RU2654672C1 - Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата - Google Patents

Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата Download PDF

Info

Publication number
RU2654672C1
RU2654672C1 RU2017121916A RU2017121916A RU2654672C1 RU 2654672 C1 RU2654672 C1 RU 2654672C1 RU 2017121916 A RU2017121916 A RU 2017121916A RU 2017121916 A RU2017121916 A RU 2017121916A RU 2654672 C1 RU2654672 C1 RU 2654672C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
reagents
immobilized
luciferin
gelatin
gel
Prior art date
Application number
RU2017121916A
Other languages
English (en)
Inventor
Мария Александровна Кириллова
Елена Николаевна Есимбекова
Валентина Александровна Кратасюк
Original Assignee
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет" filed Critical Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет"
Priority to RU2017121916A priority Critical patent/RU2654672C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2654672C1 publication Critical patent/RU2654672C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Предложен комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата (АТР). Комплекс включает люциферин и ферментный препарат. Ферментный препарат содержит люциферазу светляков, буферный раствор, стабилизирующие добавки дитиотриетол и бычий сывороточный альбумин. Причём доза каждого из реагентов для одного количественного анализа отдельно иммобилизирована. Так ферментный препарат иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении люциферазы светляков и желатина от 1:50 до 1:90, а люциферин иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении от 1:15 до 1:50 или в крахмальный гель при количественном соотношении от 1:40 до 1:150. Изобретение обеспечивает повышение стабильности реагентов для определения АТР при хранении и использовании, а также упрощение процедуры приготовления реагента. 3 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, в частности к веществам, которые могут использоваться в качестве реагента - биологического модуля - в биолюминометрах и устройствах типа «биосенсор» для определения количества микробного загрязнения объектов окружающей среды, продуктов питания и др.
Принцип работы биосенсоров для анализов микробных загрязнений основан на количественном определении молекул аденозин-5'-трифосфата (АТР), концентрация которых пропорциональна количеству КОЕ (колониеобразующих единиц) в образце.
В настоящее время для анализов микробного загрязнения окружающей среды применяют реагенты ферментов, иммобилизированные на высокомолекулярных носителях физическими и химическими способами.
Известен аналогичный реагент, используемый в качестве биомодуля, для анализа химической токсичности различных сред, включающий дозировано иммобилизированные в гель люциферазу, НАДН : ФМН - оксидоредуктазу, миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид (НАДН), дитиотриетол (ДТТ) [Патент на изобретение RU 2413772 «Биолюминесцентный биомодуль для анализа токсичности различных сред и способ его приготовления», опубл. 10.03.2011]. Известный реагент предназначен для оценки химического загрязнения образцов различными веществами и не пригоден для анализа микробного загрязнения.
Прототипом изобретения является реагент для определения аденозин-5'-трифосфата [Патент RU 2164241 Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, МПК C12Q 1/66, C12N 11/12, опубл. 20.03.2001], предназначенный для количественного определения АТР и включающий люциферазу светляков, иммобилизированную на полисахаридном носителе, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с ДТТ в качестве стабилизатора, а также дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина (БСА) и трегалозы и воду.
Недостатком прототипа является снижение эргономичности количественного анализа, обусловленное необходимостью разведения реагента специализированным буферным раствором, а также недостаточно высокая стабильность реагента при комнатной температуре, что создает неудобства при работе: необходимо специальное охлаждение и периодическая проверка калибровочного графика - зависимости интенсивности свечения от концентрации АТР. Кроме того, при получении реагента используют дорогостоящий носитель, а в качестве одного из стабилизаторов используют высокие концентрации трегалозы.
Технической проблемой изобретения является повышение эргономичности количественного анализа посредством получения комплекса дозированных реагентов, предназначенных для проведения одного количественного анализа, повышения стабильности реагентов для определения АТР при хранении и использовании, упрощения процедуры приготовления реагента, а также снижение его стоимости.
Сущность изобретения заключается в том, что в комплексе реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата, состоящего из двух реагентов - люциферина в качестве субстрата и ферментного препарата, содержащего люциферазу светляков, буферный раствор, стабилизирующие добавки дитиотриетол и бычий сывороточный альбумин, согласно изобретению каждый из реагентов - ферментный препарат и люциферин, отдельно иммобилизированы на высокомолекулярном носителе. Ферментный препарат иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении люциферазы светляков и желатина от 1:50 до 1:90. Люциферин иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении от 1:15 до 1:50 или в крахмальный гель при количественном соотношении от 1:40 до 1:150. Доза каждого из реагентов для одного количественного анализа отдельно иммобилизирована на автономном носителе с возможностью образования его твердой формы - стеклообразного состояния высокомолекулярного соединения - желатина или крахмала.
Техническим результатом изобретения является получение комплекса автономно дозированных реагентов, предназначенных для проведения одного количественного анализа, повышение стабильности реагентов для определения АТР при хранении и использовании, упрощение процедуры приготовления реагента, что способствует повышению эргономичности процесса.
Техническим результатом изобретения также является снижение стоимости комплекса реагентов за счет использования в качестве носителя дешевых высокомолекулярных соединений - желатина и крахмала.
Количественный анализ АТР проводят следующим образом. Готовят комплекс реагентов. Дозу каждого из реагентов иммобилизируют известным способом в высокомолекулярный носитель - гель при помощи известного оборудования, например автоматического дозатора. Ферментный препарат, состоящий из люциферазы светляков, буферного раствора и стабилизирующих добавок дитиотриетола и бычьего сывороточного альбумина, дозируют и иммобилизируют в желатиновый гель при количественном соотношении люциферазы светляков и желатина в одном реагенте от 1:50 до 1:90.
Люциферин дозируют и иммобилизируют в желатиновый гель при количественном соотношении от 1:15 до 1:50 или в крахмальный гель при количественном соотношении от 1:40 до 1:150.
Доза каждого из реагентов представляет собой количество, достаточное и необходимое для выполнения одного количественного анализа исследуемого вещества в образце с минимальным содержанием АТР - не менее 1×10-13 М.
Дозирование реагентов, например по 25 мкл, проводят на гидрофобную подложку. Высушивание до образования твердой формы каждой дозы реагента проводят при нормальных условиях без использования вакуумного испарителя. Высушенные реагенты представляют собой тонкие прозрачные дискообразные пленки - «диски». Диски отделяют от подложки и используют для анализа.
Выполняют количественный анализ исследуемого вещества следующим образом. В кювету биолюминометра помещают один иммобилизированный реагент (диск), содержащий 4,2 мкг люциферазы светляков (активность 5,5⋅1012 усл.ед./мг), 0,5 мМ ДТТ, 0,3 мг/мл БСА, а также один иммобилизированный реагент (диск), содержащий 2,5 мМ люциферина, 1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор рН 7,8, содержащий 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния. Кювету помещают в биолюминометр и регистрируют Iфон. Через 1 час добавляют 20 мкл раствора АТР и регистрируют максимальную интенсивность свечения.
Изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг. 1 представлена зависимость интенсивности свечения иммобилизированной люциферазы от концентрации АТР. Фиг. 2 иллюстрирует зависимость относительной интенсивности свечения биолюминесцентной системы светляков от концентрации люциферина, иммобилизированного в крахмальный или желатиновый гель. На фиг. 3 представлена зависимость интенсивности свечения биолюминесцентной системы светляков от концентрации АТР при различных концентрациях люциферина, иммобилизированного в желатиновый гель.
Изобретение поясняется примерами, которые не несут ограничительный характер.
Пример 1.
Реагент на основе люциферазы готовят следующим способом: 0,245 г желатина помещают в 11 мл трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния, оставляют на 30 минут, затем полученную смесь нагревают до 80°С при постоянном перемешивании и охлаждают до 25°С. К 408 мкл полученного геля вносят 6,2 мкл раствора люциферазы светляков, содержащего 0,17 мг фермента (активность фермента 5,5⋅1012 усл.ед./мг), 100 мкл 5 мМ ДТТ, 100 мкл 3 мг/мл БСА и 386 мкл буферного раствора. Перемешивают и дозируют полученную смесь по 25 мкл на гидрофобную подложку, высушивают при температуре 8°С в течение 24 часов, получают «диски».
Концентрация желатина в одном реагенте составляет 1%, люциферазы светляков - 4,2 мкг, ДТТ - 0,5 мМ, БСА - 0,3 мг/мл.
Определяют чувствительность реагента к АТР. Для измерения параметров свечения в пробе в кювету биолюминометра Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Германия) последовательно вносят реагент, 310 мкл трис-ацетатного буфера рН 7,8 и 20 мкл 2,2 мМ раствора люциферина. Выдерживают кювету при комнатной температуре (25°С) в течение 1 часа, затем кювету помещают в биолюминометр и измеряют интенсивность фонового свечения (Iфон). Затем биолюминесцентную реакцию инициируют добавлением 20 мкл раствора АТР. Смесь быстро перемешивают, помещают в кюветное отделение биолюминометра и регистрируют максимальную интенсивность свечения (I). Интенсивность свечения пропорциональна концентрации АТР в реакционной смеси (фиг. 1). Максимальная чувствительность реагента составляет 0,3 пМ АТР. Диапазон линейной зависимости составляет от 0,3 пМ до 3 нМ.
Пример 2.
а) Реагент на основе люциферина светляков с использованием крахмального геля готовят следующим образом: к 0,6 г крахмала добавляют 11 мл калий-фосфатного буфера рН 7,8, полученную суспензию кипятят в течение 3-х минут, затем охлаждают до 25°С. К 500 мкл полученного геля добавляют 500 мкл раствора люциферина разных концентраций, тщательно перемешивают и дозируют по 25 мкл на лавсановую пленку. Реагенты высушивают при 8°С в течение суток, получают «диски».
б) Реагент на основе люциферина светляков с использованием желатинового геля готовят следующим образом: к 0,2 г желатина добавляют 11 мл трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния, оставляют на 30 минут, затем полученную смесь нагревают до 80°С при постоянном перемешивании. Полученную смесь охлаждают до 25°С, затем к 500 мкл геля добавляют 500 мкл раствора люциферина, тщательно перемешивают и дозируют по 25 мкл на лавсановую пленку. Реагенты высушивают при 8°С в течение суток, получают «диски».
Активность реагентов проверяют путем добавления в кювету 4 мкл раствора люциферазы светляков, содержащего 4,2 мкг фермента (активность фермента 5,5⋅1012 усл.ед./мг), 1 реагент, содержащий люциферин, иммобилизированный в крахмальный или желатиновый гель, и 326 мкл 1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния. Кювету помещают в биолюминометр и регистрируют Iфон. Через 1 час добавляют 20 мкл 5⋅10-8 М раствора АТР и регистрируют максимальную интенсивность свечения.
На фиг.2 представлена зависимость относительной интенсивности свечения от концентрации люциферина, иммобилизированного в крахмальный или желатиновый гели. Интенсивность свечения возрастает с увеличением концентрации люциферина в иммобилизированном реагенте. При этом различий в активности биолюминесцентной системы в зависимости от природы геля не наблюдается. Так, при иммобилизации 2,5 мМ люциферина как в крахмальный, так и желатиновый гели интенсивность биолюминесцентной системы остается на уровне контроля.
Пример 3.
Реагент на основе люциферина светляков с использованием желатинового геля готовят способом, аналогичным примеру 2: к 0,2 г желатина добавляют 11 мл трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния, оставляют на 30 минут, затем полученную смесь нагревают до 80°С при постоянном перемешивании. Полученную смесь охлаждают до 25°С, затем к 500 мкл геля добавляют 500 мкл раствора люциферина различных концентраций, тщательно перемешивают и дозируют по 25 мкл на лавсановую пленку. Реагенты высушивают при 8°С в течение суток. Полученные реагенты («диски») содержат люциферин концентрации 0,625 мМ, 1,25 мМ, 2,5 мМ. Количественный анализ АТР проводят с использованием иммобилизированного в желатиновый гель люциферина. В кювету биолюминомерта помещают 1 реагент, содержащий люциферин, 4 мкл раствора люциферазы светляков, содержащего 4,2 мкг фермента (активность фермента 5,5⋅1012 усл.ед./мг) и 326 мкл 1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,002 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,01 М сульфата магния. Кювету помещают в биолюминометр и регистрируют Iфон. Через 1 час добавляют 20 мкл 5⋅10-8 М раствора АТР и регистрируют максимальную интенсивность свечения.
Фиг. 3 иллюстрирует зависимость интенсивности свечения биолюминесцентной системы светляков от концентрации АТР при различных концентрациях люциферина, иммобилизированного в желатиновый гель. Увеличение содержания люциферина в иммобилизированном реагенте приводит к увеличению интенсивности свечения, т.е. к увеличению чувствительности реагента к АТР. Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 0,3 пМ АТР и достигается при концентрации люциферина 2,5 мМ.

Claims (1)

  1. Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата, состоящий из двух реагентов - люциферина и ферментного препарата, содержащего люциферазу светляков, буферный раствор, стабилизирующие добавки дитиотриетол и бычий сывороточный альбумин, отличающийся тем, что доза каждого из реагентов для одного количественного анализа отдельно иммобилизирована на автономном высокомолекулярном носителе с возможностью образования его твердой формы, при этом ферментный препарат иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении люциферазы светляков и желатина от 1:50 до 1:90, люциферин иммобилизирован в желатиновый гель при количественном соотношении от 1:15 до 1:50 или в крахмальный гель при количественном соотношении от 1:40 до 1:150.
RU2017121916A 2017-06-21 2017-06-21 Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата RU2654672C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017121916A RU2654672C1 (ru) 2017-06-21 2017-06-21 Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017121916A RU2654672C1 (ru) 2017-06-21 2017-06-21 Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2654672C1 true RU2654672C1 (ru) 2018-05-21

Family

ID=62202344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017121916A RU2654672C1 (ru) 2017-06-21 2017-06-21 Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2654672C1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2164241C2 (ru) * 1999-04-22 2001-03-20 Дементьева Екатерина Игоревна Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2268943C2 (ru) * 2004-02-19 2006-01-27 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2268944C2 (ru) * 2004-02-11 2006-01-27 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2420594C2 (ru) * 2009-05-20 2011-06-10 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2164241C2 (ru) * 1999-04-22 2001-03-20 Дементьева Екатерина Игоревна Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2268944C2 (ru) * 2004-02-11 2006-01-27 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2268943C2 (ru) * 2004-02-19 2006-01-27 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата
RU2420594C2 (ru) * 2009-05-20 2011-06-10 Наталья Николаевна Угарова Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЛОМАКИНА Г.Ю., БЕЗРУКИХ А.Е., УГАРОВА Н.Н. Влияние желатины на свойства люциферазы Luciola mingrelica // Вестник Московского Университета, сер.2, химия, т.53, N1, 2012, стр.12-17. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cahn Biosensors
Okuma et al. Flow system for fish freshness determination based on double multi-enzyme reactor electrodes
Luong et al. The potential role of biosensors in the food and drink industries
Esimbekova et al. Bioluminescent enzymatic rapid assay of water integral toxicity
JP5718571B2 (ja) 生物発光検出によるピロリン酸塩の検出方法
Lonshakova-Mukina et al. Impact of enzyme stabilizers on the characteristics of biomodules for bioluminescent biosensors
Sahney et al. A comparative study of immobilization techniques for urease on glass-pH-electrode and its application in urea detection in blood serum
Ramos et al. Enhanced chemiluminescence biosensor for the determination of phenolic compounds and hydrogen peroxide
Akyilmaz et al. Sensitive determination of L-lysine with a new amperometric microbial biosensor based on Saccharomyces cerevisiae yeast cells
Esimbekova et al. Disk-shaped immobilized multicomponent reagent for bioluminescent analyses: correlation between activity and composition
Mieliauskiene et al. Amperometric determination of acetate with a tri-enzyme based sensor
Marazuela et al. Determination of choline-containing phospholipids in serum with a fiber-optic biosensor
RU2654672C1 (ru) Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата
JPS5948098A (ja) リパ−ゼの測定方法
Nanjyo et al. Rapid measurement of fish freshness indices by an amperometric flow-injection system with a 16-way switching valve and immobilized enzyme reactors
US4927752A (en) Support used in bioluminescent dosing of enzymes, substrates or enzymatic inhibitors
KR100866524B1 (ko) 형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 및 이를이용한 검출키트 및 방법
Şehitoğullari et al. Preparation of a potentiometric immobilized urease electrode and urea determination in serum
Michel et al. Luciferin incorporation in the structure of acrylic microspheres with subsequent confinement in a polymeric film: A new method to develop a controlled release-based biosensor for ATP, ADP and AMP
US4278761A (en) Enzyme assay and kit therefor
Lathika et al. Determination of urinary oxalate using banana oxalate oxidase: comparison with immobilized enzyme
GB2116709A (en) Detecting surface mildew
JP2009136205A (ja) 細胞内ａｔｐ測定方法
Green et al. Rapid assays based on immobilized bioluminescent enzymes and photographic detection of light-emission
JP2005304483A (ja) アルカリフォスファターゼ測定法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190622