CN116287106B - 增强萤火虫萤光素酶atp生物发光法检测性能的方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种增强萤火虫萤光素酶ATP生物发光法检测性能的方法，包括生物发光反应的检测工作液进行优化，较佳地还包括对萤火虫萤光素酶和萤光素底物进行提高稳定性的保护。所述检测性能的增强包括：提高酶稳定性，提高反应稳定性，增强检测信号，提高检测灵敏度，扩展检测范围，增加检测信号的半衰期等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，更具体地，本发明涉及一种增强萤火虫萤光素酶ATP生物发光法检测性能(包括增强灵敏度、扩展检测范围、提高稳定性、延长信号半衰期等)的方法及试剂。
背景技术
ATP是所有生命活动的能量来源，普遍存在于动植物和微生物中，它是具有代谢活性细胞的重要标志性分子，是区分活细胞和死细胞的重要标记，和活细胞数目成良好的线性关系。每个微生物活细胞中ATP的含量大致相同，当生物体死亡后，ATP会迅速分解，不会对活体微生物的测定产生影响，因此ATP含量能很好地反映微生物活细胞的数目。同时，ATP也是萤光素酶催化发光的重要底物，所以基于ATP含量测定的萤光素-萤光素酶检测体系广泛应用于细胞的活力检测。
在微生物检测领域，ATP生物发光技术是即时检测微生物的最快的方法。微生物体内的ATP经过裂解释放而出，在萤火虫萤光素酶的催化作用下，与体系中的萤光素在有氧环境及二价镁离子的共同作用下，形成氧化萤光素并发出萤光，发出的萤光强度与微生物活细胞的数量成正比，因此通过测试萤光信号的强度即可得知待测微生物的活性。
鉴于ATP生物发光法检测微生物的灵敏性、快速性和简便性，目前在饮用水卫生质量监测、食品工业表面卫生监控、消毒剂消杀效果评价等方向都有基于ATP检测技术的检测方法、检测装置、检测试剂和检测试剂盒的研究。
然而，随着技术的进步，对微生物检测的灵敏度、稳定性等提出了更高的要求。为了更好地应用这项技术，基于ATP生物发光法检测微生物的试剂盒，其灵敏度、稳定性等有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强萤火虫萤光素酶ATP生物发光法检测性能(包括增强灵敏度、扩展检测范围、提高稳定性、延长信号半衰期等)的方法及试剂。
在本发明的第一方面，提供一种催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的方法，包括：
(a)提供适于生物发光反应的检测工作液，其中包括：
检测底物，包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物；
检测缓冲液，其中含有聚乙烯基吡咯烷酮K30；
(b)以(a)的检测工作液测定ATP测试物，分析所述ATP测试物催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的情况。
在本发明的另一方面，提供一种增强萤火虫萤光素酶ATP生物发光法检测性能的方法，包括：以适于生物发光反应的检测工作液测定ATP测试物，所述检测工作液中含有检测底物和检测缓冲液，所述检测底物包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物；且在检测缓冲液中添加聚乙烯基吡咯烷酮K30；较佳地，所述检测性能包括(但不限于)：提高酶稳定性，提高反应稳定性，增强检测信号，提高检测灵敏度，扩展检测范围，增加检测信号的半衰期。
在另一优选例中，所述萤火虫萤光素酶是野生型萤火虫萤光素酶或其突变体；较佳地，所述野生型萤火虫萤光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述突变体包括氨基酸序列基于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的酶：第357位由Lys突变为Glu；第394位由Pro突变为Ala；第34位由Asp突变为Val；更佳地，所述突变体为基于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶第357位由Lys突变为Glu的酶。
在另一优选例中，(a)中，所述检测底物中，所述括萤火虫萤光素酶和萤光素底物为冻干剂；较佳地，所述括萤火虫萤光素酶和萤光素底物与海藻糖、蔗糖或其组合混合形成冻干剂；更佳地，与海藻糖和蔗糖混合形成冻干剂；
在另一优选例中，萤火虫萤光素酶的浓度为5～50μg/ml，萤光素的浓度为0.05～5mM，海藻糖的浓度为0.5～8％(w/v)，蔗糖的浓度为0.8～12％(w/v)。
在另一优选例中，(b)中，所述检测缓冲液的pH6.5～8.0，较佳地pH6.8～7.8；较佳地，所述检测缓冲液包括pH缓冲液，所述pH缓冲液选自(但不限于)：Tris缓冲液，Hepes缓冲液，柠檬酸钠缓冲液，磷酸氢二钾缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液，MOPS缓冲液，Tricine缓冲液，MES缓冲液，Tris-HCl缓冲液，PIPES缓冲液，或其组合。
在另一优选例中，(b)中，所述检测缓冲液包括：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。
在另一优选例中，在所述适于生物发光反应的检测工作液中，所述MgSO4、NaCl和Triton X-100，或可选的BSA、Gelatin、溶菌酶、破壁酶或脱氧胆酸钠的量为(均为工作液中终浓度)：
MgSO4：2～20mM，较佳地4～18mM(如5、6、8、10、12、15、16mM)；
NaCl：10～300mM，较佳地20～250mM(如25、50、80、100、150、200mM)；
Triton X-100：0.1～5％(v/v)，较佳地0.15～3％(v/v)(如0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5％(v/v))；
BSA：0.5～5mg/mL，较佳地0.8～3mg/mL(如1、1.5、2、2.5mg/mL)；
Gelatin：0.1～5％(w/v)，较佳地0.15～3％(w/v)(如0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5％(w/v))；
溶菌酶：0.3～10mg/mL，较佳地0.5～8mg/mL(如1、1.5、2、3、5、6mg/mL)；
破壁酶：3～150U/mL，较佳地5～120U/mL(如8、10、20、40、60、80、100U/mL)；或
脱氧胆酸钠：0.02～0.5％(w/v)，较佳地0.05～0.4％(w/v)(如0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35％(w/v))。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于进行体外ATP检测；较佳地，用于包括(但不限于)以下的检测：测定包含于溶液体系中的ATP的量；细胞(包括微生物细胞)活力检测；较佳地，所述ATP测试物为细胞，所述方法用于测定细胞活力。
在另一优选例中，所述的细胞活力与所述生物发光的发光量成正比。
在另一优选例中，所述的细胞活力检测是针对离体细胞培养物的。
在另一优选例中，所述的细胞活力检测是不以疾病诊断为直接目的的。
在另一优选例中，所述的细胞包括微生物细胞。
在另一优选例中，所述的微生物包括病原体微生物，如致病菌。
在另一优选例中，所述的微生物包括但不限于：大肠杆菌，沙门氏菌，变形杆菌，副溶血性弧菌，金黄色葡萄球菌，肉毒梭菌，蜡样芽胞杆菌，李斯特氏菌等等(原核细胞)。
在另一优选例中，所述的细胞包括但不限于：原核细胞，真核细胞(如酵母，真菌，寄生虫等)。
在本发明的另一方面，提供一种用于催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的检测体系或检测试剂盒，其中含有适于生物发光反应的检测工作液，包括分装或混合的：检测底物，包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物；检测缓冲液，其中含有聚乙烯基吡咯烷酮K30。
在另一优选例中，所述检测底物中，所述包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物为冻干剂；较佳地，所述包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物与海藻糖、蔗糖或其组合混合形成冻干剂；更佳地，与海藻糖和蔗糖混合形成冻干剂。
在另一优选例中，所述萤火虫萤光素酶是野生型萤火虫萤光素酶或其突变体；较佳地，所述野生型萤火虫萤光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述突变体包括氨基酸序列基于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的酶：第357位由Lys突变为Glu；第394位由Pro突变为Ala；第34位由Asp突变为Val；更佳地，所述突变体为基于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶第357位由Lys突变为Glu的酶。
在另一优选例中，所述检测缓冲液的pH6.5～8.0，较佳地pH6.8～7.8。
在另一优选例中，所述检测缓冲液包括：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、野生型萤火虫萤光素酶和突变体对ATP标准品的检测效果对比图。图A和图B分别为野生型萤火虫萤光素酶和突变体对0.01μM和1μM ATP标准品检测发光信号强度的对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示(***p<0.001)。
图2、野生型萤火虫萤光素酶和突变体对DH5α和酵母菌检测发光信号强度的对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示(***p<0.001)。
图3、野生型萤火虫萤光素酶和突变体对DH5α(图A)和酵母菌(图B)检测的发光信号稳定性的对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。
图4含不同添加剂的微生物检测底物冻干粉和未进行冻干的微生物检测底物溶液的检测效果对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示(**p<0.01,***p<0.001)。
图5、溶液装的微生物检测试剂、微生物检测底物冻干粉和添加保护剂的微生物检测底物冻干粉在不同温度保存7天后的活性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示(*p<0.05)。
图6、微生物检测裂解液对微生物细胞的裂解效果对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示(***p<0.001)。
图7、微生物检测试剂对ATP标准品的检测效果图。数据以平均数±标准偏差形式展示。
图8、微生物检测试剂对大肠杆菌和酵母菌的检测效果图。数据以平均数±标准偏差形式展示。
图9、微生物检测试剂对大肠杆菌和酵母菌检测的发光信号稳定性效果图。数据以平均数±标准偏差形式展示。
图10A-B、PBS和擦拭缓冲液浸润的棉签对材料表面微生物提取效果对比及微生物检测试剂对材料表面微生物的检测效果图。数据以平均数±标准偏差形式展示(**p<0.01,***p<0.001)。
图11、光密度(OD)测量和微生物检测试剂监测大肠杆菌(DH5α)增殖情况的效果对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种增强萤火虫萤光素酶ATP生物发光法检测性能的方法，包括生物发光反应的检测工作液进行优化，较佳地还包括对萤火虫萤光素酶和萤光素底物进行提高稳定性的保护。所述检测性能的增强包括：提高酶稳定性，提高反应稳定性，增强检测信号，提高检测灵敏度，扩展检测范围，增加检测信号的半衰期等。
如本文所用，除非另外说明，所述的“萤火虫萤光素酶突变体”、“突变型萤火虫萤光素酶”、“萤光素酶突变体”、“突变型萤光素酶”可互换使用，是指对应于突变前的萤火虫萤光素酶，在本发明人确定的一些与酶的活性/稳定性具有相关性的位点发生突变后构成的酶(多肽/蛋白)，较佳地相应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，突变选自下组的位点或其组合：第357位，第394位或第34位。
如本文所用，若需要表示突变前的萤火虫萤光素酶(野生型)，其可以为氨基酸序列如SEQ ID NO:1的酶。除非另外说明，本发明中的突变体的突变位点基于该SEQ ID NO:1所示的序列。
本发明中，除非另外说明，萤火虫萤光素酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示萤火虫萤光素酶突变体中突变的氨基酸，如K357E，表示位置357的氨基酸由出发萤火虫萤光素酶的K替换成E。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
如本文所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。
在本发明人的前期工作中，对萤火虫萤光素酶进行分析及突变改造，考虑了大量的位点后，针对各个位点进行独立地或组合地分析及实验，确定了K357E、P394A和D34V三个突变位点；它们具有活性高、稳定性高的特点。本发明中包括了野生型的萤火虫萤光素酶或其突变体，优选地为其突变体，优选地为K357E。
本发明的萤火虫萤光素酶或其突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括所述萤火虫萤光素酶或其突变体的片段、衍生物和类似物，只要它们基本上保持了本发明的实施例验证的酶接近或相同的生物学功能或活性。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，“萤火虫萤光素酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括萤火虫萤光素酶突变体的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，“萤火虫萤光素酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的萤火虫萤光素酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。
发明还提供所述萤火虫萤光素酶突变体的类似物。这些类似物与所述萤火虫萤光素酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。
在适合的反应条件下，萤火虫萤光素酶可催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光；也即，本发明的萤火虫萤光素酶可应用于三磷酸腺苷生物发光法，作为催化剂。三磷酸腺苷生物发光法是一种经过简化的生物化学方法，利用ATP与萤光素-萤光素酶复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷(ATP)，该法可用于体外环境或细胞的ATP量的测定。生物发光反应需要ATP、萤光素和萤火虫萤光素酶。反应期间萤光素被氧化并发出荧光，光子的数量可采用ATP荧光仪进行测量，光子的数量的ATP含量成正比。应用于细胞活力测定时，由于每种细胞中的ATP含量是恒定的，样品中ATP含量与样品中细胞的数量有关。这一方法可在非常快的时间内(例如数秒)进行ATP量的测定。利用本发明的萤火虫萤光素酶突变体，可以更为高效、灵敏地实现检测。
本发明中，对生物发光反应的检测工作液进行优化，较佳地还包括对萤火虫萤光素酶和萤光素底物进行提高稳定性的保护。在获得了本发明的技术方案后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用萤光素酶及其底物来发挥催化氧化萤火虫萤光素、在ATP存在的条件下产生生物发光的作用。
在优选的方式中，所述催化在适于反应的体系中进行，所述适于反应的体系中包括：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。
基于萤火虫萤光素酶的ATP生物发光法的应用范围十分广泛，可被应用于食品(如微生物检测)、药品、电子和化妆品等众多领域。例如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。ATP生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。ATP生物发光法还可用于食品生产环境的清洁度检测；例如，用ATP生物发光法检测食品生产线及厨房、冰箱、食品操纵台、铁路站车食品器具等处的清洁度。ATP生物发光法还可用于医疗环境中的清洁度检测；例如，对于手术用具、医用耗材的微生物检测。
对于动植物组织样品或细胞样品，也可应用如本发明的方法来进行ATP量的检测，以研究生物代谢性能等。例如，在涉及转基因研究的植物学领域中，可对于植物的愈伤组织进行ATP含量的测定，以研究其中的细胞能量代谢的特点。
应理解，本发明的具有更高活性及稳定性的萤火虫萤光素酶突变体，适用于多种多样本领域已知或正在发展的ATP检测方法中，具有广泛的可应用性。
在本发明的具体实施例中，本发明使用的微生物检测试剂由冻干粉形式的微生物检测底物和微生物检测缓冲液两部分组成，微生物检测底物由萤火虫萤光素酶和萤光素底物及保护剂混合后进行冻干，所用的萤火虫萤光素酶是一种突变体，具有高活性和高稳定性，微生物检测缓冲液中经过优化加入表面活性剂K30，可以高效裂解并提取微生物ATP。实施例中的萤火虫萤光素酶突变体活性要高于野生型萤火虫萤光素酶90％以上，且产生的萤光更稳定，半衰期可到2.5小时；微生物检测底物在冻干时添加的保护剂可以有效的保证微生物检测底物的活性、确保检测效果，并且有效的提高了检测试剂的保存稳定性；微生物检测缓冲液中含有的K30，可以显著提高微生物细胞的裂解效果，确保ATP的有效提取。在实际使用中，经擦拭缓冲液浸润的棉棒对待检材料表面进行擦拭，可以有效的提取材料表面的微生物，其信号强度比PBS浸润的棉棒高出70％。利用本发明检测微生物的活性，微生物细胞的ATP提取效率高，微生物检测试剂稳定，检测方法高效快捷，仅需几分钟就可以得到准确的检测结果，且检测灵敏度非常高、最低可检测出5个微生物，同时产生的萤光信号非常稳定、信号半衰期可长达2.5小时以上。
萤火虫萤光素酶突变体的组合物/试剂盒
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的萤火虫萤光素酶或其突变体以及在检测中所需的其它组分。这类组分包括(但并不限于)选自下组的组分：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。本领域技术人员可根据实际用途确定组合物中萤火虫萤光素酶或其突变体的有效量。所述的组合物中还可添加进一步调节本发明的萤火虫萤光素酶突变体酶活性或促进反应进程的其它物质。
本发明还提供了一种检测体系，其中包括：本发明的萤火虫萤光素酶或其突变体、萤火虫萤光素(作为底物)；较佳地还包括选自下组的组分：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。该检测体系中，当加入待测样品后，可以在很短的时间内发生反应，获得测定结果。
为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种检测体系或检测试剂盒，其中包括：本发明的萤火虫萤光素酶或其突变体、萤火虫萤光素(作为底物；较佳地还包括选自下组的组分：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。其中，所述的试剂可被独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。
作为本发明的优选方式，所述的检测试剂盒中还可包括：细胞裂解试剂，和/或ATP提取试剂。
作为本发明的优选方式，所述的检测试剂盒中，还可包括使用说明书，以指导人们以正确的方法应用本发明的试剂盒。
为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种ATP测试仪，其中包括：容器，包含于容器中的所述的萤火虫萤光素酶或其突变体；容器，包含于容器中的萤光素酶底物(如萤光素)；采样(如拭子)、加样及反应装置，用于添加待测样品，该待测样品是需要进行ATP测定的样品；气体供应装置，所述气体包含氧气。或者，也可以自然状态下存在的空气(氧气)来替代该气体供应装置。
作为本发明的优选方式，所述的ATP测试仪中还包括：容器，以及包含于容器中的：pH缓冲液；以及MgSO4，NaCl和Triton X-100；较佳地，还包括选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠。所述的ATP测试仪中，所述的试剂被独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。所述的ATP测试仪内可设置有一些计算程序，以及设置有输出屏，从而直观地向人们展示测定结果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、实验材料、试剂与仪器
大肠杆菌DH5α、酵母菌(DE3)、ATP标准品、ATP检测裂解液、溶菌酶、脱氧胆酸钠、抗生素等材料和试剂均为碧云天商业销售的材料和试剂。
超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
pure蛋白纯化系统及其配套Ni亲和层析预装柱和Superdex200凝胶过滤层析预装柱购自美国GE公司。
多功能酶标仪Varioskan LUX购自ThermoFisher。
2、实验方法
2.1酶的表达和纯化
野生型萤火虫萤光素酶(146-1H2)氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVASIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGYFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPLHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG
146-1H2 K357E突变体为上述SEQ ID NO:1基础上，第357位发生K至E的突变而形成的突变体(参见专利ZL 202110347736.6，发明名称：一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用；其中SEQ ID NO:3的突变体)。
将表达萤火虫萤光素酶146-1H2 K357E突变体的BL21(DE3)菌种(含pET-N-His-luc4-K357E-C-His质粒)和萤火虫萤光素酶野生型菌株(含pET-N-His-luc4-C-His质粒)在含有抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4-0.6，再加入终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG在16℃下以200rpm摇动培养16小时，诱导蛋白表达。IPTG诱导后的发酵液以8000×g离心5分钟收集菌体。菌体用裂解液(50mM NaH2PO4.2H2O，300mMNaCl，pH8.0，10％甘油，1mM DTT)于超声波细胞粉碎机超声粉碎，低温高速离心收集破碎上清液，4℃环境下使用Ni亲和层析纯化柱进行纯化收集，得到纯化的萤火虫萤光素酶。纯化后的酶使用储存缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油)于-20℃保存。用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime,P0006)，通过在595nm处的吸光度确定浓度。
2.2萤火虫萤光素酶突变体活性的检测
2.2.1萤火虫萤光素酶突变体用于ATP标准品的检测
用碧云天的ATP检测裂解液稀释的浓度为0.01μM和1μM的ATP标准品100微升作为样品，用100微升ATP检测裂解液作为空白对照，加入萤光素酶底物和纯化得到的野生型或突变体萤火虫萤光素酶等物质配制的检测试剂100微升，混匀后用多功能酶标仪化学发光进行检测。ATP标准品孔的萤光值明显高于空白对照孔的萤光值，可认为纯化得到的萤火虫萤光素酶具有萤火虫萤光素酶活性；突变体的萤光值明显高于野生型的萤光值，则认为突变体的萤火虫萤光素酶活力较野生型有明显的提高。
2.2.2萤火虫萤光素酶突变体用于微生物细胞活性和发光稳定性的检测
借助于ATP依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应，通过微生物细胞内ATP水平来反映代谢活力。希望通过对微生物细胞的活性检测来进一步确定该纯化的萤火虫萤光素酶突变体的活性。
大肠杆菌和酵母菌的活性及发光信号的稳定性检测。小摇过夜的大肠杆菌和酵母菌，分别用LB和PYD稀释10倍，各取100微升加入96孔板中作为样品，取100微升加入萤光素酶底物和纯化得到的萤火虫萤光素酶等物质配制的检测工作液100微升，混匀、室温震荡2分钟，室温孵育5分钟后进行化学发光检测，每10分钟测定一次。
2.3微生物检测底物的冻干及冻干粉的稳定性检测
2.3.1微生物检测底物的冻干
在50μg/ml萤火虫萤光素酶突变体、0.5mM萤光素的混合液中分别添加3％海藻糖、1mg/ml BSA、3％甘露醇、3％蔗糖、2％海藻糖+1mg/ml BSA、2％海藻糖+3％甘露醇、2％海藻糖+3％蔗糖后进行冻干作为检测底物，以未加这些试剂的萤火虫萤光素酶和萤光素冻干粉作为对照，将冻干粉用微生物检测缓冲液溶解后得到微生物检测试剂，以用萤火虫萤光素酶和萤光素溶液配制的微生物检测试剂作为对照，以大肠杆菌作为样品，考察不同的保护剂在冻干过程中对微生物检测底物的保护效果，确保检测底物的最大活性。
2.3.2微生物检测底物冻干粉的稳定性测试
将含和不含保护剂的微生物检测底物冻干粉在-20℃、4℃、25℃和37℃分别保存7天，然后用微生物检测缓冲液溶解配制成微生物检测试剂；以在相同条件下保存的、用萤火虫萤光素酶和萤光素溶液配制的溶液状的微生物检测试剂作为对照，测定大肠杆菌的活力，以考察冻干的微生物检测底物的保存稳定性。
2.4微生物检测缓冲液对微生物细胞的裂解效果检测
以小摇过夜的大肠杆菌和酵母菌作为样品，在含有Triton X-100的微生物检测缓冲液溶中再分别添加溶菌酶、破壁酶、脱氧胆酸钠和K30等后，溶解微生物检测底物配制成微生物检测试剂测定大肠杆菌的活力，以考察添加的各裂解组分对微生物细胞的裂解效果。
2.5微生物检测试剂用于ATP标准品的检测
通过对ATP标准品的检测来测定微生物检测试剂的使用效果，将ATP标准品用PBS分别稀释成浓度为0、1pM、3pM、10pM、30pM、100pM、300pM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM、3000nM、10,000nM的ATP标准溶液，100微升每孔加入96孔板中作为标准品孔，各孔加入微生物检测试剂100微升，混匀后进行化学发光检测。
2.6微生物检测试剂用于微生物细胞活性的检测
小摇过夜的大肠杆菌和酵母菌，离心收集菌液，分别用LB和PYD重悬稀释至酶标仪测得OD600为1.1，再依次做10倍的稀释，取100微升加入96孔板中作为样品，取100微升LB和PYD作为空白对照，加入微生物检测试剂100微升，混匀、室温震荡5分钟，室温孵育5分钟后进行化学发光检测。
2.7微生物检测试剂用于微生物检测时发光信号稳定性的检测
取小摇过夜的大肠杆菌和酵母菌，100微升每孔加入96孔板中作为样品，加入微生物检测试剂100微升，混匀、室温震荡5分钟，室温孵育5分钟后进行化学发光检测，每10分钟测定一次。
2.8微生物检测试剂用于材料表面微生物的检测
取长柄的无菌棉签，分别用PBS和擦拭缓冲液浸润后，反复擦拭材料表面以获得微生物，将棉签置于盛有PBS和微生物检测缓冲液的离心管中洗下微生物，即得微生物样品溶液。用PBS和微生物检测缓冲液将微生物样品溶液做10倍、100倍和1000倍的稀释，各取100微升加入96孔板中，以100微升PBS和微生物检测缓冲液作为空白对照，加入萤火虫萤光素酶、萤光素配制的微生物检测试剂100微升，混匀后测定萤光，从而反映微生物的活性，以检测材料表面微生物的污染程度。
2.9微生物检测试剂用于微生物的生长监测
将过夜培养的大肠杆菌按照1:1000的比例接种于新鲜的LB培养基中，250rpm振荡37℃培养，在不同时间点取样，200微升加入透明的96孔板用酶标仪测定OD600，100微升加入白板，用微生物检测试剂检测菌液的活力，用微生物检测试剂和光密度(OD)测量对比监测大肠杆菌(DH5α)的增殖情况。
实施例1、突变体与野生型萤火虫萤光素酶的性能分析
如ZL 202110347736.6中所验证，萤火虫萤光素酶突变体146-1H2 K357E的发光信号强度要高于野生型萤火虫萤光素酶100-250％，发光信号的半衰期相比于野生型的15分钟要长很多，可达2.5小时以上。
表达纯化获得的野生型和萤火虫萤光素酶突变体146-1H2 K357E，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，根据测定的蛋白浓度结果配制检测工作液(配方为：15μg/ml萤火虫萤光素酶，0.2mM D-Luciferin；5mM MgSO4，50mM Tris，pH 7.2，25mM NaCl，1mg/ml BSA，0.2％(v/v)Triton X-100，2mg/ml溶菌酶)，测定ATP标准品和大肠杆菌、酵母菌的活性及发光信号的稳定性。
结果显示，和野生型萤火虫萤光素酶相比，萤火虫萤光素酶突变体具有更高的活性和发光信号稳定性。萤火虫萤光素酶突变体具有很高的酶活性，0.01μM ATP的萤光值即可以达到空白对照的50倍以上(图1A)。和野生型的萤火虫萤光素酶信号相比，对ATP标准品、大肠杆菌和酵母菌的检测，萤火虫萤光素酶突变体的信号强度分别高于野生型萤火虫萤光素酶120％、90％和180％(图1和图2)，发光信号在60分钟内的变动不超过15％，信号半衰期长达2.5-3小时，而野生型的萤火虫萤光素酶信号半衰期仅在25分钟左右，具有显著的差异(图3)。
实施例2、检测底物的保存稳定性分析
1、海藻糖和蔗糖的组合有效保证检测底物冻干粉的活性
20μg/ml萤火虫萤光素酶突变体和0.2mM D-Luciferin的混合物，分别添加3％海藻糖、1mg/ml BSA、3％甘露醇、3％蔗糖、2％海藻糖+1mg/ml BSA、2％海藻糖+3％甘露醇、2％海藻糖+3％蔗糖作为保护剂冻干得到微生物检测底物(浓度均为反应体系中的终浓度)。
用微生物检测缓冲液(5mM MgSO4，75mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，0.2％(w/v)Gelatin，1％(v/v)Triton X-100，5mg/ml溶菌酶，20U/ml破壁酶)溶解配制成微生物检测试剂，测定大肠杆菌的活性。
结果显示，单纯地对表达纯化获得的蛋白进行冻干，冻干对微生物检测底物活性的影响很大，冻干后检测底物会损失约50％的活性；海藻糖、BSA、甘露醇和蔗糖的加入都可以一定程度的保护检测底物的活性，但是保护效果达不到100％，效果最佳的海藻糖可以保护80％的活性；而2％海藻糖和3％蔗糖的组合可以100％保护检测底物的活性(图4)。
2、含有海藻糖和蔗糖的微生物检测底物冻干粉的稳定性更高
分别将冻干的微生物检测底物(30μg/ml萤火虫萤光素酶突变体，0.5mM D-Luciferin，2％海藻糖，3％蔗糖)和微生物检测缓冲液(15mM MgSO4，150mM柠檬酸钠，pH7.8，200mM NaCl，2mg/ml BSA，1％(v/v)Triton X-100，0.1％(w/v)脱氧胆酸钠，50U/ml破壁酶)同时置于-20℃、4℃、25℃、37℃保存7天；以相同条件保存的溶液装的微生物检测试剂(30μg/ml萤火虫萤光素酶突变体，0.5mM D-Luciferin，15mM MgSO4，150mM柠檬酸钠，pH7.8，200mM NaCl，2mg/ml BSA，1％(v/v)Triton X-100，0.1％(w/v)脱氧胆酸钠，50U/ml破壁酶)作为对照，检测大肠杆菌的活力。
结果显示，以保存在-20℃的试剂作为对照，溶液装的微生物检测试剂在4℃、25℃、37℃保存7天活力分别下降10％、35％和55％，未添加保护剂的微生物检测底物冻干粉在4℃、25℃、37℃保存7天活力分别下降5％、20％和40％，而添加海藻糖和蔗糖的微生物检测底物冻干粉在4℃、25℃、37℃保存7天活力仅分别下降2％、10％和30％，在25℃和37℃保存的稳定性显著提高。(图5)。
因此，在检测底物中同时添加适量的海藻糖和蔗糖可以有效的保证检测底物冻干粉的活性，并提高检测底物的保存稳定性。
实施例3、微生物检测缓冲液中添加表面活性剂K30显著提高检测效果
为进一步优化微生物检测试剂对微生物细胞的裂解效果，在已含有Triton X-100的微生物检测缓冲液溶中再分别添加溶菌酶、破壁酶、脱氧胆酸钠、K30等，溶解微生物检测底物配制成微生物检测试剂(25μg/ml萤火虫萤光素酶突变体(非冻干)，0.25mM D-Luciferin(非冻干)，10mM MgSO4，200mM磷酸氢二钾，pH 7.0，75mM NaCl，2mg/ml BSA，0.5％(v/v)Triton X-100，0.1％(w/v)脱氧胆酸钠(或0.1％ NP40、或5mg/ml溶菌酶、或100U/ml破壁酶、或0.05％ K30))测定大肠杆菌的活力。
结果显示，在含有0.5％(v/v)Triton X-100的前提下，0.1％ NP40的加入会降低检测效果，0.1％(w/v)脱氧胆酸钠、或5mg/ml溶菌酶、或100U/ml破壁酶的加入对检测结果的影响不大，而0.05％ K30的加入会显著地提高检测效果，信号强度较其它组高2.6倍(图6)。
实施例4、微生物检测试剂对ATP标准品和微生物细胞的检测性能的提高
1、微生物检测试剂对ATP标准品和微生物细胞活性检测具有超高的检测灵敏度和超宽的检测范围
用微生物检测试剂(配方为：50μg/ml萤火虫萤光素酶突变体(非冻干)，1mM D-Luciferin(非冻干)，10mM MgSO4，50mM MOPS，pH 7.0，75mM NaCl，0.5％(w/v)Gelatin，2％(v/v)Triton X-100、0.05％ K30)测定ATP标准曲线和大肠杆菌、酵母菌的细胞活力曲线。
结果显示，微生物检测试剂对ATP标准品和微生物细胞活性曲线都有较好的检测效果，都具有超高的检测灵敏度和超宽的线性范围，根据计算，最低可检测出约2-3×10- 18mol的ATP，对ATP标准品在1pM-10μM浓度范围内线性良好，对于大肠杆菌(DH5α)和酵母菌(Y187)可以在约5到1011个细菌范围内呈现良好的线性关系，当细菌数量仅为10个/孔时，发光强度与空白孔的信号差值也可以达到100，而且检测速度非常快，只需要5分钟就可以得到检测结果(图7和图8)。
2、微生物检测试剂用于微生物检测产生的发光信号非常稳定、信号半衰期长
用微生物检测试剂(检测底物(冻干制剂)配方为：50μg/ml萤火虫萤光素酶突变体，0.5mM D-Luciferin，3％海藻糖，5％蔗糖；检测缓冲液配方为：15mM MgSO4，25mMTricine，pH7.8，150mM NaCl，0.5％(w/v)Gelatin，2％(v/v)Triton X-100、0.03％ K30)测定大肠杆菌和酵母菌的发光信号稳定性。
结果显示，对大肠杆菌的检测，发光信号在60分钟内的变动不到10％，信号半衰期均约2.5小时，对酵母菌的检测，发光信号在60分钟基本恒定，信号半衰期约3小时(图9)。
3、微生物检测试剂可以有效的检测材料表面微生物的污染
微生物检测试剂可以有效的检测材料表面微生物的污染，用擦拭缓冲液浸润的棉签擦拭材料表面，可以高效的提取材料表面的微生物，信号强度要比PBS浸润的棉棒提取的微生物的信号强度高70％。用PBS和擦拭缓冲液(0.05％ Tween-20、0.1％酚醚磷酸酯TXP-10)浸润的无菌棉签分别擦拭微生物表面，洗下微生物得到微生物样品溶液，用微生物检测试剂(配方为：10μg/ml萤火虫萤光素酶突变体(非冻干)，0.1mM D-Luciferin(非冻干)，10mM MgSO4，100mM MES，pH 6.8，100mM NaCl，0.2％(w/v)Gelatin，0.5％(v/v)Triton X-100，1mg/ml溶菌酶，10U/ml破壁酶)测定样品溶液中的微生物活性，以检测材料表面微生物的提取效果和污染程度。
结果显示，用擦拭缓冲液浸润的棉棒擦拭污染的微生物表面、再涮洗可以有效的提取材料表面的微生物，其萤光信号强度要高于PBS处理的样品70％，即使稀释1000倍，其萤光信号也可以高于空白对照2-3倍，可以有效的检测出材料表面微生物的污染(图10A-B)。
4、微生物检测试剂可以有效的监测微生物的生长
将过夜培养的大肠杆菌按照1:1000的比例接种于新鲜的LB培养基中，在不同时间点取样，用酶标仪在600nm测定OD值或使用微生物检测试剂(配方为：50μg/ml萤火虫萤光素酶突变体(非冻干)，1mM D-Luciferin(非冻干)，20mM MgSO4，50mM柠檬酸钠，100mM磷酸氢二钾，pH 7.4，75mM NaCl，0.2％(w/v)Gelatin，1％(v/v)Triton X-100，0.02％ K30)检测菌液的萤光发光，通过光密度(OD)测量和微生物检测试剂检测对比监测大肠杆菌(DH5α)的增殖情况。
结果：对于微生物的生长监测，微生物检测试剂较光密度测量更高效更灵敏，大肠杆菌接种后1.5小时OD值检测才会和空白对照有明显的差异，而微生物检测试剂在接种后立即检测得到的萤光信号可以达到空白培养基的5倍以上，具有极高的检测灵敏度(图11)。
因此，本发明的微生物检测试剂对ATP标准品和微生物细胞的检测具有超高的检测灵敏度、超宽的检测范围和超长的信号半衰期，可以快速、高效的检测微生物污染、监测微生物的生长。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (16)
1.一种催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的方法，包括：
(a) 提供适于生物发光反应的检测工作液，其中包括：
检测底物，包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物；所述萤火虫萤光素酶是野生型萤火虫萤光素酶的突变体，基于SEQ ID NO: 1所示的萤火虫萤光素酶第357位由Lys突变为Glu的酶；
检测缓冲液，其中含有聚乙烯基吡咯烷酮 K30，MgSO4，NaCl和Triton X-100，及选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠；pH6.5～8.0；
所述适于生物发光反应的检测工作液中，聚乙烯基吡咯烷酮 K30 0.02%(v/v)、0.03%(v/v)或0.05%(v/v)；MgSO4 2～20mM，NaCl 10～300mM，Triton X-100 0.1～5%(v/v)；BSA0.5～5mg/mL，Gelatin 0.1～5%(w/v)，溶菌酶0.3～10mg/mL，破壁酶3～150U/mL，脱氧胆酸钠0.02～0.5%(w/v)；
(b) 以(a)的检测工作液测定ATP测试物，分析所述ATP测试物催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的情况。
2. 一种增强萤火虫萤光素酶ATP生物发光法检测性能的方法，包括：以适于生物发光反应的检测工作液测定ATP测试物，所述检测工作液中含有检测底物和检测缓冲液，所述检测底物包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物；且在检测缓冲液中添加聚乙烯基吡咯烷酮K30，MgSO4，NaCl和Triton X-100，及选自下组的试剂：BSA，Gelatin，溶菌酶，破壁酶，脱氧胆酸钠；pH6.5～8.0；所述检测性能包括：提高酶稳定性，提高反应稳定性，增强检测信号，提高检测灵敏度，扩展检测范围，增加检测信号的半衰期；所述萤火虫萤光素酶是野生型萤火虫萤光素酶的突变体，基于SEQ ID NO: 1所示的萤火虫萤光素酶第357位由Lys突变为Glu的酶；
在所述适于生物发光反应的检测工作液中，聚乙烯基吡咯烷酮 K30 0.02%(v/v)、0.03%(v/v)或0.05%(v/v)；MgSO4 2～20mM，NaCl 10～300mM，Triton X-100 0.1～5%(v/v)；BSA 0.5～5mg/mL，Gelatin 0.1～5%(w/v)，溶菌酶0.3～10mg/mL，破壁酶3～150U/mL，脱氧胆酸钠0.02～0.5%(w/v)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述检测底物中，所述萤火虫萤光素酶和萤光素底物为冻干剂；所述萤火虫萤光素酶和萤光素底物与海藻糖和蔗糖混合形成冻干剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，形成冻干剂时，海藻糖的浓度为0.5～8%(w/v)，蔗糖的浓度为0.8～12%(w/v)。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，检测工作液中，萤火虫萤光素酶的浓度为5～50µg/ml，萤光素的浓度为0.05～5mM。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，检测工作液中，所述检测缓冲液的pH6.8～7.8。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测缓冲液包括pH缓冲液，所述pH缓冲液选自：Tris缓冲液，Hepes缓冲液，柠檬酸钠缓冲液，磷酸氢二钾缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液，MOPS缓冲液，Tricine缓冲液，MES缓冲液，Tris-HCl缓冲液，PIPES缓冲液，或其组合。
8. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述适于生物发光反应的检测工作液中，所述聚乙烯基吡咯烷酮 K30 0.02%(v/v)、0.03%(v/v)或0.05%(v/v)，MgSO4 4～18mM、NaCl 20～250mM，Triton X-100 0.15～3%(v/v)；BSA 0.8～3 mg/mL、Gelatin 0.15～3%(w/v)、溶菌酶0.5～8mg/mL、破壁酶5～120 U/mL，脱氧胆酸钠0.05～0.4%(w/v)。
9.权利要求1～8任一所述的方法的应用，用于进行体外ATP检测。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，用于包括以下的检测：
测定包含于溶液体系中的ATP的量；
细胞活力检测。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述ATP测试物为细胞，所述方法用于测定细胞活力。
12.一种用于催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的检测体系或检测试剂盒，其中含有适于生物发光反应的检测工作液，包括分装或混合的：
检测底物，包括萤火虫萤光素酶和萤光素底物；所述萤火虫萤光素酶是野生型萤火虫萤光素酶的突变体，基于SEQ ID NO: 1所示的萤火虫萤光素酶第357位由Lys突变为Glu的酶；
检测缓冲液，其中含有：聚乙烯基吡咯烷酮 K30 0.02%(v/v)、0.03%(v/v)或0.05%(v/v)；MgSO4 2～20mM，NaCl 10～300mM和Triton X-100 0.1～5%(v/v)，及选自下组的试剂：BSA 0.5～5mg/mL，Gelatin 0.1～5%(w/v)，溶菌酶0.3～10mg/mL，破壁酶3～150U/mL，脱氧胆酸钠0.02～0.5%(w/v)；pH6.5～8.0。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述检测底物中，所述萤火虫萤光素酶和萤光素底物为冻干剂，所述萤火虫萤光素酶和萤光素底物与海藻糖、蔗糖混合形成冻干剂。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述检测缓冲液的pH6.8～7.8。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述检测缓冲液包括：pH缓冲液，选自：Tris缓冲液，Hepes缓冲液，柠檬酸钠缓冲液，磷酸氢二钾缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液，MOPS缓冲液，Tricine缓冲液，MES缓冲液，Tris-HCl缓冲液，PIPES缓冲液，或其组合。
16. 如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述聚乙烯基吡咯烷酮 K30 0.02%(v/v)、0.03%(v/v)或0.05%(v/v)，MgSO4 4～18mM、NaCl 20～250mM，Triton X-100 0.15～3%(v/v)；BSA 0.8～3 mg/mL、Gelatin 0.15～3%(w/v)、溶菌酶0.5～8mg/mL、破壁酶5～120U/mL，脱氧胆酸钠0.05～0.4%(w/v)。
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