CN110779887B - 一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，通过测定PGK催化BPG和ADP向3‑PG和ATP正向转化的速率。本发明的正向反应更加彻底，测定的线性范围更大，反应速率更快，测定时间更短，因此相对于测定逆向反应的方法，测定正向反应可以在更加微量的样本中检测PGK的活性，具有更大的实用价值。本方法最终产生ATP，因而可以偶联荧光素酶读取ATP产生的量来测定活性，从而适应多功能酶标仪荧光检测，可以扩大样本检测通量，降低检测限。适用于检测微量样本及高通量检测。
Description
技术领域
本发明属技术发明，涉及测定磷酸甘油酸激酶活性的方法学，尤其涉及在生物样本中测定磷酸甘油酸激酶活性的方法。
背景技术
在介绍背景技术前，先引入名词和名词缩写：PGK，Phosphoglycerate Kinase，磷酸甘油酸激酶；GAPDH，glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 3-磷酸甘油醛脱氢酶；BPG，1,3-bisphosphoglycerate, 1,3- 二磷酸甘油酸；3-PG, 3-phosphoglycerate,3-磷酸甘油酸；GA3-P，glyceraldehyde 3-phosphate, 3-磷酸甘油醛；ADP，adenosinediphosphate, 二磷酸腺苷；ATP, adenosine triphosphate，三磷酸腺苷；Pi, phosphoricacid，磷酸；NADH，Nicotinamide adenine dinucleotide，reduced, 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+，Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；Hepes：4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；Tris，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷；EDTA，Ethylenediaminetetraacetic acid ，乙二胺四乙酸；SDS，Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠；DTT，DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇。
磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate Kinase，PGK） (EC 2.7.2.3) 参与细胞内最重要的两条代谢途径，糖酵解和糖异生。PGK催化如下可逆的反应
1,3-二磷酸甘油酸 + ADP 
3-磷酸甘油酸 + ATP………（反应 1）
在绝大多数细胞内，PGK催化的反应是正向的，有利于糖酵解过程。但在肝脏、小肠上皮、肾脏髓质，PGK催化的反应可以是反向的，有利于糖异生。在人体中，PGK存在两种亚型，PGK1和PGK2，两者催化相同的反应。PGK1广泛表达在各个器官组织中，PGK2主要在生精细胞中。
有研究指出，PGK的表达和突变与疾病有关，如肿瘤内的PGK表达增高，以维持糖酵解，对肿瘤的发展有重要意义。也有报道PGK1缺失与慢性溶血性贫血（chronic hemolyticanemia）、精神障碍（mental disorders）、肌病（myopathy in humans）有关联。
糖酵解是动物、植物、微生物必需的一条代谢通路，因此PGK在生物中广泛表达。
现有的测定PGK活性的方法是酶偶联法，其原理如下：
3-磷酸甘油酸 + ATP 
1,3-二磷酸甘油酸 + ADP …………（单向反应2）
1,3-二磷酸甘油酸 + NADH 
NAD++ 3-磷酸甘油醛………（单向反应3）
目前市场上仅有一家公司将此方法制作成测定PGK的试剂盒。
然而此方法存在显著的弱点，其报告的酶活性是到目前为止，尚无测定此反应的正向反应的酶活性方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，是一种测定PGK催化BPG和ADP向3-PG和ATP方向转化速率的方法。
此方法通过以下两步反应完成：
（一）第一步反应：
3-磷酸甘油醛 + NAD+ + 磷酸 
1,3-二磷酸甘油酸+ NADH
………………（平衡反应式 4）
1.反应液：由缓冲体系、镁离子和磷酸根离子组成，其pH值在6.5-8.5之间。反应液成分如下：200 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲液，5 mM MgCl2, 5 mM Na2HPO4，pH7.4。
2.具体步骤：
（1）向石英比色杯中加入1 ml 反应缓冲液；
（2）依次加入10μL、100mM 3-磷酸甘油醛至终浓度1mM，5μL、200 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+ )至终浓度1mM；
（3）混匀溶液后，在紫外分管光度计上340 nm吸光度读数归零；
（4）再加入1 U（1个酶活力单位）的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)纯酶，持续记录A340吸光度；
（5）A340读数迅速上升，于数分钟后进入平台期（一分钟内即可平衡)，当A340读数稳定，此时第一步反应达到平衡；
（6）本反应在pH 6.5-pH 8.5 均能正常进行；
（7）本反应在25℃-37℃温度范围内均能正常测定。
（二）第二步反应：
1.第一步反应达到平衡后，加入终浓度2 mM 二磷酸腺苷（ADP）和待测样本（含有PGK酶），此时会发生以下反应：
1,3-二磷酸甘油酸+ ADP 
3-磷酸甘油酸+ATP ………（单向反应 5）
1．分光光度法检测具体步骤：
（1）第一步反应（平衡反应式 4）达到平衡后，加入三磷酸腺苷(ADP)至终浓度2mM，混匀；
（2）加入待测生物样品；
（3）记录A340变化值；
（4）由于1,3-二磷酸甘油酸消耗立即打破第一步的化学平衡，第一步反应底物3-磷酸甘油醛和NAD就会立即向产物1,3-二磷酸甘油酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)转化，NADH的生成可在340 nm吸光度处检测。
2.荧光法检测步骤：
上面所述的方法是根据监测反应产生的产物之一（NADH）来测定PGK的酶活，PGK催化产生的另一个产物ATP还可以通过另一个方法测定，即荧光素酶偶联的方法。荧光素酶催化的反应底物之一是ATP，因此可以通过荧光素酶检测产生ATP的速率，也能检测PGK的酶活。
（1）第一步反应（平衡反应式 4）达到平衡后，加入ADP至终浓度2 mM，混匀；
（2）加以上混合物至96孔微孔板中，每孔50μL；
（3）每孔加入50μL待测样品：
（4）加入50μL 发光溶液，含荧光素酶1μg/mL、荧光素1μg/mL；
（5）于多功能酶标仪检测化学发光强度；
（6）同步设置PGK酶活性标准曲线；
（7）计算样品中PGK活性。
（三）总体反应的计算
根据单向反应的反应式4和单向反应的反应式5，可以得出以下等式：
产生的ATP分子数（NATP） = 消耗的3-PG分子数（NBPG）,
产生的3-PG分子数（N3PG） = 消耗的BPG分子数（NBPG）,
消耗的BPG分子数（NBPG） = 消耗的GA3P分子数（NGA3P）,
消耗的GA3P分子数（NGA3P） = 消耗的NAD+分子数（NNAD）,
消耗的NAD+分子数（NNAD） = 产生的NADH分子数（NNADH）
因此, NADH 的产生速率 = PGK催化 BPG (或 ADP + Pi) 转化成 3PG (或 ATP)的速率。注意, 此处 NADH 产生速率指加入PGK后的速率。
NADH的产生速率（RNADH）则可以通过其摩尔吸光系数（Molar AbsorptionCoefficient，ε=6.22 x 103 L×mol-1×cm-1）及A340变化值计算获得，V代表反应体积。
因此，PGK的初速度可以被准确测定，根据其初速度就可以计算PGK的酶学活性。
以上方法的原理可以图1表示。
本发明的另一个目的是提供所述方法在生物样本中测定磷酸甘油酸激酶活性中的应用，生物样本通过分光光度法测定PGK活性，最低检测酶活性为2.5x10-3U单位，极微量生物样本通过荧光法检测，最低检测酶活性为10-7U单位。本发明方法能测定PGK催化的正向反应生物速率，即测定磷酸甘油酸激酶催化 BPG 和 ADP向3-PG 和 ATP方向的反应速率。
1.所述生物样本是含有PGK酶的生物制品、组织液、血浆、血清、细胞裂解液，组织裂解液，细胞和组织培养液。
2.所述生物样本来源于动物、植物、微生物。
3.根据Michaelis-Menten方程，通过在不同的底物浓度下检测酶学活性可测定其Km值等酶学参数。
4.常规生物样本可通过分光光度法来测定PGK活性，最低可检测2.5x10-3U酶活性；
5.极微量样本可以通过荧光法检测检测，最低检测限至10-7U单位酶活性。极微量指的是低于2.5x10-3U但高于10-7U的酶活量；
6.目前市场上有检测PGK酶催化的反向酶活的试剂盒，尚无检测该酶正向反应酶活的试剂盒。所述方法可用于测定生物样本中PGK酶学活性试剂盒制作。
本发明提供了一种测定PGK催化BPG和ADP向3-PG和ATP转化速率的方法。本发明方法测定正向反应的优势在于：（1）正向反应是生理上最普遍的反应，正向反应自由能为-20～-16 kJ/mol，平衡常数为637-3204，因此正向反应更加彻底，测定的线性范围更大，反应速率更快，测定时间更短，因此相对于测定逆向反应的方法，测定正向反应可以在更加微量的样本中检测PGK的活性，具有更大的实用价值。（2）本方法基础方法较已有方法的检测限更低。（3）本方法最终产生ATP，因而可以偶联荧光素酶读取ATP产生的量来测定活性，从而适应多功能酶标仪荧光检测，可以扩大样本检测通量，降低检测限。本发明方法适用于检测微量样本及高通量检测。
附图说明
图1是测定PGK正向反应速率的原理图。
图2是不同pH条件下测定酵母PGK酶活。箭头表示加入ADP及PGK纯酶（每个反应加入相同量的PGK）的时间点。左图是在不同pH条件下，加入同样量的PGK，斜率不同，代表所测得的酶活力不同。右图是计算得到的不同pH条件下所测得的PGK酶活大小。
图3是分光光度计检测PGK酶活性的范围。
图4是PGK酶在正反方向上具有不同的催化活性。
图5是测定动物心脏、肝脏、肺、肌肉、脑组织（来源C57小鼠）、植物（豌豆种子）、及细菌（大肠杆菌）中的PGK酶活性。
图6是偶联荧光素酶测定ATP来检测PGK的酶活。左图为实际测得的值的双对数作图，右图为实际测得值的线性图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，是一种测定PGK催化BPG和ADP向3-PG和ATP方向转化速率的方法。
此方法通过以下两步反应完成：
（一）第一步反应：
3-磷酸甘油醛 + NAD+ + 磷酸
1,3-二磷酸甘油酸+ NADH
………………（平衡反应式 4）
1.反应液：本方法反应液必须含有提供足够缓冲能力的缓冲体系、镁离子和磷酸根离子，其pH值在6.5-8.5之间。典型的反应液及本说明书实施例中使用的反应液成分如下：200 mM Hepes，5 mM MgCl2, 5 mM Na2HPO4，pH 7.4。
2.具体步骤：
（1）向石英比色杯中加入1 ml 反应缓冲液；
（2）依次加入10 μL 100 mM 3-磷酸甘油醛至终浓度1 mM、 5 μL 200 mM NAD+至终浓度1 mM；
（3）混匀溶液后，在紫外分管光度计上340 nm吸光度读数归零；
（4）再加入1 U（1个酶活力单位）的GAPDH纯酶，持续记录A340吸光度；
（5）A340读数迅速上升，于1分钟后进入平台期，此时A340读数稳定，即第一步反应达到平衡；
（6）本反应在pH 6.5-pH 8.5 均能正常进行；
（7）本反应在25℃-37℃温度范围内均能正常测定。
（二）第二步反应：
第一步反应达到平衡后，加入终浓度2 mM 二磷酸腺苷（ADP）和待测样本（含有PGK酶），此时会发生以下反应：
1,3-二磷酸甘油酸+ ADP 
3-磷酸甘油酸+ATP ………（单向反应 5）
1．分光光度法检测具体步骤：
（1）第一步反应（平衡反应式 4）达到平衡后，加入ADP至终浓度2 mM，混匀；
（2）加入待测样品；
（3）记录A340变化值；
（4）由于1,3-二磷酸甘油酸消耗立即打破第一步的化学平衡，第一步反应底物3-磷酸甘油醛和NAD就会立即向产物1,3-二磷酸甘油酸和NADH转化，NADH的生成可在340 nm吸光度处检测。
2.荧光法检测步骤：
上面所述的方法是根据监测反应产生的产物之一（NADH）来测定PGK的酶活，PGK催化产生的另一个产物ATP还可以通过另一个方法测定，即荧光素酶偶联的方法。荧光素酶催化的反应底物之一是ATP，因此可以通过荧光素酶检测产生ATP的速率，也能检测PGK的酶活。
（1）第一步反应（平衡反应式 4）达到平衡后，加入ADP至终浓度2 mM，混匀；
（2）加以上混合物至96孔微孔板中，每孔50μL；
（3）每孔加入50μL待测样品：
（4）加入50μL 发光溶液，含荧光素酶1μg/mL、荧光素1μg/mL；
（5）于多功能酶标仪检测化学发光强度；
（6）同步设置PGK酶活性标准曲线；
（7）计算样品中PGK活性。
（三）总体反应的计算
根据单向反应反应式4和单向反应反应式5，可以得出以下等式：
产生的ATP分子数（NATP）= 消耗的3-PG分子数（NBPG），
产生的3-PG分子数（N3PG）= 消耗的BPG分子数（NBPG），
消耗的BPG分子数（NBPG） = 消耗的GA3P分子数（NGA3P），
消耗的GA3P分子数（NGA3P）= 消耗的NAD+分子数（NNAD），
消耗的NAD+分子数（NNAD）= 产生的NADH分子数（NNADH），
因此, NADH 的产生速率 = PGK催化 BPG (或 ADP + Pi) 转化成 3PG (或 ATP)的速率。注意, 此处 NADH 产生速率指加入PGK后的速率.
NADH的产生速率（RNADH）则可以通过其摩尔吸光系数（Molar AbsorptionCoefficient，ε=6.22 x 103 L×mol-1×cm-1）及A340变化值计算获得，V代表反应体积。
因此，PGK的初速度可以被准确测定，根据其初速度就可以计算PGK的酶学活性。
以上方法的原理可以图1表示。
实施例2：在Hepes缓冲中下测定PGK酶活性
配制200 mM Hepes 缓冲液(200 mM Hepes，5mM MgCl2, 5 mM Na2HPO4，pH 7.4)，将1ml该缓冲液加入比色杯，然后加入GA3P 及NAD各1 mM，在分光光度计将A340读数归零；再加入1 U（1个酶活力单位，1个酶活力单位等于每分钟转化1微摩尔底物的酶量，在这里，底物为GA3P或者NAD）的GAPDH酶，340 nm读数快速上升，在平衡时，加入2 mM ADP及PGK，在分光光度计中记录340 nm读数。不同pH条件下，测得的PGK酶活力不同，见图2 。根据340 nm读数的斜率，可计算酶活性。以1ml的反应体积计算，其中的PGK酶活力含量为（其中E为计算得到的酶活力，单位为U，S为A340在加入PGK后的稳定斜率）：E=S/6.22。
实施例3：测定生物样品中PGK1酶的Km值
使用实施例1中的Hepes缓冲液（pH 7.4）及不同浓度的反应物浓度，我们测定了酵母来源纯酶（购于sigma，货号P7634）以及人宫颈癌细胞HeLa中BPG的Km值。结果如下（单位为μM）：4.38±0.26（酵母来源），8.75±0.45（HeLa细胞）。
实施例4：测定方法的灵敏度
使用实施例1中的Hepes缓冲液（pH 7.4）及相同的反应物浓度，加入不同的PGK酶浓度，记录A340读数斜率，结果如图3，表明1 ml的反应体积中能准确检测0.0025 U的PGK酶活，在0.0025 U-0.1 U范围内斜率具有良好的线性，表明在该范围内该方法具有较好的准确性。
实施例 5： PGK催化正、反方向的速率差异
使用pH 7.4的Hepes缓冲液，我们测定了酵母来源的PGK纯酶以及人宫颈癌细胞HeLa中的PGK酶活性。并按目前反向测定PGK酶活性的方法（2 mM 3PG，2 mM ATP为底物，偶联1 U/ml GAPDH，0.1 mM NADH），同时测定PGK的正向及反向酶活，发现PGK正向活性约为反向活性的3倍，见图4。
实施例6 测定动物组织中的PGK酶活性
取C57小鼠，断颈处死后，取肝、心脏、脑、肌肉、肺各0.1 g左右，加入裂解液M-PER（Thermo Scientific）0.5 ml，眼科剪剪碎，匀浆器研磨均匀，再12000 g于4℃离心10分钟，取上清测定其中的PGK酶活（方法如实施例1，缓冲液pH=7.4）及蛋白浓度，结果见图5。
实施例 7 植物组织
我们选择豌豆的新鲜种子（去掉种皮），取0.1 g，加入0.5 ml裂解液（125 mMTris-HCl，pH 8.0, 375 mM NaCl，2.5 mM EDTA，1 % SDS，1 % β-巯基乙醇），冰上充分研磨，再12000 g于4℃离心10 min，取上清测定其中PGK酶活（方法如实施例1，缓冲液pH=7.4）及蛋白浓度，结果见图5。
实施例 8 大肠杆菌
我们选择大肠杆菌的一种感受态细胞DH5α，3000g离心收集2ml菌液沉淀，PBS重悬离心两次，最后用0.5ml PBS重悬，再加入250 mM KCl，10 mM DTT，置于冰上，超声5秒，静置5秒，循环10次。再将产物12000 g于4 ℃离心10分钟，取上清测定其中的PGK酶活性（方法如实施例1，缓冲液pH=7.4）及蛋白浓度，结果如图5。
实施例9：通过偶联荧光素酶测定ATP来检测PGK的酶活性
方法如下：
1.缓冲溶液（200 mM HEPES， 5 mM MgCl2，5 mM Na2HPO4, pH 7.4）中加入1 mMNAD+， 1 mM GA3P，2 mM ADP，1 U/mL GAPDH。室温反应5分钟，使反应平衡；
2.取50 μL 加入到白色96孔微孔板中，再加入50 μL PGK溶液，混匀；
3.加入50 μL荧光素酶检测系统（同样的buffer，含荧光素酶1 μg/mL，荧光素1 μg/mL）。
4.多功能酶标仪检测化学发光。结果如图6，左图为实际测得的值的双对数作图，右图为实际测得值的线性图。说明此方法可以检测10-7-10-3单位活性的PGK酶, 线性范围10-7-10-4单位活性。
Claims (3)
1.一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）第一步反应：向石英比色杯中加入1 ml 反应缓冲液，再依次加入10μL、100mM 3-磷酸甘油醛至终浓度1mM，5μL、200 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸至终浓度1mM，混匀溶液后，在紫外分光光度计上340 nm吸光度读数归零，再加入1 个酶活力单位的3-磷酸甘油醛脱氢酶，持续记录A340吸光度，A340读数迅速上升，当A340读数稳定时，反应达到平衡；反应在pH 6.5-pH 8.5进行, 反应温度在25℃-37℃；
（2）第二步反应：第一步反应达到平衡后，加入终浓度2 mM 二磷酸腺苷和待测生物样本，此时会发生单向反应 5：
（3）分光光度法检测：在第二步反应的同时，记录A340变化值，在340 nm吸光度处检测；
（4）荧光法检测：
在第一步反应达到平衡后，加入二磷酸腺苷至终浓度2 mM，混匀，将混合物加至96孔微孔板中，每孔50μL，再每孔加入50μL待测生物样本，每孔加入50μL 发光溶液，然后置于多功能酶标仪检测化学发光强度，同步设置PGK酶活性标准曲线，计算样品中PGK活性；发光溶液由荧光素酶1μg/mL、荧光素1μg/mL组成；
（5）酶学活性测定：
NADH的产生速率（RNADH）通过其摩尔吸光系数，ε=6.22×103 L×mol-1×cm-1，及A340变化值△A340计算获得，测定磷酸甘油酸激酶的初速度，根据PGK初速度计算PGK的酶学活性：
其中V代表反应体积；△T代表反应时间；
生物样本通过分光光度法测定PGK活性，最低检测酶活性为2.5x10-3U单位，极微量生物样本通过荧光法检测，最低检测酶活性为10-7U单位；
所述方法测定PGK催化的正向反应生物速率，测定磷酸甘油酸激酶催化 BPG 和 ADP向3-PG 和 ATP方向的反应速率。
2.根据权利要求1所述的一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，所述生物样本是含有PGK酶的生物制品、组织液、血浆、血清、细胞裂解液、组织裂解液、细胞或组织培养液。
3.根据权利要求2所述的一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，所述生物样本来源于动物、植物、微生物。
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