JP3229884B2 - 細菌を検出する方法及びキット - Google Patents
細菌を検出する方法及びキットInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌を検出、同定及び／または定量する方
法と、該方法を実施する試験キットとに係わる。上記方
法は特に、特定の細菌属、種または血清型の生物を単離
形態で、または環境試料や法廷試料（forensic sample
s）中、もしくは食物中の汚染物質として検出すること
を可能にする。
法と、該方法を実施する試験キットとに係わる。上記方
法は特に、特定の細菌属、種または血清型の生物を単離
形態で、または環境試料や法廷試料（forensic sample
s）中、もしくは食物中の汚染物質として検出すること
を可能にする。
特定の細菌、特に特定の環境内に少数存在する細菌、
例えば汚染食物中のヒト病原菌（human bacterial path
ogens）をスクリーニングする方法の必要性は大きい。
公衆衛生及び品質管理に携わる機関は適当レベルの特異
性及び感度を有する迅速な細菌検出方法を必要としてい
るが、満足の行く方法は僅かしか存在しない。
例えば汚染食物中のヒト病原菌（human bacterial path
ogens）をスクリーニングする方法の必要性は大きい。
公衆衛生及び品質管理に携わる機関は適当レベルの特異
性及び感度を有する迅速な細菌検出方法を必要としてい
るが、満足の行く方法は僅かしか存在しない。
Ulitzer及びKuhnがJohn Wiley and Sons発行（1987）
のScholmerich等（Eds.）の“Bioluminescence and Che
miluminescence−new perspectives,"pp.463−472に述
べているような、遺伝子操作された生物発光バクテリオ
ファージ、即ちそのゲノムに“lux"遺伝子が挿入された
ウイルス粒子を用いることによって特定の細菌を検出す
ることが公知である。“lux"遺伝子は細菌のルシフェラ
ーゼをコードする遺伝子であり、上記技術は、標的細菌
への感染の際にバクテリオファージの遺伝子及びlux遺
伝子が標的細菌に注入され、後に発現するという事実に
基づいている。容易に測定可能な光が試料から発せられ
ることにより、標的細菌の存在が示される。ほとんどの
細菌はバクテリオファージ（通常“ファージ”と呼称）
によって攻撃されやすく、ファージの多くはその複製過
程終了時に当該ファージ自体の宿主を溶解または崩壊さ
せ、このような相互作用は様々な程度の宿主−ファージ
特異性を示す。
のScholmerich等（Eds.）の“Bioluminescence and Che
miluminescence−new perspectives,"pp.463−472に述
べているような、遺伝子操作された生物発光バクテリオ
ファージ、即ちそのゲノムに“lux"遺伝子が挿入された
ウイルス粒子を用いることによって特定の細菌を検出す
ることが公知である。“lux"遺伝子は細菌のルシフェラ
ーゼをコードする遺伝子であり、上記技術は、標的細菌
への感染の際にバクテリオファージの遺伝子及びlux遺
伝子が標的細菌に注入され、後に発現するという事実に
基づいている。容易に測定可能な光が試料から発せられ
ることにより、標的細菌の存在が示される。ほとんどの
細菌はバクテリオファージ（通常“ファージ”と呼称）
によって攻撃されやすく、ファージの多くはその複製過
程終了時に当該ファージ自体の宿主を溶解または崩壊さ
せ、このような相互作用は様々な程度の宿主−ファージ
特異性を示す。
Schutzbank等は上記技術の可能性を示したが、構築フ
ァージと標的でない他の種類の細菌との交叉反応性に伴
う問題点を指摘している。そのような問題点はより特異
的なファージを遺伝子工学的に製造することによって克
服し得る（例えば米国特許第4,348,478号参照）が、そ
の場合には、試験する必要性が存在する各種の標的細胞
それぞれのためにファージを用意しなければならない。
このような組み換え体は様々な理由から容易に構築でき
ず、その際ファージ自体の機能の崩壊を回避しなければ
ならないことが前記理由の相当部分を占める。
ァージと標的でない他の種類の細菌との交叉反応性に伴
う問題点を指摘している。そのような問題点はより特異
的なファージを遺伝子工学的に製造することによって克
服し得る（例えば米国特許第4,348,478号参照）が、そ
の場合には、試験する必要性が存在する各種の標的細胞
それぞれのためにファージを用意しなければならない。
このような組み換え体は様々な理由から容易に構築でき
ず、その際ファージ自体の機能の崩壊を回避しなければ
ならないことが前記理由の相当部分を占める。
最初、サルモネラファージ及び大腸菌ファージのみが
首尾よく改変できた。これは、以前はこれらの生物が分
子生物学的にかなり研究されたこと、及びlux遺伝子が
ファージ頭部に、ファージの感染能力を低下させること
なく適合し得ることが周知であったことによる。他の食
物病原体には上記のようなことは該当せず、広範囲の改
変ファージを構築し得るまでには多大の研究を行なわな
ければならない。
首尾よく改変できた。これは、以前はこれらの生物が分
子生物学的にかなり研究されたこと、及びlux遺伝子が
ファージ頭部に、ファージの感染能力を低下させること
なく適合し得ることが周知であったことによる。他の食
物病原体には上記のようなことは該当せず、広範囲の改
変ファージを構築し得るまでには多大の研究を行なわな
ければならない。
ファージの、その宿主細菌に対する特異性を利用する
別の方法がHirsh及びMartinによって、Journal of Food
Protection,Vol.47,No.5,pp.388−390（1984）に開示
されている。この方法は、ファージが濃縮ブイヨン上で
増殖した細菌の破壊を誘起して、細菌コロニー（bacter
ial lawns）の中に凹窩を生じさせることに依拠し、そ
の際前記凹窩が標的細菌、この引例ではサルモネラ菌属
の存在を示唆する。しかし、この方法は実施に時間が掛
かり、明確な結果が得られるまでに24時間を要し、かつ
５細胞/ml以上にしか感受性でない。
別の方法がHirsh及びMartinによって、Journal of Food
Protection,Vol.47,No.5,pp.388−390（1984）に開示
されている。この方法は、ファージが濃縮ブイヨン上で
増殖した細菌の破壊を誘起して、細菌コロニー（bacter
ial lawns）の中に凹窩を生じさせることに依拠し、そ
の際前記凹窩が標的細菌、この引例ではサルモネラ菌属
の存在を示唆する。しかし、この方法は実施に時間が掛
かり、明確な結果が得られるまでに24時間を要し、かつ
５細胞/ml以上にしか感受性でない。
本発明者はここに、ファージ複製サイクル終了時にに
新生ファージ粒子が放出される際に細菌の細胞壁が損傷
され、例えば溶解されると細胞内容物の放出が生起する
ことに基づく方法を提供する。この方法によって、ファ
ージゲノムへのlux遺伝子の挿入を必要とせずに、従っ
て検出するべき標的細菌を選択的に攻撃するのに適した
種類のファージの入手可能性によってしか特異性を限定
されずに、しかも改変しないファージを用いる既存技術
よりはるかに短い時間で特定細菌を検出できる。即ち、
本発明の方法は、必要な特異性を有するファージさえ見
出せれば任意の環境（食物、飲料水、医薬品、並びにヒ
ト、動物及び植物の罹患組織等）におけるほぼあらゆる
細菌の特異的で迅速な検出をより容易に実現し得る。本
発明の方法を用いれば1mlの乳試料中の１種のサルモネ
ラ菌属を12時間未満の時間で検出し得ることが判明し
た。
新生ファージ粒子が放出される際に細菌の細胞壁が損傷
され、例えば溶解されると細胞内容物の放出が生起する
ことに基づく方法を提供する。この方法によって、ファ
ージゲノムへのlux遺伝子の挿入を必要とせずに、従っ
て検出するべき標的細菌を選択的に攻撃するのに適した
種類のファージの入手可能性によってしか特異性を限定
されずに、しかも改変しないファージを用いる既存技術
よりはるかに短い時間で特定細菌を検出できる。即ち、
本発明の方法は、必要な特異性を有するファージさえ見
出せれば任意の環境（食物、飲料水、医薬品、並びにヒ
ト、動物及び植物の罹患組織等）におけるほぼあらゆる
細菌の特異的で迅速な検出をより容易に実現し得る。本
発明の方法を用いれば1mlの乳試料中の１種のサルモネ
ラ菌属を12時間未満の時間で検出し得ることが判明し
た。
即ち、本発明は、物質中に存在する特定の細菌属、種
または血清型の標的生物を検出、同定及び／または定量
する方法を提供し、この方法は前記物質または前記物質
由来の細菌を、標的生物に特異的に感染し、かつ標的生
物からの細胞成分の放出を実現する能力により選択した
バクテリオファージと共にインキュベートし、インキュ
ベーションの間に存在する細菌から放出される１種以上
の特定の細胞成分の量を測定し、並びに前記測定を標的
生物の存在、同等性及び／または量と関係付けることを
含む。好ましくは、バクテリオファージの存在下での物
質のインキュベーションは細菌支持培地中で行なう。
または血清型の標的生物を検出、同定及び／または定量
する方法を提供し、この方法は前記物質または前記物質
由来の細菌を、標的生物に特異的に感染し、かつ標的生
物からの細胞成分の放出を実現する能力により選択した
バクテリオファージと共にインキュベートし、インキュ
ベーションの間に存在する細菌から放出される１種以上
の特定の細胞成分の量を測定し、並びに前記測定を標的
生物の存在、同等性及び／または量と関係付けることを
含む。好ましくは、バクテリオファージの存在下での物
質のインキュベーションは細菌支持培地中で行なう。
好ましい細菌成分にヌクレオチドが含まれる。理論的
には、新生ファージ粒子の放出によって惹起される細胞
溶解により放出される任意のヌクレオチド、例えばNA
D、NADP、NADH、NADPH、ATPもしくはADP、cAMP、または
cGMPを、当分野で有効である、酵素に基づく多くのアッ
セイ系のうちの１種以上、例えば“カスケード”系を用
いることによって得られる感度で測定することが可能で
ある。例えば、英国特許第2,213,261号には還元型ピリ
ジンヌクレオチド、例えばNADHまたはNADPHのアッセイ
に用い得る、サリチレートモノオキシゲナーゼ系に基づ
く方法が開示されており、一方英国特許第2,240,845号
にはアルカリホスファターゼ/NAD/NADP系などの他の酵
素系が開示されている。ADP、cAMP、cGMP等に関する適
当なアッセイは当業者には自明であろう。
には、新生ファージ粒子の放出によって惹起される細胞
溶解により放出される任意のヌクレオチド、例えばNA
D、NADP、NADH、NADPH、ATPもしくはADP、cAMP、または
cGMPを、当分野で有効である、酵素に基づく多くのアッ
セイ系のうちの１種以上、例えば“カスケード”系を用
いることによって得られる感度で測定することが可能で
ある。例えば、英国特許第2,213,261号には還元型ピリ
ジンヌクレオチド、例えばNADHまたはNADPHのアッセイ
に用い得る、サリチレートモノオキシゲナーゼ系に基づ
く方法が開示されており、一方英国特許第2,240,845号
にはアルカリホスファターゼ/NAD/NADP系などの他の酵
素系が開示されている。ADP、cAMP、cGMP等に関する適
当なアッセイは当業者には自明であろう。
しかし、特に好ましいのはアデノシン三リン酸（AT
P）を測定することであり、ATPは多くの基質変換におけ
る補因子であり、また他の細菌ヌクレオチドに比べれば
比較的大量に放出されるので、様々な酵素と酵素基質と
の組み合わせでのアッセイにより容易に測定可能であ
る。放出されたATPのレベルを迅速かつ効率的に測定す
るには発光をもたらす酵素反応を利用することが特に好
ましく、その場合ルシフェラーゼを用いるのが最も有利
である。ATP放出は生物発光を用いる市販試薬で定量可
能であり、その際ルシフェラーゼにより触媒下にルシフ
ェリンの酸化を生起させて光の発生を促す。この反応の
量子効率はきわめて高く、発生した光の存在及び量から
放出されたATPの測定、即ち標的生物の存在及び数の確
認ができる。
P）を測定することであり、ATPは多くの基質変換におけ
る補因子であり、また他の細菌ヌクレオチドに比べれば
比較的大量に放出されるので、様々な酵素と酵素基質と
の組み合わせでのアッセイにより容易に測定可能であ
る。放出されたATPのレベルを迅速かつ効率的に測定す
るには発光をもたらす酵素反応を利用することが特に好
ましく、その場合ルシフェラーゼを用いるのが最も有利
である。ATP放出は生物発光を用いる市販試薬で定量可
能であり、その際ルシフェラーゼにより触媒下にルシフ
ェリンの酸化を生起させて光の発生を促す。この反応の
量子効率はきわめて高く、発生した光の存在及び量から
放出されたATPの測定、即ち標的生物の存在及び数の確
認ができる。
物質、例えば単離細菌の培養物中に比較的高濃度で発
生する特定細菌を同定または定量するには、当該細菌に
特異的なファージを前記培養物の一部または継代培養物
と共に成分アッセイ試薬の存在下にインキュベートする
か、またはインキュベートした後に前記試薬を添加し、
このようにアッセイを行なうことにより放出された成分
の量を測定しさえすればよい。
生する特定細菌を同定または定量するには、当該細菌に
特異的なファージを前記培養物の一部または継代培養物
と共に成分アッセイ試薬の存在下にインキュベートする
か、またはインキュベートした後に前記試薬を添加し、
このようにアッセイを行なうことにより放出された成分
の量を測定しさえすればよい。
例えば水や食物の中または表面上の汚染物質のように
比較的低濃度の特定細菌を同定、検出及び／または定量
する場合は、まず試験物質に由来する細菌の富裕化を例
えば数時間行なって標的細菌を、該細菌の放出成分、例
えばヌクレオチドが検出可能となる、バックグラウンド
レベルより高いレベルまで増加させなければならない。
上記富裕化は好ましくは、標的細菌の増殖に有利な選択
培地に試験物質かまたは試験物質由来の、例えばスワブ
に由来する培養物を接種し、これを培養することによっ
て行なう。典型的には、上記富裕化の継続時間は１日よ
り短く、例えば１〜10時間、好ましくは１〜５時間であ
る。
比較的低濃度の特定細菌を同定、検出及び／または定量
する場合は、まず試験物質に由来する細菌の富裕化を例
えば数時間行なって標的細菌を、該細菌の放出成分、例
えばヌクレオチドが検出可能となる、バックグラウンド
レベルより高いレベルまで増加させなければならない。
上記富裕化は好ましくは、標的細菌の増殖に有利な選択
培地に試験物質かまたは試験物質由来の、例えばスワブ
に由来する培養物を接種し、これを培養することによっ
て行なう。典型的には、上記富裕化の継続時間は１日よ
り短く、例えば１〜10時間、好ましくは１〜５時間であ
る。
富裕化後、既知の標的宿主特異性を有する１種以上の
ファージを培養物と混合し、混合物をインキュベートす
る。インキュベーションの間にファージが標的細菌に特
異的に感染し、複製サイクルが開始される。複製サイク
ル終了時に存在する標的細菌は破裂し（時間は種に応じ
て例えば20〜60分）、細胞成分、例えばヌクレオチドが
放出されるので、これを検出する。細菌を含有しない対
照試料も、標的でない細菌を含有する対照試料も、また
ファージを伴わない細菌を含有する対照試料も、バック
グラウンドレベルを越える実質的なレベル上昇は示さな
い。
ファージを培養物と混合し、混合物をインキュベートす
る。インキュベーションの間にファージが標的細菌に特
異的に感染し、複製サイクルが開始される。複製サイク
ル終了時に存在する標的細菌は破裂し（時間は種に応じ
て例えば20〜60分）、細胞成分、例えばヌクレオチドが
放出されるので、これを検出する。細菌を含有しない対
照試料も、標的でない細菌を含有する対照試料も、また
ファージを伴わない細菌を含有する対照試料も、バック
グラウンドレベルを越える実質的なレベル上昇は示さな
い。
そのうえ、選択するファージ−宿主対の生物学的特性
次第では、本発明の方法は高い特異性を有しながら、高
い感度及び迅速性も有し得る。先に述べたATPアッセイ
法を用いて、本発明の発明者は、乳中に存在する黄色ブ
ドウ球菌、リステリアモノサイトゲネス及びサルモネラ
菌を含めた幾種かのヒト病原体、並びに表面にリステリ
ア菌などが危険な病原体として存在し得ることが知られ
ているレタスなどの食物上の他のヒト病原体を検出する
系を容易に開発した。サルモネラ菌、リステリア菌、ブ
ドウ球菌、大腸菌及びシュードモナス菌はいずれも本発
明の方法によって容易に検出可能であることが判明し
た。しかし、必要な１種以上の特異的ファージの入手可
能性以外に本発明の方法の適用を限定するものは無いこ
とは、当業者には理解されよう。
次第では、本発明の方法は高い特異性を有しながら、高
い感度及び迅速性も有し得る。先に述べたATPアッセイ
法を用いて、本発明の発明者は、乳中に存在する黄色ブ
ドウ球菌、リステリアモノサイトゲネス及びサルモネラ
菌を含めた幾種かのヒト病原体、並びに表面にリステリ
ア菌などが危険な病原体として存在し得ることが知られ
ているレタスなどの食物上の他のヒト病原体を検出する
系を容易に開発した。サルモネラ菌、リステリア菌、ブ
ドウ球菌、大腸菌及びシュードモナス菌はいずれも本発
明の方法によって容易に検出可能であることが判明し
た。しかし、必要な１種以上の特異的ファージの入手可
能性以外に本発明の方法の適用を限定するものは無いこ
とは、当業者には理解されよう。
本発明の更に好ましい具体例では、何等かの富裕化イ
ンキュベーションを行なう前に、調べている物質試料中
に存在する細菌の実質的に総てを活性化し、もしくは
“蘇生”させるべく前記試料をペプトン水やブレインハ
ートインフュージョン（BHI）ブイヨンなどの非選択的
な細菌支持培地と共にインキュベートすると有利である
ことが明らかとなった。このようなインキュベーション
は１〜５時間行なうことが、必須ではないが好ましい。
しかし、富裕化インキュベーションの場合同様、特に物
質の新鮮度次第では上記より短いかまたは長い期間が適
当となり得る。
ンキュベーションを行なう前に、調べている物質試料中
に存在する細菌の実質的に総てを活性化し、もしくは
“蘇生”させるべく前記試料をペプトン水やブレインハ
ートインフュージョン（BHI）ブイヨンなどの非選択的
な細菌支持培地と共にインキュベートすると有利である
ことが明らかとなった。このようなインキュベーション
は１〜５時間行なうことが、必須ではないが好ましい。
しかし、富裕化インキュベーションの場合同様、特に物
質の新鮮度次第では上記より短いかまたは長い期間が適
当となり得る。
好ましい一具体例では次に、蘇生させた物質の試料
を、他の邪魔な細菌の増殖よりも調べている細菌の増殖
に有利なように構成された選択培地に移し、例えば１〜
５時間更にインキュベートする。好ましくは、蘇生段階
から得た培地のアリコートを上記のように移す。
を、他の邪魔な細菌の増殖よりも調べている細菌の増殖
に有利なように構成された選択培地に移し、例えば１〜
５時間更にインキュベートする。好ましくは、蘇生段階
から得た培地のアリコートを上記のように移す。
インキュベーション完了後、培養培地の全部または一
部を、例えば懸濁液の形態かまたは凍結乾燥形態の選択
したファージと混合し、かつ用いるファージと細菌との
組み合わせの生物学的特性に従い選択した所定の温度で
所定の期間インキュベートする。次に、その放出量を測
定する成分、例えばヌクレオチドの量を適当なアッセイ
系、例えば酵素−基質系を用いて測定する。
部を、例えば懸濁液の形態かまたは凍結乾燥形態の選択
したファージと混合し、かつ用いるファージと細菌との
組み合わせの生物学的特性に従い選択した所定の温度で
所定の期間インキュベートする。次に、その放出量を測
定する成分、例えばヌクレオチドの量を適当なアッセイ
系、例えば酵素−基質系を用いて測定する。
細胞成分の放出をアッセイするには、完結した蘇生ま
たは選択富裕化ステップの培地、または物質自体の試料
を含有する培地を容器、例えばATPの場合であればルミ
ノメーター管（luminometer tube）内で選択したファー
ジと好ましく混合し、かつ適当な温度で適当な期間、例
えば20〜40℃で30〜60分間インキュベートして細胞を溶
解させる。上記条件はファージ−細菌系に依存する。AT
P測定のためには、発光アッセイ試薬、例えばルシフェ
リン−ルシフェラーゼ系の試薬を上記インキュベーショ
ン期間もしくは細胞溶解期間の前または後に添加し得、
前記期間の間中に、または試薬添加の際に発せられた光
をルミノメーターで検出し、放出されたATPの量と関係
付ける。いずれの場合も、ファージを存在させずにイン
キュベートしたか、またはファージ及び既知量の標的細
菌を存在させてインキュベートした試料においてバック
グラウンド成分レベル、例えばヌクレオチドレベルとの
比較のための対照試験を行なえば、細菌数を確定するた
めの検量数（calibration curves）を得ることができ
る。そのような対照試験には、物質中に存在する生物の
特性をより完璧に確認するべく、異なる特異性を有する
別のファージで試験してみることが含まれ得る。同様
に、特異的ファージを異にする数種の細菌のスクリーニ
ングに本発明の方法を用いる場合は同一インキュベーシ
ョンにおいて数種のファージを用いることも可能であ
る。
たは選択富裕化ステップの培地、または物質自体の試料
を含有する培地を容器、例えばATPの場合であればルミ
ノメーター管（luminometer tube）内で選択したファー
ジと好ましく混合し、かつ適当な温度で適当な期間、例
えば20〜40℃で30〜60分間インキュベートして細胞を溶
解させる。上記条件はファージ−細菌系に依存する。AT
P測定のためには、発光アッセイ試薬、例えばルシフェ
リン−ルシフェラーゼ系の試薬を上記インキュベーショ
ン期間もしくは細胞溶解期間の前または後に添加し得、
前記期間の間中に、または試薬添加の際に発せられた光
をルミノメーターで検出し、放出されたATPの量と関係
付ける。いずれの場合も、ファージを存在させずにイン
キュベートしたか、またはファージ及び既知量の標的細
菌を存在させてインキュベートした試料においてバック
グラウンド成分レベル、例えばヌクレオチドレベルとの
比較のための対照試験を行なえば、細菌数を確定するた
めの検量数（calibration curves）を得ることができ
る。そのような対照試験には、物質中に存在する生物の
特性をより完璧に確認するべく、異なる特異性を有する
別のファージで試験してみることが含まれ得る。同様
に、特異的ファージを異にする数種の細菌のスクリーニ
ングに本発明の方法を用いる場合は同一インキュベーシ
ョンにおいて数種のファージを用いることも可能であ
る。
入手可能なファージ、及び該ファージが特異性を有す
る細菌の範囲が広いことは、当業者には明らかであろ
う。例えば、American Type Culture Collection（ATC
C）から入手可能な一連のファージがATCCによって“Cat
alogue of Bacteria ＆ Bacteriophages"として公表さ
れている。他の同様受託機関もそのカタログに同様のデ
ータを公表しており、これらは本発明の方法に用い得る
ファージ“試薬”の同定に用いることができる。ファー
ジは特に、例えばマイクロタイタープレートウェル上で
水性懸濁液の形態でか、または凍結乾燥形態で用い得
る。このように、プレートルミノメトリー（plate lumi
nometry）を用いることも可能である。好ましいファー
ジは溶菌性であり、標的生物の溶解を招く。
る細菌の範囲が広いことは、当業者には明らかであろ
う。例えば、American Type Culture Collection（ATC
C）から入手可能な一連のファージがATCCによって“Cat
alogue of Bacteria ＆ Bacteriophages"として公表さ
れている。他の同様受託機関もそのカタログに同様のデ
ータを公表しており、これらは本発明の方法に用い得る
ファージ“試薬”の同定に用いることができる。ファー
ジは特に、例えばマイクロタイタープレートウェル上で
水性懸濁液の形態でか、または凍結乾燥形態で用い得
る。このように、プレートルミノメトリー（plate lumi
nometry）を用いることも可能である。好ましいファー
ジは溶菌性であり、標的生物の溶解を招く。
寄託ファージに加えて、適当な環境からファージを単
離することによってもファージ源は得られる。適当な環
境とは好ましくは、標的細菌自体が見出される環境であ
る。例えば、家禽類加工プラントから出る廃棄物からは
カンピロバクター菌種とサルモネラ菌種との両方に特異
的なファージを単離し得る。単離技術は、当業者には良
く知られていようが、Loessner及びBusseによってAppli
ed and Environmental Microbiology,Vol.56,pp.1912−
1918（1990）に、またAdamsによってInterscience Inc.
発行の“Bacteriophages,"pp.447−455（1959）に例示
されている。
離することによってもファージ源は得られる。適当な環
境とは好ましくは、標的細菌自体が見出される環境であ
る。例えば、家禽類加工プラントから出る廃棄物からは
カンピロバクター菌種とサルモネラ菌種との両方に特異
的なファージを単離し得る。単離技術は、当業者には良
く知られていようが、Loessner及びBusseによってAppli
ed and Environmental Microbiology,Vol.56,pp.1912−
1918（1990）に、またAdamsによってInterscience Inc.
発行の“Bacteriophages,"pp.447−455（1959）に例示
されている。
特定種類の細菌の増殖を選択的に促進するのに有効な
一連の培地も当業者には公知であり、それらの培地は積
極的な作用によって、即ち例えば所期以外の生物の阻害
によって機能し得る。このような培地の例は、例えばUN
IPATH Limited,Wade Road,Basingstoke,HANTS,RG24 OP
W,UKから入手可能な“Selective Microbiology for Foo
d and Dairy Laboratories"や、OXOIDマニュアルなどの
ような供給元のマニュアルを参照することによって挙げ
ることができる。上記出版物には、例えばカンピロバク
ター菌、リステリア菌及びエルシニア菌の増殖に有利で
あり得る培地が列挙されている。同様に、試験試料を調
製するべく食物病原体を単離する方法も良く知られてい
る。（UNIPATH及びOXOIDは登録商標である）。
一連の培地も当業者には公知であり、それらの培地は積
極的な作用によって、即ち例えば所期以外の生物の阻害
によって機能し得る。このような培地の例は、例えばUN
IPATH Limited,Wade Road,Basingstoke,HANTS,RG24 OP
W,UKから入手可能な“Selective Microbiology for Foo
d and Dairy Laboratories"や、OXOIDマニュアルなどの
ような供給元のマニュアルを参照することによって挙げ
ることができる。上記出版物には、例えばカンピロバク
ター菌、リステリア菌及びエルシニア菌の増殖に有利で
あり得る培地が列挙されている。同様に、試験試料を調
製するべく食物病原体を単離する方法も良く知られてい
る。（UNIPATH及びOXOIDは登録商標である）。
本発明は、本発明の方法を実施する試験キットも提供
し、このキットは標的細菌生物、即ちその検出、同定及
び／または定量が望まれる１種以上の細菌生物に特異的
に感染する能力に関して選択されたバクテリオファージ
を、先に述べた本発明の方法に特に関連する試薬のうち
の幾つかまたは総てと組み合わせて含むことを特徴とす
る。
し、このキットは標的細菌生物、即ちその検出、同定及
び／または定量が望まれる１種以上の細菌生物に特異的
に感染する能力に関して選択されたバクテリオファージ
を、先に述べた本発明の方法に特に関連する試薬のうち
の幾つかまたは総てと組み合わせて含むことを特徴とす
る。
即ち、好ましくは本発明の試験キットは （ａ）標的細菌生物に特異的に感染し、かつ標的細菌生
物からの細胞成分の放出を実現する能力に関して選択さ
れた、好ましくは実質的に標的細菌生物を伴わない状態
に有るバクテリオファージ、及び （ｂ）バクテリオファージの標的細菌生物への作用によ
って放出される１種以上の細胞成分の量をアッセイする
のに必要な試薬 を含む。
物からの細胞成分の放出を実現する能力に関して選択さ
れた、好ましくは実質的に標的細菌生物を伴わない状態
に有るバクテリオファージ、及び （ｂ）バクテリオファージの標的細菌生物への作用によ
って放出される１種以上の細胞成分の量をアッセイする
のに必要な試薬 を含む。
場合によっては、本発明のキットは（ｃ）標的細菌生
物の選択的増殖を促進する選択培地、及び／または
（ｄ）非選択的な細菌増殖培地をも含む。
物の選択的増殖を促進する選択培地、及び／または
（ｄ）非選択的な細菌増殖培地をも含む。
即ち、本発明の好ましい試験キットは、アッセイの実
施に必要な試薬が試料中に存在するヌクレオチドの量を
アッセイするのに用いられる試薬であり、この試薬に好
ましくはルシフェリン及びルシフェラーゼが含まれるキ
ットである。細菌の高感度アッセイを行なうべく最適化
された試験キットは非選択増殖培地と選択増殖培地との
両方を含み、その際非選択増殖培地は好ましくは微生物
蘇生ステップに適するものである。
施に必要な試薬が試料中に存在するヌクレオチドの量を
アッセイするのに用いられる試薬であり、この試薬に好
ましくはルシフェリン及びルシフェラーゼが含まれるキ
ットである。細菌の高感度アッセイを行なうべく最適化
された試験キットは非選択増殖培地と選択増殖培地との
両方を含み、その際非選択増殖培地は好ましくは微生物
蘇生ステップに適するものである。
固体培地に支持された細菌コロニー上の凹窩を監視す
る従来方法とは異なり、本発明の方法は特に、物質試料
に由来する細菌を液体培地上での培養により調べること
で試験するべく構成されていることは明らかであるが、
固体培地を用いることも当然ながら可能である。本発明
方法実施のための特定のキットは、バクテリオファージ
成分（ａ）を液体の形態である１種以上の培地（ｃ）及
び／または（ｄ）、または前記液体培地の調製に適合す
る濃縮成分もしくは乾燥成分と共に有し得る。本発明の
方法の実施に適合する上記のような組み合わせの多くは
当業者に自明であろうが、本発明のキットは最も完璧な
形態では試薬（ａ）〜（ｄ）を総て含む。ヌクレオチド
アッセイ成分は好ましくは、細菌増殖培地の試料のヌク
レオチドレベルの測定のために最適化される。定量を行
ないたい場合、ヌクレオチドアッセイの検量のために既
知量の細菌の対照読み取り値を設定するべく細菌試料を
例えば胞子として、または培地中の細胞の形態で含ませ
ることも可能であろう。標的生物、及び標的でない対照
生物を用い得る。
る従来方法とは異なり、本発明の方法は特に、物質試料
に由来する細菌を液体培地上での培養により調べること
で試験するべく構成されていることは明らかであるが、
固体培地を用いることも当然ながら可能である。本発明
方法実施のための特定のキットは、バクテリオファージ
成分（ａ）を液体の形態である１種以上の培地（ｃ）及
び／または（ｄ）、または前記液体培地の調製に適合す
る濃縮成分もしくは乾燥成分と共に有し得る。本発明の
方法の実施に適合する上記のような組み合わせの多くは
当業者に自明であろうが、本発明のキットは最も完璧な
形態では試薬（ａ）〜（ｄ）を総て含む。ヌクレオチド
アッセイ成分は好ましくは、細菌増殖培地の試料のヌク
レオチドレベルの測定のために最適化される。定量を行
ないたい場合、ヌクレオチドアッセイの検量のために既
知量の細菌の対照読み取り値を設定するべく細菌試料を
例えば胞子として、または培地中の細胞の形態で含ませ
ることも可能であろう。標的生物、及び標的でない対照
生物を用い得る。
次の非限定的な実施例を参照して、本発明の方法及び
キットの例を単なる一具体例として以下に示す。先に説
明し、かつ以下に特定した一般的な方法、並びに用い得
るバクテリオファージ及びヌクレオチドアッセイの種類
の考慮下に、当業者はきわめて様々な変形を容易に為す
ことができよう。
キットの例を単なる一具体例として以下に示す。先に説
明し、かつ以下に特定した一般的な方法、並びに用い得
るバクテリオファージ及びヌクレオチドアッセイの種類
の考慮下に、当業者はきわめて様々な変形を容易に為す
ことができよう。
実施例1:乳中の低レベルのサルモネラ菌をファージ媒介
ATP生物発光によって検出する方法及び試験キット 用いた菌株：検出するべき菌株は、家禽類加工プラント
廃水から単離したサルモネラ菌とした。試験前にストッ
クの細菌培養物を、ブレインハートインフュージョン
（BHI）寒天（UNIPATH Ltd.,Basingstoke,Hampshire）
斜面培地上に保持した。特異的バクテリオファージSall
も上記ソースから単離した。
ATP生物発光によって検出する方法及び試験キット 用いた菌株：検出するべき菌株は、家禽類加工プラント
廃水から単離したサルモネラ菌とした。試験前にストッ
クの細菌培養物を、ブレインハートインフュージョン
（BHI）寒天（UNIPATH Ltd.,Basingstoke,Hampshire）
斜面培地上に保持した。特異的バクテリオファージSall
も上記ソースから単離した。
バクテリオファージは、液体窒素の上方に配置した1.
5ml容の低温試験管（cryotubes）内に無菌（bacteria−
free）溶解物として貯蔵した。用いたバクテリオファー
ジ溶解物の力価は1ml当たり1.2×109プラーク形成単位
（PFU）であった。
5ml容の低温試験管（cryotubes）内に無菌（bacteria−
free）溶解物として貯蔵した。用いたバクテリオファー
ジ溶解物の力価は1ml当たり1.2×109プラーク形成単位
（PFU）であった。
UNIPATH Ltd.のブレインハートインフュージョン（BH
I）ブイヨンを用いて接種物を増殖させた。ブイヨン培
養物を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7）を用いて連
続稀釈した。選択的富裕化は、Rappaport−Vassiliadis
（RV）ブイヨン（UNIPATH Ltd.）、より好ましくはセレ
ナイトシスチン（SC）ブイヨン（Difco Laboratories,D
etroit,Michigan）を用いれば達成できることが判明し
た。
I）ブイヨンを用いて接種物を増殖させた。ブイヨン培
養物を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7）を用いて連
続稀釈した。選択的富裕化は、Rappaport−Vassiliadis
（RV）ブイヨン（UNIPATH Ltd.）、より好ましくはセレ
ナイトシスチン（SC）ブイヨン（Difco Laboratories,D
etroit,Michigan）を用いれば達成できることが判明し
た。
（ａ）特異的バクテリオファージSall、（ｂ）（例え
ば後述するような）ルシフェリン／ルシフェラーゼアッ
セイ試薬、及び／または（ｃ）RVもしくはSCブイヨン、
及び場合によっては（ｄ）BHIを含む、上記サルモネラ
菌を本発明の方法を用いて検出するのに適したキットを
用意した。Sallは場合によっては、使用前に安全に溶解
してファージを放出し、細菌を破壊する感染細菌として
提供されてもよい。
ば後述するような）ルシフェリン／ルシフェラーゼアッ
セイ試薬、及び／または（ｃ）RVもしくはSCブイヨン、
及び場合によっては（ｄ）BHIを含む、上記サルモネラ
菌を本発明の方法を用いて検出するのに適したキットを
用意した。Sallは場合によっては、使用前に安全に溶解
してファージを放出し、細菌を破壊する感染細菌として
提供されてもよい。
用いた分光光度計は、使い捨ての1cmキュベット（Wha
t−man International Ltd.,Maidstone,England）を具
備したCE 202型（Cecil Instruments,Cambridge,Englan
d）であった。光測定はLB953型ルミノメーターAutoluma
t（Berthold Instruments U.K.Ltd.,St.Albans,Hertfor
d−shire）と、使い捨てのポリスチレン管（カタログ番
号55.476;Sarstedt,Beaumont Leys,Leicester,U.K.）と
を用いて行なった。アデノシン５′−三リン酸アッセイ
試薬はルシフェリン／ルシフェラーゼ及びアデノシン
５′−三リン酸アッセイ混合稀釈緩衝液であり、Sigma
Chemical Co.Limited,Poole,Dorsetから得た。必要な場
合、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を上記緩衝液で
1:25に稀釈した。
t−man International Ltd.,Maidstone,England）を具
備したCE 202型（Cecil Instruments,Cambridge,Englan
d）であった。光測定はLB953型ルミノメーターAutoluma
t（Berthold Instruments U.K.Ltd.,St.Albans,Hertfor
d−shire）と、使い捨てのポリスチレン管（カタログ番
号55.476;Sarstedt,Beaumont Leys,Leicester,U.K.）と
を用いて行なった。アデノシン５′−三リン酸アッセイ
試薬はルシフェリン／ルシフェラーゼ及びアデノシン
５′−三リン酸アッセイ混合稀釈緩衝液であり、Sigma
Chemical Co.Limited,Poole,Dorsetから得た。必要な場
合、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を上記緩衝液で
1:25に稀釈した。
接種物の調製:Sallのブイヨン培養物を10mlのBHIブイヨ
ン中に入れ、濁りが目に見えるようになるまで37℃でイ
ンキュベートした。650nmにおける吸光度を測定し、同
時にリン酸カリウム緩衝液で100倍から1010倍までの連
続10倍稀釈物を調製した。各培養稀釈物から五つの1ml
試料を得、これらを9ml量の新鮮なBHIブイヨンに接種し
た。稀釈物試料を接種したブイヨンの入った管を37℃で
一晩インキュベートし、濁り具合を観察した。公表され
ている表（“Theory and Practice in Experimental Ba
cteriology",G.G.Meynell ＆ Elinor Meynell,Cembridg
e University Press）から、いずれの培養稀釈物が1ml
当たり約100個の細胞を含有するか決定することがで
き、その稀釈物を用いて試験用の試料を調製した。
ン中に入れ、濁りが目に見えるようになるまで37℃でイ
ンキュベートした。650nmにおける吸光度を測定し、同
時にリン酸カリウム緩衝液で100倍から1010倍までの連
続10倍稀釈物を調製した。各培養稀釈物から五つの1ml
試料を得、これらを9ml量の新鮮なBHIブイヨンに接種し
た。稀釈物試料を接種したブイヨンの入った管を37℃で
一晩インキュベートし、濁り具合を観察した。公表され
ている表（“Theory and Practice in Experimental Ba
cteriology",G.G.Meynell ＆ Elinor Meynell,Cembridg
e University Press）から、いずれの培養稀釈物が1ml
当たり約100個の細胞を含有するか決定することがで
き、その稀釈物を用いて試験用の試料を調製した。
ｉ） 方法；乳試験：試料採取及び富裕化手順 蘇生／富裕化ステップとして、室温において1ml当た
り約１個の対数増殖期Sall細胞を感染させた100mlの新
鮮な低温殺菌乳の1ml試料を9mlの新鮮なBHIブイヨン中
に移し、37℃で２時間インキュベートした。次に、
（ａ）上記ステップ終了後の培地0.1mlを10mlのRappapo
rt−Vassiliadis（RV）選択的富裕ブイヨン中に置き、4
1℃で７時間インキュベートした。
り約１個の対数増殖期Sall細胞を感染させた100mlの新
鮮な低温殺菌乳の1ml試料を9mlの新鮮なBHIブイヨン中
に移し、37℃で２時間インキュベートした。次に、
（ａ）上記ステップ終了後の培地0.1mlを10mlのRappapo
rt−Vassiliadis（RV）選択的富裕ブイヨン中に置き、4
1℃で７時間インキュベートした。
あるいはまた、弱った細菌細胞はRV培地の存在下に死
ぬこともあると報告されているので、試料中の細菌の生
存率が低いと考えられる場合は比較的効力の小さい選択
培地を適用した。“より穏和な”培地としてセレナイト
シスチンブイヨンを選択し、この場合は回収ステップと
して、（ｂ）完了した蘇生／富裕化ステップの培地1.0m
lを9mlのセレナイトシスチン選択富裕ブイヨン中に置
き、これを35℃で一晩インキュベートして得られた培養
物1mlを9mlの新鮮なBHIに接種し、37℃で２時間インキ
ュベートした。
ぬこともあると報告されているので、試料中の細菌の生
存率が低いと考えられる場合は比較的効力の小さい選択
培地を適用した。“より穏和な”培地としてセレナイト
シスチンブイヨンを選択し、この場合は回収ステップと
して、（ｂ）完了した蘇生／富裕化ステップの培地1.0m
lを9mlのセレナイトシスチン選択富裕ブイヨン中に置
き、これを35℃で一晩インキュベートして得られた培養
物1mlを9mlの新鮮なBHIに接種し、37℃で２時間インキ
ュベートした。
（ａ）の場合も（ｂ）の場合も、4.5mlの完結培養物
を0.5mlの特異的バクテリオファージSall懸濁液と混合
した。RV、セレナイトシスチンまたはBHI回収培養物の
残部は保存した。
を0.5mlの特異的バクテリオファージSall懸濁液と混合
した。RV、セレナイトシスチンまたはBHI回収培養物の
残部は保存した。
ii） ルミノメーターの準備及び光測定 37℃に予熱したルミノメーター中の80本のポリスチレ
ン製ルミノメーター管の総てに、37℃に維持した50μ
のBHIを入れた。選択した方法に応じてRV培養物またはB
HI培養物である、先にバクテリオファージを添加した培
養物50μをルミノメーター中の管に１本置きに添加
し、残りの管にはバクテリオファージを伴わない各培養
物50μを陰性対照として添加した。続いて光測定を開
始し、即ち100μのルシフェリン／ルシフェラーゼ試
薬を各管に注入し、直ちに出力される光を60秒間にわた
って監視した。陽性管と陰性対照管との両方に関し、得
られた測定値をピーク光強度として時間に対してプロッ
トした。
ン製ルミノメーター管の総てに、37℃に維持した50μ
のBHIを入れた。選択した方法に応じてRV培養物またはB
HI培養物である、先にバクテリオファージを添加した培
養物50μをルミノメーター中の管に１本置きに添加
し、残りの管にはバクテリオファージを伴わない各培養
物50μを陰性対照として添加した。続いて光測定を開
始し、即ち100μのルシフェリン／ルシフェラーゼ試
薬を各管に注入し、直ちに出力される光を60秒間にわた
って監視した。陽性管と陰性対照管との両方に関し、得
られた測定値をピーク光強度として時間に対してプロッ
トした。
いずれの方法を用いた場合も、陽性管に関しては60分
後に25,000カウント／秒（cps）のピークが得られた
が、陰性対照は500cpsにしか達しなかった。
後に25,000カウント／秒（cps）のピークが得られた
が、陰性対照は500cpsにしか達しなかった。
実施例2:レタスのリステリア菌をファージ媒介ATP生物
発光によって検出する方法及び試験キット 用いた菌株：用いたリステリアモノサイトゲネス株はAT
CC 23074であり、その特異的バクテリオファージはATCC
23074−B1であった。バクテリオファージは、液体窒素
の上方に配置した1.5ml容の低温試験管内に無菌溶解物
として貯蔵した。ファージ調製物の力価は1ml当たり約
2.11×1010PFUであった。
発光によって検出する方法及び試験キット 用いた菌株：用いたリステリアモノサイトゲネス株はAT
CC 23074であり、その特異的バクテリオファージはATCC
23074−B1であった。バクテリオファージは、液体窒素
の上方に配置した1.5ml容の低温試験管内に無菌溶解物
として貯蔵した。ファージ調製物の力価は1ml当たり約
2.11×1010PFUであった。
培地：ストック培養物はブレインハートインフュージョ
ン（BHI）寒天斜面培地上に保持した。接種物の増殖に
はBHIブイヨンを用いた。リン酸カリウム緩衝液（0.1M;
pH7）を用いて連続稀釈を行なった。選択富裕培地はリ
ステリア菌富裕ブイヨン（LEB）とした。いずれの培地
もUNIPATH Ltd.,Basingstoke,Hampshire,U.K.から得
た。
ン（BHI）寒天斜面培地上に保持した。接種物の増殖に
はBHIブイヨンを用いた。リン酸カリウム緩衝液（0.1M;
pH7）を用いて連続稀釈を行なった。選択富裕培地はリ
ステリア菌富裕ブイヨン（LEB）とした。いずれの培地
もUNIPATH Ltd.,Basingstoke,Hampshire,U.K.から得
た。
（ａ）バクテリオファージATCC 23074−B1、（ｂ）ル
シフェリン／ルシフェラーゼアッセイ試薬、及び／また
は（ｃ）LEB、及び場合によってはBHIを含む、リステリ
アモノサイトゲネスを本発明の方法によって測定するの
に適したキットを用意した。
シフェリン／ルシフェラーゼアッセイ試薬、及び／また
は（ｃ）LEB、及び場合によってはBHIを含む、リステリ
アモノサイトゲネスを本発明の方法によって測定するの
に適したキットを用意した。
装置：分光光度計、キュベット、ルミノメーター及びポ
リスチレン製ルミノメーター管はサルモネラ菌検出方法
に詳述したものを用いた。Colworth 400ストマッカー
（stomacher）を用いた（A.J.Seward,London SE1）。
リスチレン製ルミノメーター管はサルモネラ菌検出方法
に詳述したものを用いた。Colworth 400ストマッカー
（stomacher）を用いた（A.J.Seward,London SE1）。
試薬：発光試薬はサルモネラ菌検出方法に述べたものを
用いた。
用いた。
接種物の調製:1ml当たり約100細胞を含有するATCC 2307
4の接種物を、サルモネラ菌検出方法に述べたのと同様
の操作で調製した。
4の接種物を、サルモネラ菌検出方法に述べたのと同様
の操作で調製した。
陽性試験として用いるためのレタスへの細菌接種：新鮮
なレタスを手でちぎって長さ約2cmの小片状とした。100
gのちぎったレタスに、ステップ（ｉ）で調製したリス
テリア菌の緩衝懸濁液100mlを添加し、１分間振盪する
ことにより十分に混合した。その後、レタスに付着した
液体を除いてからレタスを４℃で貯蔵した。
なレタスを手でちぎって長さ約2cmの小片状とした。100
gのちぎったレタスに、ステップ（ｉ）で調製したリス
テリア菌の緩衝懸濁液100mlを添加し、１分間振盪する
ことにより十分に混合した。その後、レタスに付着した
液体を除いてからレタスを４℃で貯蔵した。
ｉ） リステリア菌の抽出及び富裕化手順 リステリア菌を接種したレタスを100mlのリン酸カリ
ウム緩衝液と共に大型のストマッカーバッグに入れ、ス
トマッカー内で１分間混合した。次に蘇生／富裕化ステ
ップとして、上記のようにして得た懸濁液1mlを9mlのBH
Iブイヨンに添加し、30℃で４時間インキュベートし
た。このステップで得られた培養物1mlを30℃において9
mlのLEBに添加し、一晩インキュベートしたが、これは
選択富裕化ステップであった。選択富裕化ステップで得
られた培養物を4.5ml取り出し、これに0.5mlの特異的バ
クテリオファージATCC 23074−B1を添加した。
ウム緩衝液と共に大型のストマッカーバッグに入れ、ス
トマッカー内で１分間混合した。次に蘇生／富裕化ステ
ップとして、上記のようにして得た懸濁液1mlを9mlのBH
Iブイヨンに添加し、30℃で４時間インキュベートし
た。このステップで得られた培養物1mlを30℃において9
mlのLEBに添加し、一晩インキュベートしたが、これは
選択富裕化ステップであった。選択富裕化ステップで得
られた培養物を4.5ml取り出し、これに0.5mlの特異的バ
クテリオファージATCC 23074−B1を添加した。
LEB培養物の残部は陰性対照として保存した。
ii） ルミノメーターの準備及び光測定 30℃に予熱したルミノメーター中の80本の管に、（30
℃に）加熱した50μのBHIを入れた。機械を、30℃に
おいて動力学的モード（kinetics mode）で作動するよ
うに設定した。第一の管から１本置きに、50μの陰性
対照培養物（バクテリオファージを伴わない）を添加し
た。残りの管には50μの試験培養物（バクテリオファ
ージを伴う）を添加した。次に、100μのルシフェリ
ン／ルシフェラーゼ試薬を各管に逐次注入し、直ちに出
力される光を60秒間にわたって測定した。
℃に）加熱した50μのBHIを入れた。機械を、30℃に
おいて動力学的モード（kinetics mode）で作動するよ
うに設定した。第一の管から１本置きに、50μの陰性
対照培養物（バクテリオファージを伴わない）を添加し
た。残りの管には50μの試験培養物（バクテリオファ
ージを伴う）を添加した。次に、100μのルシフェリ
ン／ルシフェラーゼ試薬を各管に逐次注入し、直ちに出
力される光を60秒間にわたって測定した。
サルモネラ菌の場合同様、試験培養物管及び陰性対照
管に関するピーク光強度（カウント／秒）を時間に対し
てプロットした。ここに述べた方法によれば、試験培養
物に関しては48分後に10,000cpsのピークが観察された
が、陰性対照の方は常に約1,000cpsのままであった。対
照を上回る光出力レベルが存在しないことは標的生物の
リステリア菌の不在と解釈され、細菌自体の不在とは解
釈されない。
管に関するピーク光強度（カウント／秒）を時間に対し
てプロットした。ここに述べた方法によれば、試験培養
物に関しては48分後に10,000cpsのピークが観察された
が、陰性対照の方は常に約1,000cpsのままであった。対
照を上回る光出力レベルが存在しないことは標的生物の
リステリア菌の不在と解釈され、細菌自体の不在とは解
釈されない。
実施例３〜11 更に別の細菌、及び当該細菌のATPを含めた細胞内容
物の放出を特異的に実現し得る特定のファージを、本発
明の目的のために前記細菌とファージとを一緒にインキ
ュベートするのに適した培地及び好ましいインキュベー
ション温度と共に次表に例示する。
物の放出を特異的に実現し得る特定のファージを、本発
明の目的のために前記細菌とファージとを一緒にインキ
ュベートするのに適した培地及び好ましいインキュベー
ション温度と共に次表に例示する。
フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4104126（ＵＳ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐ ｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．47， Ｎ ｏ．５，（1984）ｐ．388−390 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏ ｌ．20（1984）ｐ．1122−1125 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (21)
- 【請求項１】物質中に存在する特定の細菌属、種または
血清型の標的生物を検出、同定及び／または定量する方
法であって、前記物質または前記物質由来の細菌を、標
的生物に特異的に感染し、かつ標的生物からの細胞成分
の放出を実現する能力に関して選択したバクテリオファ
ージと共にインキュベートし、インキュベーションの間
に存在する細菌から放出される１種以上の特定の細胞成
分の量を測定し、並びに前記測定値を標的生物の存在、
同等性及び／または量と関係付けることを含む前記方
法。 - 【請求項２】インキュベーションを細菌支持培地中で行
なうことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】インキュベーションを20〜40℃で行なうこ
とを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】１種以上の細胞成分がNAD、NADP、NADH、N
ADPH、ATP、ADP、cAMP及びcGMPから選択したヌクレオチ
ドから成ることを特徴とする請求項１、２または３に記
載の方法。 - 【請求項５】酵素に基づくアッセイ系を用いてヌクレオ
チドを測定することを特徴とする請求項３または４に記
載の方法。 - 【請求項６】細胞成分がATPであり、アッセイが発光を
生起させる酵素を用いるものであることを特徴とする請
求項１から５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】アッセイ系がルシフェリン／ルシフェラー
ゼ系であり、発せられる光の量をインキュベーションの
全体にわたって、または細胞溶解期間の間中測定するこ
とを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】物質または物質由来の細菌を特異的バクテ
リオファージと共にインキュベートするステップを特定
の細胞成分アッセイ試薬の存在下に行なうか、または該
ステップを行なった後に前記試薬を添加することを特徴
とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】物質または物質由来の細菌をバクテリオフ
ァージと共にインキュベートする前に、標的細菌の増殖
に有利な選択培地かまたは細菌増殖を支持し得る非選択
培地と共にインキュベートすることを特徴とする請求項
１から８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】選択培地の存在下でのインキュベーショ
ンを１〜10時間行なうことを特徴とする請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１１】バクテリオファージの存在下でのインキ
ュベーションを20〜60分間行なうことを特徴とする請求
項１から10のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】選択培地またはバクテリオファージの存
在下でのインキュベーションの前に物質または細菌を非
選択培地と共にインキュベートし、このインキュベーシ
ョンが完了したら培地の試料を、試験するべき物質また
は細菌の供給源として選択培地またはバクテリオファー
ジの存在下でのインキュベーションのステップに移すこ
とを特徴とする請求項１から11のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１３】非選択培地の存在下でのインキュベーシ
ョンを１〜５時間行なうことを特徴とする請求項12に記
載の方法。 - 【請求項１４】バクテリオファージを懸濁液の形態で
か、凍結乾燥ファージとしてか、または使用前に溶解さ
せる感染細菌として提供することを特徴とする請求項１
から13のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】同一インキュベーションにおいて数種の
バクテリオファージを用い、かつ多数の種類の細菌をス
クリーニングする方法を用いることを特徴とする請求項
１から14のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】特定の細菌属、種または血清型の標的生
物を検出、同定及び／または定量する試験キットであっ
て、 （ａ）標的細菌生物に特異的に感染し、かつ標的細菌生
物からの細胞成分の放出を実現する能力に関して選択さ
れたバクテリオファージ、及び （ｂ）バクテリオファージの標的細菌生物への作用によ
って放出される細胞成分の量をアッセイするのに必要な
試薬 を含む前記キット。 - 【請求項１７】（ｃ）キットが標的とする細菌属、種ま
たは血清型の生物の優先的増殖を促進する選択培地、及
び／または（ｄ）非選択的な細菌増殖培地をも含むこと
を特徴とする請求項16に記載のキット。 - 【請求項１８】試薬（ｂ）によってアッセイされるべき
細胞成分がヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項
16または17に記載のキット。 - 【請求項１９】試料中に存在するヌクレオチドの量をア
ッセイするのに必要な試薬がルシフェリン及びルシフェ
ラーゼを含むことを特徴とする請求項18に記載のキッ
ト。 - 【請求項２０】培地（ｃ）及び／または（ｄ）を液体の
形態で、またはそのような液体培地の調製に必要な濃縮
成分もしくは乾燥成分として含むことを特徴とする請求
項16から19のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項２１】更に標的生物及び／または対照の非標的
生物をも含むことを特徴とする請求項16から20のいずれ
か１項に記載のキット。
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|---|---|---|---|
| GB929220027A GB9220027D0 (en) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | Method and kits for detection of bacteria |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08503847A JPH08503847A (ja) | 1996-04-30 |
| JP3229884B2 true JP3229884B2 (ja) | 2001-11-19 |
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|---|---|---|---|
| JP50794094A Expired - Fee Related JP3229884B2 (ja) | 1992-09-22 | 1993-09-22 | 細菌を検出する方法及びキット |
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| JP (1) | JP3229884B2 (ja) |
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| GB (2) | GB9220027D0 (ja) |
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| NZ505847A (en) * | 1998-01-21 | 2002-09-27 | Secr Defence | Adenylate kinase assay for rapid and sensitive investigation of bacterial growth and inhibition |
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| WO2001009370A2 (de) | 1999-07-30 | 2001-02-08 | Profos Ag | Nachweis und identifikation von bakterienstämmen |
| DK1406642T3 (da) | 2001-07-18 | 2007-07-02 | Inst Immunologii I Terapii Dos | Fremgangsmåde til polyvalent bakteriofag-fremstilling til behandling af bakterielle infektioner |
| ES2346424T3 (es) | 2002-04-12 | 2010-10-15 | Colorado School Of Mines | Procedimiento de deteccion de bajas concentraciones de una bacteria diana que utiliza fagos para infectar celulas bacterianas diana. |
| US8216780B2 (en) | 2002-04-12 | 2012-07-10 | Microphage (Tm) Incorporated | Method for enhanced sensitivity in bacteriophage-based diagnostic assays |
| WO2006105414A2 (en) | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Colorado School Of Mines | Apparatus and method for detecting microscopic organisms using microphage |
| GB0606822D0 (en) | 2006-04-05 | 2006-05-17 | Alaska Food Diagnostics | Assay System |
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| CN109750085A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-05-14 | 希拓生物科技有限公司 | 一种精准快速检测目标超级细菌的检测方法 |
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-
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| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０（１９８４）ｐ．１１２２−１１２５ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．４７， Ｎｏ．５，（１９８４）ｐ．３８８−３９０ |
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