KR20200084686A

KR20200084686A - 캡슐화된 염료를 포함하는 pH 감지막 및 그를 이용한 pH 센서

Info

Publication number: KR20200084686A
Application number: KR1020190000852A
Authority: KR
Inventors: 이종일; 정홍영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2020-07-13
Also published as: KR102141983B1

Abstract

염료가 캡슐화되어 고분자막에 고정된 pH 감지막이 제조되었으며, pH 변화에 따라 시각적 색상 뿐 아니라 형광 파장의 변화를 동시에 보이면서도, 높은 안정성 및 양호한 선택성을 보였다. 이러한 pH 감지막은 실제 소변 샘플과 발효 기질에서 중성 및 염기성 용액의 pH 측정에 적용할 수 있으며, 생체공학에서 세포외 pH의 실시간 영상화와 모니터링까지 그 응용 범위를 확장할 수 있다.

Description

캡슐화된 염료를 포함하는 pH 감지막 및 그를 이용한 pH 센서{pH-sensing membrane containing encapsulated dyes, and pH sensor using the same}

본 발명은 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서에 관한 것이다.

또한 본 발명은 pH에 따라 캡슐화된 염료의 형광특성이 변화함을 이용한 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서에 관한 것이다.

다양한 환경에서 pH 측정은 많은 분석 과정에서 매우 중요하다. 유리 pH 전극이 일반적으로 pH 측정수단으로 알려져 있으며 실험실, 공장 및 병원 등에서 사용된다. 그러나, 유리 pH 전극에 의한 pH 측정은 일부 분석 분야에서는 분석 필드에서 만족스럽지 않으며, 따라서 다양한 유형의 pH 센서가 개발되고 있다. pH 센서 중 일부 광화학 pH 센서는 환경 화학, 분석 화학 및 생체 의학 과학을 비롯한 다양한 분야에 중점을 두고 있다.

광화학 pH 센서의 경우, 많은 흡수 염료 또는 형광 염료가 pH 지표로 사용되었다. 최근, 색도계(colorimetric) 광학 pH 센서 제작은 전통적인 pH 측정지로부터 착안된 광학 pH 센서 영역에서 새로운 트렌드가 되었다. 전통적인 pH 측정지는 단순하고 편리하게 측정되어 pH 상태를 1차적으로 추정할 수 있으나, 비가역적이며 또한 대상 분석 물질에 대한 정확한 pH 값을 확인할 수 없다. 색도계 광학 pH 센서는 생물학적 공정에서 세포외 pH의 온라인 모니터링에서 가역적으로 작동할 수 있기 때문에 pH 측정지보다 더 많은 발전을 했다.

그러나, 온라인 pH 모니터링에 사용될 수 있는 가역성 등은 모든 색도계 pH 센서에서 나타나지 않는다. 또한 다른 pH 센서는 pH 종이와 유사하지만, 다른 물질에 침전되어 비가역적 형광막과 같은 특별한 용도로 사용될 수 있다. 색도계 pH 센서는 인간의 시각에 뚜렷한 자극을 주기는 하지만, pH 값에 대한 일반적인 정보만을 제공할 뿐이어서, 광한 pH 센서가 광학적 pH 감지 지표를 통해 광 방출을 측정하면서 시각적 색상 전환까지 통합된다면, 분석 대상 물질의 정확한 pH 값을 제공하면서, 센서의 색상 변화에 대한 시각적 지각을 통해 편리하게 사용될 수 있을 것이다.

D. Wencel 외, Optical Chemical pH Sensors, Anal. Chem. 86, pp. 15-29 (2014)

본 발명은 시각적으로 인지할 수 있는 색상의 변환을 나타내면서도 형광 특성을 통해 정확한 pH 값을 측정할 수 있는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서의 제공을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 pH에 따른 가역적 색상 및 형광 변화를 보이는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서의 제공을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 가시광 또는 자외선하에서 pH 변화에 따라 뚜렷한 색상 변화를 보이는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서의 제공을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 장기간 및/또는 반복덕인 측정에서도 측정 능력이 열화되지 않고 유지되는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 pH 감지막에 관한 것으로, 상기 pH 감지막은,

pH 변화에 의해 형광 특성이 변화하는 염료;

상기 염료가 포함된 캡슐; 및

상기 캡슐이 고정된 막;을 포함하며,

pH의 변화에 따라 가시광선 영역의 색상 변화 및 형광 방출 파장이 모두 변화한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 pH는 중성 및/또는 염기성 범위일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 염료는 쿠마린6, 나일블루A, 루테늄 복합체, HPTS(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소디움염), 플루오르세인아민(fluoreceinamine), 및 CdSeTe에서 선택된 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 캡슐은 상기 염료를 담지한 중합체 입자일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 캡슐은 지름이 0.1 내지 100 ㎛일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 캡슐이 고정된 막은 나피온, 폴리우레탄 하이드로젤, 및 실란으로부터 유래한 하이드로젤에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 pH 감지막은 100 내지 400 nm의 여기 파장에 대해 450 내지 700 nm의 형광 파장을 방출할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 pH 감지막은 측정 대상물의 pH가 9에서 12로 변화하였을 때, 400 nm의 여기 파장에 대해 적어도 하나의 방출 파장이 10 nm 이상 청색편이(blue-shift)될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 pH 감지막은 pH 4.5 내지 7.5의 범위에서, 측정 대상과 2개월간 접촉한 후의 SI값(pH 변화에 대한 FI₄₈₀/FI₅₁₅의 변화량)의 변화가 0.02 이내일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 pH 감지막은 pH 9 내지 12의 범위에서, 측정 대상과 1개월간 접촉한 후의 SI값(pH 변화에 대한 FI₆₆₀/FI₄₉₀의 변화량)의 변화가 0.03 이내일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 pH 감지막은 응답 시간이 10초 이내일 수 있다.

또한 본 발명은 pH 센서에 관한 것으로, pH 센서는 상기 pH 감지막을 포함한다.

본 발명은 시각적으로 인지할 수 있는 색상의 변환을 나타내면서도 형광 특성을 통해 정확한 pH 값을 측정할 수 있는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 pH에 따른 가역적 색상 및 형광 변화를 보이는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 가시광 또는 자외선하에서 pH 변화에 따라 뚜렷한 색상 변화를 보이는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 장기간 및/또는 반복덕인 측정에서도 측정 능력이 열화되지 않고 유지되는 pH 감지막 및 그를 포함하는 pH 센서를 제공한다.

도 1은 햇빛 및 자외선 하에서, 나피온을 포함하거나 포함하지 않는 용액에서의 쿠마린6(C6)의 형광 방출 스펙트럼((a) 좌측), 및 사진((a) 우측); 및 나일블루(NB)의 형광 방출 스펙트럼((b) 좌측), 및 사진((b) 우측)이다.
도 2는 햇빛 및 자외선 하에서 산성 및 중성 용액에서의 멜라민 포름알데히드(MF) 수지 입자에 캡슐화된 C6 입자(MF-C6)(a), 및 MF 수지 입자에 캡슐화된 NB 입자(MF-NB) 입자와 그의 형광 방출 스펙트럼(b)이다.
도 3은 캡슐화된 염료 입자를 고정하기 전과 후의 나피온(Nf) 막 및 폴리우레탄 하이드로젤(PU) 막의 표면 AFM 및 SEM 이미지이다.
도 4는 상이한 pH 용액에 노출된 MF-C6-Nf 막의 형광 방출 스펙트럼, 및 두 형광 강도의 비율로 결정되는 검정 곡선이다.
도 5는 상이한 pH에 반복적으로 노출되었을 때의 MF-C6-Nf 막의 형광 강도 비율 및 2개월 후의 SI 값 변화이다.
도 6은 상이한 pH 용액에 노출된 MF-NB-PU 막의 형광 방출 스펙트럼, 및 두 형광 강도의 비율로 결정되는 검정 곡선이다.
도 7은 상이한 pH에 반복적으로 노출되었을 때의 MF-NB-PU 막의 형광 강도 비율 및 1개월 후의 SI 값 변화이다.
도 8은 상이한 pH에 노출된 MF-C6-Nf 막의 햇빛에서 색상 변화(a) 및 그의 가역적 색상 변화(b)이다.
도 9 상이한 pH에 노출된 MF-NB-PU 막의 햇빛에서 색상 변화(a) 및 그의 가역적 색상 변화(b)이다.
도 10은 표준 완충 용액 및 상이한 pH의 실제 소변 샘플에 노출된 MF-C6-Nf 막의 회복률 및 햇빛에서의 시각적 색상 전환이다.
도 11은 표준 완충 용액 및 발표 샘플에 노출된 MF-NB-PU 막의 회복률 및 햇빛에서의 시각적 색상 전환이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 실시예 및 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 실시예 및 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명에 있어, pH 감지막은,

pH 변화에 의해 형광 특성이 변화하는 염료;

상기 염료가 포함된 캡슐; 및

상기 캡슐이 고정된 막;을 포함하며,

본 발명의 일 양태에서 상기 pH는 중성 및/또는 염기성 범위일 수 있고, pH 7 내지 12, 바람직하게는 pH 7.5 내지 12에서 색상 및 형광 방출 파장이 모두 변화할 수 있다.

이때, 형광 염료를 입자에 주입하면 측정 중 염료 입자가 포함된 감지막에서 염료 유출을 방지할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 캡슐은 고분자 중합체일 수 있고, 그 예로, 멜라민, 우레탄, 비닐 방향족 단량체, (메트)아크릴산 단량체, (메트)아크릴레이트 단량체 등으로부터 중합되는 중합체일 수 있고, 그 예로, 스티렌, α-메틸스티렌, 부타디엔, 비닐 아세테이트, (메트)아크릴산, 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 2-에틸헥실 아크릴레이트 등으로부터 중합되는 중합체일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 캡슐은 좁은 입자 크기 분포 (PSD)를 갖는 중합체 입자일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 캡슐에 포함되는 중합체의 한 예인 멜라민 포름알데히드(MF) 수지 입자는 상호 연결성이 높고 온도 조절이 가능하며 극성과 비극성 용제에서는 팽창하지 않는 특성을 가진다. 따라서 형광 염료를 MF 수지와 같은 수지 입자로 캡슐화시킴으로써, 형광 염료가 장기간의 사용에도 유출되지 않고 내구성을 확보할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 캡슐은 구형, 타원회전체형, 로드형, 방추형, 입방체형, 각기둥형, 원기둥형, 아령형 등일 수 있고, 그 크기는 0.1 내지 100 ㎛, 바람직하게는 0.5 내지 50 ㎛, 더 바람직하게는 1 내지 10 ㎛, 그보다 더 바람직하게는 1 내지 5 ㎛일 수 있다. 너무 작은 캡슐은 염료가 충분량 유지되기 어렵고, 광학적 간섭의 문제가 있을 수 있으며, 너무 큰 캡슐은 pH 감지막의 박막화 및 균일한 고정화가 용이하지 않아, 색상 및 형광의 균일한 감지에 불리하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 염료는 pH의 변화에 따라 육안으로 감지할 수 있는 파장 범위에서의 색상 변화와 함께, 여기 파장에 대한 형광 방출 파장이 변화(shift)하는 염료가 사용될 수 있다. 여기 파장은 형광 방출이 가능한 파장이며, 예를 들어 자외선 영역일 수 있고, 예를 들어 자외선, X선 등의 영역을 들 수 있다. 본 발명의 일 양태에서 여기 파장은 100 내지 400 nm일 수 있고, 그에 대한 형광 방출 파장은 450 내지 700 nm일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 염료는 쿠마린6, 나일블루A, Rudpp(트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테늄(Ⅱ)복합체)과 같은 루테늄 복합체, HPTS(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소디움염), 플루오르세인아민(fluoreceinamine), CdSeTe(cadimium selenium tellurium) 등일 수 있으며, 특히 쿠마린6 및 나일블루 A가 바람직하다. 또한 쿠마린6는 높은 형광 양자 수율, 큰 파장 변이, 우수한 광 안정성 및 낮은 독성을 가지는 장점이 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 캡슐이 고정된 막은 고분자 중합체일 수 있으며, 술폰산계, 우레탄계, 실리콘계, 에폭시계 등일 수 있다. 그러한 예로서, 나피온, 폴리우레탄 하이드로젤, 실란으로부터 유래된 하이드로젤 등일 수 있다.

특히 폴리머 나피온(Nf)은 우수한 열 및 기계적 안정성 때문에 양성자 교환 멤브레인용 양성자 전도체로서 유용하고, 폴리머 백본에 연결된 수산화기, 아미노 또는 카박사마이드 그룹과 같은 많은 수의 수소 결합 기능 때문에 캡슐의 고정 막으로서 유용하다.

또한 폴리우레탄 하이드로젤은 폴리머 매트릭스 내의 염료와 분석 대상 물질 사이의 일시적인 결합이 쉽게 깨지기 때문에 높은 가역성을 보이는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 일 양태에서, pH 감지막은 측정 대상물의 pH가 변화하였을 때, 여기 파장에 대해 적어도 하나의 방출 파장이 10 nm 이상 청색편이(blue-shift)될 수 있다. 예를 들면, pH가 9에서 12로 변화하였을 때, 400 nm의 여기 파장에 대해 적어도 하나의 방출 파장이 10 nm 이상, 바람직하게는 15 nm 이상, 더 바람직하게는 20 nm 이상 청색편이될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, pH 감지막은 반복측정시에도 높은 반복재현성을 가질 수 있고, 이때 낮은 상대 표준편차(relative standard deviation, RSD) 값을 가지며, 예를 들어, 2% 이하, 바람직하게는 1.5% 이하, 더 바람직하게는 1.3% 이하, 그보다 더 바람직하게는 1.1% 이하, 그보다 더 바람직하게는 1.0% 이하의 RSD 값을 가질 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, pH 감지막은 측정 대상과 장기간 접촉하고/접촉하거나 반복되는 pH의 큰 변화에도 불구하고 그 측정 반복재현성에서 높은 안정성 및 내구성을 가질 수 있다. 일 예로, pH 4.5 내지 7.5의 범위에서, 측정 대상과 2개월간 접촉한 후의 SI값(pH 변화에 대한 FI₄₈₀/FI₅₁₅의 변화량)의 변화가 0.02 이내, 바람직하게는 0.015 이내, 더 바람직하게는 0.01 이내일 수 있고, pH 9 내지 12의 범위에서, 측정 대상과 1개월간 접촉한 후의 SI값(pH 변화에 대한 FI₆₆₀/FI₄₉₀의 변화량)의 변화가 0.03 이내, 바람직하게는 0.02 이내, 더 바람직하게는 0.01 이내일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, pH 감지막은 응답 시간이 10초 이내, 바람직하게는 5초 이내일 수 있다. 이는 pH 변화를 실시간으로 모니터링하는 프로브에 적용되기에 아주 적합한 특성으로, 측정 대상에 대한 정확한 정보 및 그를 바탕으로 한 신속한 대응이 가능하게 한다.

본 발명에서, pH 센서는 상기 pH 감지막을 포함할 수 있다. 그러한 pH 센서는 의료용이나 생물 공정에서 장기간의 온라인 pH 측정용 센서로서 유용할 수 있으며, 그러한 예로, 소변이나 발효공정액 등에서의 pH 측정을 들 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명의 여러 양태에 대하여 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있음은 당연하다.

(실시예)

염료 캡슐화 수지 입자 제조

멜라민(시그마 알드리치 화학(대한민국)) 2.6 g을 파라포름알데히드(시그마 알드리치 화학(대한민국)) 3.7 g 및 증류수 50ml와 혼합하였다. 혼합물은 50 °C에서 40분간 자석 교반하며 가열되었다. 이후에 투명 멜라민-포름알데히드(MF) 용액은 2겹의 여과지로 여과하여 추후 사용할 때까지 4 °C에 저장하였다. 이후 디메틸술폭사이드(DMSO)에서 10mM 쿠마린6(C6) 1ml 및 20mM 나일블루A(NB) 1ml를 준비된 투명 MF 용액 10ml 및 15mL에 각각 혼합한 후, 0.4 mM 묽은 염산 22ml와 혼합하였다. 그 후에 혼합물은 끓는 물에서 100 °C로 30분 동안 가열되어 C6가 캡슐화된 MF 구형 입자(MF-C6 입자) 및 NB가 캡슐화된 MF 구형 입자(MF-NB 입자) 각각의 서스펜전을 얻었다. MF-C6 입자 및 MF-NB 입자를 분리하여 증류수로 여러 번 세척한 후, 60°C에서 24시간 건조하였다.

MF-C6 입자와 MF-NB 입자의 형광 스펙트럼은 다기능 형광 마이크로플레이트 판독기(multifunctional fluorescence microplate reader; Safire, Tecan GmbH(오스트리아))에 의해 측정되었다.

염료 캡슐화 수지 입자를 포함한 pH 감지막 제작

pH 측정을 위한 감지막을 제작하기 위해 MF-C6 입자 및 MF-NB 입자가 각각 순수 에탄올로 희석된 1% 나피온(Nf) 1ml에, 그리고 9:1 부피비의 에탄올과 물에 희석된 10% 폴리우레탄 하이드로젤 D4(Advanced Source Biomaterials(미국))에 각각 첨가되었다. MF-C6 입자 및 MF-NB 입자를 각각 포함한 상기 혼합물들은 상온에서 3시간 동안 숙성된 후 pH 감지막, 즉 MF-C6 막과 MF-NB 막을 제작하는데 사용되었다.

각각의 상기 혼합물들은 10 ㎕씩, 96개의 웰(well)을 가진 마이크로타이터 플레이트의 웰 바닥에 코팅되고 60 ℃에서 24시간 건조되어 pH 감지막으로 제작되었다.

또한 각각의 상기 혼합물들이 PET 필름상의 80 cm2의 면적에 1 ml씩 코팅되고, 실온에서 2시간 건조후, 60 ℃에서 24시간 건조되어 pH 감지막으로 제작되었다.

pH 감지막의 표면 형태는 AFM(Atomic force microscope; 원자간력 현미경)으로 확인되었다.

형광 측정

pH 감지막의 형광 강도는 pH 2 ~ 12 범위에서 다기능 형광 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정되었다. pH 감지막의 제작과 pH 측정은 세 번 수행되었다. pH 감지막에 미치는 온도의 영향은 주어진 pH 값과 다양한 온도(25, 30, 33, 35, 37, 40 °C)에서 시험되었다. pH 감지막의 장기적 안정성은 초기, 및 수회의 반복 측정 또는 특정 시간 후에 얻은 형광 강도를 측정하여 반복재현성을 결정하여 평가되었다.

비율계량형광(Ratiometric fluorescent) 계산 및 데이터 분석

MF-C6 막에 대한 비율계량 계산은 다음과 같이 두 개의 방출 파장(λ_em=480 (FI₄₈₀) 및 515 nm(FI₅₁₅))에서의 형광 강도 비를 기초로 했다.

R_MF-C6 = FI₄₈₀ / FI₅₁₅

MF-NB 막에 대한 비율계량 계산은 다음과 같이 두 개의 방출 파장(λem=660 (FI₆₆₀) 및 490 nm(FI₄₉₀))에서의 형광 강도 비를 기초로 했다.

R_MF-NB = FI₆₆₀ / FI₄₉₀

서로 다른 수준의 양이온과 온도에서 pH 감지막의 형광 강도 차이는 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 통해 평가되었다. 샘플들 사이의 유의미한 차이는 p-value<0.05로 허용되었다. 통계분석은 InStat(vers.3.01, GraphPad Software Inc., San Diego, USA)를 사용하여 수행되었다.

적용

미생물 발효 과정에서 소변 pH 또는 세포외 pH의 변화를 검출하기 위해 pH 감지막이 조사되었다. MF-C6-Nf 막은 4~8의 pH 범위에서 여과된 실제 소변 샘플에 노출되었으며, 비율계량 계산에서 얻은 결과를 표준 pH 용액과 비교했다. MF-NB-PU 막은 특정 시간부터 YPD 기질(5 g/l 효모 추출물; 5 g/l 덱스트로스)에서 염기성 박테리아 중 하나인 Dietzia sp. KDB1 (KC433534)의 GDB I (5C433534)의 발효중에 수차례 수집된 상청액(上淸液; supernatant)에 노출되었다. 발효 매체의 pH 변화는 MF-NB-PU 막과 유리 pH 전극의 응답을 통해 평가되었다.

형광 염료의 특성

도 1(a)에서는 용액 pH가 산성(실선)이 될 때 중성 pH 용액에서 C6의 형광 방출 파장(490 nm)이 520~525 nm로 이동된다. 일양자성(monoproton) 형성에 따른 방출 스펙스럼의 이동은 부분적으로 전자-리치(electron-rich) 디에틸아미노 모이어티에서 링이 양성자화된 벤조티아졸로 발생하는 전하 이동 상호작용(charge-transfer interaction)에 기인한다.

Nafion이 있는 곳에서, C6의 배출 파장은 중성(480nm)에서 약 5~10nm 정도 청색 편이(blue-shift)되었지만 산성(520nm)에서는 이동하지 않았다(도 1(a)의 파선). 또한 나피온이 없는 C6 용액(도 1(a) 사진)과 비교하여 나피온이 함유된 C6 용액의 형광 강도가 크게 증가했다. 이는 C6가 선호되는 매체에서 극성화도(polarity)가 감소하는 쪽으로 용액의 극성화도가 변화하기 때문이다. 게다가, 나피온은 루이스산으로 C6와 상호작용하여 형광 강도를 높이는 복합체를 형성하였다.

산성 용액과 중성 용액의 형광 강도 변화 외에도, 도 1(a)의 사진과 같이 다른 pH 용액에서 C6의 시각적 색상 전환은 정상적인 햇빛과 자외선 아래에서 매우 명확했다. 햇빛 아래에서 C6의 색상은 pH 8의 밝은 노란색에서 pH 4의 핑크색으로 변화하였다(도 1(a), 사진). 그러나 나피온이 함유된 C6용액의 분홍색은 나피온이 없는 C6용액보다 더 어두운 것으로 보인다. 자외선 아래에서는 모든 C6 용액에서 색이 완전히 다르게 변했다. 즉, 나피온이 없는 중성 pH 용액의 옅은 오렌지색은 나피온이 없는 산 pH 용액의 경우 연두색으로, 나피온이 함유된 중성 pH 용액의 C6 색상은 녹색에서 노란색으로 변화하였다.

도 1(b)는 NB의 형광 방출 스펙트럼과 다른 pH의 수용액에서의 응답을 보여준다. 방출 파장은 400nm의 여기 파장에 대해 490nm와 645nm에서 관찰되었다. pH가 pH 12까지 증가하면서 645 nm의 방출 밴드 에지에서 NB의 형광 강도는 감소했지만 이 경우 490 nm의 밴드 에지는 거의 증가하지 않았다. 강염기의 첨가에 따라 645 nm의 방출 스펙트럼은 10 nm 정도로 청색 편이되었다. 도 1(b)의 사진과 같이, 다른 pH 용액에서 NB의 색상 변화는 햇빛과 자외선 아래에서 매우 선명했다. 햇빛 아래에서 NB 용액의 색상은 pH 9의 파란색에서 pH 12의 자주색으로 변화하였다(도 1(b), 사진). 자외선 아래에서 pH 9의 완충 용액에서 NB 용액의 빨간색은 pH 12의 완충액에서 확연하게 고정된 것이며, 이는 λ_em=645 nm에서의 형광 강도 감소에 해당한다.

캡슐화된 형광 염료의 특성

MF-C6 입자는 구형이고, 지름이 약 3~5 ㎛인 입자이다(도 2(a)) MF-C6 입자는 형광염료(C6)의 산기 특성을 유지하며 방출 파장은 변경되지 않았다. 상기 입자는 태양광 아래에서 산성 및 염기성 용액에서 선명한 시각적 색상 전환을 보여주었으며 또한 8W의 자외선 아래에서 강한 형광 강도를 보였다(도 2(a)).

MF-C6 입자와 달리 염료 NB의 형광 방출 스펙트럼은 MF(MF-NB) 입자로 캡슐화한 후 변화되었다. 즉, 645 nm의 방출 밴드 에지(emission band edge)가 670nm로 이동되었다. 670 nm의 밴드 에지에서 MF-NB 입자의 형광 강도는 수용액의 pH를 pH 12까지 증가됨에 따라 증가되었고, 490 nm의 밴드 에지에서는 다소 감소되었다(도 2(b)).

MF-C6 입자와 유사하게 MF-NB 입자들은 지름 약 3~5 ㎛의 구형 입자였다. MF-NB 입자는 햇빛 아래에서 pH 9의 파란색에서 pH 12의 보라색으로의 변화를 보여주었고, 8W의 UV 아래에서는 강한 염기의 첨가에 따라 pH 9의 버퍼 용액의 어두운 파란색이 붉은색으로 변화였다.

캡슐화된 형광 염료가 고정된 pH 감지막의 특성

도 3은 캡슐화된 염료 입자, 즉 MF-C6 입자 및 MF-NB 입자를 각각 고정하기 전과 후의 나피온(Nf) 막 및 폴리우레탄 하이드로젤(PU) 막의 표면 형태(morphology)와 SEM 이미지를 보여준다. AFM 이미지의 Nf 막은 표면 평균 거칠기(surface mean roughness (Ra))가 0.512nm이고 평균 제곱근 거칠기(root mean square roughness (Rq))은 0.671nm이었다. 반면, MF-C6-Nf 막은 큰 거칠기(Ra 143 nm, Rq 176 nm)를 보였다. 이러한 표면 거칠기의 큰 차이는 소량의 폴리머 나피온을 사용함으로써 발생할 수 있다. 그러나 도 3(a)의 SEM 이미지에서 보듯이 MF-C6 입자들은 소량의 나피온으로 서로 잘 연결되어 있었다.

또한 고밀도의 PU은 염료 입자 사이의 공간을 채웠고, 따라서 MF-NB-PU 막의 표면이 매우 매끄럽다. 여기서 PU 막의 Ra는 0.275 nm, Rq는 0.338 nm이다. 이러한 파라미터는 MF-NB 입자를 고정시킨 후 약간 증가하였다(Ra는 0.328nm, Rq는 0.406nm). MF-NB 입자는 PU 매트릭스 안에서 완전히 고정되었고 SEM 이미지에서 MF-NB-PU 막의 매끄러운 표면을 형성하였다(도 3(b)).

MF-C6 입자를 포함한 PU 막(MF-C6-PU 막)은 산성 매질 및 염기성 매질 양쪽 모두 480nm에서 단 하나의 형광 방출 밴드 에지만 보여 주었다. PU는 양성자가 첨가되는 화학적 변화를 초래하는, 양성자 위치로의 전하 이동을 방지하는 것으로 추정된다. 이 막의 형광 강도 변화는 화학적 변이(chemical shift)를 일으키지 않는 위치에서 양성자의 수소 결합이 증가했기 때문일 수 있다.

MF-C6 입자를 포함한 나피온 막(MF-C6-Nf 막)은 C6의 화학적 변이를 잘 유지했으며, 막이 산성과 중성 또는 염기성 매질에 노출되었을 때 시각적 색상 전환을 만들었다.

MF-NB 입자를 포함한 PU 막(MF-NB-PU 막)은 다양한 염기성 pH 용액에 대해, 양호한 응답성(response)을 보였다. 또한, MF-NB-PU 막이 pH 10을 넘는 염기성 용액에 노출되었을 때 색상 전환이 파란색에서 자주색으로 명확히 구분되었다. 실제로 pH 10에서는 pH 감지막의 색상은 바뀌었지만, 단일 색상으로 구분되지는 않았다. 자외선 아래에서 MF-NB-PU 막은 염기성 수용액에서 색상과 형광 강도가 명확히 달랐다.

반면, MF-NB-Nf 막의 염기성 용액에 대한 민감도는 MF-NB-PU 막보다 매우 낮았다.

pH에 따른 대한 비율계량 형광 측정

[MF-C6-Nf 막]

MF-C6-Nf 막의 형광 방출 파장은 수용액의 pH에 따라 달라진다. 산 용액에서 λ_em은 515 nm이고 용액의 pH가 중성 및 염기성으로 증가하면 λ_em은 480nm로 청색편이 된다(도 4). 중성 및 염기성 용액에서 pH 감지막의 높은 형광 강도가 관찰되었으며, 이는 용액의 pH 감소에 따라 감소하였다. λ_em 480 nm 및 515 nm에서 두 형광 강도의 비율계량 값은 pH 4.5~7.5의 선형 감지 범위를 가지는 MF-C6-Nf 막의 검정곡선(R²=0.965)을 나타낸다.

도 8(a)와 같이 MF-C6-Nf 막의 시각적 색상 전환은 매우 명확했다. pH 감지막의 분홍색은 pH 2.0~4.5 범위에서 나타났으며, pH 5.0에서는 노란색과 핑크색을 모두 보였다. pH 5.5~9.0에서 pH 감지막은 완전히 노란색을 보였다.

또한 도 8(b)에 나타난 바와 같이 pH 4.5와 pH 7.5 사이의 MF-C6-Nf 막의 양호한 색상 가역성은 향상된 특성이면서, 온라인 pH 모니터링 및 높은 처리율(throughput)의 스크리닝과 같은 용도에 유용하다.

폴리머 나피온의 양성자 전달에 대한 일반적인 특성뿐만 아니라 염료 C6의 매우 민감한 특성 때문에, MF-C6-Nf 막은 낮은 상대 표준편차(relative standard deviation, RSD) 값(pH 4.5에서 1.29%, pH 7.5에서 1.056% (도 5))을 가지는 높은 반복재현도를 보였다. 이 막의 응답 시간은 산성 및 중성 용액에서 매우 짧았다. 도 5는 산성 및 중성 pH 용액에서 MF-C6-Nf 막의 양호한 가역성을 나타낸다.

본 발명의 일 양태에서, 1 중량% 나피온 용액에 침지 및 자기조립되어 형성된 나피온 막(12.5 ㎕/cm2)은 매우 얇았지만, 2개월 후에는 손상이 없고 안정적이었다(도 5). pH 4.5~7.5 범위에서 2개월 후 기울기 값(slope value, SI)이 0.532이 초기의 SI 값(0.547)과 크게 다르지 않아, 이 pH 감지막의 민감도는 크게 변하지 않았음이 확인되었다.

온도는 pH 전극 및 pH 센서의 분석 성능에 영향을 미친다. 온도 상승 또는 감소는 센서 구조를 바꾸거나, 센서 구성요소의 위치를 이동시킴으로써 구성 요소의 활성화 또는 비활성화를 초래한다. 예를 들어, 높은 온도는 형광 분자를 서로 가까이에서 함께 움직일 수 있고, 그 결과로 광 방출의 중첩을 초래하고 신호를 감소시킨다.

본 발명의 일 양태에서, 온도는 MF-C6-Nf 막의 응답에 거의 영향을 미치지 않았다. 통계적 분석 결과에 따르면 25 ℃의 pH 값과 다른 온도에서의 pH 값 사이에 유의미한 차이가 발생하였으며(p-value<0.001), 30~40 ℃의 온도 범위에서 MF-C6-Nf 막의 감도에 유의미한 차이가 없었다.

[MF-NB-PU 막]

도 6은 400 nm(λ_ex)의 여기 파장에서 MF-NB-PU 막의 형광 방출 파장(λ_em 490nm 및 675nm)을 보여준다. 용액 pH가 12까지 증가됨에 따라, 675 nm의 방출 밴드 에지는 660 nm로 청색편이 되었고, 형광 강도가 증가하였다. 반면에 강한 염기성 용액에서 490 nm의 밴드 에지의 형광 강도는 감소했다.

λ_em 660 nm 및 490 nm에서 두 형광 강도의 비율계량 값은 pH 9.0~12.0의 선형 감지 범위를 가지는 MF-NB-PU 막의 검정곡선(R²=0.981)을 나타낸다.

MF-NB-PU 막은 pH 10에서 3.18%, pH 10.5에서 0.91%, pH 11에서 2.89%, pH 11.5에서 6.24%, pH 12에서 0.49%의 낮은 RSD 값을 가지는 높은 가역성을 보였다(도 7). 또한 MF-NB-PU 막의 응답 시간은 모든 pH에서 약 10초(t₉₅)로 매우 짧았다. 이러한 MF-NB-PU 막의 양호한 가역성과 짧은 응답 시간은 강한 염기성 매체의 발효 과정에서 pH를 온라인으로 모니터링하는데 유용할 수 있다.

도 7과 같이 MF-NB-PU 막은 1개월간의 중단 없는 측정 후에도 손상되지 않았으며 상당히 안정적이었다. pH 9~12의 선형 범위에서 기울기 값(SI)이 초기 및 1개월 사용 후에 대해 각각 0.722와 0.693으로, MF-NB-PU 막의 민감도는 크게 변경되지 않았다.

NB 염료는 샘플 내의 일부 산화제가 pH 측정중에 MF-NB-PU 막의 응답에 큰 영향을 미칠 수 있다.

MF-NB-PU 막이 pH 9~12의 범위에서 0.1 mM 과산화수소(H₂O₂), 0.1 mM 차아염소산나트륨(NaClO), 0.1 mM 클로라민T(ChT)와 같은 산화제에 노출되었다. 여기서, 과산화수소의 경우, FI₆₆₀/FI₄₉₀의 값이 pH 9 및 pH 10에서 약 3.68%, pH 11 및 12에서 0.63~1.1%로 증가된 것으로부터, MF-NB-PU 막에 약간의 영향을 끼침을 알 수 있다. NaClO과 ChT가 MF-NB-PU 막에 미치는 영향은 모든 pH에서 유사했다. 즉, NaClO과 ChT는 pH 11과 pH 12에서는 각각 간섭이 없었고, 반면에 pH 9와 10에서 FI₆₆₀/FI₄₉₀의 값이, NaClO의 경우 약 1.76~2.87 %, ChT의 경우 약 3.14~0.33% 증가하였다.

25~35 ℃(p-value>0.05)의 온도 범위에서 MF-NB-PU 막의 민감도에 유의미한 차이가 없었다. 그러나 온도가 37~40 ℃까지 증가하더라도 pH 10~12(p-value<0.001)의 범위에서 MF-NB-PU 막의 응답에 거의 영향을 미치지 않는다. MF-NB-PU 막의 이러한 온도 안정성은 MF-C6-Nf 멤브레인보다 더 우수한 것으로 보인다.

[MF-NB-PU 막 응답성]

MF-NB-PU 막의 시각적 색상 전환도 도 9(a)에 나타나 있다. pH 감지막의 보라색 색상은 pH 10.5~12.0 범위에서 나타난 반면 pH 10의 막은 햇빛 아래에서 파란색을 띠었다. 도 9(b)에서 pH 9.0과 pH 12.0 사이의 MF-NB-PU 막의 양호한 가역성은 염기성 매체에 대해, 재사용 가능하고 빠른 응답성을 가지는 육안 색도 측정용 pH 센서에 적용될 수 있다.

(시험예)

중성 pH 범위의 실제 소변 샘플

보통 사람의 신선한 소변 pH는 보통 중성이며(pH 6.2 정도) 평균 pH 5.5~7.0 범위이다. 단백질, 칼륨, 유기산과 같은 수많은 요인들이 소변의 pH를 변화시킨다. MF-C6-Nf 막이 실제 소변 용액과 표준 완충 용액의 pH 값을 측정하기 위해 사용되었다. 이때 표준 버퍼 용액의 pH는 4~8 범위로 조정되었다. 도 10에 색도 및 비율계량 형광 응답 결과가 나타나 있다. MF-C6-Nf 막의 복원률은 pH 4.0에서 105%, pH 5.0에서 103%, pH 6.0에서는 97.1%, pH 7.0에서 95.8%, pH 8에서 98%로 매우 양호했다. 분홍색은 pH 4.0과 pH 5.0에서 나타났고, pH 7.0과 pH 8.0에서 막이 완전히 노란색을 띄었다.

염기성 pH범위에서의 발효 공정

Dietzia sp. KDB1의 발효중, 발효 기질의 pH 값은 염기성에서 중성 pH 범위로 크게 변화하였다. 도 11에 표준 용액 및 발효 매체에 노출될 때 MF-NB-PU 막의 색도 및 비율계량 형광 응답 결과가 나타나 있다. MF-NB-PU 막의 복구율은 pH 11.4(t0)에서 99.9%, pH 10.6(t14)에서 98.4%, pH 9.8(t20)에서 98.2%, pH 9.5(t28)에서 100.3%, pH 9.2(t36)에서 101.9%, pH 9.1(t40)에서 104.6%로 매우 양호했다. pH 11.4(t0)에서 MF-NB-PU 막의 자주색은 발효 시간이 증가함에 따라, 즉 발효 기질의 pH 감소에 따라, 파란색으로 변하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 양태에 따른 pH 감지막은 pH 변화에 따라 시각적 색상 뿐 아니라 형광 파장의 변화를 동시에 보이면서도, 높은 안정성 및 양호한 선택성을 보였다. 이러한 pH 감지막은 실제 소변 샘플과 발효 기질 등과 같은 대상에 대해 중성 및 염기성 용액의 pH 측정에 적용할 수 있으며, 생체공학에서 세포외 pH의 실시간 영상화와 모니터링까지 그 응용 범위를 확장할 수 있다.

Claims

pH 변화에 의해 형광 특성이 변화하는 염료;
상기 염료가 포함된 캡슐; 및
상기 캡슐이 고정된 막;을 포함하며,
pH의 변화에 따라 가시광선 영역의 색상 변화 및 형광 방출 파장이 모두 변화하는 pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 pH는 중성 및/또는 염기성 범위인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 염료는 쿠마린6, 나일블루A, 루테늄 복합체, HPTS(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소디움염), 플루오르세인아민(fluoreceinamine), 및 CdSeTe에서 선택된 하나 또는 둘 이상인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 캡슐은 상기 염료를 담지한 중합체 입자인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 캡슐은 지름이 0.1 내지 100 ㎛인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 캡슐이 고정된 막은 나피온, 폴리우레탄 하이드로젤, 및 실란으로부터 유래한 하이드로젤에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 pH 감지막은 100 내지 400 nm의 여기 파장에 대해 450 내지 700 nm의 형광 파장을 방출하는, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 pH 감지막은 측정 대상물의 pH가 9에서 12로 변화하였을 때, 400 nm의 여기 파장에 대해 적어도 하나의 방출 파장이 10 nm 이상 청색편이(blue-shift)되는, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 pH 감지막은 pH 4.5 내지 7.5의 범위에서, 측정 대상과 2개월간 접촉한 후의 SI값(pH 변화에 대한 FI₄₈₀/FI₅₁₅의 변화량)의 변화가 0.02 이내인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 pH 감지막은 pH 9 내지 12의 범위에서, 측정 대상과 1개월간 접촉한 후의 SI값(pH 변화에 대한 FI₆₆₀/FI₄₉₀의 변화량)의 변화가 0.03 이내인, pH 감지막.
제1항에 있어서,
상기 pH 감지막은 응답 시간이 10초 이내인, pH 감지막.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 pH 감지막을 포함하는 pH 센서.