CN116018518A - 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物、方法和系统 - Google Patents

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物、方法和系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测MRSA，例如MRSA鼻腔定殖的组合物、方法和系统。在某些实施方案中，所述方法在对细菌和其他微生物的检测中使用基于噬菌体的信号放大来检测MRSA。所述用于检测MRSA的方法可以包括：制备测定物，所述测定物包含选择剂和包含至少两种不同类型的重组噬菌体的混合物；在所述测定物中孵育样品；俘获指示蛋白产物；并检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中对所述指示蛋白产物的阳性检测指示MRSA存在于所述样品中。

Description

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物、方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月30日提交的美国临时申请号63/018,081的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于使用感染原检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MRSA)的组合物、方法和系统。
背景技术
在检测可以导致各种形式的令人虚弱的和致死性感染的细菌和其他微生物方面有强烈的兴趣。细菌病原体可以导致人类和家畜的大量发病，以及巨大的经济损失。具体来说，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是极重要的人类病原体，它有能力导致致死性感染。MRSA是医院中手术部位感染的主要原因，与患者住院时间较长、再住院率较高、生存率减小以及经济损失相关。因为对保健工业的严重临床和财政负担，已经付出了显著的努力来理解和控制MRSA相关感染的来源。已经发现MRSA的鼻腔滞菌是后续疾病的主要风险因素，并且大多数金黄色葡萄球菌感染可以匹配到内源性定殖株。通过对MRSA鼻腔滞菌的去定殖来消除此风险因素已经证明是减少手术部位感染的成功策略。
用于检测MRSA的传统微生物学测试依赖于非选择性和选择性富集培养，接着接种在选择性培养基上，进一步测试以确认来自患者鼻拭子标本的可疑菌落。基于培养的检测方法可以涉及使用生色的和选择性的琼脂并且经常证明在灵敏度和特异性方面有很强的性能。尽管经常比一些方法显著更廉价，但基于培养的方法的一个主要缺点是在检测前结果一般需要18-24小时的孵育。
各种各样的快速方法已经进行了研究并引入到实践中以减少测试时间。然而，这些方法也具有缺点。例如，涉及免疫测定或基因探针的技术通常需要富集步骤以获得适宜的灵敏度。聚合酶链式反应(PCR)测试还包括扩增步骤，并且因此能够获得非常高的灵敏度和选择性。利用实时PCR检测MRSA-特异性DNA序列已经证明具有优异的灵敏度和特异性、快速的结果获得时间以及总体临床有效性。尽管实时PCR已经产生了有希望的结果，但该方法也有缺点。首先，新一代实时PCR必须不断地进行开发以匹配不断改变的MRSA耐药性的遗传全景，因为以前的PCR已经导致一些测定不能检测新的MRSA株。其次，相对于基于培养的替代方案，实时PCR的高成本已经引起了关于成本-有效性的不确定性，特别是在流行病传播率低的地区。
因此，存在着对更快速的、简单的和灵敏的检测和鉴定MRSA的需求。
发明内容
本公开的实施方案包括用于检测MRSA鼻腔定殖的组合物、方法、设备、系统和试剂盒。本公开可以以各种各样的方式体现。
在一些实施方案中，本公开提供了一种检测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。所述方法包括：获得样品；向所述样品中加入选择剂；使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物(cocktail)接触，其中所述感染原包含指示基因并对金黄色葡萄球菌特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；俘获所述指示蛋白产物；以及检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中MRSA的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了一种检测样品中的微生物的方法，所述方法包括：获得样品；使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对微生物特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；使所述指示蛋白产物与表面接触，所述表面包含用于俘获所述指示蛋白产物的固定化的结合伴侣；以及检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中所述微生物的存在。
在一些实施方案中，本公开利用了新的重组噬菌体用于从鼻拭子标本检测MRSA。在一些实施方案中，所述新的重组噬菌体对金黄色葡萄球菌特异。新的诊断筛选利用了包含重组噬菌体的测定物，同时依赖于抗生素限制非-MRSA株的生长，所述重组噬菌体包括能够识别金黄色葡萄球菌的萤光素酶报告子。使用本文所述的方法可以检测各种各样的MRSA株。
在一些实施方案中，本公开提供了从样品检测MRSA的方法，包括：(a)使所述样品与选择剂接触，(b)使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对金黄色葡萄球菌特异，并且其中所述指示基因编码示蛋白产物，以及(c)检测由指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中MRSA的浓度。在一些实施方案中，所述选择剂包括抗生素(例如，头孢西丁)。在一些实施方案中，所述样品来自鼻拭子。
在一些实施方案中，感染原是对金黄色葡萄球菌细菌特异的重组噬菌体。在进一步的实施方案中，指示基因编码生成内部信号的指示蛋白产物或在与底物反应后生成信号的可溶性酶。
在一些实施方案中，本公开提供了从样品检测MRSA的方法，包括：使所述样品与选择剂接触，其中所述样品来自鼻拭子；使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对金黄色葡萄球菌特异，并且其中所述指示基因编码示蛋白产物，以及检测由指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中MRSA的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了用于检测MRSA的试剂盒和系统，包括鼻拭子；以及包含重组噬菌体和抗生素溶液的测定物，所述重组噬菌体对金黄色葡萄球菌特异。在一些实施方案中，本公开提供了用于检测微生物的试剂盒和系统，包括鼻拭子；包含重组噬菌体和任选的抗生素的测定物，所述重组噬菌体对金黄色葡萄球菌特异；和用于俘获指示蛋白产物的表面。
本公开的某些具体实施方案利用了美国专利公开号2015/0218616中所述的方法和构建体，该申请的全部内容通过引用并入本文。
具体实施方式
本文公开了组合物、方法和系统，所述组合物、方法和系统证明了与常规方法相比在较短的时间范围内检测测试样品(例如，生物样品)中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的各种菌株的令人惊讶的灵敏度。本文公开的组合物、方法和系统可以在比以前认为可能的时间范围更短的时间范围内使用遗传修饰的传染性噬菌体以减少的用于富集的培养时间检测MRSA，或在一些实施方案中，以最小的孵育次数(在孵育期间MRSA可能潜在地倍增)检测MRSA。令人惊讶地，在抗生素(例如，头孢西丁)的存在下使用一种或多种重组噬菌体的测定，与测试样品孵育，在生成非常低的菌落形成单位(CFU)数的浓度来检测多种MRSA株。这样低的CFU浓度以前据称仅在使用需要孵育超过24小时的基于培养的方法后被检测到。然而，本文所述的测定可以有助于发现、结合和感染小数量的靶细胞。在一些实施方案中，所述测定在小于10小时内从鼻拭子标本中检测MRSA，成本类似于时间较长的基于培养的方法。
在一些方面，本文所述的基于噬菌体的MRSA测定提供了对靶细菌的特异性的、灵敏的、快速的和低成本的检测，并且满足了多个工业中不断增长的诊断需求。具体地，检测MRSA鼻腔定殖和抗生素易感性在防止医院获得性感染和有助于抗生素管理中具有至关重要的支持作用。在一些实施方案中，对鼻拭子标本的基于噬菌体的MRSA测定利用了两个能够识别遗传上多样的金黄色葡萄球菌的萤光素酶报告噬菌体。在一些实施方案中，包括β-内酰胺抗生素头孢西丁，以区分耐药的(MRSA)和易感的生物体。基于噬菌体的MRSA测定令人惊讶地在低细菌浓度时明确地鉴定了MRSA分离株，并且在较高浓度的接种物，非-MRSA金黄色葡萄球菌产生适宜的阴性结果。另外，在选择性条件下噬菌体混合物与其他葡萄球菌属和芽孢杆菌属物种的交叉反应性可以减小。因此，本文所述的基于噬菌体的MRSA测定在体外和在人鼻基质中均灵敏地检测MRSA。
在一些方面，本公开提供了重组噬菌体，其包含插入到噬菌体基因组的晚期基因区中的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是基因修饰的金黄色葡萄球菌-特异性噬菌体基因组。在某些实施方案中，所述重组噬菌体包含衍生自特异性识别金黄色葡萄球菌的噬菌体的基因修饰的噬菌体基因组。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含至少两种不同类型的衍生自特异性识别金黄色葡萄球菌的噬菌体的重组噬菌体。在一些实施方案中，包括重组噬菌体和选择剂(例如，抗生素)的混合物的测定可以在其他类型的细菌(具体地，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA))的存在下区分MRSA。
在一些方面，检测MRSA的方法可以使用感染原来检测金黄色葡萄球菌。例如，在某些实施方案中，感兴趣微生物是MRSA，感染原是特异性感染金黄色葡萄球菌的噬菌体。因此，在某些实施方案中，所述方法可以包括选择特异性感染金黄色葡萄球菌细菌的一种或多种噬菌体，制备衍生自金黄色葡萄球菌噬菌体的重组噬菌体，制备包含所述重组噬菌体和选择剂(例如，抗生素)的测定物，并提供来自鼻拭子或类似来源的样品用于在测定中分析。在某些实施方案中，所述重组噬菌体包含指示基因。在某些实施方案中，所述指示基因可以插入到噬菌体的晚期基因区使得在感染宿主细菌后在噬菌体复制期间表达所述指示基因，导致产生指示蛋白产物。所述方法可以包括检测所述指示蛋白产物，其中对所述指示蛋白产物的阳性检测表示MRSA存在于所述样品中。在一些实施方案中，所述指示蛋白是可溶性的。
在一些实施方案中，组合物、方法和系统可以使用包含一种或多种重组噬菌体和选择剂(例如，抗生素)的测定物检测来自各种各样的遗传背景的MRSA。在一些实施方案中，所述测定物利用选择剂，例如，头孢西丁，来限制易感细菌的活力，同时允许MRSA生长。例如，所述选择剂可以杀死或减少除MRSA以外的全部金黄色葡萄球菌细菌(例如，MSSA)的生长。以此方式，头孢西丁能够将MRSA的各种分离株与竞争性生物体鉴定开。如本文所述，包括头孢西丁的测定物产生对MRSA的高选择性，并且重要的是，不干扰对MRSA株的检测。另外，头孢西丁有效地减少来自凝固酶阴性的葡萄球菌属的几个菌种的假阳性。
在一些实施方案中，本文所述的方法和系统选择性地从鼻拭子或类似样品中检测低水平的MRSA。本公开的方法和系统的每个实施方案可以应用于对大量MRSA株的检测和定量。所述方法和系统提供了在短时间内的高检测灵敏度，无需传统的生物学富集和/或孵育，后者需要至少24个小时。所述方法利用新的基于噬菌体的MRSA诊断筛选。该测定为利用萤光素酶诸如
Figure BDA0004005192470000061
灵敏地检测靶物种的新一代萤光素酶-噬菌体报告基因系统的成员。所述方法证明包涵性高，并且当与头孢西丁选择联合时，能辨别大多数非耐药菌株。此外，该筛选能够鉴定鼻样品中的低载量MRSA，干扰很少或没有干扰。
在某些实施方案中，本公开可以包括系统。所述系统可以包含本公开的至少一些组合物。另外，所述系统可以包括至少一些用于执行所述方法的组件。在某些实施方案中，所述系统被配置为试剂盒。因此，在一些实施方案中，用于从鼻拭子快速检测MRSA的系统包括：用于将样品与对感兴趣微生物特异的重组感染原孵育的组件，其中所述重组感染原包含指示部分；选择剂；和用于检测所述指示部分的组件。在其他实施方案中，本公开包括与所述方法或系统一起使用的软件。
本文所述的本公开的一些实施方案利用了下面的发现：单一微生物能够识别并结合特异性感染原，诸如噬菌体。在噬菌体感染和复制后，子代噬菌体的成功感染和产生可以通过在噬菌体复制期间表达的指示部分被检测到。此原理允许基于对微生物表面受体的特异性识别放大来自一个或少量细胞的指示物信号。例如，通过将甚至单个细菌细胞暴露于多个噬菌体，之后使噬菌体扩增并在复制期间高水平表达所编码的指示基因产物，指示物信号被放大使得单个细菌可被检测到。
定义
除非本文另外地定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应当具有本领域中普通技术人员所普遍理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。通常，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的术语以及它们的技术是本领域中众所周知的且是普遍使用的那些。已知的方法和技术通常根据本领域中所公知的常规方法以及如贯穿本说明书所讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述来执行，除非另外指明。酶促反应和纯化技术根据生产厂商的说明书执行，如本领域中所普遍实现或如本文所述的那样。结合本文所述的实验室操作和技术使用的术语是本领域中所公知和普遍使用的那些。下面的术语，除非另外指明，应当被理解为具有下列的含义：
如本文所用，术语“一个”、“一种”和“该”可以指一个或多个，除非另外具体地注明。
术语“或”的使用用来意指“和/或”，除非明确地指明是指仅可选择物或可选择物是互斥的，尽管本公开支持指仅可选择物和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用来表明值包括关于用来确定该值的装置、方法的误差的固有变差或在样品之间存在的差异。
术语“固相载体”或“载体”意指提供其上可以结合生物分子的基底和/或表面的结构。例如，固相载体可以是测定孔(即，诸如微量滴定板或多孔板)，或固相载体可以是滤器、阵列或可移动载体上的位置，诸如珠子或膜(例如，过滤板或侧流条)上的位置。
如本文所用，术语“结合剂”或“结合伴侣”是指可以特异性地和选择性地结合第二(即，不同的)感兴趣分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，作为氢键键合、范德华相互作用、或静电或疏水相互作用的结果，或相互作用可以是共价的。
术语“可溶性结合剂”是指不与固相载体缔合(即，共价或非公价地结合)的结合剂。
术语“固定化的结合伴侣”是指与固相载体缔合(即，共价或非公价地结合)的结合剂。
如本文所用，“分析物”是指被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，感兴趣分析物可以与结合剂相互作用。
如本文所述，术语“分析物”可以指感兴趣的蛋白或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节物。备选地，分析物可以不具有生物学效应。分析物可以包括小分子、糖类、寡糖、脂质、肽、拟肽物、有机化合物等。
术语“可检测的部分”或“可检测的生物分子”或“报告子”或“指示物”或“指示部分”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，指示部分可以包含可以用来将底物转化成可以被测量的产物的酶。指示部分可以是催化生成生物发光的反应的酶(例如，萤光素酶)。备选地，指示部分可以是可以被量化的放射性同位素。备选地，指示部分可以是荧光团。备选地，可以使用其他可检测的分子。
如本文所用，“细菌噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开中，术语“细菌噬菌体”和“噬菌体”包括病毒，诸如分枝杆菌噬菌体(诸如针对TB和副TB)、噬真菌体(诸如针对真菌)、支原体噬菌体，以及指可以侵袭活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他微观活生物体并且利用它们来复制自身的病毒的任何其他术语。在此，“微观”意指最大尺寸是1毫米或更小。
细菌噬菌体是在自然界中已经进化为利用细菌作为复制自身的手段的病毒。噬菌体通过将自身附着于细菌并将其DNA(或RNA)注入到该细菌中，并且诱导其将噬菌体复制几百或甚至几千次来完成此过程。这称作噬菌体扩增。
如本文所用，“晚期基因区”是指病毒基因组中的在病毒生命周期的晚期进行转录的区域。晚期基因区典型地包括表达丰度最高的基因(例如，组装成细菌噬菌体颗粒的结构蛋白)。晚期基因与III类基因同义并且包括具有结构和组装功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中转录，例如，从感染后8分钟直至裂解，I类(例如，RNA聚合酶)是早期的4-8分钟，II类是6-15分钟，因此II类和III类的时间是存在重叠的。晚期启动子是天然地定位在此晚期基因区内并且有活性的启动子。
如本文所用，“培养用于富集”是指传统的培养，诸如在有利于微生物繁殖的培养基中孵育，并且不应当与词语“富集”的其他可能用途相混淆，诸如通过移除样品的液体组分以浓缩其中包含的微生物，或不包括传统的促进微生物繁殖的其他富集形式。以持续很短的时间段进行培养用于富集可以在本文所述的方法的一些实施方案中采用，但不是必须的，并且如果要使用，则持续的时间段要比传统的用于富集的培养短得多。
如本文所用“重组的”是指基因(即，核酸)修饰，如通常在实验室中进行从而将以其他的方式将不存在的遗传材料结合在一起那样。在本文中该术语与术语“修饰的”可互换使用。
如本文所用“RLU”是指通过光度计(例如，
Figure BDA0004005192470000081
96)或类似的检测光的仪器测量的相对光单位。例如，检测萤光素酶和适宜底物(例如，
Figure BDA0004005192470000082
与NANO-
Figure BDA0004005192470000083
)之间的反应经常以检测到的RLU报告。
如本文所用“获得结果的时间”是指从开始样品孵育至生成结果的总时间量。获得结果的时间不包括任何确认性的测试时间。数据采集可以在生成结果后的任何时间完成。
样品
本公开的方法和系统的每个实施方案可以允许快速的检测和定量样品中的MRSA。例如，根据本公开的方法可以在缩短的时间内执行，获得较佳的结果。通过本公开可检测到的细菌细胞包括，但不限于，体外的或来自鼻拭子的各种MRSA株。
样品可以是液体的、固体的或半固体的。样品可以是表面的拭子。在一些实施方案中，样品可以是鼻拭子以检测MRSA的鼻腔定殖。在一些实施方案中，样品可以包括身体的物质，例如，组织液或鼻液。在一些实施方案中，样品可以是全血、血浆、血清或其组合。
在一些实施方案中，样品可以在本公开的检测方法中直接使用，无需制备、浓缩或稀释。例如，液体样品(包括但不限于鼻拭子)可以直接进行测定。样品可以在溶液中稀释或悬浮，所述溶液可以包括，但不限于，缓冲溶液或细菌培养基。是固体或半固体的样品可以通过将固体在液体中切碎、混合或浸泡从而混悬在液体中。样品应当保持在促进细菌噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH范围内。优选地，样品保持在维持包含在样品内的任何病原体细胞的活力的温度。
在检测测定的一些实施方案中，样品保持在维持样品中存在的任何病原体细胞的活力的温度。例如，在其中细菌噬菌体附着于细菌细胞的步骤期间，优选将样品保持在促进细菌噬菌体附着的温度。在其中细菌噬菌体在被感染的细菌细胞内复制或裂解此感染细胞的步骤期间，优选将样品保持在促进细菌噬菌体复制和裂解宿主的温度。此温度为至少约25摄氏度(℃),更优选不超过约45℃，最优选约37℃。
在一些实施方案中，测定可以包括选择剂。选择剂可以添加到测定物中以抑制或促进微生物的生长，诸如可以抑制或阻止微生物生长的选择性和非选择性抗微生物剂，调节剂(即，可以改变微生物生长但不被认为是抗微生物剂的作用剂)，或富集剂(例如，营养缺陷性微生物必需的物质，诸如氯化血红素，或难养生物体必需的物质)或可以促进微生物生长的其他组分。在一些实施方案中，选择剂是包含例如头孢西丁的抗微生物剂。
测定物可以包括各种适宜的对照样品。例如，不含细菌噬菌体的对照样品或含有细菌噬菌体但不含细菌的对照样品，可以作为对照测定背景信号水平。
细菌噬菌体
如本文中更详细描述的那样，本公开的组合物、方法、系统和试剂盒可以包含用于检测MRSA的感染原。在某些实施方案中，本公开提供了重组指示细菌噬菌体，其中所述细菌噬菌体基因组被基因修饰以包括指示基因或报告基因。在一些实施方案中，组合物可以包含重组细菌噬菌体，所述重组细菌噬菌体具有掺入到细菌噬菌体的基因组中的指示基因。
本公开的组合物可以包含一种或多种基因修饰的感染原(例如，细菌噬菌体)和一个或多个指示基因。在一些实施方案中，组合物可以包括不同指示噬菌体的混合物，所述指示噬菌体可以编码和表达相同或不同的指示蛋白。在一些实施方案中，细菌噬菌体混合物包含至少两种不同类型的源自对金黄色葡萄球菌特异的细菌噬菌体的重组细菌噬菌体。
重组指示细菌噬菌体可以包括报告基因或指示基因。在感染原的某些实施方案中，在感染宿主细菌后在细菌噬菌体复制期间所述指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，所述指示基因可以插入到细菌噬菌体的晚期基因区中。晚期基因以通常比其他噬菌体基因更高的水平表达，因为它们编码结构蛋白。在一些实施方案中，指示细菌噬菌体源自对金黄色葡萄球菌特异的细菌噬菌体。
此外，被认为非必要的噬菌体基因可以具有未被认识到的功能。例如，表观上非必要基因可以在提高裂解量方面具有重要的功能，诸如在组装中的精细切割、装配或修剪功能。因此，使基因缺失以插入指示物可能是有害的。大多数噬菌体可以包装比它们的天然基因组大百分之几的DNA。鉴于这种考虑，较小的指示基因可以是修饰细菌噬菌体的更适宜选择，特别是修饰具有较小基因组的细菌噬菌体。OpLuc和
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蛋白为仅约20kDa(编码序列大约500-600bp)，而FLuc为约62kDa(编码序列大约1,700bp)。此外，报告基因不应当被细菌内源表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应当生成高信号背景比，并且应当以适时的方式可容易地检测到。Promega的
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是修饰的Oplophorusgracilirostris(深海虾)萤光素酶。在一些实施方案中，
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与Promega的
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(一种咪唑并吡嗪酮底物(furimazine))组合可以提供具有低背景的稳健信号。
指示基因可以表达各种各样的生物分子。指示基因是表达可检测产物或产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可以使用各种类型的萤光素酶。在备选的实施方案中，并且如本文更详细描述的那样，萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶基因源自Oplophorus。在一些实施方案中，指示基因是经遗传修饰的萤光素酶基因，诸如
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因此，在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰的细菌噬菌体，所述经遗传修饰的细菌噬菌体包含在晚期(III类)基因区中的非细菌噬菌体指示基因。在一些实施方案中，非天然指示基因处于晚期启动子的控制下。病毒晚期基因启动子的使用确保报告基因(例如，萤光素酶)不仅像病毒衣壳蛋白那样以高水平表达，而且如内源性细菌基因或甚至早期病毒基因那样不会关闭。
对感染原的遗传修饰可以包括核酸小片段、基因的大部分或整个基因的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，插入或取代的核酸包含非天然序列。非天然指示基因可以插入到细菌噬菌体基因组中使得其处于细菌噬菌体启动子的控制下。因此，在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，指示蛋白产物是可溶的。在一些实施方案中，本公开提供了检测感兴趣细菌(例如，金黄色葡萄球菌)的方法，包括将测试样品与此类重组细菌噬菌体孵育的步骤。
在一些实施方案中，在感染宿主细菌后在子代细菌噬菌体中指示基因的表达产生游离的可溶性蛋白产物。在一些实施方案中，非天然指示基因不与编码结构性噬菌体蛋白的基因邻接，因此不产生融合蛋白。在一些实施方案中，指示物或报告子理想地不含有细菌噬菌体结构。即，指示物或报告子不附着于噬菌体结构。像这样，在重组噬菌体基因组中，指示物或报告子的基因不与其他基因融合。这可以极大地增加测定的灵敏度(低到单个细菌)，并且简化测定，对于一些实施方案允许测定在2小时或更少的时间内完成，与此相反的是，由于利用产生可检测的融合蛋白的构建体要求附加的纯化步骤而需要几小时。
在一些实施方案中，指示噬菌体编码报告子，诸如可检测的酶。指示基因产物可以生成光和/或可以通过颜色变化来检测。各种适宜的酶是市售的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以充当指示部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
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是指示部分。其他工程化萤光素酶或生成可检测信号的其他酶也可以是适宜的指示部分。
在一些实施方案中，重组细菌噬菌体母液的制备包括在细菌检测测定中使用之前足以去除基本上全部的可能与细菌噬菌体缔合的残余指示蛋白的纯化步骤。这样得到的亲代重组细菌噬菌体的制剂基本上不含指示蛋白，用来感染感兴趣样品中的任何靶细菌。
使用感染原检测MRSA的方法
如本文所述，在某些实施方案中，本公开提供了使用感染性细菌噬菌体检测MRSA或微生物的方法。本公开的方法可以以各种各样的方式实现。
在一些实施方案中，本公开提供了检测样品中的微生物的方法。所述方法包括：获得样品；使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对微生物特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；使所述指示蛋白产物与表面接触，所述表面包含用于俘获所述指示蛋白产物的固定化的结合伴侣；以及检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中所述微生物的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了从样品(例如，从鼻拭子)检测MRSA的方法，包括以下步骤：获得样品，使所述样品在包含选择剂和感染金黄色葡萄球菌的一种或多种细菌噬菌体的测定物中孵育，其中所述细菌噬菌体包含指示基因，使得在感染感兴趣细菌后在细菌噬菌体复制期间表达所述指示基因导致产生可溶性指示蛋白产物；以及检测所述指示蛋白产物，其中对所述指示蛋白产物的阳性检测表示MRSA存在于所述样品中。在一些实施方案中，所述选择剂是包含头孢西丁的抗生素。
在一些实施方案中，所述方法包括俘获指示蛋白产物用于检测。在表面上俘获指示蛋白产物的步骤改善了对生成非常低的菌落形成单位数的浓度的微生物或多种MRSA株的检测。指示蛋白产物可以与表面接触以将指示蛋白产物俘获在表面上。例如，所述指示蛋白产物可以在俘获步骤期间附着或结合到所述表面。在一些实施方案中，所述表面可以包括微量滴定板、胶乳粒子、侧流条、珠粒、磁性粒子、浸渍试纸，等等。
在一些实施方案中，所述表面可以包含固定化的结合伴侣。例如，一个或多个特异性识别元件可以固定化在表面的离散区域中以便生成用于分析物识别的阵列。所述指示蛋白产物可以与包含固定化的结合伴侣的所述表面接触。在一些实施方案中，几种不同的结合伴侣可以同时固定化在一个表面上。在一些实施方案中，固定化的结合伴侣是抗体或其片段。
在一些实施方案中，一种或多种不同的固定化的结合伴侣可以沉积在(例如，被移液到)表面上(例如，平板)用于俘获指示蛋白产物。在一些方面，所述表面可以提高可及性并且通过定向固定化的结合伴侣俘获所述指示蛋白产物。例如，抗体可以沉积在平板上并孵育一段时间。在一些实施方案中，抗体可以是兔抗体或山羊抗体。任选地，平板可以在孵育后进行洗涤。随后，
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抗体可以沉积在包被的平板上。在一些方面，如果待沉积在表面上的指示蛋白产物的量与固定化的结合伴侣相等或小于用于在作为固相载体的表面上形成单层的固定化的结合伴侣的量，则这是有利的。例如，固定化的结合伴侣可以是抗体，所述抗体结合在固体载体表面上的层，产生它们的特异性结合表位的可及性。
在一些实施方案中，本公开的方法可以包括各种其他步骤以增加灵敏度。检测微生物或MRSA的方法的灵敏度可以通过一个或多个洗涤步骤增加。例如，所述方法可以包括洗涤所俘获的指示蛋白产物以去除过多的细菌噬菌体和/或萤光素酶或污染细菌噬菌体制剂的其他指示蛋白的步骤。另外，所俘获的微生物可以在与抗生素和感染原孵育后被洗涤，然后添加裂解缓冲液和底物。这些附加的洗涤步骤辅助去除过多的亲代噬菌体和/或萤光素酶或污染噬菌体制剂的其他指示蛋白。在一些实施方案中，微生物可以被俘获，洗涤，然后用细菌噬菌体感染。
在一些实施方案中，所述方法包括将蛋白加入到抗体中以促进细菌噬菌体的感染。金黄色葡萄球菌结合血液中的抗体(例如，IgG)阻止了细菌噬菌体感染细胞。在一些实施方案中，加入蛋白A以结合血液中的抗体，由此防止抗体结合到金黄色葡萄球菌。当金黄色葡萄球菌在蛋白A的存在下分裂时，抗体不能结合子代细胞，使得细菌噬菌体感染血液中的细胞。在一些实施方案中，将蛋白A加入到噬菌体混合物中。例如，在感染前蛋白A可以与噬菌体混合物混合。
在某些实施方案中，可以进行测定以利用一般概念，所述一般概念可以被修改以适应不同的样品类型或大小以及测定形式。采用重组细菌噬菌体(即，指示细菌噬菌体)的实施方案可以允许快速的检测MRSA，总测定时间在1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5或26.0小时内，取决于样品类型、样品大小以及测定形式。例如，需要的时间量可以稍微短一些或长一些，取决于在所述测定中待检测的细菌噬菌体株以及细菌菌株、待测试样品的类型和大小、靶标活力所需的条件、物理/化学环境的复杂性以及“内源性”非靶细菌污染物的浓度。
实施例
下面实施例中所述的结果证明了本文所述的组合物、方法和系统在缩短的获得结果时间内从鼻拭子标本检测MRSA的有效性。所述实施例评价了在本文所述的诊断性筛选方法和系统中使用的新的基于细菌噬菌体的测定。该测定是采用
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检测靶物种的新一代萤光素酶-噬菌体报告系统的成员。该方法证明包涵性高，并且当与头孢西丁选择联合时，能辨别大多数非耐药菌株。此外，该方法能够鉴定鼻样品中的低载量MRSA，很少或没有证据表明存在有问题的干扰。最后，数据显示此诊断性筛选可以是用于从鼻拭子标本检测MRSA定殖的有前途的新工具。
材料和方法
细菌菌株
除了下面的例外，细菌菌株均获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)S492获自乔治亚大学研究基金会，金黄色葡萄球菌RN4220获自爱荷华大学。金黄色葡萄球菌的临床菌株来自临床微生物学实验室(Laboratory Corporation of America Holdings)内部。来自去识别化的人临床标本的MRSA分离株源自三个地理位置不同的美国地点(Burlington NC、Phoenix AZ和RaritanNJ)。MSSA分离株以相似的方式从一个地点(Burlington，NC)获得。MRSA或MSSA的确定通过铺板在选择性显色琼脂MRSA Select II(Bio-Rad，Marnes-la-coquette，France)上得到证实。菌株常规地在37℃在脑心浸出液(BHI)肉汤(Becton Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)中生长，并以每分钟250转(RPM)震摇。
细菌噬菌体来源和母液制备
测定物包括两种修饰的金黄色葡萄球菌细菌噬菌体，MP115和ISP。金黄色葡萄球菌细菌噬菌体是肌病毒科成员，包括大的溶解性金黄色葡萄球菌细菌噬菌体。MP115细菌噬菌体获自科罗拉多矿业大学(Colorado School of Mine)，ISP细菌噬菌体获自埃默里大学(Emory University)。
细菌噬菌体母液如下制备。对于MP115，将RN4220的过夜培养物稀释，生长到指数期，然后以0.01的感染复数(MOI)感染。监测培养物的光密度(OD)损失作为对病毒繁殖的确认。细菌噬菌体裂解产物随后通过以10,000rpm在4℃离心10分钟进行澄清。澄清的上清液再次在4℃以10,000rpm离心2小时。片状沉淀物在1x TMS(50mM Tris-HCL，10mM MgCl2，和300mM NaCl)中重悬过夜。细菌噬菌体制备物然后用10μg/mL DNA酶I(DNase I)和5μg/mLRNA酶(RNase)处理。处理后，所述制备物以5,000rpm在4℃离心10分钟。移除上清液，进一步通过氯化铯密度梯度离心(密度为1.2、1.3、1.4和1.6)以30,000rpm在20℃纯化2小时。移除含有噬菌体的条带，并将制备物置于透析管(Spectra/Por 4，MWCO 12,000-14,000)中。在含有2.4M NaCl的TMS中进行透析1小时，在含有0.9M NaCl的TMS中重复，并在含有0.3MNaCl的TMS中再重复一次。
对于ISP，使用类似的程序，不同之处在于下面：使用菌株12600作为宿主，以0.05的MOI感染指数期培养物，在片状沉淀物重悬过夜后以5,000rpm在4℃进行附加的离心10分钟，然后用DNA酶和RNA酶处理。通过标准方法使用对半固体琼脂中生长的宿主菌株进行的菌斑计数确定母液滴度。
萤光素酶报告噬菌体的工程化
利用同源重组供体构建物转化靶细菌噬菌体，所述同源重组供体构建物利用宿主特异性启动子和置于两个500bp侧翼序列之间的密码子优化的
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设计，所述侧翼序列具有对应于ISP中的疑似晚期基因区的同源性。该构建物插入到pBAV1KT5gfp(登录号HQ191434)的PstI位点中。在前面的研究后构建宿主特异性启动子。
Figure BDA0004005192470000162
的克隆和密码子优化由Genewiz(South Plainfield，NJ，USA)进行。此供体构建物被用于ISP和MP115两者的工程化，因为同源区共享99％同一性。
电穿孔感受态金黄色葡萄球菌由RN4220制成。为了实现此目的，RN4220的过夜培养物在大豆胰蛋白胨肉汤(TSB)(Oxiod，Hampshire，United Kingdom)中稀释并生长至对数中期。然后细菌在冰上冷却1小时，以4,000g在4℃离心10分钟，并利用冰冷的无菌去离子水洗涤三次。在洗涤后，将最终的片状沉淀物悬浮在冰冷的10％甘油中并制备成等分试样用于-80℃储存。然后，将100ng供体构建物质粒DNA加入到复苏的等分试样中并在室温孵育30分钟，然后进行电穿孔。使用MicroPulser Plus(1.8kV电压，1次脉冲，2.5毫秒时间常数)利用0.2cm比色皿(Bio-Rad，Marnes-la-coquette，France)进行电穿孔。将细胞回收在B2培养基(10g/L蛋白胨，25g/L酵母提取物，25g/L NaCl，1g/L K2HPO4，pH 7.5)中并铺在含有50μg/mL卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)的TSB琼脂上。分离转化体并通过
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的表达确认。在测试前菌落在含有卡那霉素的TSB中生长3小时。制备10μL培养物、50μLNanoGlo缓冲液、15μL海肾裂解缓冲液和1μL NanoGlo底物(Promega，Madison，WI，USA)的混合物并使用GloMax Navigator(Promega，Madison，WI，USA)分析。
转化的RN4220的
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-阳性培养物生长至对数早期，并用MP115或ISP以0.1的MOI感染并在37℃孵育3小时，以225rpm震摇。将噬菌体裂解物离心以去除细胞碎片，通过0.45μM Whatman Puradisc滤器(GE Health，Pittsburgh，PA，USA)过滤，最后使用100K MWCO蛋白浓缩仪(Pierce)缓冲液交换至TMS中。然后进行有限稀释富集以增加重组体的频率，然后在半固体琼脂上进行菌斑筛选。使用无菌移液枪头分离单个菌斑，并与100μLTMS缓冲液混合。10μL的此悬液用来在37℃感染100μL在TSB中的菌株12600持续2小时。感染后，向每孔加入50μL NanoGlo缓冲液，15μL海肾裂解缓冲液，和1μL NanoGlo底物，然后在GloMax Navigator上评估。将具有高信号的阳性细胞过滤、稀释，并用来感染下一代。重复此过程直至连续三代产生100％阳性且被认为纯的菌斑为止。
体外噬菌体检测测定–灵敏度、包涵性和MSSA排除性
将过夜培养物在脑心浸出液(BHI)肉汤中稀释，并将135μL在BHI中稀释的培养物转移到96孔带状板(Griener Bio-One GmbH，Frickenhausen，Germany)的两个孔中以获得期望的每孔菌落形成单位(CFU)(例如，10、1000或1000CFU)。利用仅由135μL BHI肉汤组成的另外两孔来确定培养基背景。每个样品的一孔充当对照孔，并且接收15μL BHI肉汤。其他孔充当选择孔，且接收15μL含有22μg/mL头孢西丁(Alfa Aesar，Ward Hill，MA，USA)的BHI肉汤。选择孔含有终浓度为2.2μg/mL的头孢西丁。当指示时，每个样品的实际CFU通过在BHI琼脂上的菌斑计数来确认。96孔带状板用覆盖膜(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY，USA)密封，并在37℃孵育4小时以促进富集和选择。在溶菌肉汤(LB)(Gibco，GrandIsland，NY，USA)中制备噬菌体混合物，该噬菌体混合物包含各自1.6x108菌斑形成单位(PFU)/mL的两种工程化噬菌体。将10μL噬菌体混合物加入到每孔中，并通过移液管混合，然后再次用膜覆盖。将平板在37℃孵育4小时以在MRSA的存在下促进噬菌体感染以及萤光素酶的产生。将65μL由50μL NanoGlo缓冲液、15μL海肾裂解缓冲液和1μL NanoGlo底物组成的检测溶液加入到每孔中，并通过移液管混合。使用GloMax Navigator对样品读数，采用3分钟等待时间和1秒积分。利用600相对光单位(RLU)的截止值评价结果，该截止值为利用单独培养基观察到的背景的大约3倍。
体外噬菌体检测测定–非-金黄色葡萄球菌排除性和细菌干扰
竞争生物体的过夜培养物在BHI肉汤中稀释，并将125μL稀释的培养物转移到96孔带状板的4个孔中以获得期望的每孔CFU(例如，10、1000或1000CFU)。利用仅由125μL BHI肉汤组成的另外4个孔来确定培养基背景和MRSA(BAA-1720)的基线信号。每个样品的2个孔被分配至排除性测试，而其他两孔用来评估细菌干扰。对于排除性，将10μL BHI肉汤加入到两孔中，而将10μL的含有MRSA的BHI肉汤加入至细菌干扰孔中。对于每种条件，一孔充当对照孔，并且接收另外15μL BHI肉汤，而其他孔充当选择孔，且接收15μL含有22μg/mL头孢西丁的BHI肉汤。然后如前所述确定富集、噬菌体感染和CFU。
鼻拭子噬菌体检测–内源性样品，MRSA掺加和自发光
在本文所述的实验中使用BBL CultureSwab Liquid Stuart Double swab(Becton Dickinson and Company，Sparks，MD，USA)。人造纤维鼻拭子由志愿者自采集，他们被指导将拭子插入到一个鼻孔，旋转至少5次，并在第二个鼻孔中用同一拭子重复。在处理前，将样品在4℃保存过夜。为了评价内源性鼻样品，一个拭子通过在1mL BHI肉汤中涡旋15秒进行洗脱。将135μL此鼻洗脱物加入至96孔带状板的2孔中。这些孔以与上面所述的135μL稀释培养物相同的方式评估。
采用使用直接铺板和富集培养的参考方法来鉴定真实的MRSA定殖。对于直接铺板，将135μL在筛选中使用的鼻洗脱物铺板在MRSA Select II琼脂上。对于富集培养法，将一个拭子置于3mL含有6.5％ NaCl(Fisher Scientific，Geel，Belgium)的TSB中并在37℃生长过夜，并以250rpm震摇。第二天，将培养物在MRSA Select II琼脂上划线。在两种情况下，遵循生产厂商的说明书来鉴定MRSA定殖的存在或不存在。如果任一种方法(直接铺板或富集培养)在选择性琼脂上产生了阳性结果则拭子被认为是MRSA阳性。
在鼻基质中检测MRSA的能力通过将MRSA的稀释培养物掺加到鼻洗脱物中进行评估。为此，对于每个样品将125μL鼻洗脱物加入至96孔带状板的2个孔中。两个孔接收10μL稀释的MRSA培养物。评估40个独立的鼻样品，每个测试的MRSA菌株(BAA-1707，BAA-1717，BAA-1720，BAA-1763，BAA-1766)分配8个样品。作为对照，10μL每种MRSA菌株也掺加到125μL BHI肉汤中。掺加后，以与上面所述的135μL稀释培养物相同的方式评估这两孔。
每个鼻样品的自发光通过将每个样品与没有萤光素酶的来源(噬菌体混合物)的检测溶液混合来评估。为了实现此目的，135μL每种鼻洗脱物与25μL BHI肉汤在96孔带状板中合并。65μL检测溶液然后加入至每孔中并吸打混合。将平板在光度计上读数。
实施例1.选择性和包涵性研究
本文所述的方法和系统能够从各种各样的遗传背景中鉴定MRSA株(表1)。如表1中所示，MRSA的包涵性菌株获自学院来源。对于绝大多数菌株，检测各种MRSA株可以在100CFU或更少实现。此检测限和分析灵敏度类似于以前所述的基于PCR的筛选。
基于细菌噬菌体的MRSA筛选包括4小时的富集，2小时的感染，和后续在光度计上对发射光的检测。对于每个样品测定96孔带状板的2个孔，所述两个孔由一个对照孔和一个选择孔组成。选择孔用于MRSA确定，包含MRSA选择剂头孢西丁，而对照孔仅包含细菌培养基，并且在测定显色期间主要校准噬菌体性能。在纸片扩散和琼脂稀释测定中显示头孢西丁对于MRSA的表型鉴定来说是最佳选择。样品在这些孔中富集4小时，这促进了对耐药细菌的回收、生长和选择。此后，进行利用重组的编码萤光素酶的细菌噬菌体的2小时感染期。在加入底物后，通过利用光度计检测发射光测量萤光素酶的产生，其产生指示成功的病毒感染。使用此方法在一式三份的孔中在10、100或1,000个菌落形成单位(CFU)的起始靶标评价17个不同的MRSA菌株(表1)。CFU(由平板计数测定)和相对光单位(RLU)的数值在表S1中提供。基于600RLU的截止值确定阳性结果。此截止值为利用单独培养基观察到的背景的大约3倍。
在对照条件下在每孔100CFU和1,000CFU，测试的51个孔中的51个(100％)均获得了阳性结果。在10CFU/孔，51个孔中的48个(94.1％)是阳性的。在10CFU，在三个孔中的仅两个中MRSA的三个独特菌株是阳性的。这些结果突出了噬菌体混合物识别各种MRSA分离株的能力。当包括头孢西丁用于MRSA测定时，在1,000CFU/孔，51个孔中的51个(100％)仍然可以检测到阳性信号，在100CFU/孔，51个孔中的48个(94.1％)仍然可以检测到阳性信号。在100CFU，在选择后不能检测BAA-42(也称作HDE288)并非完全不能预期的。此菌株属于MRSA的“古老克隆”，与低水平和异质的甲氧西林耐药性相关。如表1中显示的那样，利用仅10CFU，51个选择孔中的44个(86.3％)仍然是阳性的。基于在对照和选择孔两者中100％检测的最低CFU，对于每个菌株确定检测限。在10CFU/孔，测试的17个MRSA菌株中的13个可以可靠地检测到，而三个需要100CFU/孔。BAA-42是需要大于100CFU/孔以利用MRSA选择获得一致性阳性检测的仅有菌株。如表1中所示，MRSA测定证明了在100CFU测试的17个MRSA菌株具有100％的包涵性。MRSA测定还证明了对所测试的51个MRSA菌株中的48个有选择性。总之，这些结果证明了此筛选在低细菌载量下检测遗传上多样的MRSA菌株存在的能力。
表1
Figure BDA0004005192470000201
1菌株ID对应美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录号。
2 SCCmec类型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)可获自(ATCC)。
3基于600相对光单位(RLU)的信号截止值定义阳性细胞。
4检测限(LoD)定义为在对照和选择孔两者中表现100％阳性结果的最低菌落形成单位(CFU)。
表S1
Figure BDA0004005192470000202
Figure BDA0004005192470000211
1通过对利用100CFU的靶标的样品进行平板计数(一式两份)，并从利用10和1000CFU的靶标的样品的稀释液计算来确定CFU。
2使用BHI肉汤代替细菌培养物来显示测定背景。
实施例2.体外MRSA筛选的排除性和特异性
除了灵敏的MRSA检测，成功的MRSA测定必须还要证明排除大多数甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株的能力。表2显示了MRSA的5个充分表征的菌株，使用本文所述的方法以100、1,000和10,000CFU在一式三份的孔中评价它们，并提供CFU值，由平板计数和RLU值确定。MRSA对照孔不包括头孢西丁，且MRSA选择孔包括头孢西丁。如期望的那样，在100、1,000和10,000的CFU水平，在100％的对照孔中MSSA株是阳性的。在选择孔中包含头孢西丁导致阳性结果显著减少。在包括头孢西丁的MRSA选择孔中，15个选择孔中有0个(0％)在100CFU时为阳性，而15个选择孔中仅有1个(6.7％)在1,000CFU和10,000CFU时为阳性。这些结果支持MRSA测定区分出大多数MSSA菌株的能力。
表2
Figure BDA0004005192470000221
1菌株ID对应美国典型培养物保藏中心(ATCC)目录号。
2基于600RLU的信号截止值定义阳性细胞。
表S2
Figure BDA0004005192470000222
1通过对利用100CFU/孔的靶标的样品进行平板计数(一式两份)，并从利用10和1000CFU的靶标的样品的稀释液计算来确定CFU。
2使用BHI肉汤代替细菌培养物来鉴定测定背景。
如表3中所示，除了MSSA以外，在体外针对40个菌株的小组评价MRSA筛选的排除性，所述40个菌株涵盖21个特有属和32个不同的种。在表S3中提供了CFU(由平板计数确定)和RLU的值。每个排他菌株的CFU大于1,500CFU/孔(中位CFU为15,950)。当评估特异性时，表3显示了在对照孔中40个菌株中的6个(15％)为阳性。此条件下的阳性信号是噬菌体混合物的交叉反应性的结果，对金黄色葡萄球菌属和芽孢杆菌属的种观察到。许多金黄色葡萄球菌噬菌体已经证明是多价的，溶解凝固酶阳性和凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌属种。以前已经报道芽孢杆菌属种吸附金黄色葡萄球菌噬菌体，并且可能与它们细胞壁磷壁酸(WTA)有相似性有关。尽管有这种交叉反应性，但在选择条件下40个菌株中有0个阳性，并且将不会导致MRSA的假阳性。这些结果证明在本文所述的实验中所用的噬菌体混合物的特异性和整个测定的排除性。
在过量竞争物载量的存在下评估MRSA筛选检测低数量MRSA的能力。为此，约50CFU的MRSA与至少20倍过量的来自排除组(表3)的每个菌株合并。在表S3中提供了CFU(由平板计数确定)和RLU的值。令人惊讶地，在对照和选择条件下，在竞争物种的存在下，分别地，40孔中的39孔(97.5％)和40孔中的40孔(100％)为阳性。肺炎链球菌当以100倍过量测试时抑制对照条件下的检测。考虑到在体外和体内这些物种之间存在已知的拮抗作用，这不令人惊讶。至关重要的是，在头孢西丁(MRSA选择条件)的存在下，这种效应消失，因此不会导致MRSA的假阴性。此数据证明了这种筛选在含有过量竞争生物体的环境中检测低水平MRSA的能力。
表3
Figure BDA0004005192470000231
Figure BDA0004005192470000241
1所有菌株的菌株ID对应ATCC目录号，肠炎沙门氏菌S492株例外。
2基于600RLU的信号截止值定义阳性细胞。
3对于排除性，每个竞争菌株单独在大于1,500CFU/孔单独评估。
4对于细菌干扰，MRSA(BAA-1720)以约50CFU/孔加入，而指示的竞争菌株过量(至少20倍)加入。
表S3
Figure BDA0004005192470000242
Figure BDA0004005192470000251
1对竞争物使用稀释样品或对于MRSA直接进行平板计数(一式两份)确定CFU。
2使用BHI肉汤代替细菌培养物鉴定测定背景。
3对于排除性，每个竞争菌株单独在指示的CFU/孔单独评估。
4对于细菌干扰，MRSA(BAA-1720)以指示的载量组合所示的竞争物CFU/孔加入。
实施例3.在循环的金黄色葡萄球菌临床分离株间的体外筛选性能。
来自人临床标本的MRSA分离株获自美国三个地理上不同的临床微生物学实验室内部(Burlington NC、Phoenix AZ和Raritan NJ)。MSSA分离株以相似的方式获自一个地点(Burlington，NC)。MRSA或MSSA鉴定通过在选择性生色琼脂上铺板来确认。总计390个临床MRSA株分离自独立标本，并利用MRSA筛选评价。对每个菌株提供了RLU和CFU值(表S4)。
表4显示了测试的MRSA的中位载量为47CFU/孔。如表4中所示，在对照孔中390个临床MRSA株中的388个(99.5％)被检测为阳性。在头孢西丁选择后，390个临床MRSA株中的381个(97.7％)为阳性，并通过该筛选被鉴定为MRSA。在较高的载量，10-或100-倍的MRSA水平(分别为500CFU和5,000CFU)，测试临床MSSA株的排除性。在每个接种物的对照条件下123个临床MSSA株中的122个(99.2％)被检测为阳性。然而，在选择孔中，来自500CFU的阳性信号降至123个MSSA株中8个阳性(6.5％)。在约5,000CFU/孔，此假阳性率增加至123个菌株21个阳性(17.1％)。这提示，尽管大多数MSSA株为阴性，但一些可以在高载量下承受选择，并导致假阳性。至关重要的是，在513个测试的临床金黄色葡萄球菌分离株中，510个(99.4％)在对照条件下为阳性。这继续支持在所述的方法和系统中利用的噬菌体混合物产生宽宿主范围覆盖度的观点。总之，这些结果显示了此筛选成功地识别和检测大多数临床MRSA株、同时排除大多数临床MSSA株的能力。
表4
Figure BDA0004005192470000261
1基于600RLU的信号截止值定义阳性细胞。
2对临床MRSA株所测试的中位CFU为47CFU/孔。每个菌株的载量可以在附录中找到。
3对临床MSSA株所测试的中位CFU/孔为“500”的850CFU和“5,000”的8,500CFU。
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000262
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000271
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000281
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000291
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000301
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000311
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000321
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000331
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000341
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000351
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000361
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000371
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000381
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000391
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000401
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000411
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000421
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000431
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000441
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000451
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000461
表S4
用于利用临床金黄色葡萄球菌的MRSA筛选的CFU和RLU(表4)
Figure BDA0004005192470000471
实施例4.利用人鼻拭子的特异性和筛选性能。
前鼻标本由40名成年人志愿者使用人造纤维拭子自采集。前面的研究已经证实自采集用于检测MRSA定殖的效力。在处理前，将标本在4℃储存过夜以尽量模拟可能的样本运输条件。采用使用直接铺板和富集培养两者的参照方法来鉴定真实的MRSA定殖。通过两种参照方法，所有40个人鼻标本均为阴性，并且被确定缺少MRSA定殖(表5)。在40名个体间缺少检测不令人惊讶，因为据估计在健康成人中MRSA定殖率小于2％。
为了利用这些标本进行筛选，将拭子洗脱到细菌培养基中，并加入到含有(选择)或不含有(对照)头孢西丁的孔中。选择条件中的阳性结果被认为是阳性MRSA结果。对照条件不是MRSA测定所必需的或不用于MRSA测定，但包括它以证明选择的有效性。因金黄色葡萄球菌属种的高鼻腔定殖率以及前面关于噬菌体混合物所述的交叉反应性所致，在大多数对照孔中预期有阳性结果。如期望的那样，在对照孔中，40个样品中的36个(90％)为阳性。提供了内源性样品的RLU值(表S5)。
对于MRSA检测，40个标本中的36个(90.0％)为阴性，与参照方法一致。在4个样品中鉴定出了假阳性，中位RLU信号小于信号截止值的5倍。当直接利用萤光素酶底物检测时所有鼻样品均为阴性，表明非特异性自发光不是假阳性的主要来源(表S5)。在这些样品中假阳性信号后的确切机制仍然未知，但可以潜在地与耐甲氧西林的凝固酶阴性的葡萄球菌相联系。另外，以前观察到一些MSSA株在高细菌载量时产生假阳性结果(表4)。总之，大多数(90％)MRSA-阴性样品可以成功地通过此方法筛选出来。
表5.非定殖的鼻拭子的筛选性能
Figure BDA0004005192470000481
1基于600RLU的信号截止值定义阳性孔。
2鼻拭子在细菌培养基中洗脱并直接测定。
3在测试前鼻洗脱物掺加约100CFU/孔的5个MRSA株中的一株。
4采用直接铺板和富集培养的组合作为使用MRSA Select II琼脂的参照方法。
表S5
Figure BDA0004005192470000482
Figure BDA0004005192470000491
1鼻拭子在BHI中洗脱并直接测定。
2鼻洗脱物用指定的MRSA株以所示的CFU/孔掺加。
3鼻洗脱物与萤光素酶底物和缓冲液在缺少萤光素酶报告噬菌体的情况下组合。这些孔中的信号被认为是自发光，可能是底物的非特异性激活或样品中事先存在的发光的结果。
4通过平板计数直接测定CFU(一式两份)。
为了确定此方法是否可以成功地检测鼻基质中的MRSA，将5个充分表征的MRSA株掺加到来自前面所述的40个非定殖的鼻拭子的洗脱物中。提供了每个样品的RLU和CFU值(表S5)。MRSA掺加的中位数载量为87CFU/孔。在对照和选择条件下，40个MRSA接菌样品中40个(100％)为阳性(表5)。缺少任何无效样品表明在这些个体中缺少测定抑制剂。5个独立的MRSA株当以低载量掺加到这些样品中时的成功检测支持了基于细菌噬菌体的筛选在鼻基质中的效力。
如实施例中所示，本公开提供了MRSA萤光素酶噬菌体报告子测定，以基于培养的方式，实现了从鼻拭子灵敏和快速的检测MRSA。如表1中所示，利用MRSA萤光素酶噬菌体报告子测定的诊断性筛选能够在大约6小时内鉴定来自各种遗传背景的MRSA株。对于绝大多数MRSA株，成功的检测需要存在仅10-100CFU/孔，大致相当于75-750CFU/鼻拭子。此检测限类似于以前所述的基于PCR的筛选。从载体的鼻拭子回收的MRSA的中位载量发现大于10,000CFU。另外，具有高载量的鼻腔定殖的个体更可能在多个身体部位携带MRSA并且是传播的运载体。因此此测定的灵敏性似乎非常适合于解决来自临床鼻标本的预期载量问题，无论目标是消除MRSA滞菌还是限制患者至患者的播散。
在一些方面，萤光素酶报告噬菌体测定的性能高度依赖于对细菌噬菌体的选择。实施例中的此MRSA诊断性筛选利用表达NanoLuc的两个噬菌体(ISP和MP115)的重组体，它们是大的溶解性金黄色葡萄球菌细菌噬菌体的肌病毒科成员。这些噬菌体主要通过高度保守的WTA结合到宿主表面，产生了宽宿主范围的能力。缺少WTA的突变体被认为耐受全部，或至少大多数葡萄球菌噬菌体。尽管耐药性WTA-缺陷型突变体假定是可能的，但以前的研究已经揭示了WTA对于鼻腔定殖和甲氧西林抗性两者都是必需的。通常，WTA的损失还导致体内的健康成本以及毒力的总体降低。因此，合理的预期参与鼻滞菌的全部现有和未来的MRSA株均具有被此筛选靶向的受体。此外，此结论进一步得到表4中的数据支持，表4显示了对测试的临床MRSA分离株有99.5％检测到阳性噬菌体信号。
如表4中的结果所示，在513个金黄色葡萄球菌临床株中，两个MRSA分离株(BNC159和PHX 079)和一个MSSA分离株(MSSA 090)不能在对照条件下产生阳性信号。这些分离株中的一个(PHX 079)似乎在培养中具有生长缺陷(数据未显示)。在富集期期间的不良生长可能促进了不能可靠地检测此MRSA株。不能检测BNC 159和MSSA 090可能与通过限制-修饰系统的噬菌体抗性或荚膜产生相关。限制-修饰系统靶向并消除外来DNA，经常通过在特异性基序处存在或缺少DNA甲基化来鉴定。存在证据，葡萄球菌噬菌体在这些通路的压力下已经进化，并且几个噬菌体完全缺少被这些系统靶向的特定序列。尽管如此，在金黄色葡萄球菌间限制-修饰系统的多样性是广泛的，并且可能促进了在这些分离株中观察到的耐药性。分别地来说，通过掩蔽表面受体，荚膜产生已经与金黄色葡萄球菌中的噬菌体抗性联系在一起。尽管金黄色葡萄球菌几个常见谱系并没有产生荚膜多糖，但此机制可能有助于所观察到的少见(<1％)抗性。
另外，表4还显示了MRSA萤光素酶噬菌体报告子测定和选择剂(例如，抗生素)的组合限制了非MRSA的活力和生长，并且不会干扰MRSA检测。例如，MRSA萤光素酶噬菌体报告子测定利用了头孢西丁来限制非MRSA的活力和生长。表4中的结果证明了此选择的效力，因为当以约500CFU/孔测试时仅6.5％的临床MSSA株为阳性。令人惊讶地，头孢西丁不干扰MRSA检测，因为在以约50CFU/孔的选择孔中97.7％的临床MRSA株仍然是阳性的。另外，表3显示了此选择剂也有益于限制来自芽孢杆菌属以及凝固酶阴性的葡萄球菌属的几个种的假阳性，同时还防止了来自肺炎链球菌的干扰。头孢西丁已经证明是MRSA选择的较佳选择，能够鉴定各种分离株。尽管临床MRSA的检测率高，但一些菌株在头孢西丁的存在下产生假阴性结果。由于在一些实施例中临床MRSA株以特别低的载量进行评价，似乎可信的是这些菌株表达低水平的耐药性或异质性耐药性。此类菌株可以存在大于100CFU/孔的检测限，类似于对BAA-42所发现的那样(表1)。
关于利用鼻拭子的性能，表5提供了在选择后90.0％的MRSA-阴性样品得出了阴性测试结果，与参照方法一致。因此在10％的鼻洗脱物中检测到假阳性。这些假阳性可能源自三个来源。首先，可能出现自发光，但通过证明在这些样品中需要加入萤光素酶，排除了自发光，如表S5中所提供的。其次，某些MSSA株的高载量可能导致假阳性(表4)。最后，凝固酶阴性的葡萄球菌属的一些交叉反应种可以通过与MRSA相同的耐药机制成为耐甲氧西林的。这些种可能潜在地促成了在4个样品中观察到的弱假MRSA阳性。
本文所述的检测MRSA的方法和系统要求内源性鼻腔菌群的活力，在评价样品的活力方面是独特的。为了复制内源性鼻腔菌群，用5个MRSA株中的一个掺加到鼻洗脱物中(表5)。如表5中所示，在100％的掺加样品中实现了在鼻基质中对低MRSA载量的阳性检测。重要的是，这表明成功的细菌噬菌体感染和萤光素酶产生能够在鼻基质中发生。此外，这揭示了以前在10％的内源性样品中看到的阴性对照孔不是测定抑制剂的结果。总之，结果强烈提示当存在时，MRSA滞菌将在鼻标本中检测到。
本文所述的基于细菌噬菌体的MRSA测定是利用NanoLuc以灵敏地检测靶物种的新一代萤光素酶报告噬菌体系统的成员。所述方法证明包涵性高，并且当与头孢西丁选择联合时，能辨别大多数非耐药菌株。此外，该筛选能够鉴定鼻样品中的低载量MRSA，没有有问题的干扰的证据。另外，随着MRSA检测在6小时内完成，可执行的结果可在单次交班内获得。最后，数据显示本文所述的基于细菌噬菌体的MRSA测定可以是用于从鼻拭子检测MRSA定殖的有前途的新工具。
实施例5.直接在培养基和高蛋白结合平板上涂布NanoLuc。
金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长至对数期(OD600为0.41)。培养物在TSB中稀释以获得期望的载量，载量通过在TSB琼脂上接种来确认菌落形成单位(CFU)。12.5μL的每个稀释液直接加入到96孔带状板(高结合；Grenier Bio-One，Ref#762074)中的37.5μL TSB或人血液中。当指明时，一些条带包含用于俘获的结合的抗-NanoLuc抗体(纯化的鼠单克隆IgG克隆#965808；目录#MAB10026)。人血液采集自单个供体，使用肝素钠作为抗凝剂。对于血液样品，加入100μL含聚茴香脑磺酸钠(SPS)的TSB以达到25％人血基质。孔(150μL体积)中SPS的终浓度为0.05％。对于TSB样品，加入100μL TSB以达到相同的150μL体积。然后测试条用盖膜密封，并在37℃孵育30分钟。在此短暂富集后，将20μL噬菌体工作母液加入到含有TSB基质的孔中。噬菌体工作母液包含8x 107菌斑形成单位/mL的MP115.NL和SAPJV1.NL。为了允许在包含血液基质的孔中的感染，如指示的那样在20μL噬菌体工作母液中包括0.5mg重组葡萄球菌蛋白A(pro-356，Prospec，Ness-Ziona，Israel)/孔。测定条再次用盖膜密封，并在37℃孵育3小时。感染后，用300μL PBS-T(10mM磷酸钠，150mM NaCl，0.05％ Tween 20，pH 7.4)洗涤这些条3次。使用自动洗板机(AccuWash，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)进行洗涤。将100μL包含1μL NanoGlo底物(Promega，Madison，WI，USA)的NanoGlo缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)加入到每孔中。在3分钟等待期后，使用GloMax Navigator(Promega，Madison，WI，USA)测定每个样品作为相对光单位(RLU)的信号输出。将来自每个样品的RLU除以在用于该测试基质的培养基对照中观察到的RLU计算信号背景比(S/B)。
Figure BDA0004005192470000531
在这些实施例中，抗-NanoLuc抗体是固定化结合伴侣。表6证明了当指示蛋白被固定化结合伴侣俘获时信号检测大幅增加。例如，在含有低载量或高载量的金黄色葡萄球菌的样品中，当指示蛋白被抗-NanoLuc抗体俘获时的RLU显著高于使用对照条样品未被俘获时的RLU。令人惊讶地，如果金黄色葡萄球菌已经结合了IgG，则可以不发生金黄色葡萄球菌的感染。加入蛋白A使金黄色葡萄球菌被感染。红细胞和其他血清蛋白不干扰对表达的指示蛋白的俘获。另外，如在对照中所看到的红细胞对信号的淬灭消失，并且信号背景比得到维持或增加。因此，使用全血样品可以检测到指示蛋白，来自样品中其他组分(例如，蛋白)的干扰微小。常规地，从血液分离血清或血浆以可靠地检测指示蛋白产物。有利地，所述实施例证明了所述检测方法可以通过使用此俘获步骤在直接采自患者的全血样品上完成。
实施例6.人血液中的抗生素易感性测试。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)株(ATCC BAA-1720、CDC AR0480)和甲氧西林易感金黄色葡萄球菌(MSSA)株(ATCC 12600)在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长至对数期(OD600范围为0.16-0.4)。培养物在TSB中稀释以获得期望的载量，载量通过在TSB琼脂上铺板来确认菌落形成单位(CFU)。50μL的每个稀释液加入到测试条。当指明时，一些条包含在培养基结合板(Grenier Bio-One，带状板12xF8，PS，F-底，白色，Lumitrac，Med Binding，Ref#762075)或高结合板(Grenier Bio-One，Ref#762074)上的用于俘获的结合的抗-NanoLuc抗体(纯化的小鼠单克隆IgG克隆#965808；目录#MAB10026)。加入85μL的TSB或用TSB和聚茴香脑磺酸钠(SPS)稀释的人血液。人血液采集自单个供体，使用肝素钠作为抗凝剂。然后每孔接收15μL TSB或在TSB中的22μg/mL头孢西丁(FOX)。孔(150μL体积)中每个组分的终浓度为25％人血液，0.0375％ SPS，和2.2μg/mL FOX。然后测试条用盖膜密封，并在37℃孵育2小时。在此选择性富集后，将20μL噬菌体工作母液加入到含有TSB基质的孔中。噬菌体工作母液含有8x107菌斑形成单位/mL(pfu/mL)的MP115.NL和6.9x108pfu/mL的SAPJV1.NL。对于含有血液基质的孔，在20μL噬菌体工作母液中包含0.5mg重组葡萄球菌蛋白A(pro-356，Prospec，Ness-Ziona，Israel)/孔。测定条再次用盖膜密封，并在37℃孵育3小时。在感染后，抗-NanoLuc俘获和对照条用300μL PBS-T(10mM磷酸钠，150mM NaCl，0.05％ Tween 20，pH 7.4)洗涤3次。使用自动洗板机(AccuWash，Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)进行洗涤。将100μL包含1μL NanoGlo底物(Promega，Madison，WI，USA)的NanoGlo缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)加入到每孔中。“无洗涤+无俘获”条不洗涤，并替代地接收65μL含有50μLNanoGlo缓冲液、15μL TSB和1μL NanoGlo底物的主混合物。洗涤5％ BSA(牛血清白蛋白，Sigma Life Science Product#A9647)封闭的条。BSA封闭的条用BSA封闭非特异性结合位点。在3分钟等待期后，使用GloMax Navigator(Promega，Madison，WI，USA)测定每个样品作为相对光单位(RLU)的信号输出。将来自每个样品的RLU除以在用于该测试基质的培养基对照中观察到的RLU计算信号背景比(S/B)。
Figure BDA0004005192470000551
在表7中，“无俘获+无洗涤”的实施例证明了当在仅培养基(TSB)中完成测定时生成的总信号以及因头孢西丁引起的信号下降。当在血液的存在下完成时，信号被淬灭。当使用俘获条时，因消除了因血液引起的淬灭导致信号大幅增加。5％ BSA封闭条(牛血清白蛋白，Sigma Life Science Product#A9647)为显示非特异性结合。所述实施例再次证明对于全血液样品，当指示蛋白被固定化结合伴侣俘获时信号检测大幅增加。另外，对于包含抗生素的全血液样品俘获步骤显著地提高了信号检测。令人惊讶地，使用全血液样品可以检测到指示蛋白，来自样品中其他组分的干扰微小。
实施例7.对NanoLuc包被平板的滴定。
1.5mg/mL纯化NANOLUC的母液在PBS中稀释到1ng/mL。在PBS中制备从1ng/mL至0.001pg/mL的连续10倍稀释液。兔抗小鼠IgG(Abcam，目录#46540)或山羊抗小鼠IgG(Abcam，目录#6708)在PBS中稀释到10μg/mL并移液至100μL/孔。将平板在2-8℃孵育18-20小时，然后使用300μL PBS/孔/洗涤将其洗涤3次。小鼠抗-NanoLuc抗体(纯化的小鼠单克隆IgG，克隆#965808，R&D Systems，目录#MAB10026)在PBS中稀释到1μg/mL并以100μL/孔移液到包被以兔或山羊抗小鼠IgG的平板。包括5％ BSA封闭条用于确定非特异性结合，以及未包被条用于测量Nanoluc活性。测定条用盖膜密封并在37℃孵育3小时。抗体包被条用300μL/孔PBS-T(10mM磷酸钠，150mM NaCl，0.05％ Tween 20，pH 7.4)洗涤3次。使用自动洗板机(AccuWash，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)进行洗涤。将100μL包含1μLNanoGlo底物(Promega，Madison，WI，USA)的NanoGlo缓冲液(Promega，Madison，WI，USA)加入到每孔中。在3分钟等待期后，使用GloMax Navigator(Promega，Madison，WI，USA)测定每个样品作为相对光单位(RLU)的信号输出。将来自每个样品的RLU除以在用于该测试的PBS对照中观察到的RLU计算信号背景比(S/B)。
Figure BDA0004005192470000561
Figure BDA0004005192470000571
Figure BDA0004005192470000572
表8和9证明了用兔抗小鼠IgG或山羊抗小鼠IgG包被的平板为小鼠抗nanoluc萤光素酶提供了改善的定向用于改善俘获/结合表面。实际上，包被以兔抗小鼠IgG或山羊抗小鼠IgG的平板为结合指示蛋白产物提供了更高的可及性。平板的包被表现出改善的信号检测，可能是因小鼠抗nanoluc萤光素酶的定向和结合位点对指示蛋白的可及性所致。
实施方案
实施方案1:一种检测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述方法包括：获得样品；向所述样品中加入选择剂；使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对金黄色葡萄球菌特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；俘获所述指示蛋白产物；以及检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中MRSA的存在。
实施方案2是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述选择剂包括抗生素。
实施方案3是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述抗生素包括头孢西丁。
实施方案4是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述样品来自鼻拭子。
实施方案5是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述方法检测样品中少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。
实施方案6是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述混合物包含至少两个不同类型的重组细菌噬菌体，并且所述重组细菌噬菌体中的至少一个来自ISP、MP115或其组合。
实施方案7是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述指示基因进行密码子优化并且编码生成内部信号的可溶性蛋白产物或在与底物反应后生成信号的可溶性酶。
实施方案8是任何前述或后续实施方案所述的方法，进一步包括经密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括细菌噬菌体晚期基因启动子。
实施方案9是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述俘获步骤包括使所述指示蛋白产物与表面接触。
实施方案10是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述表面是微量滴定板、胶乳粒子、侧流条、珠粒、磁性粒子或浸渍试纸。
实施方案11是任何前述或后续实施方案所述的方法，进一步包括在俘获所述指示蛋白产物之前将固定化的结合伴侣沉积在所述表面上。
实施方案12是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述固定化的结合伴侣是抗体或其片段。
实施方案13是任何前述或后续实施方案所述的方法，进一步包括洗涤包含所述固定化的结合伴侣的表面。
实施方案14是任何前述或后续实施方案所述的方法，进一步包括在俘获所述指示蛋白产物后洗涤所述表面。
实施方案15是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中通过检测所述指示蛋白产物所产生的信号背景比为至少2.0或至少2.5。
实施方案16是任何前述或后续实施方案所述的方法，其中所述样品首先在有助于生长的条件下孵育持续小于24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时的富集期。
实施方案17是任何前述或后续实施方案所述的方法，所述方法包括：获得样品；使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对微生物特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；使所述指示蛋白产物与表面接触，所述表面包含用于俘获所述指示蛋白产物的固定化的结合伴侣；以及检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中所述微生物的存在。
实施方案18：一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括：鼻拭子；测定物，所述测定物包含对金黄色葡萄球菌特异的重组细菌噬菌体和抗生素；以及用于俘获指示蛋白产物的表面。
实施方案19是任何前述或后续实施方案所述的试剂盒，其中所述表面包含固定化的结合伴侣。
实施方案20是任何前述或后续实施方案所述的试剂盒，其中所述抗生素包括头孢西丁。
本公开不限于所显示和所描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化包括在由权利要求所限定的本公开范围内。

Claims (20)

1.一种检测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus Aureus，MRSA)的方法，所述方法包括：
获得样品；
向所述样品中加入选择剂；
使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对金黄色葡萄球菌特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；
俘获所述指示蛋白产物；以及
检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中MRSA的存在。
2.权利要求1所述的方法，其中所述选择剂包括抗生素。
3.权利要求2所述的方法，其中所述抗生素包括头孢西丁。
4.权利要求1所述的方法，其中所述样品来自鼻拭子。
5.权利要求1所述的方法，其中所述方法检测样品中少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。
6.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含至少两个不同类型的重组噬菌体，并且所述重组噬菌体中的至少一个来自ISP、MP115或其组合。
7.权利要求1所述的方法，其中所述指示基因进行密码子优化并且编码生成内部信号的可溶性蛋白产物或在与底物反应后生成信号的可溶性酶。
8.权利要求1所述的方法，进一步包括经密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子。
9.权利要求1所述的方法，其中所述俘获步骤包括使所述指示蛋白产物与表面接触。
10.权利要求9所述的方法，其中所述表面是微量滴定板、胶乳粒子、侧流条、珠粒、磁性粒子或浸渍试纸。
11.权利要求9所述的方法，进一步包括在俘获所述指示蛋白产物之前将固定化的结合伴侣沉积在所述表面上。
12.权利要求11所述的方法，其中所述固定化的结合伴侣是抗体或其片段。
13.权利要求11所述的方法，进一步包括洗涤包含所述固定化的结合伴侣的表面。
14.权利要求13所述的方法，进一步包括在俘获所述指示蛋白产物后洗涤所述表面。
15.权利要求1所述的方法，其中通过检测所述指示蛋白产物所产生的信号背景比为至少2.0或至少2.5。
16.权利要求1所述的方法，其中所述样品首先在有助于生长的条件下孵育持续小于24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时的富集期。
17.一种检测样品中的微生物的方法，所述方法包括：
获得样品；
使所述样品与包含一种或多种感染原的混合物接触，其中所述感染原包含指示基因并对微生物特异，并且其中所述指示基因编码指示蛋白产物；
使所述指示蛋白产物与表面接触，所述表面包含用于俘获所述指示蛋白产物的固定化的结合伴侣；以及
检测由所述指示蛋白产物产生的信号，其中对所述信号的检测用来确定所述样品中所述微生物的存在。
18.用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，包含：
鼻拭子；
测定物，其包含抗生素和对金黄色葡萄球菌特异的重组噬菌体；以及
用于俘获指示蛋白产物的表面。
19.权利要求18所述的试剂盒，其中所述表面包含固定化的结合伴侣。
20.权利要求18所述的试剂盒，其中所述抗生素包括头孢西丁。
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