の分析管に、ＥＤＴＡを含ま
ない検出反応混合物(100mＭのトリス-ＨＣl、ｐＨ8.0；
0.6mＭのＮＡＤＰ+；１Ｕ/mＬのホスホグルコイソメラ
ーゼ；0.5Ｕ/mＬのグルコース-６-リン酸デヒドロゲー
ゼ)125μＬを添加し、90℃で30分間加熱し、酵素を失活
させた。試料液の白濁の程度を目視観察した。また、実
施例２で得られた検出反応混合物添加溶液(ＥＤＴＡ-室
温で酵素を失活させたもの)を対照とした。その結果、
加熱失活の場合は試料溶液が白濁したのに対し、ＥＤＴ
Ａを用いた場合は、試料溶液は澄明であった。
ない検出反応混合物(100mＭのトリス-ＨＣl、ｐＨ8.0；
0.6mＭのＮＡＤＰ+；１Ｕ/mＬのホスホグルコイソメラ
ーゼ；0.5Ｕ/mＬのグルコース-６-リン酸デヒドロゲー
ゼ)125μＬを添加し、90℃で30分間加熱し、酵素を失活
させた。試料液の白濁の程度を目視観察した。また、実
施例２で得られた検出反応混合物添加溶液(ＥＤＴＡ-室
温で酵素を失活させたもの)を対照とした。その結果、
加熱失活の場合は試料溶液が白濁したのに対し、ＥＤＴ
Ａを用いた場合は、試料溶液は澄明であった。
【図１】 ＡＴＰの標準試料におけるインキュベーショ
ン時間に対する蛍光光度測定値を示すグラフである。
ン時間に対する蛍光光度測定値を示すグラフである。
【図２】 ｃＡＭＰの標準試料の濃度に対する蛍光光度
測定値を示すグラフである。
測定値を示すグラフである。
【図３】 本発明の方法、免疫比色法および放射免疫測
定法を用いてｃＡＭＰ値を比較測定した結果を示す棒グ
ラフである。
定法を用いてｃＡＭＰ値を比較測定した結果を示す棒グ
ラフである。
【図４】 本発明の方法、放射免疫測定法およびSalomo
n法を用いてアデニル酸シクラーゼ活性を比較測定した
結果を示す棒グラフである。
n法を用いてアデニル酸シクラーゼ活性を比較測定した
結果を示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/52 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (20)
- 【請求項１】 生物学的試料中の内因性ＡＴＰ、ＡＤＰ
およびＡＭＰからなる非環状アデニンヌクレオチド類お
よび内因性グルコース-６-リン酸をより迅速に除去する
方法であって、生物学的試料を非環状アデニンヌクレオ
チド類およびグルコース-６-リン酸を除去するのに効果
的な量のアピラーゼ、アルカリホスファターゼおよびア
デノシンデアミナーゼを用いて処理することを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 生物学的試料中のｃＡＭＰ量またはアデ
ニル酸シクラーゼ活性の測定方法であって、 クリーニング反応：生物学的試料を内因性ＡＴＰ、ＡＤ
ＰおよびＡＭＰからなる非環状アデニンヌクレオチド類
およびグルコース-６-リン酸を除去するのに効果的な量
のアピラーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼを用いて処理する工程、 変換反応：生物学的試料中のｃＡＭＰをＡＭＰに酵素的
に変換する工程、 検出反応：放射性試薬を用いることなくＡＭＰ量を測定
する工程、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３】 上記クリーニング反応において、上記試
料にさらに、有効量のグルコースオキシダーゼ、グリコ
ーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼを
加えて処理し、上記試料から内因性グリコーゲンを酵素
的に除去することを含む、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 上記変換反応が上記試料を有効量のホス
ホジエステラーゼによる処理により行われる、請求項２
記載の方法。 - 【請求項５】 ｃＡＭＰからＡＭＰへの上記変換反応の
酵素がｃＡＭＰを変換させた後にキレート剤により不活
性化される、請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 キレート剤がＥＤＴＡである、請求項５
記載の方法。 - 【請求項７】 上記検出反応が、上記試料に添加された
グリコーゲン及び無機リン酸の存在下、グリコーゲンホ
スホリラーゼと接触させて、グルコース-１-リン酸に変
換されることを含み、そしてこの変換が上記ＡＭＰによ
ってin vitroで活性化されるものである、請求項２記載
の方法。 - 【請求項８】 上記検出反応において、さらに、グルコ
ース-１-リン酸をグルコース-６-リン酸に変換させるの
に有効な量のホスホグルコムターゼで上記試料を処理
し、ついでグルコース−６−リン酸を６-ホスホグルコ
ノラクトンに変換するのに有効な量のグルコース-６-リ
ン酸デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＰ+で上記試料を処
理することによって、グルコース-１-リン酸を６-ホス
ホグルコノラクトンおよびＮＡＤＰＨに変換する、請求
項７記載の方法。 - 【請求項９】 上記検出反応において、さらに、上記試
料を水の存在下で加熱して、６-ホスホグルコノラクト
ンを６-ホスホグルコン酸に変換し、ついでこの６-ホス
ホグルコン酸をリブロース-５-リン酸およびＮＡＤＰＨ
に変換するのに有効な量のＮＡＤＰ+を添加することを
含む、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 生物学的試料中のｃＡＭＰ量またはア
デニル酸シクラーゼ活性の測定方法であって、 クリーニング反応：生物学的試料を、上記試料中のｃＡ
ＭＰ以外の内因性非環状アデニンヌクレオチド類、およ
び内因性グルコース-６-リン酸を酵素的に除去するのに
有効な量のアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよび
アルカリホスファターゼで処理する工程、 変換反応：生物学的試料中のｃＡＭＰをＡＴＰに酵素的
に変換する工程、 検出反応：ＡＴＰをフルクトース-６-リン酸に酵素的に
変換し、フルクトース-６-リン酸を６-ホスホグルコノ
ラクトンおよびＮＡＤＰＨに酵素的に変換後、放射性物
質を用いずにＮＡＤＰＨ濃度を測定する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 上記クリーニング反応において、さら
に、上記試料を有効量のグルコースオキシダーゼ、グリ
コーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼ
で処理し、上記試料から内因性グリコーゲンを酵素的に
除去することを含む、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 上記検出反応において、フルクトース
-６-リン酸を６-ホスホグルコノラクトンおよびＮＡＤ
ＰＨに酵素的に変換後、さらに、引き続き反応混合物を
加熱し、そして上記反応混合物に６-ホスホグルコン酸
デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＰ+を添加することによ
って上記６-ホスホグルコノラクトンをリブロース-５-
リン酸およびＮＡＤＰＨに変換することを含む、請求項
１０または１１記載の方法。 - 【請求項１３】 上記クリーニング反応のｃＡＭＰ以外
の内因性非環状アデニンヌクレオチド類が、ＡＴＰ、Ａ
ＤＰ、ＡＭＰの１種またはそれ以上の混合物である、請
求項１０記載の方法。 - 【請求項１４】 上記変換反応において、ｃＡＭＰから
ＡＴＰの変換が有効量のホスホジエステラーゼ、ミオキ
ナーゼおよびピルビン酸キナーゼの組み合わせで行われ
る、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１５】 上記検出反応において、ＡＴＰからフ
ルクトース-６-リン酸の変換がヘキソキナーゼおよびピ
ルビン酸キナーゼの組み合わせで行われる、請求項１０
記載の方法。 - 【請求項１６】 上記検出反応において、フルクトース
-６-リン酸から６-ホスホグルコノラクトンおよびＮＡ
ＤＰＨの変換がホスホグルコイソメラーゼおよびグルコ
ース-６-リン酸デヒドロゲナーゼの組み合わせで行われ
る、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１７】 上記検出反応において、ＡＴＰをフル
クトース−６−リン酸に変換する酵素が非環状アデニン
ヌクレオチド類の変換後にキレート剤により不活性化さ
れる、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１８】 キレート剤がＥＤＴＡである、請求項
１７記載の方法。 - 【請求項１９】 上記生物学的試料が、哺乳動物組織で
ある、請求項１、２または１０記載の方法。 - 【請求項２０】 上記生物学的試料が、生物学的液体で
ある請求項１、２または１０記載の方法。
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