JPH08503847A - 細菌を検出する方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 特定の細菌属、種または血清型の標的生物を、当該生物に特異的なバクテリオファージ（ファージ）と共にインキュベートした際に細菌の細胞壁が溶解されると細胞内容物、特にATPなどのヌクレオチドの放出が生起することに基づき検出、同定及び／または定量する方法。ファージ複製サイクル終了時に新生ファージ粒子が放出されたらヌクレオチドレベルを測定し、かつ対照と比較する。この方法により、ファージゲノムへのlux遺伝子の挿入を必要とせずに、しかも改変しないファージを用いる公知技術より迅速に、かつ高感度で特定細菌を検出できる。この方法は、検出するべき標的細菌を選択的に攻撃するのに適した種類のファージの入手可能性によってしか限定されず、乳試料中の1種のサルモネラ菌を12時間未満の時間で検出し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌を検出する方法及びキット 本発明は、細菌を検出、同定及び／または定量する方法と、該方法を実施する 試験キットとに係わる。上記方法は特に、特定の細菌属、種または血清型の生物 を単離形態で、または環境試料や法廷試料（forensic samples）中、もしくは食 物中の汚染物質として検出することを可能にする。 特定の細菌、特に特定の環境内に少数存在する細菌、例えば汚染食物中のヒト 病原菌（human bacterial pathogens）をスクリーニングする方法の必要性は大 きい。公衆衛生及び品質管理に携わる機関は適当レベルの特異性及び感度を有す る迅速な細菌検出方法を必要としているが、満足の行く方法は僅かしか存在しな い。 Ulitzer及びKuhnがJohn Wiley and Sons発行（1987）のScholmerich等（Eds. ）の“Bioluminescence and Chemilumi-nescence−new perspectives,”pp．463 -472に述べているような、遺伝子操作された生物発光バクテリオファージ、即ち そのゲノムに“lux”遺伝子が挿入されたウイルス粒子を用いることによって特 定の細菌を検出することが公知である。“ｌux”遺伝子は細菌のルシフェラーゼ をコードする遺伝子であり、上記技術は、標的細菌への感染の際に バクテリオファージの遺伝子及び1ux遺伝子が標的細菌に注入され、後に発現す るという事実に基づいている。容易に測定可能な光が試料から発せられることに より、標的細菌の存在が示される。ほとんどの細菌はバクテリオファージ（通常 “ファージ”と呼称）によって攻撃されやすく、ファージの多くはその複製過程 終了時に当該ファージ自体の宿主を溶解または崩壊させ、このような相互作用は 様々な程度の宿主−ファージ特異性を示す。 Schutzbank等は上記技術の可能性を示したが、構築ファージと標的でない他の 種類の細菌との交叉反応性に伴う問題点を指摘している。そのような問題点はよ り特異的なファージを遺伝子工学的に製造することによって克服し得る（例えば 米国特許第4,348,478号参照）が、その場合には、試験する必要性が存在する各 種の標的細胞それぞれのためにファージを用意しなければならない。このような 組み換え体は様々な理由から容易に構築できず、その際ファージ自体の機能の崩 壊を回避しなければならないことが前記理由の相当部分を占める。 最初、サルモネラファージ及び大腸菌ファージのみが首尾よく改変できた。こ れは、以前はこれらの生物が分子生 物学的にかなり研究されたこと、及び1ux遺伝子がファージ頭部に、ファージの 感染能力を低下させることなく適合し得ることが周知であったことによる。他の 食物病原体には上記のようなことは該当せず、広範囲の改変ファージを構築し得 るまでには多大の研究を行なわなければならない。 ファージの、その宿主細菌に対する特異性を利用する別の方法がHirsh及びMar tinによって、Journal of Food Protection，Vol．47，No.5，pp．388-390（198 4）に開示されている。この方法は、ファージが濃縮ブイヨン上で増殖した細菌 の破壊を誘起して、細菌コロニー（bacteriallawns）の中に凹窩を生じさせるこ とに依拠し、その際前記凹窩が標的細菌、この引例ではサルモネラ菌属の存在を 示唆する。しかし、この方法は実施に時間が掛かり、明確な結果が得られるまで に24時間を要し、かつ5細胞/ml以上にしか感受性でない。 本発明者はここに、ファージ複製サイクル終了時にに新生ファージ粒子が放出 される際に細菌の細胞壁が損傷され、例えば溶解されると細胞内容物の放出が生 起することに基づく方法を提供する。この方法によって、ファージゲノムへの1u x遺伝子の挿入を必要とせずに、従って検出するべ き標的細菌を選択的に攻撃するのに適した種類のファージの入手可能性によって しか特異性を限定されずに、しかも改変しないファージを用いる既存技術よりは るかに短い時間で特定細菌を検出できる。即ち、本発明の方法は、必要な特異性 を有するファージさえ見出せれば任意の環境（食物、飲料水、医薬品、並びにヒ ト、動物及び植物の罹患組織等）におけるほぼあらゆる細菌の特異的で迅速な検 出をより容易に実現し得る。本発明の方法を用いれば1mlの乳試料中の1種のサル モネラ菌属を12時間未満の時間で検出し得ることが判明した。 即ち、本発明は、物質中に存在する特定の細菌属、種または血清型の標的生物 を検出、同定及び／または定量する方法を提供し、この方法は前記物質または前 記物質由来の細菌を、標的生物に特異的に感染し、かつ標的生物からの細胞成分 の放出を実現する能力により選択したバクテリオファージと共にインキュベート し、インキュベーションの間に存在する細菌から放出される1種以上の特定の細 胞成分の量を測定し、並びに前記測定を標的生物の存在、同等性及び／または量 と関係付けることを含む。好ましくは、バクテリオファージの存在下での物質の インキュベーショ ンは細菌支持培地中で行なう。 好ましい細胞成分にヌクレオチドが含まれる。理論的には、新生ファージ粒子 の放出によって惹起される細胞溶解により放出される任意のヌクレオチド、例え ばNAD、NADP、NADH、NADPH、ATPもしくはADP、cAMP、またはcGMPを、当分野で有 効である、酵素に基づく多くのアッセイ系のうちの1種以上、例えば“カスケー ド”系を用いることによって得られる感度で測定することが可能である。例えば 、英国特許第2,213,261号には還元型ピリジンヌクレオチド、例えばNADHまたはN ADPHのアッセイに用い得る、サリチレートモノオキシゲナーゼ系に基づく方法が 開示されており、一方英国特許第2,240,845号にはアルカリホスファターゼ/NAD/ NADP系などの他の酵素系が開示されている。ADP、cAMP、cGMP等に関する適当な アッセイは当業者には自明であろう。 しかし、特に好ましいのはアデノシン三リン酸（ATP）を測定することであり 、ATPは多くの基質変換における補因子であり、また他の細菌ヌクレオチドに比 べれば比較的大量に放出されるので、様々な酵素と酵素基質との組み合わせでの アッセイにより容易に測定可能である。放出された ATPのレベルを迅速かつ効率的に測定するには発光をもたらす酵素反応を利用す ることが特に好ましく、その場合ルシフェラーゼを用いるのが最も有利である。 ATP放出は生物発光を用いる市販試薬で定量可能であり、その際ルシフェラーゼ により触媒下にルシフェリンの酸化を生起させて光の発生を促す。この反応の量 子効率はきわめて高く、発生した光の存在及び量から放出されたATPの測定、即 ち標的生物の存在及び数の確認ができる。 物質、例えば単離細菌の培養物中に比較的高濃度で発生する特定細菌を同定ま たは定量するには、当該細菌に特異的なファージを前記培養物の一部または継代 培養物と共に成分アッセイ試薬の存在下にインキュベートするか、またはインキ ュベートした後に前記試薬を添加し、このようにアッセイを行なうことにより放 出された成分の量を測定しさえすればよい。 例えば水や食物の中または表面上の汚染物質のように比較的低濃度の特定細菌 を同定、検出及び／または定量する場合は、まず試験物質に由来する細菌の富裕 化を例えば数時間行なって標的細菌を、該細菌の放出成分、例えばヌクレオチド が検出可能となる、バックグラウンドレベルより 高いレベルまで増加させなければならない。上記富裕化は好ましくは、標的細菌 の増殖に有利な選択培地に試験物質かまたは試験物質由来の、例えばスワブに由 来する培養物を接種し、これを培養することによって行なう。典型的には、上記 富裕化の継続時間は1日より短く、例えば1〜10時間、好ましくは1〜5時間である 。 富裕化後、既知の標的宿主特異性を有する1種以上のファージを培養物と混合 し、混合物をインキュベートする。インキュベーションの間にファージが標的細 菌に特異的に感染し、複製サイクルが開始される。複製サイクル終了時に存在す る標的細菌は破裂し（時間は種に応じて例えば20〜60分）、細胞成分、例えばヌ クレオチドが放出されるので、これを検出する。細菌を含有しない対照試料も、 標的でない細菌を含有する対照試料も、またファージを伴わない細菌を含有する 対照試料も、バックグラウンドレベルを越える実質的なレベル上昇は示さない。 そのうえ、選択するファージ−宿主対の生物学的特性次第では、本発明の方法 は高い特異性を有しながら、高い感度及び迅速性も有し得る。先に述べたATPア ッセイ法を用いて、本発明の発明者は、乳中に存在する黄色ブドウ球菌、 リステリアモノサイトゲネス及びサルモネラ菌を含めた幾種かのヒト病原体、並 びに表面にリステリア菌などが危険な病原体として存在し得ることが知られてい るレタスなどの食物上の他のヒト病原体を検出する系を容易に開発した。サルモ ネラ菌、リステリア菌、ブドウ球菌、大腸菌及びシュードモナス菌はいずれも本 発明の方法によって容易に検出可能であることが判明した。しかし、必要な1種 以上の特異的ファージの入手可能性以外に本発明の方法の適用を限定するものは 無いことは、当業者には理解されよう。 本発明の更に好ましい具体例では、何等かの富裕化インキュベーションを行な う前に、調べている物質試料中に存在する細菌の実質的に総てを活性化し、もし くは“蘇生”させるべく前記試料をペプトン水やブレインハートインフュージョ ン（BHI）ブイヨンなどの非選択的な細菌支持培地と共にインキュベートすると 有利であることが明らかとなった。このようなインキュベーションは1〜5時間行 なうことが、必須ではないが好ましい。しかし、富裕化インキュベーションの場 合同様、特に物質の新鮮度次第では上記より短いかまたは長い期間が適当となり 得る。 好ましい一具体例では次に、蘇生させた物質の試料を、 他の邪魔な細菌の増殖よりも調べている細菌の増殖に有利なように構成された選 択培地に移し、例えば1〜5時間更にインキュベートする。好ましくは、蘇生段階 から得た培地のアリコートを上記のように移す。 インキュベーション完了後、培養培地の全部または一部を、例えば懸濁液の形 態かまたは凍結乾燥形態の選択したファージと混合し、かつ用いるファージと細 菌との組み合わせの生物学的特性に従い選択した所定の温度で所定の期間インキ ュベートする。次に、その放出量を測定する成分、例えばヌクレオチドの量を適 当なアッセイ系、例えば酵素−基質系を用いて測定する。 細胞成分の放出をアッセイするには、完結した蘇生または選択富裕化ステップ の培地、または物質自体の試料を含有する培地を容器、例えばATPの場合であれ ばルミノメーター管（luminometer tube）内で選択したファージと好ましく混合 し、かつ適当な温度で適当な期間、例えば20〜40℃で30〜60分間インキュベート して細胞を溶解させる。上記条件はファージ−細菌系に依存する。ATP測定のた めには、発光アッセイ試薬、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ系の試薬を上 記インキュベーション期間もしくは細胞溶解 期間の前または後に添加し得、前記期間の間中に、または試薬添加の際に発せら れた光をルミノメーターで検出し、放出されたATPの量と関係付ける。いずれの 場合も、ファージを存在させずにインキュベートしたか、またはファージ及び既 知量の標的細菌を存在させてインキュベートした試料においてバックグラウンド 成分レベル、例えばヌクレオチドレベルとの比較のための対照試験を行なえば、 細菌数を確定するための検量線（calibration curves）を得ることができる。そ のような対照試験には、物質中に存在する生物の特性をより完璧に確認するべく 、異なる特異性を有する別のファージで試験してみることが含まれ得る。同様に 、特異的ファージを異にする数種の細菌のスクリーニングに本発明の方法を用い る場合は同一インキュベーションにおいて数種のファージを用いることも可能で ある。 入手可能なファージ、及び該ファージが特異性を有する細菌の範囲が広いこと は、当業者には明らかであろう。例えば、American Type Culture Collection（ ATCC）から入手可能な一連のファージがATCCによって“Catalogue of Bacteria & Bacteriophages”として公表されている。他の同様受託機関もそのカタログに 同様のデータを公表して おり、これらは本発明の方法に用い得るファージ“試薬”の同定に用いることが できる。ファージは特に、例えばマイクロタイタープレートウェル上で水性懸濁 液の形態でか、または凍結乾燥形態で用い得る。このように、プレートルミノメ トリー（plate luminometry）を用いることも可能である。好ましいファージは 溶菌性であり、標的生物の溶解を招く。 寄託ファージに加えて、適当な環境からファージを単離することによってもフ ァージ源は得られる。適当な環境とは好ましくは、標的細菌自体が見出される環 境である。例えば、家禽類加工プラントから出る廃棄物からはカンピロバクター 菌種とサルモネラ菌種との両方に特異的なファージを単離し得る。単離技術は、 当業者には良く知られていようが、Loessner及びBusseによってApplied and Env i -ronmental Microbiology，Vol．56，pp．1912-1918（1990）に、またAdamsに よってInterscience Inc．発行の“Bacte-riophages，”pp．447-455（1959）に 例示されている。 特定種類の細菌の増殖を選択的に促進するのに有効な一連の培地も当業者には 公知であり、それらの培地は積極的な作用によって、即ち例えば所期以外の生物 の阻害によっ て機能し得る。このような培地の例は、例えばUNIPATH Limited，Wade Road，Ba singstoke，HANTS，RG24 OPW，UKから入手可能な“Selective Microbiology for Food and Dairy Laboratories”や、OXOIDマニュアルなどのような供給元のマ ニュアルを参照することによって挙げることができる。上記出版物には、例えば カンピロバクター菌、リステリア菌及びエルシニア菌の増殖に有利であり得る培 地が列挙されている。同様に、試験試料を調製するべく食物病原体を単離する方 法も良く知られている。（UNIPATH及びOXOIDは登録商標である）。 本発明は、本発明の方法を実施する試験キットも提供し、このキットは標的細 菌生物、即ちその検出、同定及び／または定量が望まれる１種以上の細菌生物に 特異的に感染する能力に関して選択されたバクテリオファージを、先に述べた本 発明の方法に特に関連する試薬のうちの幾つかまたは総てと組み合わせて含むこ とを特徴とする。 即ち、好ましくは本発明の試験キットは （ａ）標的細菌生物に特異的に感染し、かつ標的細菌生物からの細胞成分の放出 を実現する能力に関して選択された、好ましくは実質的に標的細菌生物を伴わな い状態に有るバ クテリオファージ、及び （ｂ）バクテリオファージの標的細菌生物への作用によって放出される1種以上 の細胞成分の量をアッセイするのに必要な試薬 を含む。 場合によっては、本発明のキットは（ｃ）標的細菌生物の選択的増殖を促進す る選択培地、及び／または（ｄ）非選択的な細菌増殖培地をも含む。 即ち、本発明の好ましい試験キットは、アッセイの実施に必要な試薬が試料中 に存在するヌクレオチドの量をアッセイするのに用いられる試薬であり、この試 薬に好ましくはルシフェリン及びルシフェラーゼが含まれるキットである。細菌 の高感度アッセイを行なうべく最適化された試験キットは非選択増殖培地と選択 増殖培地との両方を含み、その際非選択増殖培地は好ましくは微生物蘇生ステッ プに適するものである。 固体培地に支持された細菌コロニー上の凹窩を監視する従来方法とは異なり、 本発明の方法は特に、物質試料に由来する細菌を液体培地上での培養により調べ ることで試験するべく構成されていることは明らかであるが、固体培地 を用いることも当然ながら可能である。本発明方法実施のための特定のキットは 、バクテリオファージ成分（a）を液体の形態である1種以上の培地（c）及び／ または（d）、または前記液体培地の調製に適合する濃縮成分もしくは乾燥成分 と共に有し得る。本発明の方法の実施に適合する上記のような組み合わせの多く は当業者に自明であろうが、本発明のキットは最も完璧な形態では試薬（a）〜 （d）を総て含む。ヌクレオチドアッセイ成分は好ましくは、細菌増殖培地の試 料のヌクレオチドレベルの測定のために最適化される。定量を行ないたい場合、 ヌクレオチドアッセイの検量のために既知量の細菌の対照読み取り値を設定する べく細菌試料を例えば胞子として、または培地中の細胞の形態で含ませることも 可能であろう。標的生物、及び標的でない対照生物を用い得る。 次の非限定的な実施例を参照して、本発明の方法及びキットの例を単なる一具 体例として以下に示す。先に説明し、かつ以下に特定した一般的な方法、並びに 用い得るバクテリオファージ及びヌクレオチドアッセイの種類の考慮下に、当業 者はきわめて様々な変形を容易に為すことができよう。実施例１： 乳中の低レベルのサルモネラ菌をファージ媒介 ATP生物発光によって検出する方法及び試験キット 用いた菌株 ： 検出するべき菌株は、家禽類加工プラント廃水から単離したサル モネラ菌とした。試験前にストックの細菌培養物を、ブレインハートインフュー ジョン（BHI）寒天（UNIPATH Ltd.，Basingstoke，Hampshire）斜面培地上に保 持した。特異的バクテリオファージSallも上記ソースから単離した。 バクテリオファージは、液体窒素の上方に配置した1.5ml容の低温試験管（cry otubes）内に無菌（bacteria-free）溶解物として貯蔵した。用いたバクテリオ ファージ溶解物の力価は1ml当たり1.2×10⁹プラーク形成単位（PFU）であった。 UNIPATH Ltd.のブレインハートインフュージョン（BHI）ブイヨンを用いて接 種物を増殖させた。ブイヨン培養物を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7）を用 いて連続稀釈した。選択的富裕化は、Rappaport-Vassiliadis（RV）ブイヨン（U NIPATH Ltd.）、より好ましくはセレナイトシスチン（SC）ブイヨン（Difco Lab oratories，Detroit，Michigan）を用いれば達成できることが判明した。 （a）特異的バクテリオファージSal1、（b）（例えば後述するような）ルシフ ェリン/ルシフェラーゼアッセイ試薬、及 び／または（c）RVもしくはSCブイヨン、及び場合によっては（d）BHIを含む、 上記サルモネラ菌を本発明の方法を用いて検出するのに適したキットを用意した 。Sal1は場合によっては、使用前に完全に溶解してファージを放出し、細菌を破 壊する感染細菌として提供されてもよい。 用いた分光光度計は、使い捨ての1cmキュベット（What-man International Lt d.，Maidstone，England）を具備したCE 202型（Cecil Instruments，Cambridge ，England）であった。光測定はLB953型ルミノメーターAutolumat（Ber-thold I nstruments U．K．Ltd.，St．Albans，Hertford-shire）と、使い捨てのポリス チレン管（カタログ番号55.476；Sarstedt，Beaumont Leys，Leicester，U．K． ）とを用いて行なった。アデノシン5′−三リン酸アッセイ試薬はルシフェリン/ ルシフェラーゼ及びアデノシン5′−三リン酸アッセイ混合稀釈緩衝液であり、S igma Chemical Co．Limited，Poole，Dorsetから得た。必要な場合、ルシフェリ ン/ルシフェラーゼ試薬を上記緩衝液で1：25に稀釈した。接種物の調製 ： Sal1のブイヨン培養物を10mlのBHIブイヨン中に入れ、濁りが 目に見えるようになるまで37℃でインキュベートした。650nmにおける吸光度を 測定し、同時に リン酸カリウム緩衝液で10⁰倍から10¹⁰倍までの連続10倍稀釈物を調製した。各 培養稀釈物から五つの1ml試料を得、これらを9ml量の新鮮なBHIブイヨンに接種 した。稀釈物試料を接種したブイヨンの入った管を37℃で一晩インキュベートし 、濁り具合を観察した。公表されている表（“Theory and Practice in Experim ental Bacteriology”，G．G．Meynell & Elinor Meynell，Cambridge Universi ty Press）から、いずれの培養稀釈物が1ml当たり約100個の細胞を含有するか決 定することができ、その稀釈物を用いて試験用の試料を調製した。 ｉ） 方法；乳試験：試料採取及び富裕化手順 蘇生／富裕化ステップとして、室温において1ml当たり約1個の対数増殖期Sall 細胞を感染させた100mlの新鮮な低温殺菌乳の1ml試料を9mlの新鮮なBHIブイヨン 中に移し、37℃で２時間インキュベートした。次に、（a）上記ステップ終了後 の培地0.1mlを10mlのRappaport-Vassiliadis（RV）選択的富裕ブイヨン中に置き 、41℃で7時間インキュベートした。 あるいはまた、弱った細菌細胞はRV培地の存在下に死ぬこともあると報告され ているので、試料中の細菌の生存率 が低いと考えられる場合は比較的効力の小さい選択培地を適用した。“より穏和 な”培地としてセレナイトシスチンブイヨンを選択し、この場合は回収ステップ として、（b）完了した蘇生／富裕化ステップの培地1.0mlを9mlのセレナイトシ スチン選択富裕ブイヨン中に置き、これを35℃で一晩インキュベートして得られ た培養物1mlを9mlの新鮮なBHIに接種し、37℃で2時間インキュベートした。 （a）の場合も（b）の場合も、4.5mlの完結培養物を0.5mlの特異的バクテリオ ファージSal1懸濁液と混合した。RV、セレナイトシスチンまたはBHI回収培養物 の残部は保存した。 ii） ルミノメーターの準備及び光測定 37℃に予熱したルミノメーター中の80本のポリスチレン製ルミノメーター管の 総てに、37℃に維持した50μlのBHIを入れた。選択した方法に応じてRV培養物ま たはBHI培養物である、先にバクテリオファージを添加した培養物50μlをルミノ メーター中の管に1本置きに添加し、残りの管にはバクテリオファージを伴わな い各培養物50μlを陰性対照として添加した。続いて光測定を開始し、即ち100μ lのルシフェリン/ルシフェラーゼ試薬を各管に注入し、直ちに出力される光を60 秒間にわたって監視した。陽性管と 陰性対照管との両方に関し、得られた測定値をピーク光強度として時間に対して プロットした。 いずれの方法を用いた場合も、陽性管に関しては60分後に25,000カウント/秒 （cps）のピークが得られたが、陰性対照は500cpsにしか達しなかった。 実施例２： レタスのリステリア菌をファージ媒介ATP生物発光によって検出す る方法及び試験キット 用いた菌株 ： 用いたリステリアモノサイトゲネス株はATCC 23074であり、その 特異的バクテリオファージはATCC23074-B1であった。バクテリオファージは、液 体窒素の上方に配置した1.5ml容の低温試験管内に無菌溶解物として貯蔵した。 ファージ調製物の力価は1ml当たり約2.11×10¹⁰PFUであった。培地 ： ストック培養物はブレインハートインフュージョン（BHI）寒天斜面培 地上に保持した。接種物の増殖にはBHIブイヨンを用いた。リン酸カリウム緩衝 液（0.1M； pH7）を用いて連続稀釈を行なった。選択富裕培地はリステリア菌富 裕ブイヨン（LEB）とした。いずれの培地もUNIPATH Ltd.，Basingstoke，Hampsh ire，U．K．から得た。 （a）バクテリオファージATCC 23074-B1、（b）ルシフェリ ン/ルシフェラーゼアッセイ試薬、及び／または（c）LEB、及び場合によってはB HIを含む、リステリアモノサイトゲネスを本発明の方法によって測定するのに適 したキットを用意した。装置 ： 分光光度計、キュベット、ルミノメーター及びポリスチレン製ルミノメ ーター管はサルモネラ菌検出方法に詳述したものを用いた。Colworth 400ストマ ッカー（sto-macher）を用いた（A．J．Seward，London SEI）。試薬 ： 発光試薬はサルモネラ菌検出方法に述べたものを用いた。接種物の調製 ： 1ml当たり約100細胞を含有するATCC23074の接種物を、サルモ ネラ菌検出方法に述べたのと同様の操作で調製した。陽性試験として用いるためのレタスへの細菌接種 ： 新鮮なレタスを手でちぎっ て長さ約2cmの小片状とした。100gのちぎったレタスに、ステップ（ｉ）で調製 したリステリア菌の緩衝懸濁液100mlを添加し、1分間振盪することにより十分に 混合した。その後、レタスに付着した液体を除いてからレタスを4℃で貯蔵した 。 ｉ） リステリア菌の抽出及び富裕化手順 リステリア菌を接種したレタスを100mlのリン酸カリウム緩衝液と共に大型の ストマッカーバッグに入れ、ストマッカー内で1分間混合した。次に蘇生／富裕 化ステップとして、上記のようにして得た懸濁液1mlを9mlのBHIブイヨンに添加 し、30℃で4時間インキュベートした。このステップで得られた培養物1mlを30℃ において9mlのLEBに添加し、一晩インキュベートしたが、これは選択富裕化ステ ップであった。選択富裕化ステップで得られた培養物を4.5ml取り出し、これに0 .5mlの特異的バクテリオファージATCC23074-BIを添加した。 LEB培養物の残部は陰性対照として保存した。 ii） ルミノメーターの準備及び光測定 30℃に予熱したルミノメーター中の80本の管に、（30℃に）加熱した50μlのB HIを入れた。機械を、30℃において動力学的モード（kinetics mode）で作動す るように設定した。第一の管から１本置きに、50μlの陰性対照培養物（バクテ リオファージを伴わない）を添加した。残りの管には50μlの試験培養物（バク テリオファージを伴う）を添加した。次に、100μlのルシフェリン/ルシフェラ ーゼ試薬を各管に逐次注入し、直ちに出力される光を60秒間にわたっ て測定した。 サルモネラ菌の場合同様、試験培養物管及び陰性対照管に関するピーク光強度 （カウント/秒）を時間に対してプロットした。ここに述べた方法によれば、試 験培養物に関しては48分後に10,000cpsのピークが観察されたが、陰性対照の方 は常に約1,000cpsのままであった。対照を上回る光出力レベルが存在しないこと は標的生物のリステリア菌の不在と解釈され、細菌自体の不在とは解釈されない 。実施例3〜11 更に別の細菌、及び当該細菌のATPを含めた細胞内容物の放出を特異的に実現 し得る特定のファージを、本発明の目的のために前記細菌とファージとを一緒に インキュベートするのに適した培地及び好ましいインキュベーション温度と共に 次表に例示する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．物質中に存在する特定の細菌属、種または血清型の標的生物を検出、同定及 び／または定量する方法であって、前記物質または前記物質由来の細菌を、標的 生物に特異的に感染し、かつ標的生物からの細胞成分の放出を実現する能力に関 して選択したバクテリオファージと共にインキュベートし、インキュベーション の間に存在する細菌から放出される1種以上の特定の細胞成分の量を測定し、並 びに前記測定値を標的生物の存在、同等性及び／または量と関係付けることを含 む前記方法。 ２．インキュベーションを細菌支持培地中で行なうことを特徴とする請求項1に 記載の方法。 ３．インキュベーションを20〜40℃で行なうことを特徴とする請求項1または2に 記載の方法。 ４．1種以上の細胞成分がNAD、NADP、NADH、NADPH、ATP、ADP、cAMP及びcGMPか ら選択したヌクレオチドから成ることを特徴とする請求項1、2または3に記載の 方法。 ５．酵素に基づくアッセイ系を用いてヌクレオチドを測定することを特徴とする 請求項3または4に記載の方法。 ６．細胞成分がATPであり、アッセイが発光を生起させる 酵素を用いるものであることを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の 方法。 ７．アッセイ系がルシフェリン/ルシフェラーゼ系であり、発せられる光の量を インキュベーションの全体にわたって、または細胞溶解期間の間中測定すること を特徴とする請求項6に記載の方法。 ８．物質または物質由来の細菌を特異的バクテリオファージと共にインキュベー トするステップを特定の細胞成分アッセイ試薬の存在下に行なうか、または該ス テップを行なった後に前記試薬を添加することを特徴とする請求項1から7のいず れか1項に記載の方法。 ９．物質または物質由来の細菌をバクテリオファージと共にインキュベートする 前に、標的細菌の増殖に有利な選択培地かまたは細菌増殖を支持し得る非選択培 地と共にインキュベートすることを特徴とする請求項1から8のいずれか1項に記 載の方法。 10．選択培地の存在下でのインキュベーションを1〜10時間行なうことを特徴と する請求項9に記載の方法。 11．バクテリオファージの存在下でのインキュベーションを20〜60分間行なうこ とを特徴とする請求項1から10のい ずれか1項に記載の方法。 12．選択培地またはバクテリオファージの存在下でのインキュベーションの前に 物質または細菌を非選択培地と共にインキュベートし、このインキュベーション が完了したら培地の試料を、試験するべき物質または細菌の供給源として選択培 地またはバクテリオファージの存在下でのインキュベーションのステップに移す ことを特徴とする請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。 13．非選択培地の存在下でのインキュベーションを1〜5時間行なうことを特徴と する請求項12に記載の方法。 14．バクテリオファージを懸濁液の形態でか、凍結乾燥ファージとしてか、また は使用前に溶解させる感染細菌として提供することを特徴とする請求項1から13 のいずれか1項に記載の方法。 15．同一インキュベーションにおいて数種のバクテリオファージを用い、かつ多 数の種類の細菌をスクリーニングする方法を用いることを特徴とする請求項1か ら14のいずれか1項に記載の方法。 16．特定の細菌属、種または血清型の標的生物を検出、同定及び／または定量す る試験キットであって、標的生物に 特異的に感染し、かつ標的生物からの細胞成分の放出を実現する能力に関して選 択されたバクテリオファージを含み、更に請求項1から15のいずれか1項に記載の 方法に特異的に関連する試薬のうちの幾つかまたは総てをも含むことを特徴とす る前記キット。 17．特定の細菌属、種または血清型の標的生物を検出、同定及び／または定量す る試験キットであって、 （ａ）標的細菌生物に特異的に感染し、かつ標的細菌生物からの細胞成分の放出 を実現する能力に関して選択されたバクテリオファージ、及び （ｂ）バクテリオファージの標的細菌生物への作用によって放出される細胞成分 の量をアッセイするのに必要な試薬を含む前記キット。 18．（ｃ）キットが標的とする細菌属、種または血清型の生物の優先的増殖を促 進する選択培地、及び／または（ｄ）非選択的な細菌増殖培地をも含むことを特 徴とする請求項17に記載のキット。 19．試薬（b）によってアッセイされるべき細胞成分がヌクレオチドを含むこと を特徴とする請求項17または18に記載のキット。 20．試料中に存在するヌクレオチドの量をアッセイするのに必要な試薬がルシフ ェリン及びルシフェラーゼを含むことを特徴とする請求項19に記載のキット。 21．培地（c）及び／または（d）を液体の形態で、またはそのような液体培地の 調製に必要な濃縮成分もしくは乾燥成分として含むことを特徴とする請求項17か ら20のいずれか1項に記載のキット。 22．更に標的生物及び／または対照の非標的生物をも含むことを特徴とする請求 項16から21のいずれか1項に記載のキット。 23．実質的に実施例1または実施例2に記載したようなものであることを特徴とす る請求項16から21のいずれか1項に記載のキット。 24．実質的に実施例1または実施例2に記載したようなものであることを特徴とす る請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。