ES2346424T3 - Procedimiento de deteccion de bajas concentraciones de una bacteria diana que utiliza fagos para infectar celulas bacterianas diana. - Google Patents

Procedimiento de deteccion de bajas concentraciones de una bacteria diana que utiliza fagos para infectar celulas bacterianas diana. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para determinar si una bacteria diana está presente en una solución líquida cuando la bacteria diana está en una baja concentración tal que un análisis de espectrometría de masa no proporciona una señal indicativa de la presencia de la bacteria diana en la solución líquida, que compren- de: Infectar al menos alguna de cualquier bacteria diana presente en dicha solución líquida con un bacteriófago marcado con una sustancia que altera o cambia el espectro de masa del bacteriófago padre respecto del bacteriófago progenie, y producir un número de bateriófagos no marcados en dicha solución líquida; y Realizar un espectro de masa sobre dicha solución líquida para determinar la presencia de un cambio en el espectro de masa que sea indicativo de la presencia de dicho bacteriófago no marcado e, indirectamente, de la bacteria diana.

Description

Procedimiento de detección de bajas concentraciones de una bacteria diana que utiliza fagos para infectar células bacterianas diana.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar bajas concentraciones de una bacteria diana en una mezcla líquida que utiliza bacteriófagos para infectar células bacterianas diana.
Antecedentes de la invención
Los procedimientos microbiológicos estándar se han fundamentado en ensayos basados en sustratos para probar la presencia de organismos específicos (Bordner, et al. 1978). Estas técnicas ofrecen niveles muy altos de selectividad pero están dificultadas por el requerimiento de, primero hacer crecer o cultivar cultivos puros del organismo localizado, lo que puede demorar 24 horas o más. Esta restricción de tiempo limita severamente la efectividad para proporcionar una respuesta rápida a la presencia de cepas virulentas de microorganismos.
Las técnicas de biología molecular están ganando rápidamente aceptación como alternativas valiosas de los ensayos microbiológicos estándar. En particular, se han empleado muchos procedimientos serológicos para evaluar un huésped de matrices para microorganismos localizados (Kingsbury & Falkow 1985; Wyatt et al. 1992). Estos ensayos se centran en utilizar anticuerpos para primero atrapar y después separar organismos localizados de otros constituyentes en mezclas biológicas complicadas. Una vez aislado, el organismo capturado puede concentrarse y detectarse mediante una variedad de técnicas diferentes que no requieren cultivar el analito biológico.
Un enfoque muy popular, denominado separación inmunomagnética (IMS), incluye inmovilizar anticuerpos de perlas paramagnéticas esféricas de microdimensiones adecuadas, y utilizar las perlas revestidas con el anticuerpo para atrapar microorganismos localizados de los medios líquidos. Las perlas se multiplican fácilmente bajo la influencia de un campo magnético facilitando la recuperación y concentración de organismos localizados. Además, el pequeño tamaño y forma de las perlas les permite dispersarse en forma pareja en la muestra, acelerando la velocidad de interacción entre la perla y la diana. Estas características favorables llevan a reducciones en el tiempo de ensayo y ayudan a simplificar el procedimiento analítico, por lo cual se hace más aplicable para una mayor capacidad de procesamiento y automatización de muestras.
Los procedimientos de detección descendente previamente utilizados con IMS incluyen ELISA
(Cudjoe, et al. 1995), ensayo de transferencia de puntos (Skjerve et al. 1990), electroquimioluminiscencia (Yu and Bruno 1996) y citometría de flujo (Pyle
et al. 1999). Aunque estos ensayos proporcionan resultados satisfactorios, son laboriosos para realizar y dar respuestas binarias (sí/no) que sean altamente susceptibles a los resultados falsos-positivos debido a la reactividad cruzada con analitos no diana. Recientemente se informó acerca de un método rápido para identificar bacterias específicas de mezclas biológicas complejas utilizando IMS combinado con desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI) tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masa (MS) (Madonna et al. 2001). Este enfoque permitió que se evalúe una variedad de matrices en cuanto a la presencia de una especie de Salmonella dentro de un tiempo de análisis total de 1 hora. Además, el procedimiento desarrollado requirió poco procesamiento de muestras, fue relativamente fácil de realizar, y la información obtenida sobre el peso molecular hizo posible discriminar entre las señales de las bacterias diana y las señales de los constituyentes de reacción cruzada.
MALDI-TOF-MS es una técnica probada para identificar microorganismos celulares enteros (Holland et al (1996); van Barr 2000; Madonna et al. 2000). En principio, MALDI es una técnica de obtención de la huella genética en la que se generan espectros de masa que caracterizan las distribuciones variables de señales de proteínas. Los perfiles de señales que se producen, debido a diferencias inherentes en proteomas microbianos, hacen posible discriminar entre organismos por debajo del nivel de cepa (Arnold and Reilly 1998). La técnica MALDI-TOF combinada con IMS incluye, en una realización, mezclar perlas inmunomagnéticas específicas de las bacterias diana con la mezcla líquida que puede contener las bacterias diana durante un corto período de incubación (por ejemplo, 20 minutos). Cualquier bacteria diana capturada por las perlas se lavan dos veces, se resuspenden en H_{2}O desionizada, y se aplican directamente a una sonda de muestra para MALDI. El complejo bacterias diana-perla después se cubre con un microvolúmen de solución de matriz y se seca a temperatura ambiente. La irradiación de la masa cristalina resultante con un láser de alta intensidad promueve la liberación e ionización de las proteínas celulares intactas que son posteriormente detectadas por un espectrómetro de masa TOF. El espectro de masa resultante después es interrogado en cuanto a los picos definitivos de masa que signifiquen la presencia de bacterias diana.
Sumario de la invención
La invención se refiere a un procedimiento para determinar si una bacteria diana está presente en una solución líquida cuando la bacteria diana está presente en una baja concentración que está en o cerca del límite de detección para espectrometría en masa. Según lo utilizado en la presente memoria, el término "bacteria diana" se refiere a especies de bacterias. A su vez, la invención es aplicable a situaciones en las que es deseable determinar si una bacteria diana (por ejemplo, E. coli) está presente en una solución líquida cuando el número de bacterias diana por unidad de volumen de solución (es decir, la concentración de la bacteria diana) está por debajo del límite de detección para la espectrometría de masa. En algunos casos, una pluralidad de bacterias diana puede denominarse bacterias diana. El procedimiento es según lo definido en las reivindicaciones.
En una realización, el proceso comprende utilizar un procedimiento de amplificación biológica en el que los bacteriófagos para la bacteria diana se aplican a la solución líquida. (Lo bacteriófagos son virus que infectan las bacterias y en el proceso producen mucha progenie. Estructuralmente, el bacteriófago consiste en una envoltura proteica (cápside) que encapsula el ácido nucleico viral. La cápside se construye a partir de copias de repetición de la misma proteína. Los bacteriófagos son capaces de infectar células bacterianas específicas y debido a la multiplicación del material genético, las células eventualmente estallan liberando millones de copias del fago original.) Se permite que los bacteriófagos y cualquier bacteria diana presente en la solución líquida se incuben. Durante el período de incubación, los bacteriófagos se multiplicarán infectando la bacteria diana presente en la solución. Más específicamente, el bacteriófago replica numerosas copias de sí mismo en una bacteria diana infectada. Finalmente, el lisado de bacteria diana infectada y los bacteriófagos progenie o replicados son liberados en la solución líquida. La solución después se analiza para determinar si está presente un marcador biológico para el bacteriófago, lo que indica en forma indirecta, que la bacteria diana está presente en la solución líquida. Las técnicas posibles de espectrometría de masa incluyen las técnicas MALDI-MS y de ionización mediante electropulverización-MS.
Para asegurar que la detección de un marcador biológico para el bacteriófago indica que la bacteria diana está presente en la solución líquida, se aplica una concentración del bacteriófago a la solución líquida que está por debajo del límite de detección del marcador biológico para el bacteriófago en cualquier técnica de análisis que se emplee. Esto asegura que si se detecta el marcador biológico para el bacteriófago mediante la técnica de análisis, la concentración detectable del marcador biológico es atribuible a la réplica del bacteriófago mediante la bacteria diana presente en la solución líquida. En ciertas situaciones, el uso de dicha concentración de bacteriófago posee una multiplicidad de infección ("MOI") (es decir, relación de bacteriófagos infectantes y bacteria diana) que es demasiado baja para producir rápidamente una concentración suficiente de bacteriófagos o marcadores biológicos del bacteriófago para detección.
Otra realización del proceso trata este problema añadiendo una concentración muy alta del bacteriófago a la solución líquida, lo que asegura de ese modo una alta MOI. En este caso, la concentración del bacteriófago añadido a la solución puede exceder el límite de detección de cualquier técnica de análisis que se emplee para detectar el bacteriófago o marcador biológico del bacteriófago. En consecuencia, el proceso aplica bacteriófago padre a la solución que puede distinguirse de cualquier bacteriófago de la progenie resultante de la infección de la bacteria diana en la mezcla. Si está presente el bacteriófago progenie distinguible o un marcador biológico distinguible del bacteriófago progenie, esto indica que la bacteria diana está presente en la sonda de la solución.
El bacteriófago padre (es decir, el bacteriófago inicialmente aplicado a la solución) es "marcado" de manera que la técnica de análisis que se emplea sea inherentemente capaz de distinguir el bacteriófago padre o marcadores biológicos del bacteriófago padre del bacteriófago progenie o marcadores biológicos para el bacteriófago progenie. El bacteriófago padre es "marcado" con una sustancia que altera o cambia el espectro de masa del bacteriófago padre respecto del bacteriófago progenie, que no heredará la "marca" del bacteriófago padre. Por ejemplo, un bacteriófago biotinilado puede emplearse como bacteriófago padre y tendrá un espectro de masa diferente que el bacteriófago progenie producido por el bacteriófago biotinilado que infecta la bacteria diana presente en la solución. Pueden emplearse otras "marcas".
En otra realización, el bacteriófago padre posee una característica que permite que el bacteriófago padre sea separado del bacteriófago progenie en la solución líquida previo al análisis, lo que asegura de ese modo que la mayoría, si no la totalidad de los bacteriófagos presentes en la solución líquida después de la separación, sea bacteriófago progenie resultante de la réplica del bacteriófago padre por las bacterias diana presentes en la solución líquida. En una realización, los bacteriófagos padrees inicialmente aplicados a la solución líquida son bacteriófagos biotinilados. Los bacteriófagos biotinilados son altamente atraídos a la estreptavidina. Esta atracción se aprovecha para separar el bacteriófago biotinilado de la progenie de bacteriófago resultante de la réplica del bacteriófago biotinilado mediante la bacteria diana presente en la mezcla.
En una realización, el bacteriófago biotinilado se une a una sonda revestida con estreptavidina. En consecuencia, la separación del bacteriófago biotinilado de la solución líquida después del período de incubación se logra quitando la sonda de la solución líquida. En otra realización, las perlas magnéticas revestidas con estreptavidina se aplican a la solución líquida. Se utilizan las perlas para recoger el bacteriófago biotinilado. Las perlas después se separan de la solución líquida utilizando un imán. Aún en otra realización, se aplica una sonda revestida con estreptavidina (por ejemplo, un portaobjeto) a la solución líquida después del período de incubación. El bacteriófago biotinilado se adhiere a la sonda y después la sonda se separa de la solución líquida.
Aún otra realización de la invención reconoce que la solución líquida en la cual la bacteria diana puede estar presente es o puede ser una mezcla compleja que incluye material biológico que hace que la detección del bacteriófago o marcador biológico para el bacteriófago sea más difícil o reduce la confiabilidad de la información proporcionada por la tecnología de detección empleada. Por ejemplo, cuando se emplea una metodología de detección por espectrometría de masa, la mezcla compleja puede producir una señal en la que el marcador biológico asociado al bacteriófago es oscuro o, expresado diferente, posee una baja relación señal-ruido. Para tratar esta posibilidad, la solución líquida se somete a una etapa de purificación en la que la bacteria diana que está presente en la solución líquida se separa del resto de la solución. En una realización, se utiliza la separación inmunomagnética ("IMS") para separar la bacteria diana presente en la solución líquida del resto de la solución. En una realización particular, las perlas magnéticas se revisten con un anticuerpo para la bacteria diana. Los anticuerpos recogen la bacteria diana presente en la mezcla líquida y después se utiliza un imán para separar las perlas del resto de la solución líquida. Las perlas y cualquier bacteria diana adherente después se someten al proceso y análisis de amplificación biológica. Debe apreciarse que esta etapa de purificación también trata la posibilidad de que pueden estar presentes versiones salvajes del bacteriófago en la solución líquida y que dichas versiones podrían producir un falso positivo si la solución líquida no se sometió a una etapa de purificación.
Si las versiones salvajes del bacteriófago no importan, puede implementarse la etapa de purificación después del proceso de amplificación biológica. En esta realización, la etapa de purificación incluye separar los bacteriófagos y la solución líquida, en vez de separar la bacteria diana y la solución líquida. En una realización, se utiliza una IMS en la que las perlas magnéticas se revisten con un anticuerpo para el bacteriófago. Las perlas recogen los bacteriófagos presentes en la solución y después se utiliza un imán para separar las perlas del resto de la solución.
En otra realización de la invención, la etapa de análisis comprende utilizar análisis MS/MS para determinar si está presente un marcador biológico para la bacteria diana. El uso del análisis MS/MS produce una indicación altamente confiable de la presencia de un marcador biológico para una bacteria diana. Como consecuencia, al menos en algunos casos, el uso del análisis MS/MS hace que ya no sea necesaria una etapa de purificación.
Aún en otra realización, la invención se refiere a un proceso para detectar bajas concentraciones de una bacteria diana en mezclas complejas. En una realización, el proceso comprende el uso de un procedimiento IMS para aislar al menos una parte de la cantidad de bacteria diana que puede estar presente en una mezcla líquida. El proceso además incluye emplear un procedimiento de amplificación biológica en el que se aplica un título o concentración bajos de bacteriófagos para la bacteria diana a al menos algo de la bacteria diana que se ha aislado mediante el procedimiento de IMS. Se permite que se incube la mezcla de bacteriófagos y cualquier bacteria diana que haya sido aislada. Si al menos está presente una cierta concentración de la bacteria diana, los bacteriófagos se multiplicarán durante el período de incubación de manera tal que estará presente un alto título o concentración de bacteriófagos en la mezcla y será detectable mediante análisis MALDI-TOF-MS. Si está presente solamente un pequeño número de bacteria diana o ninguna, habrá una baja concentración de bacteriófagos presentes en la mezcla que razonablemente no será detectado mediante análisis MALDI-TOF-MS. Después de la incubación, se realiza un análisis MALDI-TOF-MS sobre la mezcla incubada de bacteriófagos y bacteria diana. El espectro de masa resultante se analiza para determinar si está presente una proteína que está asociada con los bacteriófagos. Si se detecta la proteína para el bacteriófago, después puede concluirse que al menos una baja concentración de la bacteria diana está presente en la mezcla.
También debe apreciarse que el procedimiento de la invención es capaz de detectar baja concentración de una bacteria diana sin importar la manera en la que la bacteria se hizo crecer o se propagó.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 describe, para una realización de la invención, una perla inmunomagnética que se utiliza para aislar el microorganismo diana (anticuerpos no dibujado a escala);
La Figura 2 es una representación esquemática de la etapa de purificación inmunomagnética utilizada para aislar un antígeno diana (Escherichia coli) en una realización de la invención;
La Figura 3 es una representación esquemática de la etapa de amplificación del bacteriófago para una realización de la invención;
La Figura 4 muestra un espectro de masa por MALDI-TOF típico obtenido de una muestra de título alto de MS2 en PBS; y
Las Figuras 5A-5C ilustran cómo una realización de la invención fue capaz de detectar un marcador biológico del bacteriófago indicativo de la presencia de E. coli para concentraciones decrecientes de E. coli.
Descripción detallada
Generalmente, la invención se refiere al uso de un bacteriófago para detectar indirectamente la presencia de una bacteria diana en una solución líquida en la que la concentración de la bacteria diana está o es posible que esté cerca o por debajo del límite de detección para la tecnología de detección particular empleada.
Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y en el proceso de infección de la bacteria producen mucha progenie. Estructuralmente, el bacteriófago consiste en una envoltura proteica (cápside) que encapsula el ácido nucleico viral. La cápside se construye a partir de copias de repetición de la misma proteína(s). Los bacteriófagos son capaces de infectar células bacterianas específicas y debido a la multiplicación del número de progenie, las células finalmente estallan y liberan millones de copias del fago original. Este proceso de infección se ha utilizado para ser útil como una etapa de amplificación de marcador biológico para detectar bajas concentraciones de células bacterianas diana. Por ejemplo, la cápside del bacteriófago MS2 contiene 180 copias de una proteína 13 kDa. Este virus particular infecta específicamente las cepas de Echerichia coli y es capaz de producir entre 10.000 a 20.000 copias de sí mismo dentro de 40 minutos después de la unión a la célula bacteriana diana. Esencialmente, una E. coli podría infectarse con MS2 dando como resultado la réplica de la(s) proteína(s) cápside mediante un factor de 1,8 x 10^{6}.
Los resultados de la espectrometría de masa/ionización desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI/TOF) pueden utilizarse para mostrar la utilidad de la etapa de amplificación. MALDITOF-MS es una técnica probada para identificar microorganismos celulares enteros (Holland et al 1996; van Barr 2000; Madonna et al. 2000). En principio, MALDI es una técnica de obtención de la huella genética en la que se generan espectros de masa que caracterizan las distribuciones variables de señales de proteínas. Los perfiles de señales que se producen, debido a diferencias inherentes en proteomas microbianos que hacen posible discriminar entre organismos por debajo del nivel de cepa (Arnold and Reilly 1998).
En un experimento en el que la señal proteica por MALDI de células bacterianas diana fue demasiado débil para la detección, la adición de bajos niveles (demasiado bajos para detectar mediante MALDI) del fago apropiado a la células bacterianas diana después de aproximadamente treinta minutos produjo una señal proteica detectable mediante MALDI atribuible a la proteína de cápside del fago. Los bacteriófagos específicos para otras especies bacterianas típicamente poseen proteínas cápside de diferente peso molecular y por ello brindan una señal MALDI diferente. Por ello, el procedimiento es aplicable a un sinnúmero de diferentes especies bacterianas. También son factibles otras tecnologías de detección, tales como espectrometría por movilidad iónica, espectroscopía óptica, técnicas inmunológicas, técnicas cromatográficas y procesos de aptameros.
Generalmente, el proceso para detectar bajas concentraciones de una bacteria diana en una mezcla líquida compleja que contiene o es probable que contenga material biológico distinto de la bacteria diana comprende procesar la mezcla o una porción de la misma para producir una mezcla líquida, solución o muestra para análisis que, si en la mezcla está presente al menos una cierta concentración de la bacteria diana, se produce una señal o indicación perceptible de la misma. Debe entenderse que los términos "Solución líquida" y "mezcla líquida" se refieren a la solución o mezcla original que se somete al ensayo y cualquier solución o mezcla líquida que, como resultado de la aplicación del procedimiento, contiene una porción de la solución o mezcla original.
En una realización, el proceso comprende determinar si en la solución líquida está presente una baja concentración de una bacteria diana. Esta determinación puede realizarse asumiendo que cualquier bacteria diana que está presente en la solución líquida está presente en una baja concentración. Alternativamente, puede realizarse un ensayo para determinar si la bacteria diana está presente en una concentración que exceda con seguridad el límite de detección de cualquier tecnología de detección que esté siendo utilizada. Por ejemplo, puede utilizarse una técnica de espectrometría de masa. Si la técnica de espectrometría de masa proporciona una señal confiable indicativa de la presencia de la bacteria diana en la solución líquida, no se necesita tomar ninguna otra medida. Sin embargo, si la técnica de espectrometría de masa no proporciona una señal confiable indicativa de la presencia de la bacteria diana en la solución líquida, entonces puede concluirse que la bacteria diana puede estar presente en la solución líquida pero en una concentración que está por debajo de o cerca del límite de detección de la técnica de espectrometría de masa. En este caso, se toman otras medidas para determinar si la bacteria diana está presente en la solución líquida en una concentración que está por debajo del límite de detección de la técnica de espectrometría de masa.
El proceso incluye una etapa de purificación que incluye capturar la bacteria diana que puede estar presente en la mezcla y separar cualquier bacteria capturada de otro material biológico que puede estar presente en la mezcla. Al separar cualquier bacteria diana capturada de otro material biológico que puede estar presente en la mezcla, se reduce la porción de la señal de espectro de masa producido posteriormente asociada con otro material biológico presente en la mezcla. En una realización, se utiliza una técnica de separación inmumomagnética (IMS) para capturar y separar la bacteria diana.
El proceso además comprende someter a menos alguna de cualquier bacteria diana capturada y separada a una etapa de amplificación en la que la bacteria diana se infecta con un bacteriófago que es específico de la bacteria diana. Si al menos hay una cierta concentración de la bacteria diana presente, el bacteriófago se multiplicará hasta un punto que un marcador biológico asociado al bacteriófago será detectable utilizando una técnica de análisis, tal como MALDI/TOF-MS. En el caso de MALDI/TOF-MS, se incrementará una porción de la señal espectral de masa posteriormente producida e indicativa de la presencia del bacteriófago. Si hay menos que una concentración particular de la bacteria diana presente, el bacteriófago no se multiplicará lo suficiente para ser detectable en el espectro de masa producido utilizando MALDI/TOF-MS. En esencia, en el caso de que haya al menos una cierta concentración de la bacteria diana presente en la mezcla, las etapas de purificación y amplificación son útiles para incrementar la relación señal-ruido para la porción del espectro de masa posteriormente producido que está asociado al bacteriófago.
Después de la amplificación, al menos una porción de la mezcla amplificada se somete al análisis para determinar si un marcador biológico para la bacteria diana está presente. Por ejemplo, el análisis MALDI/TOF-MS puede utilizarse para producir un espectro de masa. Se analiza el espectro de masa para determinar si están presentes uno o más marcadores biológicos para el bacteriófago. Si están presentes dichos marcadores biológicos, esto es una indicación indirecta de que al menos una cierta concentración de la bacteria diana estuvo presente en la mezcla de muestreo original.
Debe apreciarse que la necesidad de la etapa de purificación puede no ser tal en situaciones en las que la porción de la señal asociada con otros materiales biológicos puede filtrarse, eliminarse o de otra manera ignorarse, y/o en situaciones en las que la ganancia de la etapa de amplificación es tal que la porción del espectro de masa asociado al bacteriófago es posible que exceda cualquier señal de fondo asociada con otros materiales biológicos y/o situaciones en las que se considera que un falso positivo es remoto. Además, también debe apreciarse que uno de los otros materiales biológicos que puede hacer difícil determinar si el marcador biológico para el bacteriófago está presente es una versión salvaje del bacteriófago que está presente en la solución líquida que se está ensayando. La etapa de purificación trata la presencia de un bacteriófago salvaje.
Si la presencia o posible presencia de un bacteriófago salvaje en la solución o mezcla que se está ensayando no es una preocupación, también es posible realizar una etapa de purificación después de la etapa de amplificación. Sin embargo, en este caso, el bacteriófago se separa del resto de la solución líquida. Puede emplearse la técnica de IMS previamente observada. Sin embargo, la perla magnética se reviste con un anticuerpo para el bacteriófago, en vez de un anticuerpo para la bacteria diana.
También es posible en ciertos casos eliminar la necesidad de una etapa de purificación utilizando una técnica de análisis altamente específica, tal como MS/MS, en la que el marcador biológico para el bacteriófago es tan altamente específico para el bacteriófago que existe poca posibilidad de un falso positivo. Actualmente, el uso de MS/MS se limita a las proteínas cápside que son menores que 7000 Da.
Con referencia a la Fig. 1, se describe la técnica de separación inmunomagnética (IMS) para capturar la bacteria diana en una mezcla y separar cualquier bacteria diana capturada de otro material biológico en la mezcla. Las perlas de microtamaño se construyen a partir de un núcleo de oxido de hierro revestido con una superficie polimérica. Los anticuerpos secundarios levantados contra la región de Fc de los anticuerpos primarios se unen covalentemente a través de un conector a la superficie polimérica. El anticuerpo primario (levantado contra un microorganismo localizado) se une a las perlas mediante fuertes interacciones no covalentes con el anticuerpo secundario, que mantiene el anticuerpo primario en la orientación apropiada para la reacción con el antígeno localiza-
do.
Con referencia a la Fig. 2, las perlas inmunomagnéticas se añaden a la mezcla bacteriana o biológica, que es el objeto de análisis, y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las perlas después se aíslan al lado del tubo de reacción utilizando un imán. Este proceso permite que el material extraño (no localizado) sea eliminado por aspiración. En esta etapa, las perlas pueden lavarse varias veces antes de resuspenderlas en PBS.
Con referencia a la Fig. 3, El complejo perla-bacteria diana se mezcla con una suspensión de bajo título de bacteriófago específico de la bacteria localizada. El título se mantiene bajo para que la señal de espectrometría de masa del virus sea no detectable. Después de una incubación de 40 minutos, el bacteriófago ha completado un ciclo de propagación de unión, inserción, autoensamblaje y lisis celular que da como resultado la producción de mucha progenie que es liberada en el medio de reacción. El medio después se analiza para determinar si un marcador biológico para el bacteriófago está presente que indique indirectamente que la bacteria diana estaba presente. Por ejemplo, el medio puede analizarse mediante MALDI-TOF-MS utilizando una técnica de preparación de muestra sándwich con una matriz de ácido ferúlico. También son factibles otras matrices MALDI conocidas en la técnica. El espectro de masa resultante muestra la presencia de la proteína de cápside del bacteriófago, que no hubiera estado presente si la bacteria diana tampoco estaba presente.
Se describe una técnica de IMS para capturar la bacteria diana en una mezcla y separar cualquier bacteria diana capturada de otro material biológico en la mezcla y posterior análisis mediante MALDI-TOF/MS en la Solicitud de Patente Estadounidense Número de Serie 10/063.346, titulada " Method for Determining if a Type of Bacteria is Present in a Mixture", presentada el 12 de abril de 2002, que se incorpora a la presente memoria, en su totalidad, por referencia.
Ejemplo
Según lo descrito de aquí en adelante, se ha utilizado una realización del procedimiento para reducir el límite de detección para E. coli hasta menos que 5,0 x 10^{4} células ml^{-1}. El procedimiento utilizó perlas inmunomagnéticas revestidas con anticuerpos contra E. coli, de aquí en adelante referidas como complejo perla-diana, para aislar la bacteria de la solución. El complejo perla-diana después se resuspendió en una solución que contenía MS2, un bacteriófago que es específico para E. coli. La concentración del bacteriófago MS2 se ajustó de manera que la señal iónica de la proteína de cápside del bacteriófago MS2 estuviera por debajo del límite de detección del espectrómetro de masa. Después de un período de incubación de 40 minutos, se tomó una alícuota de la solución y se analizó mediante el procedimiento MALDI- TOF-MS sobre sonda para la proteína de cápside de 13 kDa. Se detectaron las señales iónicas [M+H]^{+} (m/z 13.726) y [M+2H]^{+2} (m/z 6865) para la proteína de cápside de MS2 (Figura 4).
Con referencia a la Fig. 5A, la aplicación del proceso a una mezcla que contiene una concentración de 5,0 x 10^{6} células de E. coli ml^{-1} produce un espectro de masa con señales de proteína para ambos E. coli y el bacteriófago MS2. El proceso se repitió para las concentraciones decrecientes de E. coli. Específicamente, con referencia a la Fig. 5B, el proceso se repitió para una concentración de -5,0 x 10^{5} células de E. coli ml^{-1}. En este caso, el espectro de masa definitivamente no logra mostrar ninguna señal de proteína para las células de E. coli, pero muestra las señales de proteína para la proteína de cápside del bacteriófago MS2. Con referencia a la Fig. 5e, el proceso se repitió para la concentración de E. Coli de -5,0 x 10^{4} células ml^{-1}. En este caso, el espectro de masa definitivamente no logra mostrar ninguna señal de proteína para las células de E. coli, pero aún muestra las señales de proteína para la proteína de cápside del bacteriófago MS2. Estos resultados indican que la E. coli fue atrapada por las perlas inmunomagnéticas y después infectada por el virus MS2, que fue capaz de multiplicarse e incrementar la concentración de la proteína de cápside hasta un nivel detectable. Actualmente, las concentraciones de bacteria diana tan bajas como -1,0 x 10^{3} células ml^{-1} han sido indirectamente detectadasutilizando este proceso.
A continuación se describen varios aspectos de la realización del procedimiento implementado con respecto al ejemplo de la detección de E. coli.
Preparación de E. coli
La bacteria E. coli se hizo crecer en caldo con tripticasa de soja (TSB) (Difco, Detroit, MI) con incubación a 37ºC utilizando procedimientos microbianos estándar.
Propagación del bacteriófago
Se llevó a cabo la propagación del bacteriófago de conformidad con el procedimiento de superposición en agar de Adams según lo descrito en M. H. Adams' Bacteriophages (Interscience Publishers, Inc., Nueva York, 1959). Brevemente, se preparó un revestimiento huésped en agar blando superponiendo placas de agar (agar de tripticasa de soja, Difco) con 2,5 ml de agar fundido al 0,5% (mismo medio), que contenía dos gotas de un huésped de 20 horas en TSB. Se permitió que el revestimiento de agar blando se endurezca antes de la adición de una superposición de 0,5 ml de una suspensión concentrada de MS2, preparada rehidratando el MS2 liofilizado en TSB. Después de 24 horas, el agar blando se eliminó por raspado de la superficie de las placas de agar y se centrifugó (1000G) durante 25 minutos para sedimentar los desechos celulares y el agar. Se conservó el sobrenadante, se pasó a través de filtros de Millipore de 0,22 \mum, y se almacenó mediante refrigeración a 4-8ºC.
Preparación de la perla inmunomagnética
Se unió anticuerpo anti-E. coli IgG de conejo (Cortex Biochem, San Leandro, CA) a las perlas inmunomagnéticas (MagaBeads, Goat anti-Rabbit IgG F (c), Cortex Biochem) utilizando el protocolo sugerido por el fabricante.
E. coli de separación inmunomagnética (IMS)
Se aisló la Escherichia coli de las suspensiones acuosas mediante captura por afinidad utilizando las perlas inmunomagnéticas. Se prepararon suspensiones de bacteria en tubos microcentrífugos de 1,5 ml (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, Ny) combinando 100 \mul de medio de caldo con 900 \mul de solución salina de tampón de fosfato (PBS, Na_{2}HPO_{4} 0,01M, NaCI 0,15M titulado a pH 7,35 con HCI). Se determinaron las concentraciones celulares utilizando una cámara de conteo Petroff-Hauser (Hauser Scientific, Horsham, PA).
El procedimiento de separación inmunomagnética (IMS) desarrollado en esta investigación incluyó las siguientes etapas: En la primer etapa, se añadió una alícuota de 30 \mul de las perlas inmunomagnéticas a la solución de muestra bacteriana y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación continua. La segunda etapa incluyó concentrar las perlas al lado del tubo de muestra utilizando un concentrador de partículas magnético (Dynal, Lake Success, NY) y eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta de 1 ml. En la tercera etapa, se sacó el imán y las perlas se resuspendieron en 1 ml de PBS fresco con agitación enérgica durante 20 segundos para sacar con lavado cualquier componente de adherencia no específica. La suspensión de perlas después se transfirió a un nuevo tubo y se repitieron las etapas 2 y 3 una vez más. En la cuarta y última etapa, las perlas se aislaron con el imán seguido de decantación del lavado de tampón para desecho y se resuspendieron las perlas en 500 \mul de agua desionizada. Posteriormente, los complejos perla-E. coli se mezclaron con un título bajo (por debajo del límite de detección del espectrómetro de masa) del bacteriófago MS2 y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 40 minutos. Después se tomó una alícuota de la suspensión y se analizó para determinar la proteína de cápside de MS2 utilizando una preparación de muestra sándwich con una matriz de ácido ferúlico (12,5 mg de ácido ferúlico en 1 ml de 17% de ácido fórmico : 33% de acetonitrilo : 50% de H_{2}O desionizada).
MALDI-TOF MS
Se generaron todos los espectros de masa sobre un espectrómetro de masa por MALDI-TOF Voyager DE STR+ (AB Applied Biosystems, Framingham, MA), operando en el modo lineal positivo. Se utilizaron los siguientes parámetros: voltaje de aceleración 25 kV, voltaje de cuadrícula 92% del voltaje de aceleración, tiempo de retraso de extracción de 350 nanosegundos, y canales iónicos de baja masa fijados en 4 kDa. La intensidad del láser (N_{2}, 337 nm) se fijó justo por encima del umbral de generación iónica y se pulsó cada 300ns. Se adquirieron los espectros de masa de cada muestra acumulando 100 disparos de láser de cinco puntos diferentes de la muestra (espectro final = promedio de 5. x 100 disparos de láser).
Debe apreciarse que para asegurar que la detección del bacteriófago indique que la bacteria diana está presente en la solución líquida, se aplica una concentración de bacteriófago "padre" a la solución líquida que está por debajo del límite de detección para el bacteriófago o marcador biológico para el bacteriófago para espectrometría en masa. Esto asegura que si se detecta el bacteriófago o el marcador biológico para el bacteriófago mediante la técnica de análisis, la concentración detectable del bacteriófago o marcador biológico es atribuible a la progenie de bacteriófago, es decir, el bacteriófago resultante de la réplica del bacteriófago por la bacteria diana presente en la solución líquida. En ciertas situaciones, el uso de dicha concentración de bacteriófago "padre" posee una multiplicidad de infección ("MOI") (es decir, la relación del número de bacteriófago padre y el número de bacteria diana) que es demasiado baja para producir una concentración suficiente de bacteriófagos o marcadores biológicos para el bacteriófago para detección.
Para superar las desventajas asociadas con una baja MOI, se añade una concentración suficientemente alta de bacteriófago "padre" a la solución líquida. En este caso, la concentración del bacteriófago "padre" añadido a la solución puede exceder el límite de detección de cualquier técnica de análisis que se emplee para detectar el bacteriófago o marcador biológico del bacteriófago. En consecuencia, el análisis de una solución líquida tratada de esta manera podría detectar los bacteriófagos "padres" que se añadieron a la solución, en vez del bacteriófago progenie resultante de la réplica por parte de la bacteria diana.
En consecuencia, otra realización del proceso aplica una concentración de bacteriófago "padre" a la solución que sea capaz de ser distinguida de cualquier bacteriófago progenie. El bacteriófago padre (es decir, el bacteriófago inicialmente aplicado a la solución) es "marcado" de manera que la espectrometría de masa sea inherentemente capaz de distinguir el bacteriófago padre o los marcadores biológicos del bacteriófago padre del bacteriófago progenie o marcadores biológicos para el bacteriófago progenie. El bacteriófago padre es "marcado" con una sustancia que altera o cambia el espectro de masa del bacteriófago padre respecto de la progenie del bacteriófago, que no heredará la "marca" del bacteriófago padre. Por ejemplo, se emplea un bacteriófago biotinilado como bacteriófago padre y posee un espectro de masa diferente al de la progenie del bacteriófago producida por el bacteriófago biotinilado que infecta la bacteria diana presente en la solución. Pueden emplearse otras "marcas" para otros tipos de técnicas analíticas.

Claims (9)

1. Un procedimiento para determinar si una bacteria diana está presente en una solución líquida cuando la bacteria diana está en una baja concentración tal que un análisis de espectrometría de masa no proporciona una señal indicativa de la presencia de la bacteria diana en la solución líquida, que compren-
de:
Infectar al menos alguna de cualquier bacteria diana presente en dicha solución líquida con un bacteriófago marcado con una sustancia que altera o cambia el espectro de masa del bacteriófago padre respecto del bacteriófago progenie, y producir un número de bateriófagos no marcados en dicha solución líquida; y
Realizar un espectro de masa sobre dicha solución líquida para determinar la presencia de un cambio en el espectro de masa que sea indicativo de la presencia de dicho bacteriófago no marcado e, indirectamente, de la bacteria diana.
2. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa o infección comprende aplicar una primera cantidad de dicho bacteriófago a dicha solución líquida de manera tal que probablemente haya un alto número de multiplicidad de infección ("MOI").
3. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de realización comprende llevar a cabo un análisis MALDI.
4. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de realización comprende llevar a cabo un análisis MALDI-TOF.
5. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de realización comprende llevar a cabo un análisis de espectrometría de masa de ionización por electropulverización.
6. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende separar dicha bacteria diana de dicha solución líquida.
7. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha etapa de separación comprende utilizar perlas inmunomagnéticas revestidas con anticuerpos para dicha bacteria diana.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho bacteriófago marcado es biotinilado.
9. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 8, que además comprende: separar dicho bacteriófago biotinilado de dicha mezcla.
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