KR100866524B1 - 형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 및 이를이용한 검출키트 및 방법 - Google Patents

형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 및 이를이용한 검출키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광염료(fluorophores)와 효소의 고정화를 위한 졸-겔(sol-gel) 조성물, 상기 졸-겔 조성물을 이용한 센싱막(sensing membranes), 상기 센싱막을 이용한 생물학적 검출키트, 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법에 관한 것으로서, 형광염료와 효소의 고정화를 위해 각각 최적의 졸-겔 조성물을 사용함으로써, 효소 고정화효율, 감도, 재현성, 장기 안정성 등의 특성이 우수한 센싱막을 대량으로 경제적으로 제조할 수 있으며, 상기 센싱막을 이용하여 글루코스, 락테이트, 타이라민은 물론 pH, 산소, 이산화탄소, 암모니아, 염소 등과 같은 형광염료와 효소를 이용하여 측정할 수 있는 모든 대상을 효율적으로 검출할 수 있다.
형광염료, 효소, 산화효소, 글루코스, 락테이트, 타이라민, 센싱막, 센서, 마이크로타이터 플레이트, GPTMS, APTMS, MTES

Description

형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법{Sol-gel compositions for the immobilization of fluorophores and enzymes, and detection kits and methods using the same}
도 1은 GA1(a), GA2(b) 및 GT(c) 졸-겔 상에 고정화된 GOD의 SEM 사진이고;
도 2는 트랜스듀서 GM1 또는 GM2 및 GOD를 위한 상이한 종류의 졸-겔을 갖는 GOD-고정화 센싱막에 대한 글루코스의 검량 곡선이며;
도 3은 0.0 및 1.0 g/ℓ의 글루코스에서 GOD-고정화 센싱막의 재현성을 보여주는 그래프이고;
도 4는 다양한 락테이트 농도에서 LOD-고정화 센싱막(GM2-GA2)의 반응을 보여주는 그래프이며;
도 5는 LOD-고정화 센싱막(GM2-GA2)에 대한 반응용액의 온도(a) 및 pH(b)의 영향을 보여주는 그래프이고;
도 6은 8 개월의 조작 및 저장 후 LOD-고정화 센싱막(GM2-GA2)의 장기 안정성을 보여주는 그래프이며;
도 7은 다양한 농도의 타이라민에서 TOD-고정화 센싱막((a) GM2-GA1, (b) GM2-GA2)의 응답을 보여주는 그래프이고;
도 8은 TOD-고정화 센싱막(GM2-GA1 및 GM2-GA2)에 대한 온도(a) 및 pH(b)의 영향을 보여주는 그래프이며;
도 9는 TOD-고정화 센싱막((a) GM2-GA1, (b) GM2-GA2)의 장기 안정성을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔(sol-gel) 조성물, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 루테늄 복합체(ruthenium complexes)와 같은 형광염료와 글루코스 옥시다제, 락토스 옥시다제, 타이라민 옥시다제와 같은 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 상기 졸-겔 조성물을 이용한 센싱막(sensing membranes), 상기 센싱막을 이용한 생물학적 검출키트, 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법에 관한 것이다.
마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)는 초고속 검출(HTS, High-Throughput Screening), 효소-면역측정 분석이나 독성 시험에 널리 사용되어왔다. 마이크로타이터 플레이트는 소량의 샘플과 많은 수의 샘플을 동시에 측정할 수 있는 장점을 가지고 있다. 많은 수의 샘플을 동시에 측정하기 때문에 흡광도나 형광의 변화를 빠르게 검출할 수 있는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)는 많은 분야에서 널리 사용되기 시작하였다. 더욱이, 마이크로플레이트 리더는 효소활성 측정이나 세포의 호흡뿐만 아니라, 생물- 및 화학발광 복합된 정량적인 측정과 같은 다른 기능에도 적용되어 왔다. 마이크로타이터 플레이트에서, 효소나 대사물과 단백질과 같은 분석물(analytes)은 액체 배지나 웰 바닥의 얇은 층에 일부 지시제(indicators)와 함께 결합될 수 있다. 선택된 표적 상의 그들의 결합은 분석물의 실체와 농도와 관련되는 발산되는 빛의 정량적 평가를 가능하게 한다.
많은 화학적, 물리적 방법이 지지 물질에 효소 또는 분석물을 결합시키는데 사용되어왔다. 이러한 방법 중, 기능화된 담체에 대한 효소 또는 분석물의 공유결합이나 생분자간 가교결합을 포함하는 몇가지 화학적 고정화 방법이 센싱막의 제조에 널리 사용되고 있다. 다양한 고정화 방법 중 지지 물질에 분석물과 효소를 캡슐화하는 졸-겔 기술이 화학적으로 불활성이고 물리적으로 안정하며 투과성 물질이기 때문에 폭넓게 사용되어왔다. 지금까지 많은 졸-겔 시스템이 효소 또는 기타 생분자의 고정화를 위해 개발되었다. 특히, 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS; 3-glycidoxypropyl-trimethoxysilane), 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS; aminopropyl-trimethoxysilane), 및 메틸-트리에톡시실란(MTES; methyltriethoxy-silane)은 불활성 화학물질이면서 물리적으로 안정하며 광학적 특성 때문에 형광 지시제의 지지 물질로 자주 사용되어왔다. 아래 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 졸-겔 GPTMS의 에폭시 그룹과 효소의 아민 그룹의 공유결합은 센싱막의 안정성을 장시간 지속시키는데 도움을 준다.
Figure 112007038023760-pat00001
그러나 지금까지 졸-겔 시스템의 특성과 고정화된 효소 또는 생분자의 최종 활성 간의 관계는 규명되지 않았다. 따라서 지지 물질에 특정 효소나 생분자의 효율적인 고정화를 위한 최적의 졸-겔 시스템을 확립하는 것이 필요하다.
한편, 용존산소, pH 및 이산화탄소에 대해 감응할 수 있는 형광염료로는 루테늄 복합체, HPTS(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소디움염), 플루오르세인아민(fluoreceinamine)을 들 수 있다. 루테늄을 이용한 복합체들은 특정 파장에서 형광 특성을 갖는데, 대표적으로 RuDPP(트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테늄 (Ⅱ) 복합체)는 470 ㎚의 여기광을 입사시켰을 때 600 ㎚의 형광을 방출하는 특성을 지니고 있으며, 산소의 농도에 반비례하여 형광을 발생시킨다. 또한, HPTS는 이산화탄소 검출용 형광염료로 사용되며, 플루오르세인아민은 pH 검출용 형광염료로 사용되는 물질이다.
최근에, 발효공정, 식품제조 및 의학 분야에서 글루코스, 락테이트 및 타이라민(tyramine) 분석의 수요가 급증하고 있다. 글루코스는 생물기술 공정에서 미생물 성장에 가장 중요한 영양분이다. 이 탄소원은 모든 발효공정의 거의 95%에 사용된다. 따라서 글루코스 농도의 분석은 다양한 생물기술 공정의 제어를 위해 필수적인 과정이 되었다. 게다가 글루코스 모니터링은 많은 물질대사 경로의 규명 이나 질병의 진단 또는 치료에 중요한 역할을 한다. D(-)- 및 L(+)-락트산은 식품 평가에 사용된다. 3 g/㎏ 이상의 L(+)-락트산은 미생물 오염의 지수로 간주된다. 이것은 발효식품에서 타이라민 검출에 사용되는 것과 동일한 원리이다. 타이라민과 기타 바이오제닉 아민(biogenic amines)의 존재는 저해 약물, 알콜의 섭취나 위장 질환으로 인해, 아미노산 분해효소의 활성이 낮거나 결핍한 사람의 건강을 위협할 수 있다.
본 발명자들은 형광염료로서 루테늄 복합체와 효소로서 글루코스 옥시다제, 락테이트 옥시다제, 타이라민 옥시다제의 고정화를 위한 여러 졸-겔 시스템을 제조하고, 글루코스, 락트산 및 타이라민의 농도를 검출하기 위한 이들 졸-겔 시스템의 특성을 연구한 결과, 각각 트랜스듀서(transducer) 제조 및 효소 고정화를 위한 최적의 조성을 밝혀내었다.
따라서 본 발명의 제1목적은 형광염료를 고정화하기 위한 졸-겔 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제2목적은 효소를 고정화하기 위한 졸-겔 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제3목적은 상기 졸-겔 조성물을 이용한 센싱막을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제4목적은 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제5목적은 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 메틸-트리에톡시실란(MTES)을 1:1~2의 부피비로 포함하는, 형광염료를 고정화하기 위한 졸-겔 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)을 2~4:1의 부피비로 포함하는, 효소를 고정화하기 위한 졸-겔 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은 트랜스듀서로서, 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 메틸-트리에톡시실란(MTES)을 1:1~2의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 형광염료, 및 생물학적 검출요소로서, 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS))을 2~4:1의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 효소를 포함하는, 센싱막(sensing membrane)에 관한 것이다.
본 발명의 제4면은 상기 센싱막을 포함하는, 생물학적 검출키트에 관한 것이다.
본 발명의 제5면은
1) 상기 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하고;
2) 상기 반응으로부터 발산되는 형광강도를 측정하는:
단계를 포함하는, 생물학적 검출방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
분석물(예: 글루코스, 락트산, 타이라민 등)을 효소(예: 글루코스 옥시다제, 락테이트 옥시다제, 타이라민 옥시다제)와 반응시켜 마이크로플레이트 또는 막대형 프로브 형태의 센서를 이용하여 분석하고자 할 때, 형광염료와 효소를 효율적으로 고정화하면 센싱막을 대량으로 경제적으로 제조할 수 있다. 졸-겔법에 의한 센싱막의 제조는 간단하지만, 졸-겔 재료를 잘 선택하여야 한다. 따라서 본 발명에서는 지지체 상에 각종 형광염료와 효소를 효율적으로 고정화할 수 있는 최적의 졸-겔 조성을 밝혀내고자 하였다.
본 발명의 일 태양의 측정원리는 효소에 의해 특이적으로 촉매되는 분석물의 산화반응에 기초한다(반응식 2 참조).
Figure 112007038023760-pat00002
상기 반응은 산소 농도의 감소를 초래하며, 이는 트랜스듀서 역할을 하는 형광염료(예: 루테늄 복합체)의 형광강도에 영향을 미치며, 이러한 형광강도를 측정함으로써 분석물의 실체와 농도를 결정할 수 있게 된다. 본 발명에서는, 효소로서 글루코스 옥시다제(GOD), 락테이트 옥시다제(LOD) 또는 타이라민 옥시다제(TOD))와 형광염료로서 루테늄 복합체를 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 단독 또는 GPTMS와 메틸-트리에톡시실란(MTES) 또는 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS) 의 혼합물로 이루어진 졸-겔 상에 고정화하여 센싱막을 제조한다. 졸-겔의 에폭시 그룹과 효소의 아민 그룹의 공유결합은 세척 시 효소가 제거되는 것을 방지하며, 센싱막의 높은 감도를 유지할 수 있게 한다(상기 반응식 1 참조).
효소 고정화나 유기물질과 생물질의 캡슐화에 적용된 졸-겔의 전형적인 특성은 글루코스, 락트산 및 타이라민 검출을 위한 센싱막의 감도와 안정성에 크게 기여한다. 졸-겔에서 실란의 혼합비율은 글루코스, 락트산 및 타이라민의 농도를 검출하는 센싱막의 상이한 응답속도 등 상이한 특성을 초래하는 바, 형광염료의 고정화를 위해서는 GPTMS 및 MTES를 1:1~2, 특히 1:2의 부피비로 포함하는 것이 바람직하며, 효소 고정화를 위해서는 GPTMS 및 APTMS를 2~4:1, 특히 4:1의 부피비로 포함하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명은 GPTMS 및 MTES를 1:1~2, 특히 1:2의 부피비로 포함하는 형광염료 고정화용 졸-겔 조성물, 및 GPTMS 및 APTMS를 2~4:1, 특히 4:1의 부피비로 포함하는 효소 고정화용 졸-겔 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 트랜스듀서로서, GPTMS 및 MTES를 1:1~2, 특히 1:2의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 형광염료, 및 생물학적 검출요소로서, GPTMS 및 APTMS를 2~4:1, 특히 4:1의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 효소를 포함하는 센싱막을 제공한다.
본 발명에 따른 센싱막은 마이크로타이터 플레이트 또는 막대형 프로브(probe)에서 제작되어 생물학적 검출키트, 즉 바이오센서로 사용될 수 있다.
본 발명은
1) 상기 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하고;
2) 상기 반응으로부터 발산되는 형광강도를 측정하는:
단계를 포함하는, 생물학적 검출방법을 제공한다. 본 발명에 따른 검출방법은 23~25 ℃와 pH 7~8의 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예: 센싱막의 제조
글루코스 옥시다제(아스퍼질러스 나이거(Aspergilus niger) 유래, 47.2 U/㎎), 락테이트 옥시다제(페디오코커스(Pediococcus) sp. 유래, 20 U/㎎ 고형), 타이라민 옥시다제(아쓰로박터(Arthrobacter) sp. 유래, 3.9 U/㎎ 고형), 3-아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS), 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 메틸트리에톡시실란(MTES)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서 구입하여 사용하였다. 트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테늄 (Ⅱ) 복합체는 공지의 방법에 따라 합성하여 사용하였으며, 다른 모든 물질들은 추가적인 정제과정 없이 사용하였다.
센싱막을 트랜스듀서와 생물학적 검출요소로 구성하였다. GPTMS와 APTMS 또는 GPTMS와 MTES의 혼합물과 GPTMS 단독을 99% 에탄올에 혼합하여 졸-겔을 제조하였다. 실란의 혼합비와 혼합용액에 첨가된 35% HCl의 부피를 표 1에 나타내었다. HCl 첨가 후, 졸-겔은 다음 단계에서 사용되기 전 최소 2 시간 동안 실온에서 보관하였다.
졸-겔 GPTMS (v/v%) APTMS (v/v%) MTES (v/v%) EtOH (v/v%) 35% HCl (㎕/㎖)
GT 37.5 - - 62.5 20
GA1 12.5 6.25 - 81.25 40
GA2 25.0 6.25 - 68.75 40
GM1 12.5 - 12.5 75.0 40
GM2 12.5 - 25.0 62.5 40
200 ㎕의 졸-겔 GM1과 GM2에 50 ㎕의 0.044 mM 루테늄 복합체를 첨가하여 트랜스듀서를 제조하였다. 루테늄 복합체와 졸-겔의 혼합물을 기계적 교반에 의해 완전히 혼합한 후, 2 시간 동안 실온에서 저장하였다. 5 ㎕ 루테늄 복합체 혼합물을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥면에 분주하여 95 ℃에서 18 시간 동안 건조시켰다. 열처리 후, 트랜스듀서 상에 상이한 졸-겔(GT, GA1, GA2, GM1 또는 GM2)을 가하고 그 위에 40 ㎕의 효소 용액(GOD: 100 유닛, LOD: 1 유닛, 또는 TOD: 0.005 유닛)을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 가하였다. 효소를 18 시간 동안 실온에서 고정화하였다.
실험예: 센싱막의 특성분석
1) 분석방법
가) 고정화효율:
효소의 고정화효율은 효소 단백질의 총량과 고정화된 효소 단백질 양의 비로 계산하였다. 또한 고정화된 효소 단백질의 양은 효소 단백질의 총량으로부터 비고정화된 효소 단백질의 양에 의해 결정된다. 고정화되지 못한 효소 단백질은 300 ㎕의 0.1 M 인산완충용액으로 세척하여 제거하고, 브래드포드(Bradford)법에 의해 단백질의 양을 측정하였다. 효소 고정화와 단백질 측정은 각각의 졸-겔에서 3회 반복하여 측정하였다.
나) pH 및 온도의 영향:
센싱막에서의 pH와 온도의 영향을 pH 4.5~10과 23~40 ℃의 범위에서 조사하였다. 본 실험에서 분석용액의 pH는 1 N NaOH 또는 HCl을 이용하여 적정하였다. pH 10의 100 ㎕ 분석용액을 센싱막이 고정화된 마이크로타이터 플레이트에 분주하고 마이크로타이터 플레이트를 여기 485 ㎚/발산 535 ㎚에서 형광강도를 측정하기 위해 마이크로플레이트 리더의 측정챔버에 삽입하였다. pH 10의 분석용액을 측정한 후, 센싱막을 증류수로 여러 번 세척하고 pH 9의 분석용액을 센싱막 내에 주입하여 형광강도를 측정하였다. 이러한 분석과정을 다른 pH 분석용액으로 순차적으로 수행하였다. 센싱막에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해, 35 ㎕의 특정 농도의 분석용액을 센싱막에 주입하고 측정챔버에 삽입하여 10 동안 반응시킨 후 형광강도를 측정하였다.
다) 동적 파라미터:
각각의 고정화된 효소의 최대 반응속도(Vmax)와 미카엘리스-멘텐 상수(KM)를 라인웨버-버크(Lineweaver-Burk) 플랏으로부터 결정하였다. 다양한 농도의 100 ㎕ 분석용액을 센싱막이 고정화된 마이크로타이터 플레이트에 주입하고 마이크로플레이트 리더의 측정챔버에 삽입하여 시간에 따른 형광강도의 변화를 측정하였다. 동적 파라미터를 낮은 농도에서 높은 농도의 분석물 순으로 측정하고 매번 형광강도를 측정한 후, 센싱막을 증류수를 이용하여 세척하였다.
라) 안정성:
센싱막의 안정성을 100%와 0%의 산소농도에서 형광강도의 변화로부터 결정 하였다. 형광측정 후 센싱막을 4 ℃ 암실조건에서 0.1 M 인산완충용액(pH 7.0)에서 저장하였다. 센싱막의 수명을 매달 모든 농도의 분석물의 형광강도의 변화를 측정하여 조사하였다.
마) 데이터 분석:
각기 다른 온도에서 형광강도의 차이를 일원 변량 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)에 의해 분석하였다. 시료 간의 유의한 차이를 P-값<0.05로 하고, 통계학적 시험을 소프트웨어 InStat(버전 3.01, GraphPad Software Inc., SanDiego, USA)을 사용하여 수행하였다.
측정된 형광강도는 최대값에 대한 비율로 측정데이터를 변환하여 정규화하였다. 일부 경우, 측정된 형광강도를 백분율 데이터로 정규화한 후, 정규화된 데이터를 정규화 값의 log10을 취하여 다시 변환하였다.
2) 분석결과
가) 지지 물질의 선택:
도 1에 (a) GA1, (b) GA2 및 (c) GT 졸-겔 상에 고정화된 GOD의 SEM 영상을 나타내었다. 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, GPTMS 단독(졸-겔 GT)에 고정화된 GOD의 양은 실란의 혼합물(졸-겔 GA1 또는 GA2)에 고정화된 GOD의 양만큼 많지 않았다. 따라서 APTMS 졸-겔의 존재는 GOD 고정화를 위해 좋은 조건을 제공함을 알 수 있었다.
나) GOD-고정화 센싱막:
도 2에 트랜스듀서 GM1 또는 GM2 및 GOD를 위한 상이한 종류의 졸-겔을 갖는 GOD-고정화 센싱막에 대한 글루코스의 검량 곡선을 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 트랜스듀서 GM2를 갖는 GOD-고정화 센싱막은 GOD 고정화를 위해 같은 종류의 졸-겔을 사용한 경우 트랜스듀서 GM1을 갖는 센싱막 보다 감도가 우수하였다. 그 이유는 트랜스듀서 GM1의 조직보다 GM2 트랜스듀서의 조직이 더 유연하기 때문일 것이다. 트랜스듀서 GM2는 많은 수의 공극(cavities)을 가짐으로써 졸-겔 층으로 산소 분자가 침투하기 용이하며 루테늄 분자와 강한 반응을 촉진하여 GOD가 고정화된 센싱막의 감도를 증가시키며 빠른 응답속도를 가지게 한다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 GOD-고정화 센싱막이 다양한 글루코스 농도에 대해 감도를 나타내며, 그 중에서 GM2(트랜스듀서)와 GA2로 제조된 센싱막의 특성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한 글루코스 0.0~1.0 g/ℓ의 선형 보정범위에서 GM2-GA2로 제조된 센싱막의 감도가 다른 졸-겔로 제조된 센싱막들에 비하여 감도가 우수하였다(R=0.9189, 기울기=0.1015). 졸-겔 GA2를 이용하여 제조한 센싱막의 GOD 고정화 효율(40.3%)은 졸-겔 GT(36.2 %), GA1(38.5 %), GM1(37.3%), GM2(36%)의 고정화 효율보다 우수하였고, GPTMS와 APTMS의 혼합비율은 졸-겔 GAs의 특성에 상당한 영향을 미쳤다.
분석용액의 온도는 GOD가 고정화된 센싱막의 응답속도에 영향을 주었다. 트랜스듀서 GM1으로 GOD를 고정화한 센싱막의 최적온도는 23 ℃였고, 23 ℃ 이상의 온도에서는 형광강도가 감소하였지만 25~40 ℃의 온도에서 GOD을 고정한 모든 센싱막의 형광강도에는 큰 차이가 없었다. 반면에 트랜스듀서 GM2로 GOD을 고정화한 센싱막은 온도가 증가함에 따라 형광강도가 감소하였다.
GOD를 고정화한 센싱막의 응답속도(T95)를 1.0 g/ℓ의 글루코스에 센싱막의 표면을 노출시켜 측정하였다. 동적 파라미터는 산소 부재 시와 100% 산소 존재 시 상이한 글루코스 농도에서 형광강도를 측정하여 얻은 후, 시간에 따른 보정된 값을 그래프화하였다. 이러한 그래프의 선형구간에서 얻어진 기울기 값은 반응속도를 의미한다(V=d(FI
Figure 112007038023760-pat00003
/FI)/dt). 측정되는 모든 센싱막은 오차를 줄이기 위해서 수차례 반복 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
센싱막 RSD T95 (분) KM (M) Vmax (M/s)
트랜스듀서 GOD 고정화 100% O2 0% O2
GM1 GT 0.9669 0.9166 3.1 0.0981 0.5137
GM1 GA1 0.7131 1.0326 3.0 0.0279 0.2431
GM1 GA2 1.4597 1.1113 0.5 0.2775 1.3865
GM1 GM1 0.8423 1.0197 2.9 0.1064 0.4566
GM1 GM2 0.6326 1.2581 3.1 1.4322 7.0972
GM2 GT 0.8612 2.7168 2.9 0.0052 0.4109
GM2 GA1 1.3486 1.6852 3.7 0.0090 0.3343
GM2 GA2 1.3966 0.6923 0.15 0.0014 0.3054
GM2 GM1 2.4863 2.8300 4.6 0.4687 0.8764
GM2 GM2 0.5401 1.0230 3.5 0.0129 0.1982
표 2에 나타낸 바와 같이, 상대 표준편차(RSD; relative standard deviations)는 0.0 g/ℓ와 1.0 g/ℓ의 글루코스 농도에서 3% 이하로 측정되었다. 또한, 졸-겔 GAs을 이용한 센싱막은 0.15~0.5 분내에 신호가 안정되기 때문에 특성이 가장 우수하며, 모든 센싱막의 응답속도는 4.6 분 이내로 매우 짧았다.
효소 역학 이론에 따르면, Vmax값이 높고 KM값이 낮을수록 초당 더 많은 몰수의 기질이 생산물로 전환된다. 이것은 더 많은 양의 산소가 소모되어 글루코스 농도에 대한 더 높은 감도의 센싱막이 얻어짐을 의미한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 졸-겔 GM2에 GOD가 고정화된 센싱막은 낮은 글루코스 농도에서 높은 감도를 보였다. 트랜스듀서로서 졸-겔 GM2를 사용한 센싱막의 KM값이 트랜스듀서로서 졸-겔 GM1을 사용한 센싱막의 것 보다 작았기 때문에, 이러한 결과는 표 2에서 다시 확인되었다. 이러한 Vmax값과 KM값을 기초로, 트랜스듀서 GM2를 사용하여 GOD를 고정화한 센싱막의 감도는 아래 순서로 감소함을 알 수 있었다: GA2 → GT → GA1 → GM2 → GM1. GM1을 트랜스듀서로 사용한 센싱막 중 GA2 센싱막은 가장 높은 응답속도를 보였다. 따라서 상대적으로 GM2와 GA2 졸-겔은 각각 트랜스듀서 제조와 GOD 고정화를 위한 최적의 물질로 결론내려졌다.
센싱막의 재현성(repeatability) 실험을 0.0 및 1.0 g/ℓ의 글루코스 농도에서 수행하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
안정성은 일정기간 동안 조작과 저장 후 GOD가 고정화된 센싱막의 감도변화에 의해 표현된다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
센싱막 최초 최종 감소 (%) 시간 (월)
트랜스듀서 GOD-고정화
GM1 GT 46549 12328 73.5 10
GM1 GA1 70488 71300 0 10
GM1 GA2 45541 57921 0 10
GM1 GM1 94194 20212 78.5 3
GM1 GM2 14667 0 100 1
GM2 GT 73640 28509 61.3 3
GM2 GA1 260351 219651 15.6 10
GM2 GA2 150762 188641 0 10
GM2 GM1 62579 53906 13.8 5
GM2 GM2 164169 97369 40.7 10
표 3에 나타낸 바와 같이, GOD가 고정화된 GMs-GAs 센싱막은 우수한 안정성을 나타내었다. 또한 10개월의 조작과 저장 후에도 GAs로 제조된 GOD 고정화 센싱막의 감도는 크게 변화하지 않았으며, 다른 센싱막들은 수명은 길지만 감도는 시간이 지남에 따라 급격히 감소하였다.
다) LOD-고정화 센싱막:
도 4에 다양한 락테이트 농도에서 LOD-고정화 센싱막(GM2-GA2)의 응답을 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, LOD 고정화 센싱막의 선형 검출구간은 0.0~0.9 ㎎/ℓ(=1 mM)였다(R
Figure 112007038023760-pat00004
=0.9543). 이것은 식품가공 처리뿐만 아니라 보통 혈액 내의 락트산의 범위가 0.5~2.5 mM이기 때문에 혈액 시료에서 락트산 센싱막에 의한 낮은 농도의 락트산 검출의 가능성을 보여주는 것이다. 또한, LOD의 동적 파라미터(Vmax=3.12 M/s, KM=0.008 M)는 LOD 촉매 하에서 락트산의 산소소비 속도가 GOD 촉매 하에서 글루코스의 산소소비 속도에 비해 매우 높음을 나타내었다. LOD의 고정화 효율은 66.89%였다. 따라서 LOD가 고정화된 센싱막은 본 실험의 범위에서 매우 높은 감도를 보여주었다.
일반적으로, 효소가 고정화된 센싱막의 응답속도와 안정성은 반응용액의 온도와 pH에 의존한다. 도 5에 센싱막에 대한 반응용액의 온도 및 pH의 영향을 나타내었다. 도 5의 (a)에 나타낸 바와 같이, LOD 고정화 센싱막의 경우, 형광강도는 온도가 증가함에 따라 감소되고 락트산의 검출을 위한 최적온도는 25 ℃였다. 락트산의 산화반응에서 락트산은 졸-겔에 고정화된 LOD 촉매 하에서 피루브산과 과산화수소로 전환된다. 또한 과산화수소로부터 생성된 양성자, H+는 배양액의 pH를 변화시킬 수 있으므로, 완충용액이 효소활성의 유지를 위해 바람직한 pH를 유지하기 위해 사용되었다. 도 5의 (b)에 나타낸 바와 같이, pH 7과 pH 8이 높은 수준의 형광강도를 보존하기 위해 최적이었다.
LOD 고정화 센싱막의 재현성은 0, 36 및 90 ㎎/ℓ의 락트산 농도에서의 상대적 표준편차(RSD)가 각각 0.766%, 1.64% 및 3.32%로서 매우 우수하였다. 센싱막의 안정성은 검출 조작을 위한 최적 조건뿐만 아니라 졸-겔과 LOD의 강한 공유결합 때문에 매우 중요하다. 95%의 총 신호값을 얻기 위한 센싱막의 반응시간(T95)은 0.4 mM 및 1.0 mM의 락테이트 농도에 대해 대략 5.3 분이었다. 도 6에 8 개월의 조작 및 저장 후 LOD-고정화 센싱막의 장기 안정성을 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 8 개월의 조작과 저장 후 LOD 고정화 센싱막의 감도는 초기 기울기 값의 91%까지 감소되었으나, 센싱막이 4~5 개월 후에도 조작가능한 것으로 나타났다. 또한 다른 락트산 검출 센서와 비교하여, 센서의 구성은 전체적으로 다를지라도 본 발명의 락트산 검출 센서의 수명은 다른 모델과 유사하거나 더 길었다.
라) TOD-고정화 센싱막:
도 7에 다양한 농도의 타이라민에서 센싱막((a) GM2-GA1, (b) GM2-GA2)의 응답을 나타내었다. 도 7로부터, TOD 고정화 센싱막의 선형 검출구간이 0~100 ㎎/ℓ(GM2-GA2)와 0~70 ㎎/ℓ(GM2-GA1)임을 알 수 있었다. 검출층에 고정화를 위해 적은 양의 TOD를 사용한 센서는 0~100 ㎎/ℓ의 타이라민 농도에서 높은 감도를 보여주었으며, 0.0과 100㎎/ℓ의 타이라민 농도에서 형광강도의 차이는 매우 컸다. 그러나 GM2-GA1을 사용한 경우, 100 ㎎/ℓ 이상의 타이라민 농도에서는 센서의 감도가 급격히 감소하였다. GM2-GA1 센싱막에서 동적 파라미터 Vmax와 KM1은 각각 6.39 M/s와 11.71 mM인 반면 GM2-GA2 센싱막의 경우 Vmax와 KM2는 0.191 M/s와 0.171 mM이었다. 따라서 KM1>KM2이므로 GM2-GA1 센싱막에서 타이라민의 산화는 GM2-GA2 센싱막에서 보다 신속하게 일어났다. 그러나 Vmax1>Vmax2이므로, 더 많은 양의 타이라민이 전환되었다.
도 8에 센싱막 GM2-GA1 및 GM2-GA2에 대한 (a) 온도 및 (b) pH의 영향을 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 두 센싱막의 신호는 온도가 증가함에 따라 감소되며, 다른 효소와 마찬가지로 TOD는 높은 온도에서는 활성이 감소되거나 기능을 유지할 수 없었다. 최대 형광강도를 얻기 위한 최적 온도범위는 23~25 ℃였다. 또한, pH 7은 안정성과 높은 감도를 유지하기 위한 최적 pH 조건이었다. 그러나 그 이유는 GM2-GA2 센싱막의 경우, pH 10 이상에서는 형광강도가 변하지 않으므로 설명할 수가 없었다.
두 센싱막은 0.0 및 50 ㎎/ℓ 타이라민에서 반복된 사용 후 그들의 원래 형광 신호값을 복원할 수 있었다. GM2-GA1과 GM2-GA2의 센싱막의 상대적 표준편차는 5% 이내이며, 이러한 결과는 졸-겔과 효소 사이의 강한 공유결합 때문에 센싱막에서 세척에 의한 효소의 손실이 방지되었음을 가리킨다. GM2와 GAs의 복합체는 센싱막의 제조을 위한 우수한 특성을 가지며 GM2-GA1 센싱막의 응답속도는 총 형광강도의 95%을 획득하기 위해 대략 9 초가 걸리는 반면 GM2-GA2 센싱막의 경우 대략 3분이 필요하였다.
두 센싱막(GM2-GA1, GM2-GA2) 모두 4~6 개월 후 정규화된 형광강도가 감소되었으나, GM2-GA2 센싱막은 2 개월의 조작과 저장 후 정규화된 형광강도가 변하지 않았다. 사실상 타이라민 분석에 관한 많은 연구가 이루어지지 않았고 이와 같은 형태의 바이오센서는 제작된 바 없었다. 따라서 본 발명의 센서를 기존에 제작된 다른 센서와 비교할 수는 없지만 4~6 개월의 수명을 가진 본 발명의 바이오센서는 우수한 특성을 가짐을 알 수 있었다.
본 발명에 따르면, 형광염료와 효소 고정화를 위해 각각 최적의 졸-겔 조성물을 사용함으로써, 효소 고정화효율, 감도, 재현성, 장기 안정성 등의 특성이 우수한 센싱막을 대량으로 경제적으로 제조할 수 있으며, 상기 센싱막을 이용하여 글루코스, 락테이트, 타이라민은 물론 pH, 산소, 이산화탄소, 암모니아, 염소 등과 같은 형광염료와 효소를 이용하여 측정할 수 있는 모든 대상을 효율적으로 검출할 수 있다.

Claims (11)

  1. 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 메틸-트리에톡시실란(MTES)을 1:1~2의 부피비로 포함하는, 형광염료를 고정화하기 위한 졸-겔 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 형광염료가 루테늄 복합체(ruthenium complex)인 졸-겔 조성물.
  3. 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)을 2~4:1의 부피비로 포함하는, 효소를 고정화하기 위한 졸-겔 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 효소가 산화효소인 졸-겔 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 산화효소가 글루코스 옥시다제, 락테이트 옥시다제 및 타이라민 옥시다제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 졸-겔 조성물.
  6. 1) 트랜스듀서(transducer)로서, 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 메틸-트리에톡시실란(MTES)을 1:1~2의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 형광염료; 및
    2) 생물학적 검출요소로서, 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS))을 2~4:1의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 효소:
    를 포함하는, 센싱막(sensing membrane).
  7. 제6항에 따른 센싱막을 포함하는, 생물학적 검출키트.
  8. 제7항에 있어서, 글루코스, 락트산 및 타이라민으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 검출하기 위한 키트.
  9. 제7항에 있어서, 마이크로타이터 플레이트 또는 막대형 프로브 형태의 키트.
  10. 1) 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하고,
    2) 상기 반응으로부터 발산되는 형광강도를 측정하는:
    단계를 포함하는, 생물학적 검출방법.
  11. 제10항에 있어서, 23~25 ℃와 pH 7~8에서 수행되는 생물학적 검출방법.
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