RU2268944C2

RU2268944C2 - Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата

Info

Publication number: RU2268944C2
Application number: RU2004103830/13A
Authority: RU
Inventors: Наталь Николаевна Угарова (RU); Наталья Николаевна Угарова; Лили Георгиевна Малошенок (RU); Лилия Георгиевна Малошенок
Original assignee: Наталья Николаевна Угарова; Лилия Георгиевна Малошенок
Priority date: 2004-02-11
Filing date: 2004-02-11
Publication date: 2006-01-27
Also published as: RU2004103830A

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Реагент для количественного определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) биолюминесцентным методом содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду pLR с нативным геном люциферазы светляков или люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду с m-pLR с мутантным геном люциферазы Luciola migrelica, в котором остаток гистидина в положении 433 заменен на остаток тирозина, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этиленаминотетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и трегалозы в качестве стабилизаторов и воду. При определении аденозин-5'-трифосфата реагент обеспечивает повышение чувствительности и воспроизводимости определения АТФ и снижение расхода фермента за счет увеличения удельной активности реагента. Реагент позволяет проводить определение аденозин-5'-трифосфата по интенсивности биолюминесценции при 560-570 нм при использовании нативной люциферазы светляков Luciola migrelica, и по интенсивности биолюминесценции при 606-610 нм при использовании люциферазы, в которой остаток гистидина в положении 433 заменен на остаток тирозина. 1 ил., 1 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) на основе фермента - люциферазы светляков.

Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, пропорциональна концентрации АТФ в широком интервале концентраций. Зависимость между интенсивностью биолюминесценции и концентрацией АТФ описывается уравнением:

где [АТФ, моль/л] - концентрация АТФ в кювете люминометра,

(I, усл.ед.) - интенсивность биолюминесценции в условных единицах, регистрируемая на люминометре,

n - показатель степени, характеризующий чувствительность реагента для определения АТФ,

α - коэффициент пропорциональности.

Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицинской диагностике, в контроле микробных загрязнений в различных продуктах и окружающей среде. На основе этого метода разработаны методики «быстрой микробиологии» для контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и других напитков, для оценки стерильности оборудования и материалов в особо чистых помещениях (Угарова Н.Н, 1993, Прикладная биохимия и микробиология, т.29, №2, с.180-191).

Наиболее близким к заявляемому является патент РФ №2164241, 1999 (Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н., Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75%-ным сульфатом аммония, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза, иммобилизованная	0,05-0,20
Люциферин	0,014-0,056
Сульфат магния	0,2-0,3
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,12-0,60
Уксусная кислота	0,01-0,60
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,04-0,08
Дитиотреитол	0,05-0,10
Бычий сывороточный альбумин	0,05-0,20
D-(+)-трегалоза	5,0-20,0
Вода	Остальное

Реагент по прототипу имеет спектр биолюминесценции с максимумом в желто-зеленой области спектра при 560-570 нм.

Недостатком прототипа является невысокая каталитическая активность иммобилизованной люциферазы, поскольку при иммобилизации теряется около 80% активности фермента, что делает необходимым использовать для анализа АТФ относительно высокие количества реагента и тем самым увеличивает расход реагента и стоимость определения АТФ. Недостатком прототипа также является неоднородность суспензии иммобилизованной люциферазы, что приводит к довольно высокой погрешности результатов при определении ультрамалых концентраций АТФ. Существенным недостатком прототипа является невысокая чувствительность реагента, а именно то, что при концентрации АТФ ниже 10^-10 моль/л показатель степени (n) в уравнении (1), характеризующий чувствительность реагента для определения АТФ, гораздо ниже единицы (n=0,2). Поэтому при увеличении концентрации АТФ в 10 раз интенсивность биолюминесценции увеличивается лишь в 1,6 раза. Кроме того, использование дорогостоящего импортного носителя для иммобилизации значительно увеличивает стоимость АТФ-реагента.

Задачей настоящего изобретения является повышение активности реагента для определения АТФ, снижение расхода фермента для получения реагента, увеличение чувствительности и воспроизводимости определения АТФ, а также получение реагентов с максимумами биолюминесценции в различной области спектра.

Для решения поставленной задачи предлагается реагент для определения АТФ, включающий люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75%-ным сульфатом аммония, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду, который содержит растворимую, высокоочищенную, высокоактивную, нативную или мутантную люциферазу. Активность люциферазы, используемой для приготовления реагента по данному изобретению, составляет 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка).

В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент содержит растворимую высокоочищенную люциферазу светляков, которую выделяют из клеток E.coli, содержащих плазмиду с нативным (плазмиду pLR) или с мутантным (плазмиду m-pLR) геном люциферазы. Получение плазмиды pLR проводят по известному методу (Д. Гловер. Клонирование ДНК. Методы. М., Мир, 1988). Получение плазмиды m-pLR проводят методом сайт-направленного мутагенеза плазмиды pLR с помощью полимеразной цепной реакции, как описано в примере 1. Получение штаммов E.coli, содержащих плазмиду pLR или m-pLR, наращивание биомассы клеток, выделение и частичную очистку люциферазы проводят по методу, описанному в прототипе, и далее фермент дополнительно очищают следующим образом. Осадок люциферазы, полученный при добавлении сульфата аммония до 75% насыщения, как описано в прототипе, растворяют в трис-ацетатном буферном растворе, содержащем MgSO₄, ЭДТА и дитиотреитол, рН 7,8, и далее подвергают гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Фракции с удельной активностью не менее 5 Е/мл объединяют, вновь осаждают 75%-ным сульфатом аммония, осадок растворяют в вышеуказанном буферном растворе и очищают от примеси сульфата аммония гель-фильтрацией. Фракции с активностью люциферазы не менее 5 Е/мл объединяют и получают раствор люциферазы с удельной активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка). Данный препарат люциферазы используют для приготовления реагента.

Согласно изобретению реагент для определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) содержит растворимую рекомбинантную, нативную или мутантную, высокоочищенную и высокоактивную люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду с нативным или мутантным геном люциферазы светляков, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этиленаминотетраацетата натрия, дитиотреитола, бычьего сывороточного альбумина и трегалозы в качестве стабилизаторов и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,001-0,01
Люциферин	0,014-0,028
Сульфат магния	0,5-0,75
Трис-(оксиметил)-аминометан	2,4-4,8
Уксусная кислота	0,1-0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15-0,22
Дитиотреитол	0,04-0,08
Бычий сывороточный альбумин	2-5
D-(+)-трегалоза	10-20
Вода	Остальное

Повышение чувствительности определения АТФ с помощью предлагаемого реагента достигается за счет увеличения удельной активности реагента. В случае прототипа активность реагента составляет 0,005-0,2 Е/мл при максимальной плотности суспензии иммобилизованного фермента 1 мг/мл. С использованием высокоочищенной люциферазы с удельной активностью 20-100 Е/мл получают реагент с активностью 0,5-5 Е/мл. Использование реагента с активностью более 5 Е/мл является нецелесообразным, поскольку приводит к непроизводительному расходу реагента. Повышение чувствительности определения АТФ достигается за счет того, что для предлагаемого реагента показатель степени (n) в уравнении (1), характеризующий чувствительность реагента, близок к единице (n=9,0-1,0), в то время как для реагента в соответствии с прототипом этот показатель значительно ниже единицы (n=0,2). Дополнительным преимуществом предлагаемого реагента является использование в качестве фермента мутантной люциферазы Luciola mingrelica, в которой остаток гистидина-433 заменен на остаток тирозина. Для получения мутантной люциферазы используют плазмиду m-pLR, которую получают методом сайт-направленного мутагенеза плазмиды pLR с помощью полимеразной цепной реакции. В отличие от нативного фермента, для которого максимум биолюминесценции наблюдается в желто-зеленой области спектра, при 560-570 нм, для люциферазы Luciola mingrelica с мутацией Гис433Тир максимум биолюминесценции наблюдается в красной области спектра, при 606-610 нм. Использование реагента для определения АТФ с максимумом биолюминесценции в различной области спектра создает дополнительные преимущества его применения в анализе, поскольку для регистрации биолюминесценции в красной области спектра могут быть использованы приборы, в которых детектором света является не фотоумножитель, а менее дорогостоящий фотодиод.

Реагент для определения АТФ получают добавлением концентрированного раствора высокоочищенной люциферазы к трис-ацетатному буферному раствору, рН 7,8, содержащему сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, люциферин, бычий сывороточный альбумин и трегалозу. После тщательного перемешивания раствор фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью фермента 0,5-5 Е/мл.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмиды m-pLR

Плазмиду m-pLR, содержащую мутантный ген люциферазы светляков L.mingrelica с точечной заменой Гис433→Тир, получают путем единичной замены нуклеотида С1297→Т в гене люциферазы светляков с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующего клонирования мутантного гена люциферазы в плазмиде pLR.

a. Получение мутантного гена люциферазы светляков L.mingrelica с точечной заменой Гис433→Тир. Плазмиду pLR (фиг.1), содержащую ген люциферазы светляков L. mingrelica, выделяют из клеток Е. coli (штамм LE 392) с помощью набора реактивов фирмы Кайджен. С помощью программы "Клон Менеджер 5'' определяют уникальные сайты рестрикции для вырезания участка плазмиды, содержащего ген люциферазы. Для введения замены С1297→Т в ген люциферазы методом ПЦР синтезируют 4 олигонуклеотида (праймеры А и D и праймеры В и С) длиной 17-21 пара оснований (фиг.1). Праймеры А и D содержат сайты узнавания для рестриктаз NheI и AatII, соответственно.

Nhe I
5'-ATAGGAGG↓CTAG CAAAATG-3'	праймер А
Aat II
5'-TGCCACCTGACGT↓CTAA-3'	праймер В

Праймеры В и С комплементарны прямой и обратной цепи ДНК люциферазы в области мутации, но содержат в центре замену G→А и С→Т, соответственно.

5'-ATGAAGAAATATTCGTCTTCG-3';	праймер В
3'-TACTTCTTTATAAGCAGAAGC-5';	праймер С

Используя указанные выше праймеры и плазмиду pLR, синтезируют два фрагмента ДНК, имеющие перекрывающиеся концы следующим образом. Для получения 5'-концевого фрагмента ДНК к 5 мкл 2 мкМ праймера А и 5 мкл 2 мкл праймера В добавляют 1 мкл 10 мМ нуклеотидов, 5 нг/мкл ДНК (плазмида pLR), 0,5 мкл 5 ед. Pwo полимеразы, 5 мкл 10×буфера для полимеразы и 32,5 мкл воды. Для получения 3'-концевого фрагмента ДНК к 5 мкл 2 мкМ праймера С и 5 мкл 2 мкМ праймера D добавляют 1 мкл 10 мМ нуклеотидов, 5 нг/мкл ДНК (плазмида pLR), 0,5 мкл 5 ед. Pwo полимеразы, 5 мкл 10×буфера для полимеразы и 32,5 мкл воды.

Полученные смеси амплифицируют на амплификаторе Techne PHC-2 при следующем температурном режиме: инкубирование 30 сек при 95°С, далее 25 циклов инкубирования смеси: 30 сек при 95°С, 30 сек при 57°С и 90 сек при 72°С и, наконец, инкубирование 5 мин при 72°С. Полученные фрагменты ДНК очищают методом электрофореза в 1,2% агарозном геле и выделяют из агарозного геля, используя набор реактивов фирмы Кайджен.

Очищенные 3'-концевой и 5'-концевой фрагменты ДНК сшивают методом ПЦР в условиях, описанных выше, при следующем составе реакционной смеси: 8 мкл (3 нг/мкл) 5'-концевого фрагмента ДНК, 8 мкл (2,5 нг/мкл) 3'-концевого фрагмента ДНК, 10 мМ нуклеотидов, 2,5 мкл 5 ед. Pwo полимеразы, 2,5 мкл 10×буфера для полимеразы и 3,5 мкл воды. Полученный продукт амплифицируют, используя 5 мкл 2 мкМ праймера А и 5 мкл 2 мкл праймера D, 1 мкл 10 мМ нуклеотидов, 2 нг/мкл продукта сшивки, 0,5 мкл 5 ед. Pwo полимеразы, 5 мкл 10×буфера для полимеразы и 32,5 мкл воды, в температурном режиме, указанном выше. Очищают продукт амплификации, содержащий мутантный ген люциферазы, методом электрофореза, как описано выше. Секвенирование полученного продукта подтвердило наличие соответствующей замены для мутации Гис433Тир.

б. Клонирование мутантного гена в плазмиде pLR. Продукт амплификации, содержащий мутантный ген люциферазы светляков, обрабатывают рестриктазами NheI и AatII для получения липких концов следующим образом. К 16,8 мкл (4 нг/мкл) продукта добавляют 0,8 мкл 20 ед/мкл рестриктазы NheII, 0,2 мкл 5 ед/мкл рестриктазы AatII, 2 мкл 10×буфера для рестриктаз, 0,2 мкл 100×бычьего сывороточного альбумина. Смесь инкубируют при 37°С в течение часа. Реакцию останавливают, добавляя 0,5 мкл 0,5 М ЭДТА. Аналогично обрабатывают рестриктазами плазмиду pLR, но добавляют дополнительно 10 ед/мкл рестриктазы KpnI для разрушения исходного гена люциферазы светляков L.mingrelica. Полученный фрагмент ДНК, содержащий мутантный ген люциферазы светляков, и фрагмент плазмиды (4467 пар оснований), не содержащий гена люциферазы, очищают методом электрофореза, как описано выше. Очищенные фрагменты лигируют для получения плазмиды m-pLR. Для этого к 9 мкл (3 нг/мкл) фрагмента плазмиды добавляют 8 мкл (3,36 нг/мкл) фрагмента ДНК, содержащего мутантный ген, инкубируют при 45°С в течение 5 минут, охлаждают до 0°С, добавляют 2 мкл 10×буфера для лигирования и 1 мкл (20 ед/мкл) Т4 ДНК-лигазы и инкубируют при 23°С, в течение 2 часов.

Получение компетентных клеток Е. coli и трансформацию клеток Е. coli мутантной плазмидой (pLRm), проводят по известным методикам, описанным в (Д. Гловер. Клонирование ДНК. Методы. М., Мир, 1988.).

Пример 2. Приготовление высокоочищенной рекомбинантной нативной и мутантной люциферазы Luciola mingrelica

а. Рекомбинантную нативную люциферазу получают из клеток E.coli, штамм LE392, содержащих плазмиду pLR с геном люциферазы светляков Luciola mingrelica. Клетки выращивают в 1 л среды Лурия-Бертани (бактотриптон, 10 г/л, дрожжевой экстракт, 5 г/л, NaCl, 10 г/л, рН 7,5), содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, при 18-20°С до оптической плотности А₅₉₀=4,0-6,0 и осаждают центрифугированием (6000 g, 20 мин). Осадок суспендируют в 50 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, 1% неонол-10, 0,5% Тритон Х-100. Клетки разрушают на ультразвуковом диспергаторе. Клеточные стенки и ДНК осаждают центрифугированием (20000 g, 20 мин) и отбрасывают. К надосадочному раствору при охлаждении и перемешивании прибавляют сухой сульфат аммония до 35% насыщения для осаждения балластных белков и центрифугируют при 20000 g 20 мин. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 75% насыщения. Образовавшийся осадок, содержащий люциферазу светляков, растворяют в 20 мл 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 М NaCl. Полученный раствор очищают от избытка солей методом гель-фильтрации через Сефадекс Г-50 при 8°С, используя в качестве элюента 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол. Фракции с люциферазной активностью 5 Е/мл и более, объединяют и наносят на ДЕАЕ-Сефарозу CL-6B. Несвязавшиеся примесные белки элюируют тем же буферным раствором, а люциферазу элюируют тем же буферным раствором в линейном градиенте концентрации сульфата магния от 30 до 90 мМ. Фракции с активностью люциферазы 5 Е/мл и более объединяют, осаждают сульфатом аммония (75% насыщения), растворяют и освобождают от избытка солей, как описано выше. В результате получают 20 мл раствора высокоочищенной рекомбинантной люциферазы в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол с активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка).

б. Люциферазу получают из клеток E.coli, как описано в примере 2а, но используют штамм LE392, содержащий плазмиду m-pLR с мутантным геном люциферазы. В результате получают 20 мл высокоочищенной мутантной люциферазы в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол с активностью 20-30 Е/мл (10-15 Е/мг белка).

Пример 3. Приготовление реагента для определения АТФ на основе растворимой, высокоочищенной, рекомбинантной нативной или мутантной люциферазы

а. 1 мл концентрированного раствора люциферазы, полученной, как описано в примере 2а, с активностью 20 Е/мл в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, добавляют к 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 0,5 мМ люциферин, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 200 мг/мл D-(+)-трегалозу, тщательно перемешивают, фильтруют в стерильных условиях (под ламинаром) через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 1,0 мл, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют 1,0 мл деионизованной стерильной воды и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,001
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис-(оксиметил)-аминометан	2,4
Уксусная кислота	0,1
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	5
D-(+)-трегалоза	20
Вода	Остальное

б. Все операции проводят, как описано в примере 3а, но используют люциферазу, полученную, как описано в примере 2а, с активностью 80 Е/мл. Получают реагент того же состава, что в примере 3а, за исключением того, что активность люциферазы составляет 2 Е/мл.

в. Все операции проводят, как описано в примере 3а, но используют люциферазу, полученную, как описано в примере 2а, с активностью 100 Е/мл и 19 мл буферного раствора состава, как описано в примере 3а. Получают реагент того же состава, что в примере 3а, за исключением того, что активность люциферазы составляет 5 Е/мл.

г. Все операции проводят, как описано в примере 3а, но используют люциферазу, полученную, как описано в примере 2б, с активностью 20 Е/мл. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл.

д. Все операции проводят, как описано в примере 3г, но используют люциферазу с активностью 30 Е/мл. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,75 Е/мл.

е. Все операции проводят, как описано в примере 3в, но используют 39 мл 0,4 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1,0 мМ люциферин, 20 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 100 мг/мл D-(+)-трегалозы. Получают реагент для измерения. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 2,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза	0,005
Люциферин	0,028
Сульфат магния	0,75
Трис-(оксиметил)-аминометан	4,8
Уксусная кислота	0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,22
Дитиотреитол	0,08
Бычий сывороточный альбумин	2
D-(+)-трегалоза	10
Вода	Остальное

Пример 4. Методика определения АТФ

0,05 мл реагента, полученного, как описано в примерах 2 и 3, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен 0. Затем вводят 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции (I). Разность между измеренной интенсивностью биолюминесценции (I) и фоновым сигналом является величиной, которая характеризует интенсивность биолюминесценции измеряемого раствора АТФ и пропорциональна концентрации АТФ в кювете люминометра. Процедуру повторяют для растворов с различными концентрациями АТФ. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру 3а-3е, показаны в таблице 1. На их основании строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10^-12 до 10^-8 М. Предел обнаружения АТФ с использованием растворимого реагента, полученного по примеру 3, составляет 10^-12 М. Показатель степени (n) в уравнении (1), характеризующий чувствительность реагента для определения АТФ, для предлагаемого реагента близок к единице. При работе с концентрациями АТФ от 10^-11 М и выше предпочтительнее использовать реагент, описанный в примере 3а или в примере 3е, с концентрациями АТФ от 5×10^-12 М и выше - реагент, описанный в примере 3б, а с концентрациями АТФ от 10^-12 М и выше - реагент, описанный в примерах 3в-3д. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше, используя градуировочный график, построенный по данным таблицы 1.

Таблица 1 Результаты измерения концентрации АТФ с использованием растворимого реагента, полученного по примерам 3а-3е
Концентрация АТФ в измеряемом растворе, моль/л	Интенсивность биолюминесценции, усл.ед
Концентрация АТФ в измеряемом растворе, моль/л	Реагент по примеру 3а	Реагент по примеру 3б	Реагент по примеру 3в	Реагент по примеру 3г	Реагент по примеру 3д	Реагент по примеру 3е
1×10^-8	2623	6488	17065	3115	3497	5875
5×10^-9	1580	3476	7280	1600	1799	3056
1×10^-9	268	849	2200	308	420	551
5×10^-10	160	386	910	260	290	276
1×10^-10	28	165	290	49	83	47
5×10^-11	16	65	107	44	54	28
1×10^-11	3	18	26	19	17	8
5×10^-12		6	14	15	10
1×10^-12			2	6	4

Claims

Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, сульфат магния, трис-(оксиметил)-аминометан, уксусную кислоту, этиленаминотетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин, трегалозы и воду, отличающийся тем, что он содержит люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду pLR с нативным геном люциферазы Luciola migrelica с удельной активностью 20-100 Е/мл (10-50 Е/мг белка) и максимумом биолюминесценции 560-570 нм, или люциферазу, выделенную из рекомбинантных клеток Е. coli, содержащих плазмиду m-pLR с мутантным геном люциферазы Luciola migrelica, в котором остаток гистидина в положении 433 заменен на остаток тирозина с удельной активностью 20-30 Е/мл (10-15 Е/мг белка) и максимумом биолюминесценции 606-610 нм, при следующем соотношении компонентов, мас.%: