JP2010088456A - 標的細菌性細胞を感染させるためにファージを使用する低濃度の標的細菌を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】同方法は、溶液と一定量の標識化された親バクテリオファージとを混合して溶液中に存在する標的細菌の少なくともいくらかを感染させて、溶液中に多数の標識化されていない子孫バクテリオファージを生成する工程と、特定の検出技術によって溶液を分析し、標識化されていない子孫バクテリオファージに対するバイオマーカーであって標識化された親バクテリオファージに対するいかなるバイオマーカーに対しても識別可能であり、かつ標的細菌が溶液中に存在していることを間接的に示す、バイオマーカーが存在しているかを決定する工程と、からなる。
【選択図】 図3
Description
請求項3に記載の発明は、請求項1に記載の方法において、分析工程は、MALDI分析を実施することからなることをその要旨とする。
請求項5に記載の発明は、請求項1に記載の方法において、分析工程は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を実施することからなることをその要旨とする。
請求項7に記載の発明は、請求項1に記載の方法において、分析工程は、光学分光分析法を実施することからなることをその要旨とする。
請求項9に記載の発明は、請求項1に記載の方法において、分析工程は、クロマトグラフィー分析法を実施することからなることをその要旨とする。
請求項11に記載の発明は、請求項1に記載の方法において、標的細菌を溶液から分離する工程を更に含むことをその要旨とする。
一実施形態において、該方法は、標的細菌に対するバクテリオファージが溶液に適用されるような生物学的な増幅工程を用いることからなる(バクテリオファージは細菌を感染させ、かつ該工程において多くの子孫を生成するウィルスである。構造的に、該バクテリオファージはウィルス性核酸を被包する蛋白質の殻(キャプシド)から構成される。キャプシドは、同一蛋白質の反復するコピーから構成される。バクテリオファージは特定の細菌細胞を感染させることが可能であり、遺伝材料の増幅により、該細胞は最終的には最初のファージの数百万ものコピーを爆発的に放出する。)。溶液中に存在するバクテリオファージと任意の標的細菌は培養される。培養期間の間、該バクテリオファージは溶液中に存在する標的細菌に感染することにより増殖する。より詳細には、該バクテリオファージは、感染された標的細菌中にて、自身の非常に多くのコピーを複製する。最終的に、感染された標的細菌は溶解(lyse)され、複製されたバクテリオファージ、又は子孫(progeny)バクテリオファージは溶液中に放出される。次いで、該溶液は、該バクテリオファージに対するバイオマーカーが存在するか否かを決定するために分析され、それにより、該標的細菌が溶液中に存在することを間接的に示す。分析技術として可能なものには、MALDI−MS及びエレクトロスプレーイオン化質量分析技術のような質量分析技術が含まれる。
大腸菌の調製
大腸菌は、標準的な微生物学的方法を用いて37℃にて培養しながら、トリプチカーゼ大豆培地(TSB)(ミシガン州デトロイトに所在のDifco社)にて生育した。
バクテリオファージの調製
バクテリオファージの増殖は、M.H.Adams’Bacteriophages(Interscience Publishers社、ニューヨーク、1959年)に記載されているようなアダムス寒天重層(Adams agar−overlay)法に従って実施した。簡潔に述べると、軟寒天/ホスト皮膜を、TSB中に2滴の20hrホスト(20hr host)を含んだ溶融した0.5%の寒天の2.5mL(同一の媒体)を寒天プレート(トリプチカーゼ大豆寒天,Difco社)に積層することにより調製された。軟寒天皮膜は、凍結乾燥したMS2をTSB中にて再水和することにより調製された濃縮されたMS2の懸濁液の0.5mLを積層により加える前に、硬化された。24時間後、軟寒天が寒天プレート表面からこすりとられ、25分間遠心分離(1000G)して、細胞性の堆積物と寒天とを沈殿させた。上澄み液を保存し、0.22μmのミリポアフィルタにてろ過し、4乃至8℃にて冷蔵保存した。
免疫磁気ビーズの調製
ウサギ抗大腸菌IgG抗体(カリフォルニア州、サンレアンドロに所在のCortex Biochem社)を、製造業者が示唆したプロトコルを用いて、免疫磁気ビーズ(メガビーズ(MegaBeads)、ヤギ抗ウサギIgG F(c)、Cortex Biochem社)に付着した。
免疫磁気分離(IMS)大腸菌
大腸菌は、免疫磁気ビーズを用いたアフィニティーキャプチャーにより水性懸濁液から単離された。細菌の懸濁液は、1.5mLのマイクロ遠心管(ニューヨーク州、Westburyに所在のBrinkmann Instruments社)内にて、100μLの培養液を900μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS,0.01MのNa2HPO4,0.15MのNaClを、HClを用いてpH7.35に滴定した)と混合することにより調製した。細胞の濃度は、ペトロフ−ハウザーカウントチャンバー(Petroff−Hauser counting chamber)(ペンシルバニア州Horshamに所在のHauser Scentific社)を用いて決定した。
MALDI−TOF MS
全てのマススペクトルは、ポジティブなリニアモードにて稼動するVoyager−DE STR+MALDI−TOF質量分析計(マサチューセッツ州Framinghamに所在のAB Applied Biosystems社)にて生成した。以下のパラメータが使用された:加速電圧25kV、加速電圧の92%のグリッド電圧、350nsecの遅延引き出し(extraction delay)時間及び4kDaに設定された低質量イオンゲート。レーザの強度(N2,337nm))は、イオン発生閾値より僅かに大きい値に設定され、かつ300ns毎にパスル化した。マススペクトルは、5つの異なるサンプルスポットから100のレーザショットを累積することにより、各サンプルから得られた(最終的なスペクトル=5×100レーザショットの平均)。
Claims (13)
- 標的細菌が特定の検出技術の検出限界未満の低濃度である場合に前記標的細菌が溶液中に存在しているかどうかを決定するための方法であって、前記方法は、
前記溶液と、一定量の標識化された親バクテリオファージと、を混合して、前記溶液中に存在する標的細菌の少なくともいくらかを感染させて、前記溶液中に多数の標識化されていない子孫バクテリオファージを生成する工程と、
前記特定の検出技術によって前記溶液を分析し、前記標識化されていない子孫バクテリオファージに対するバイオマーカーであって前記標識化された親バクテリオファージに対するいかなるバイオマーカーに対しても識別可能であり、かつ前記標的細菌が前記溶液中に存在していることを間接的に示す、バイオマーカーが存在しているかを決定する工程と、
からなる方法。 - 前記分析工程は、マススペクトル分析を実施することからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、MALDI分析を実施することからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、MALDI−TOF分析を実施することからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を実施することからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、イオン移動度分光分析法を実施することからなる請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、光学分光分析法を実施することからなる請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、免疫分析法を実施することからなる請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、クロマトグラフィー分析法を実施することからなる請求項1に記載の方法。
- 前記分析工程は、アプタマー分析法を実施することからなる請求項1に記載の方法。
- 前記標的細菌を前記溶液から分離する工程を更に含む請求項1に記載の方法。
- 前記分離工程は、前記標的細菌に対する抗体で被覆された免疫磁気ビーズを使用する工程を更に含む、請求項11に記載の方法。
- 前記標識化された親バクテリオファージはビオチン化バクテリオファージである、請求項1に記載の方法。
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