WO2013038022A1 - Procede de caracterisation de bacteries, par detection de proteines non-structurales de bacteriophages - Google Patents

Procede de caracterisation de bacteries, par detection de proteines non-structurales de bacteriophages Download PDF

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WO2013038022A1
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bacteria
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Eric Ezan
Gaspard Gervasi
Mélanie HILLION
Armelle MARTELET
Bruno H. MULLER
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bioMérieux
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Definitions

  • the technical field of the present invention is that of microbiology. More specifically, the present invention relates to a method for characterizing bacteria, by detecting non-structural proteins of bacteriophages.
  • Bacteriophages are bacterial viruses that have several advantages for bacterial detection such as host cell recognition specificity, fast self-replication, long shelf life, low cost, and potential to differentiate viable cells from bacterial cells. not viable (linked to the fact that they are only able to infect metabolically active bacteria). Tailed bacteriophages [Caudoviridae, such as bacteriophage T4), which are the most frequently encountered, show a cycle that results in the lysis of the infected host bacterium. However, certain bacteriophages, such as filamentous bacteriophages [Inoviridae, such as bacteriophage M13) are released by the infected host bacterium without causing lysis. At present, bacterial detection can be performed by different approaches using bacteriophages. They are described in a recent publication (Smartt and Ripp 2011 [1]) and presented succinctly below. The detection of bacteria can be carried out:
  • a phage component capable of recognizing and binding to a defined target bacterium, such as an endolysin binding domain or a caudal fiber protein.
  • Detection tools are marketed under the VIDAS ® UP brand;
  • reporter bacteriophage comprising a reporter gene coding for a bioluminescent (luciferase) or fluorescent (GFP) protein, an enzyme (beta-galactosidase) or an ice nucleation protein (inaW gene); which is expressed only in the host bacteria infected by the bacteriophage reporter;
  • QD Quantum-Dot
  • bacteriophages When bacteriophages are added to a bacteriophage-susceptible bacteriophage host culture, the infection leads to the formation of many neoformed phage particles that are released into the medium. Different methods are used to detect neoformed phage particles.
  • the visualization of lysis plaques on solid culture media in Petri dishes goes through a 4-step protocol: step 1) addition of bacteriophages to the sample and infection of host bacteria if they are present step 2) prior to lysis of the host bacteria following infection, addition of a virucide to inactivate the remaining free bacteriophages in the extracellular medium, step 3) neutralization of the virucide and addition of a population of healthy auxiliary host bacteria (" helper "or” sensor “or” signal-amplifying cells ”) which will be rapidly infected by newly formed bacteriophages resulting from the lysis of the sample, step 4) amplification of the process by infection of the auxiliary bacteria and visualization via the formation of lysis plaques on a bacterial carpet.
  • This method is used by Biotec Laboratories (Ipswich, UK) which markets tests for the detection (FastPlaqueTB TM diagnostic assay) or susceptibility to rifampicin (FastPlaque-Response TM diagnostic assay) of Mycobacterium tuberculosis [4,5,6 ].
  • This technique is complex and its implementation requires the use of at least one virucide. However, the use of this virucide can be problematic because of its non-universal effectiveness.
  • an alternative uses an immuno-magnetic separation step (magnetic beads sensitized with an antibacterial antibody) of the target cells.
  • Immuno-magnetic separation allows the target cells to be concentrated before infection by the bacteriophage and to carry out washes to eliminate bacteriophages remaining free in solution after infection (Favrin et al., 2001 [7]).
  • the same authors use an optical density (OD) reading of the liquid culture of the auxiliary bacteria (decrease of OD in case of lysis by bacteriophages). This new type of test was used for food matrices artificially contaminated with bacteria [Salmonella enteritidis or Escherichia coli 0157: H7] (Favrin et al., 2003 [8]).
  • MicroPhage Inc. [12,13,14] has also developed a series of tests for the identification and susceptibility to antibiotics of Staphylococcus aureus based on rapid immunoassay (strip test) detection of newly formed bacteriophage proteins.
  • WO-A-03/087772 describes the use of tagged bacteriophages (biotinylated capsid protein) for the detection of bacteria.
  • tagged bacteriophages induce a difference in mass between the parent bacteriophages / markers and the newly formed bacteriophages / markers.
  • This marking makes it possible to use a large quantity of parent bacteriophages (improvement of the multiplicity of infection criterion - "Multiplicity of Infection" in English or ME), which favors infection, especially in the case where there is few host bacteria present in the biological sample and thus reduces the limit of detection.
  • Another way to avoid obtaining false positive results due to the detection of a component of the parent bacteriophage is the use of a quantity of parent bacteriophages (intended to target bacterial infection) below the detection limit of the mass spectrometry instrument.
  • the bacteriophages detected by mass spectrometry are necessarily bacteriophages neoformed during the bacterial infection.
  • Such a technique is described in Madonna et al. (2003) [10] and Rees and Voorhees (2005) [11].
  • Madonna et al. (2003) [10] describes a detection method based on the amplification of bacteriophages coupled with MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the bacteriophage used in this study is the MS2 virus, whose genome encodes only four proteins. Its lytic viral cycle generates between 10,000 and 20,000 viral particles neoformed in 40 minutes.
  • the MALI-TOF spectrum of bacteriophage MS2 (stock solution) 1.10 9 PFU (Beach Formant Unit) shows a signal corresponding to bacteriophage MS2 capsid protein.
  • a 1:10 dilution series made it possible to determine the limit of detection of this marker at 1.10 6 PFUs. Therefore, in their infection protocol, the authors use an initial amount of parent bacteriophage of 1.10 5 PFU, which is below the limit of detection of the marker by the MALDI-TOF mass spectrometer.
  • the signal of the phage marker becomes detectable only if the amplification of the bacteriophage has occurred following infection of the host bacterium.
  • the models studied by this team are Escherichia co / z ' / bacteriophage MS2 and Salmonella spp./bacteriophage MPSS-1.
  • the described method allows the detection of 1.10 5 CFU (Colony Forming Unit) / mL of each bacterial species.
  • the objective of the present invention is to propose a method for detecting / characterizing bacteria based on phagic amplification, which is easy to implement and makes it possible to obtain analysis results in times compatible with the needs. analytical laboratories.
  • the present invention relates to a method for characterizing at least one bacterium, present in a sample,
  • said method comprising at least the following steps:
  • characterization is meant the detection and identification of said bacterium (s) and / or the determination of the potential resistance properties of said bacterium (s) to at least one antimicrobial, such as an antibiotic.
  • Bacteriophage capable of being specific to said bacterium (s) to be characterized means:
  • bacteriophage whose nature and / or properties seem to indicate / indicate that the bacteriophage has a specificity of infection relative to said bacterium (s) to be characterized whose presence is possible, envisaged or even suspected.
  • non-structural proteins of bacteriophages is meant the meaning generally attributed to this expression in the relevant technical field, namely proteins which are expressed in the bacterial cell infected during the bacteriophage multiplication cycle (for example protease enzymes, helicase, etc.) but which do not enter into the composition of the viral particle of said bacteriophage. This expression is used as opposed to “structural proteins of bacteriophages", which enter into the composition of the viral particle of mature bacteriophages.
  • nonstructural bacteriophage proteins in the medium is indicative of the infection of the target bacteria by the parent bacteriophage (s), susceptible to to be specific for these, and indirectly for the formation of newly formed bacteriophages during which non-structural proteins of bacteriophages are produced.
  • the non-structural proteins of bacteriophages thus play the role of markers of the infection of the host bacterium of which they indirectly reveal the presence in a sample.
  • the bacteria can thus be characterized according to the type of parent bacteriophage used and its specificity of known infection.
  • the present invention also relates to a method for identifying at least one bacterium present in a sample
  • said method comprising at least the following steps:
  • the present invention further relates to a method for determining the potential antimicrobial resistance properties of at least one bacterium present in a sample, said method comprising at least the following steps:
  • step d) the detection of the presence of non-structural proteins of bacteriophages is carried out via a detection instrument, for example a mass spectrometer, preferably coupled to liquid chromatography, and in step b), the amount of bacteriophage used is greater than or equal to, preferably greater than the detection limit of the detection instrument used, for example at the detection limit of the spectrophotometer of mass.
  • a detection instrument for example a mass spectrometer, preferably coupled to liquid chromatography
  • step b) the amount of bacteriophage used is greater than or equal to, preferably greater than the detection limit of the detection instrument used, for example at the detection limit of the spectrophotometer of mass.
  • This detection limit is a known parameter or, if it is not the case, can be easily determined by those skilled in the art on the basis of routine tests.
  • the bacteriophages are advantageously used "non-labeled", so as not to involve one or more binding labeling steps (for example labeling with a radioactive isotope, also called “isotopic labeling").
  • the process comprises an additional step c ') of lysis of the bacteria.
  • bacteriophages are classified in two categories:
  • Lytic bacteriophages that have the ability to lyse the cells they have infected to release neoformed viral particles, but also non-structural phage proteins in the external environment.
  • Non-lytic bacteriophages that do not cause lysis of host cells during the release of neo-formed virus particles. These particles are extruded from the bacterial membrane, and the non-structural proteins of the bacteriophage are conserved within the bacterial cell.
  • the detection of the presence of non-structural proteins of bacteriophages is carried out by mass spectrometry, preferably by liquid chromatography coupled to mass spectrometry.
  • the mass spectrometry used is MS, MS / MS or MS spectrometry followed by MS / MS type spectrometry.
  • the mass spectrometry is a spectrometry of SRM type (for "Selected Reaction Monitoring” in English, previously designated in the literature under the name “Multiple Reaction Monitoring”, widely known by the acronym M RM, (see Murray et al., 2006 [44]).
  • the detection of the presence of non-structural proteins of bacteriophages can be implemented by a ligand / anti-ligand reaction.
  • ligand / anti-ligand reaction is meant a reaction between two specific binding partners.
  • the ligand / antiligand reaction is an antigen / antibody reaction.
  • the antigen is constituted by a non-structural protein or one or more peptides derived from said protein, against which one or more antibodies have been produced.
  • the antibody (s) is / are conjugated to a marker making it possible to demonstrate the antigen / antibody reaction.
  • the detection of nonstructural proteins can for example be implemented by an ELISA type test (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay in English language) or ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay). More generally, the revelation of the formation of the ligand / anti-ligand complex comprises any means capable of allowing the detection of the ligand / anti-ligand complex. Such means of are known to those skilled in the art and may, by way of example, consist of one or more secondary antibodies (referred to as "detection"), capable of binding to an anti-ligand of the primary antibody type / capture (usually on the constant fragment Fc of the latter). On this (these) secondary antibody (s) are usually covalently attached (or “conjugated”) an easily detected molecule, referred to as a "marker” or "tracer".
  • markers / tracers consists of:
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes,
  • fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanins, radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I.
  • the secondary antibody "conjugate” may be optionally replaced by protein A or protein G conjugated with a marker / tracer (for example with an enzyme).
  • Indirect detection systems well known to those skilled in the art may also be used, such as the following systems: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin.
  • the method according to the invention comprises an additional step c ") of concentration or fractionation of the nonstructural proteins, before the detection step d) .
  • concentration step makes it possible to increase sensitivity of detection, insofar as the proteins are isolated from the complex medium in which the lysis took place.
  • concentration is carried out by means of magnetic beads added to the reaction medium.
  • Such beads may be, for example, those marketed by the company ADEMTECH (France, www.ademtech.com) under the trade name Carboxylic Adembeads.
  • the fractionation can be carried out for example by inserting into the reaction medium antibodies which specifically recognize the non-structural proteins of bacteriophages present in the medium. These antibodies can be attached to magnetic particles, so that they can be removed from the reaction medium by magnetization. It is then possible to recover directly in the reaction medium (supernatant) the soluble proteins to which the nonstructural proteins belong.
  • the method of the invention comprises an additional step b ') of specific capture of the said bacteria or bacteria prior to the infection step c).
  • This specific capture step aims to concentrate the target bacteria and possibly wash them, thus improving the detection limit.
  • Such a specific capture step can thus be performed by immunomagnetic separation (IMS).
  • IMS immunomagnetic separation
  • Another means of specifically capturing the said bacteria or bacteria consists in the use of a phage component as described above (see page 2).
  • the non-structural proteins of bacteriophages are chosen from the bacteriophage T4 proteins r111 and motB, the bacteriophage SPPl GllP protein and the bacteriophage Felix-01 protein GPpl3. Nevertheless, any protein encoded by the genome of bacteriophage T4, SPP1 or Felix-01, but not part of the composition of the corresponding viral particle, can also be used.
  • the identification of said bacterium (s) and / or the determination of the properties of potential resistance of said bacterium (s) to at least one antimicrobial implements at least one peptide of sequence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 or 15.
  • the bacterium (s) characterized by the process according to the invention is / are obtained from a culture medium, preferably a liquid medium.
  • the solution containing said bacteriophage (s) is brought into contact with said bacterium (s) to be characterized in presence of a protease inhibitor, for example in the presence of PEFABLOC® ((Aminoethyl-2) -benzolsulfonylfluoride-4-hydrochloride, CAS No. 30827-99-7).
  • this protease inhibitor is added in order to obtain a final concentration of protease inhibitor of between 0.15 mM and 0.40 mM, preferably between 0.2 mM and 0.3 mM, advantageously of the order of 0.25 mM. (preferably 0.25mM).
  • the use of a protease inhibitor is particularly advantageous in the context of the E. coli B / bacteriophage T4 model (see Example 1 infra).
  • Another subject of the present invention relates to a peptide of sequence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 or 15.
  • the subject of the invention is also an anti-ligand, such as an antibody or an antibody fragment, which specifically binds / is capable of specifically binding to a ligand consisting of a non-structural bacteriophage protein or at least one peptide. specific (preferably proteotypic) of said non-structural protein.
  • said ligand is chosen from:
  • antibody or antibody fragment is meant a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a humanized antibody, a human antibody or a fragment of said antibodies, in particular the Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments. , ScFv, Fv, Fd.
  • the requirement is that said antibodies must be specific for the abovementioned proteins and / or peptides, ie they do not cross-react with other proteins and / or peptides.
  • Another object of the present invention also relates to a kit for implementing the method according to the invention, said kit comprising:
  • a peptide is said to be "specific for a nonstructural bacteriophage protein" when its detection makes it possible to conclude that the nonstructural bacteriophage protein from which it is derived is present. It represents the signature of the latter.
  • the peptide "specific for a nonstructural bacteriophage protein” is a proteotypic peptide, namely whose peptide sequence is found only in a single known protein, in this case in a nonstructural bacteriophage protein. given, and thus serves to identify this protein.
  • the specific detection means comprises:
  • At least one internal standard consisting of at least one non-structural bacteriophage protein or at least one of its specific (preferably proteotypic) peptides derived, said internal standard being labeled, for example by isotopic labeling, said internal standard being specifically adapted for use in a method for detecting the presence of nonstructural bacteriophage proteins by mass spectrometry, and
  • At least one piece of information making it possible to characterize, in mass spectrometry, said at least one nonstructural bacteriophage protein or said at least one of the derived (preferably proteotypic) specific peptides.
  • the information provided consists, for example, in the sequence of the proteotypic peptide or peptides derived from said non-structural protein (s) of bacteriophage and in the nature of the isotopic labeling of the internal standard.
  • the specific detection means is constituted by:
  • At least one anti-ligand such as an antibody or an antibody fragment complementary to a ligand (that is to say capable of binding specifically to this ligand) consisting of at least one non-structural protein bacteriophage or at least one of its specific peptides derived (preferably proteotypic)
  • the means for revealing the formation of the ligand / anti-ligand complex comprises any means capable of allowing the detection of the ligand / anti-ligand complex.
  • Such means of disclosure are well known to those skilled in the art and may, by way of example, consist of one or more secondary antibodies (referred to as “detection” antibodies) capable of binding to an anti-ligand of primary / capture antibody type (generally on the constant fragment Fc of the latter). On this (these) secondary antibody (s) are usually covalently attached (or “conjugated”) an easily detectable molecule, called “marker” or "tracer".
  • detection antibodies secondary antibodies
  • markers an easily detectable molecule
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes,
  • fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanins, radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I.
  • the secondary antibody "conjugate” may be optionally replaced by protein A or protein G conjugated with a marker / tracer (for example with an enzyme).
  • Indirect detection systems well known to those skilled in the art may also be used, such as the following systems: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin.
  • said kit comprises instructions for use indicating in particular the specificity of infection of said bacteriophage (s) and, optionally, the multiplicity of infection recommended when the amount of bacteria to be infected is known.
  • the kit according to the invention advantageously comprises a lysis kit for carrying out step c ') of lysis of the bacteria.
  • said kit comprises at least one non-structural protein concentration means for performing step c "), preferably at least one magnetic means such as magnetic beads.
  • said kit comprises at least one specific capture means, preferably an immunomagnetic separation device (IMS) such as magnetic beads and a magnet.
  • IMS immunomagnetic separation device
  • said at least one non-structural bacteriophage protein is selected from bacteriophage T4 proteins r111 and motB, bacteriophage SPP1 protein G11P and bacteriophage Felix-01 protein GPpl3.
  • Said at least one of the specific (proteotypic) peptides of said non-structural protein is, for its part, advantageously chosen from peptides of sequence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 or 15 .
  • the invention also relates to the use of this kit for implementing the method according to the invention.
  • determining the resistance to at least one antimicrobial is meant determining the resistance of a microorganism to be destroyed by an antimicrobial.
  • the antimicrobial against which it can develop resistance is an antibiotic.
  • the detection of nonstructural bacteriophage proteins constitutes an indirect determination of the resistance of the bacteriophage target bacterium to a particular antibiotic. Indeed, when the bacterium has the mechanisms of resistance to said antibiotic, the presence of said antibiotic has no impact on bacterial growth and does not cause the destruction of bacteria. Bacteriophages are therefore able to infect them.
  • nonstructural proteins during the multiplication of bacteriophages; said non-structural proteins can then be detected by the method according to the invention.
  • the bacteria are sensitive to the antibiotic, they are destroyed by the antibiotic, preventing bacteriophage infection of the bacteria.
  • the sample on which the process of the invention can be implemented is any sample likely to contain a target microorganism.
  • the sample may be of biological origin, whether animal, plant or human. It can then correspond to a biological fluid sample (whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, organic secretion, for example), a tissue sample or isolated cells. This sample can be used as it is, or can undergo prior analysis, enrichment type preparation, extraction, concentration, purification, culture, according to methods known to those skilled in the art.
  • the sample may be of industrial origin, or, according to a non-exhaustive list, an air sample, a water sample, a sample taken from a surface, a part or a manufactured product, a food product.
  • samples of food origin one can non-exhaustively mention a sample of milk product (yogurt, cheese), meat, fish, egg, fruit, vegetable, water, drink (milk, fruit juice, soda, etc.).
  • milk product yogurt, cheese
  • meat, fish, egg, fruit, vegetable, water, drink milk, fruit juice, soda, etc.
  • milk, fruit juice, soda, etc. milk, fruit juice, soda, etc.
  • a food sample may finally be derived from a feed intended for animals, such as in particular animal meal.
  • the sample to be analyzed is preferentially treated beforehand to generate peptides from all the proteins present in the sample in order to fragment these proteins into peptides, for example by digestion with a protein. proteolytic enzyme (protease), or by the action of a chemical reagent.
  • proteolytic enzyme proteolytic enzyme
  • the cleavage of the proteins can be done by a physicochemical treatment, a biological treatment or a combination of the two treatments.
  • treatment with hydroxyl radicals in particular with ⁇ 2 ⁇ 2. Treatment with hydroxyl radicals causes cleavage of the peptide bonds which occurs randomly on any peptide bond of the protein.
  • the concentration of hydroxyl radicals determines the number of cleavages operated and therefore the length of the peptide fragments obtained.
  • Other chemical treatments may also be used such as, for example, cyanogen bromide (CNBr) treatment which specifically cleaves the peptide bonds at the carboxylic group of the methionyl residues. It is also possible to carry out partial acid cleavage at the aspartyl residues by heating at 1000 ° C a solution of proteins in trifluoroacetic acid.
  • proteases Protein treatment by enzymatic digestion is nevertheless preferred over physicochemical treatment because it preserves the structure of proteins more, and is easier to control.
  • enzymatic digestion is meant the simple or combined action of one or more enzymes under appropriate reaction conditions.
  • proteases cut proteins at specific locations. Each protease generally recognizes a sequence of amino acids in which it always performs the same cut. Some proteases recognize a single amino acid or a sequence of two amino acids between which they cleave; other proteases only recognize longer sequences. These proteases may be endoproteases or exoproteases.
  • proteases as described in document WO-A-2005/098071, mention may be made of:
  • thermolysin originating from the bacteria Bacillus thermoproteolyticus which hydrolyzes the peptide bond of the NH 2 group of hydrophobic amino acids (Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe), subtilisin and pronase, which are bacterial proteases which hydrolyze substantially all the bonds and can transform the proteins into oligopeptides under controlled reaction conditions (enzyme concentration and reaction time).
  • proteases can be used simultaneously, if their modes of action are compatible, or they can be used successively.
  • the digestion of the sample is preferably carried out by the action of a protease enzyme, for example trypsin.
  • peptides using a chemical reagent or a protease can be obtained by simple reaction in solution. It can also be implemented with a microwave oven [16], or under pressure [17], or even with an ultrasonic device [18]. In these last three cases, the protocol will be much faster.
  • proteotypic peptides are the ones that will be measured by mass spectrometry.
  • sample containing proteinaceous characterization markers may also be pretreated for purification purposes.
  • this pretreatment purification may be carried out before or after the peptide generation step as described above.
  • the prior purification of sample treatment is widely known to those skilled in the art and may in particular implement centrifugation, filtration, electrophoresis or chromatography techniques. These separative techniques can be used alone or combined with one another to achieve multidimensional separation.
  • multidimensional chromatography can be used by combining ion exchange chromatography separation with reverse phase chromatography, as described by T. Fortin et al. [19], or H. Keshishian et al. [20].
  • the Chromatographic medium may be in column or cartridge (solid phase extraction).
  • the electrophoretic or chromatographic fraction (or the retention time in mono or multidimensional chromatography) of the proteotypic peptides is characteristic of each peptide and the implementation of these techniques therefore makes it possible to select the proteotypic peptide (s) to be assayed.
  • Such a fractionation of the generated peptides makes it possible to increase the specificity and the sensitivity of the subsequent assay by mass spectrometry.
  • the mass spectrometry to be used in the process of the invention is widely known to those skilled in the art as a powerful tool for the analysis and detection of different types of molecules.
  • any type of molecule that can be ionized can be detected as a function of its molecular mass using a mass spectrometer.
  • some mass spectrometry technologies may be more suitable.
  • the mass spectrometry method used for the detection comprises a step of ionization of the target molecule into so-called molecular ions, in this case a step of ionization of the characterization markers, and a step separation of the molecular ions obtained according to their mass.
  • a mass analyzer for separating ionized markers, or molecular ions, as a function of their mass-to-charge ratio (m / z);
  • a detector for measuring the signal produced either directly by the molecular ions, or by ions produced from the molecular ions, as detailed below.
  • the ionization step necessary for the implementation of mass spectrometry can be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • the ionization source makes it possible to bring the molecules to be assayed under a gaseous and ionized state.
  • An ionization source can be used either in positive mode to study positive ions, or in negative mode to study negative ions.
  • EI electron ionization
  • CI chemical ionization
  • DCI chemical desorption ionization
  • ICP inductive plasma coupling
  • MALDI Matrix-assisted laser desorption-ionization
  • SELDI surface
  • DIOS on silicon
  • the ionization can be implemented as follows: the sample containing the target molecules is introduced into an ionization source, where the molecules are ionized in the gaseous state and thus transformed into molecular ions that correspond to the initial molecules .
  • An electrospray ionization source (ESI for ElectroSpray Ionization) makes it possible to ionize a molecule while passing it from a liquid state to a gaseous state.
  • the molecular ions obtained correspond to the molecules present in the liquid state, with positive mode one, two or even three or more additional protons and therefore carry one, two or even three or more charges.
  • an ionization of the proteotypic peptides obtained after fractionation of the target protein leads to gaseous multicharged ions, with one, two or even three or more additional protons and which therefore carry one, two or even three or more charges, and allows a transition from a liquid state to a gaseous state [21].
  • This type of source is particularly well suited when the target molecules or proteotypic peptides obtained are previously separated by reverse phase liquid chromatography. Nevertheless, the ionization efficiency of the molecules present in the sample may vary according to the concentration and nature of the different species present. This phenomenon results in a matrix effect well known to those skilled in the art.
  • a MALDI ionization source will ionize molecules from a solid state sample.
  • the mass analyzer in which is implemented the step of separating the ionized markers according to their mass / charge ratio (m / z) is any mass analyzer known to those skilled in the art.
  • FT-ICR magnetic sector
  • TOF time-of-flight device
  • Orbitrap an Orbitrap
  • the separation of the molecular ions as a function of their m / z ratio can be carried out only once (simple mass spectrometry or MS), or several successive MS separations can be carried out.
  • MS mass spectrometry
  • MS 2 the analysis is called MS / MS or MS 2 .
  • MS 3 the analysis is called MS / MS / MS or MS 3 and more generally, when n successive MS separations are made, the analysis is called MS ".
  • the modes SRM Select Reaction Monitoring
  • MRM Multiple Reaction Monitoring
  • MS 2 separation a particular use of MS 2 separation.
  • MRM mode 3 is a particular use of separation in MS / MS / MS. This is called targeted mass spectrometry.
  • fragmentation of molecular ions so called precursor ions to give so-called ion "fragment ions of the generation era.”
  • fragment ion of first generation it is meant an ion derived from the precursor ion, following a fragmentation step and whose mass-to-charge ratio m / z is different from the precursor ion.
  • the pairs (m / z) i and (m / z) 2 are called transitions and are representative of the characteristic ions to be detected.
  • PeptideAtlas built by F. Desiere et al. [24] to compile all MRM transitions of peptides described by the scientific community.
  • This PeptideAtlas database is available for free access on the internet.
  • databases such as for example that accessible through Cliquid software Applied Biosytems (United States of America).
  • the fragmentation of the selected precursor ions is implemented in a fragmentation cell such as the triple quadrupole type [25], or ion trap type [26], or type of flight time (TOF) [27], which also allow the separation of ions.
  • the fragmentation or fragmentation will be conventionally carried out by collision with an inert gas such as argon or nitrogen, within an electric field, by photoexcitation or photodissociation using an intense light source, collision with electrons or radical species, by applying a potential difference, for example in a flight time tube, or by any other mode of activation.
  • the characteristics of the electric field condition the intensity and the nature of the fragmentation.
  • the electric field applied in the presence of an inert gas conditions the collision energy supplied to the ions.
  • This collision energy will be optimized, by the skilled person, to increase the sensitivity of the transition to be assayed. For example, it is possible to vary the collision energy between 5 and 180 e V in q2 in an AB SCIEX QTRAP® 5500 mass spectrometer from Applied Biosystems (Foster City, United States of America) .
  • the duration of the collision step and the excitation energy within, for example, an ion trap will be optimized by the skilled person, to lead to the most sensitive dosage.
  • excitation time 0.010 and 50 ms and the excitation energy between 0 and 1 (arbitrary unit) in Q3 in an AB SCIEX mass spectrometer.
  • QTRAP® 5500 from Applied Biosystems.
  • the detection of the selected characteristic ions is done in a conventional manner, in particular thanks to a detector and a treatment system.
  • the detector collects ions and produces an electrical signal whose intensity depends on the amount of ions collected.
  • the signal obtained is then amplified so that it can be processed by computer.
  • a computer set of data processing makes it possible to transform the information received by the detector into a mass spectrum.
  • the principle of the SRM mode, or even the MRM mode, is to specifically select a precursor ion, to fragment it, and then to specifically select one of its fragment ions.
  • devices of the triple quadrupole type or triple quadrupole hybrids with ion trap are generally used.
  • the first quadrupole (Ql) makes it possible to filter the molecular ions corresponding to the characteristic proteotypic peptides of the protein to be assayed and obtained during a previous step of digestion, according to their mass-to-charge ratio (m / z). Only the peptides having the mass / charge ratio of the desired proteotypic peptide, called ratio (m / z) i, are transmitted in the second quadrupole (q2) and act as precursor ions for the subsequent fragmentation.
  • the q2 analyzer makes it possible to fragment the peptides of mass / charge ratio (m / z) i into first generation fragment ions. Fragmentation is generally achieved by collision of the precursor peptides with an inert gas, such as nitrogen or argon in q2.
  • the first generation fragment ions are transmitted in a third quadrupole (Q3) which filters the first generation fragment ions according to a mass-to-specific charge ratio called ratio (m / z) 2.
  • Q3 third quadrupole
  • ratio (m / z) 2 Only the first generation fragment ions having the mass / charge ratio of a characteristic fragment of the desired proteotypic peptide (m / z) 2 are transmitted in the detector to be detected or even quantified.
  • Mass spectrometry in SRM or MRM mode is therefore advantageous for quantification.
  • the mass spectrometry implemented in the method of the invention is a tandem mass spectrometry (MS 2 , MS 3 , MS 4 or MS 5 )
  • several mass analyzers can be coupled together.
  • a first analyzer separates the ions
  • a collision cell makes it possible to fragment the ions
  • a second analyzer separates the fragment ions.
  • Some analyzers, such as ion traps or FT-ICR, are several analyzers in one and can fragment the ions and analyze the fragments directly.
  • the identification can be carried out directly from the sample in which the identification is carried out, or the microorganisms contained in the sample can be cultivated by methods well known to those skilled in the art with culture and optimum culture conditions adapted according to the species of microorganisms to be sought, as described by Murray PR et al. in Manual of Clinical Microbiology, 2007, 9th Edition, Vol. I, Section III, Chapter 14, and in particular in Vol. I, Section IV, Chapter 21 for bacteria, Vol. II, Section VI, Chapter 81 for viruses, Vol. II, Section VIII, Chapter 117 for yeast, and Vol. II, Section X, Chapter 134 for protozoa.
  • the identification may also be carried out by mass spectrometry, according to the techniques described above, preferably by MS, by MS / MS, or by MS followed by MS / MS type spectrometry, which constitutes a mode of measurement.
  • the sample may be subjected beforehand to a culture step such as an agar seeding.
  • an identification method by MS is advantageous because it can be achieved in a few minutes and requires a mass spectrometer with a single analyzer, ie a less complex instrument than a spectrometer. tandem mass used in MS / MS.
  • MS identification method followed by MS / MS type spectrometry is also advantageous. It makes it possible to ascertain the identity of the ions observed in MS, which increases the specificity of the analysis.
  • MRM type MS / MS identification method has the advantage of being more sensitive and simpler than the traditional MS and MS / MS approaches. This method requires neither high-performance software to process the information between the acquisition of the MS spectrum and the MS / MS spectrum, nor change the setting of the machine parameters to link MS and then MS / MS spectra.
  • the MS identification method can be implemented with a raw sample electrospray source, as described by S. Vaidyanathan et al. [31] or by R. Everley et al. [32] after chromatographic separation. Different ranges of m / z then make it possible to identify the microorganisms.
  • S. Vaidyanathan et al. used a window between 200 and 2000 Th and R. Everley et al. a window between 620 and 2450 Th.
  • Mass spectra can also be deconvolved to access the mass of proteins regardless of their state of charge.
  • R. Everley et al. thus exploited the masses between about 5,000 and 50,000 Da.
  • the MS identification method can also be implemented using a MALDI-TOF, as described by Claydon et al [33] and T. Krishnamurthy and P. Ross [34].
  • the analysis combines the acquisition of a mass spectrum and the interpretation of an expert software. It is extremely simple and can be done in minutes. This identification process is currently spreading in medical analysis laboratories [35].
  • the current intensity detected is used, which is proportional to the amount of target molecule.
  • the current intensity thus measured may be used as a quantitative measure to determine the quantity of target molecule present, which is characterized by its expression in units of the International System (SI) of type mol / m 3 or kg / m 3 , or by the multiples or sub-multiples of these units, or by the usual derivatives of the SI units, including their multiples or submultiples.
  • SI International System
  • units such as ng / ml or fmol / 1 are units characterizing a quantitative measurement.
  • MRM assays are typically calibrated using external standards or, preferably, using internal standards as described by T. Fortin et al. [19].
  • the target molecule is a proteotypic peptide, which makes it possible to assay a protein of interest
  • the correlation between the quantitative measurement and the quantity of target proteotypic peptide, and subsequently of the protein of interest is obtained by calibrating the signal measured with respect to a standard signal for which the quantity to be determined is known.
  • Calibration can be performed by means of a calibration curve, for example obtained by successive injections of standard prototypic peptide at different concentrations (external calibration), or preferentially by internal calibration using a heavy peptide, as standard internal, for example according to the AQUA, QconCAT or PSAQ methods detailed below.
  • “heavy peptide” is meant a peptide corresponding to the proteotypic peptide, but in which one or more carbon atoms 12 ( 12 C) is (are) replaced by carbon 13 ( 13 C), and / or a or more nitrogen atoms 14 ( 14 N) is (are) replaced by nitrogen ( 15 N).
  • AQUA heavy peptides
  • the principle is to artificially synthesize proteotypic peptides with amino acids with heavier isotopes than the usual natural isotopes.
  • amino acids are obtained, for example, by replacing some of the carbon atoms 12 ( 12 C) with carbon 13 ( 13 C), or by replacing some of the nitrogen atoms 14 ( 14 N) with nitrogen ( 15 N).
  • the artificial peptide (AQUA) thus synthesized has the same physicochemical properties as the natural peptide (with the exception of a higher mass).
  • the sample upstream of the mass spectroscopy assay, for example between the treatment resulting in the cleavage of the proteins of the sample of interest and the fractionation of the peptides obtained after the analysis. treatment stage.
  • the AQUA peptide is co-purified with the natural peptide to be assayed, during the fractionation of the peptides.
  • the two peptides are therefore injected simultaneously into the mass spectrometer for the assay. They then undergo the same ionization yields in the source.
  • a variant of the AQUA technique has been proposed by J.-M. Pratt et al. [39] under the name of QconCat. This variant is also described in the patent application WO 2006/128492. It consists of concatenating different AQUA peptides and producing the artificial polypeptide as a heavy recombinant protein. The recombinant protein is synthesized with amino acids having heavy isotopes. In this way, it is possible to obtain a standard for calibrating the simultaneous determination of several proteins at a lower cost.
  • the QconCAT standard is added from the beginning, upstream of the treatment leading to the cleavage of the proteins and before the steps of protein fractionation, denaturation, reduction and then blocking of the thiol functions of the proteins, if these are present.
  • the QconCAT standard therefore undergoes the same treatment cycle leading to cleavage of proteins as the natural protein, allowing for the performance of the protein-cleaving processing step. Indeed, the treatment, in particular by digestion, of the natural protein may not be complete. In this case the use of an AQUA standard would underestimate the amount of natural protein. For an absolute dosage, it may therefore be important to consider processing efficiencies that lead to protein cleavage.
  • V. Brun et al. [40] showed that sometimes the QconQAT standards did not exactly reproduce the processing efficiency, particularly by digestion of the natural protein, probably because of a different three-dimensional conformation of the QconCAT protein.
  • the internal standard is a recombinant protein, having the same sequence as the natural protein but synthesized with heavy amino acids. The synthesis is carried out ex-vivo with heavy amino acids.
  • This standard has the exact same physicochemical properties as the natural protein (except for a higher mass). It is added from the beginning, before the protein fractionation step, when the latter is present. It is therefore co-purified with the native protein during the protein fractionation step. It has the same processing yield, especially by digestion, as the native protein.
  • the heavy peptide obtained after cleavage is also co-purified with the natural peptide, if a peptide fractionation step is performed.
  • the two peptides are therefore injected simultaneously into the mass spectrometer, for quantitative determination. They then undergo the same ionization yields in the source.
  • the comparison of the peak areas of the natural peptides and the reference peptides in the PSAQ method makes it possible to calculate the concentration of the protein to be assayed taking into account all the steps of the assay procedure.
  • the bacterial characterization method implements at least one specific bacteriophage of the bacterium to be characterized (identification and / or properties of potential resistance to one or more antimicrobials).
  • the characterization of Escherichia coli B can be carried out using bacteriophage T4.
  • the characterization of Escherichia coli B can be carried out by detection of T4 phage r111 and motB proteins, which are nonstructural proteins.
  • the characterization of Escherichia coli B can implement the complete protein of the following sequence SEQ ID NO: 1:
  • the characterization of Escherichia coli B can implement the complete protein of sequence SEQ ID NO: 4 below:
  • At least one peptide is meant at least one, at least two, at least three, at least four, at least five, at least 6 or more representative peptides of the marker to be detected.
  • at least two or even at least three or even at least four peptides per characteristic will be used.
  • the protein markers of the infection were identified by centrifuging the infected bacteria not yet lysed. Indeed, during the stages of the viral cycle that precede lysis, the phage proteins are all concentrated within the host bacterium. The bacterial pellet is then chemically lysed (ethanol / formic acid protocol, adapted from Freiwald and Sauer (2009) [41]). After analysis by liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry (LC-MS) (Orbitrap type), protein markers of the infection of E. coli. coli B by bacteriophage T4 could be identified: structural and nonstructural proteins.
  • LC-MS liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry
  • the eluate leaving the chromatographic column is directly injected into the electrospray ionization source (ESI) of the LTQ Orbitrap Discovery type spectrometer (Thermo Fisher Scientific).
  • ESI electrospray ionization source
  • LTQ Orbitrap Discovery type spectrometer Thermo Fisher Scientific
  • Electrospray Source (ESI)
  • Nebulizing gas 35 (arbitrary unit)
  • Auxiliary gas 20 (arbitrary unit) - Scan type: Sweep depends on acquisition data
  • Scan event 2 Smart scan with MS / MS of the most intense ions (repeated for the three most intense)
  • Infection of host bacteria by bacteriophages is carried out in liquid medium (LB medium) with a multiplicity of infection equal to 0.01 (ie a ratio of the number of bacteriophages to the number of bacteria equal to 0.01, ie 1 bacteriophage per 100 bacteria).
  • the incubation is carried out for 2 h at 37 ° C. with stirring at 220 rpm.
  • the infection is carried out in the presence of a protease inhibitor (pefabloc at 0.25mM) in order to keep intact nonstructural proteins in the lysis supernatant.
  • a short centrifugation at 12000 g eliminates cell debris and recover the lysis supernatant.
  • these nonstructural proteins are concentrated on magnetic carboxylic beads (Carboxyl-Adembeads, Ademtech).
  • a first step of conditioning the beads is carried out in order to deprotonate the carboxylic groups, and thus to obtain COO groups for the cation exchange, more specifically for positively charged proteins.
  • the sample is loaded onto the cation exchange beads.
  • the positively charged proteins are captured, then washed, and finally eluted at acidic pH (pH to reprotonate the carboxylic groups).
  • Fractionation The digestate obtained is fractionated on a 10kDa membrane by centrifugation (Nanosep 10KDa, Pall Corporation). The filtrate, containing the proteotypic peptides, is then analyzed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry in MRM mode.
  • Solvent A H 2 0 - 0.1% formic acid
  • Solvent B ACN - 0.1% formic acid
  • the eluate leaving the chromatographic column is directly injected into the ionization source of the TSQ Quantum Ultra type mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific).
  • the peptides, resulting from the digestion of proteins previously isolated on magnetic beads, are then analyzed by the mass spectrometer in MRM mode. Only the peptides indicated in the following table are detected. For this, the fragments (from a CID type collision) indicated in Table 6 below, are detected.
  • T4 bacteriophages From a liquid culture of E. coli B in exponential growth phase, add T4 bacteriophages with a multiplicity of infection equal to 0.01 in the presence of a protease inhibitor (pefabloc at 0.25 mM final).
  • TSG buffer (0.01M Tris-HCl pH7.5 / 150 mM NaCl / 0.03% gelatin).
  • Example 1.1 When the non-structural protein capture protocol described in Example 1.1 is applied to this stock solution of bacteriophage (storage time at 4 ° C. greater than 1 year), no signal is detected for the proteins r111 and motB (transitions 1 to 8), as shown in Table 8.
  • nonstructural markers abent from the bacteriophage stock solution
  • bacterial species X / non-structural protein (s) of a bacteriophage Y may be considered according to the needs of the user.
  • Bacillus subtilis / bacteriophage SPPl model is described below under the heading "Example 2”.
  • EXAMPLE 2 Characterization of Bacillus subtilis via the Detection of a Non-Structural Protein of the SPPl Bacteriophage (Bacillus subtilis / SPPl bacteriophage model) 2.1 identification of a nonstructural protein (GllP protein) as a marker of bacterial infection.
  • GllP protein nonstructural protein
  • the bacteriophage SPP1 belongs to the order of the Caudovirales and more particularly to the family Siphoviridae. This lytic bacteriophage infects the gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
  • the markers of the infection were identified by a proteomic study carried out at different times post-infection of Bacillus subtilis by the bacteriophage SPP1, in order to follow the evolution of the expression of the proteins during the infection.
  • the infected bacteria not yet lysed have been centrifuged. Indeed, during the viral cycle during the steps preceding lysis, the phage proteins are concentrated within the host bacterium. The bacterial pellet is then chemically lysed (ethanol / formic acid protocol, adapted from Freiwald and Sauer (2009) [41].
  • the eluate leaving the chromatographic column is directly injected into the electrospray ionization source (ESI) of the LTQ Orbitrap Discovery type spectrometer (Thermo Fisher Scientific).
  • ESI electrospray ionization source
  • LTQ Orbitrap Discovery type spectrometer Thermo Fisher Scientific
  • Electrospray Source (ESI)
  • Nebulizing gas 35 (arbitrary unit)
  • Auxiliary gas 20 (arbitrary unit) - Scan type: Sweep depends on acquisition data
  • Scan event 2 Smart scan with MS / MS of the most intense ions (repeated for the three most intense)
  • Phage proteins were identified in a kinetic study of Bacillus subtilis infection (5 to 25 min post-infection) by bacteriophage SPP1.
  • nonstructural proteins Of these thirty-nine phage proteins, several are nonstructural proteins.
  • GllP protein described as being expressed in a very large amount in the host bacterium, without being present in the infectious viral particle [42] [43]
  • This intermediate is a pro-capsid, composed of 3 structural proteins (G6P, G13P and G7P) and non-structural protein GllP.
  • the following examples relate to this non-structural protein GllP.
  • the sequence of the GllP protein (uniprot accession number # Q38580), referenced as SEQ ID NO: 7, is as follows:
  • the tryptic digestates prepared according to Example 2.2 were analyzed to determine if the non-structural proteins of SPP1 are detected therein.
  • the samples were analyzed by high performance liquid chromatography-coupled mass spectrometry (LC-MS) (Orbitrap) using the same parameters as those presented in Example 2.1.
  • LC-MS high performance liquid chromatography-coupled mass spectrometry
  • GllP protein (24kDa) having a molecular weight greater than 20 kDa is not directly detectable as whole protein with the instrumentation used.
  • tryptic digestate analyzes showed the presence of two proteotypic peptides, revealing the presence of the GllP protein in the lysis supernatant, namely the peptides: GADLGGLPTK (SEQ ID NO: 8), and
  • a bacteriophage SPPl stock solution (purified by cesium chloride gradient) was analyzed as described in steps 5 to 15 of Example 2.2. by LC-MS. The same parameters of liquid chromatography and mass spectrometry as those presented in Example 2.1 were used. No signal corresponding to the G11P protein (and in particular to the two proteotypic peptides of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9) was detected.
  • structural proteins could be detected, as expected, via the detection of two proteotypic peptides of the G6P structural protein, namely:
  • VSGDGGVDTLR SEQ ID NO: ° 10
  • MOI multiplicity of infection
  • Example 3 Characterization of Salmonella enterica serovar Typhimurium via the detection of a nonstructural protein of bacteriophage Felix-01 (model Salmonella typhimurium / bacteriophage Felix-01) 3.1 Identification of a nonstructural protein (the GPpl3 protein, called lysozyme) as a marker for bacterial infection.
  • a nonstructural protein the GPpl3 protein, called lysozyme
  • the bacteriophage Felix-01 belongs to the order of the Caudovirales and more particularly to the Myoviridae family. This lytic bacteriophage infects Gram-negative Salmonella bacteria [45]. Protein markers for bacterial infection with Felix-01 were identified by centrifuging infected bacteria not yet lysed, at the stage of the viral cycle at which the phage proteins are concentrated within the host bacterium, and by lysing the bacterial pellet chemically ( ethanol / formic acid protocol, adapted from Freiwald and Sauer (2009) [41] to release proteins, after a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) high-resolution analysis (Orbitrap), and Using information on the sequenced and partially annotated genome of bacteriophage Felix-01 [46], marker proteins of Salmonella enterica serovar Typhimurium infection by bacteriophage Felix-01 could be identified.
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • the eluate leaving the chromatographic column is directly injected into the electrospray ionization source (ESI) of the LTQ Orbitrap Discovery type spectrometer (Thermo Fisher Scientific).
  • ESI electrospray ionization source
  • LTQ Orbitrap Discovery type spectrometer Thermo Fisher Scientific
  • Electrospray Source (ESI)
  • Nebulizing gas 35 (arbitrary unit)
  • Auxiliary gas 20 (arbitrary unit) - Scan type: Sweep depends on acquisition data
  • Scan event 2 Smart scan with MS / MS of the most intense ions (repeated for the three most intense)
  • the sequence of the GPp13 protein (Uniprot accession number # Q6KGN3, NCBI # gi38707815), referenced as SEQ ID NO: 12, is as follows:
  • RapiGest TM surfactant at 5% and 5 ⁇ of dithiothreitol at 15.4 mg / mL. Incubate 10 min at 95 ° C. with stirring at 500 rpm (Thermomixer Eppendorf).
  • the tryptic digests prepared according to Example 3.2 were analyzed to determine if non-structural proteins of Felix-01 are detected therein.
  • the samples were analyzed by high resolution liquid chromatography-coupled mass spectrometry (LC-MS) (Orbitrap) using the same parameters as those presented in Example 3.1.
  • LC-MS liquid chromatography-coupled mass spectrometry
  • the GPp13 protein (17 kDa) having a molecular mass close to 20 kDa is not directly detectable as an entire protein with the instrumentation used.
  • the tryptic digestate analyzes showed the presence of three proteotypic peptides, revealing the presence of the GPpl3 protein in the lysis supernatant, namely the peptides:
  • Example 3.4 A Felix-01 bacteriophage stock solution prepared as described in Example 3.4 was analyzed as described in Steps 5 to 15 of Example 3.2. by LC-MS. The same parameters of liquid chromatography and mass spectrometry as those presented in Example 3.1 were used. No signal corresponding to GPp13 protein (and particularly to the three proteotypic peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15) was detected.
  • the SalmoneUa enterica serovar Typhimurium bacterium can be detected using non-structural markers of bacteriophage Felix-01, in the case of the three proteotypic peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ sequences. ID NO: 15 of the GPpl3 protein.
  • parental bacteriophage concentrations higher than the detection limit of the instrument can be used, without requiring prior labeling of said parent bacteriophages for the detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium bacteria.
  • MOI multiplicity of infection

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de caractérisation d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou des bactérie(s) à caractériser; b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) à caractériser et, éventuellement, au moins un antimicrobien; c)Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries; d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non-structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries; la présence desdites protéines non-structurales permettant de caractériser ladite ou lesdites bactérie(s).

Description

Procédé de caractérisation de bactéries, par détection de protéines non-structurales de bactériophages
Le domaine technique de la présente invention est celui de la microbiologie. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de caractérisation de bactéries, par détection de protéines non-structurales de bactériophages.
Il existe de nos jours de nombreuses méthodes pour détecter et identifier les microorganismes et en particulier les bactéries.
Parmi ces méthodes, les méthodes classiques de détection et d'identification bactérienne sont basées sur l'utilisation de milieux de cultures. Elles nécessitent une culture de plusieurs heures (12 à 24 heures), afin d'obtenir une quantité de bactéries nécessaire pour pouvoir mettre en œuvre les analyses complémentaires, généralement basées sur le métabolisme des bactéries.
Les méthodes de biologie moléculaire, basées sur l'amplification des acides nucléiques bactériens, sont aujourd'hui largement utilisées. Elles sont plus rapides et peuvent fournir des résultats en moins de 5 heures sans culture préalable ; en revanche, elles induisent de nombreux faux-positifs et nécessitent alors une étape de culture pour confirmer les résultats.
Des méthodes alternatives basées sur l'utilisation des bactériophages (ou phages) ont également été développées, particulièrement en ce qui concerne la détection de faibles concentrations de bactéries in fine dans des milieux liquides.
Les bactériophages sont des virus bactériens qui présentent plusieurs intérêts pour la détection bactérienne tels que la spécificité de reconnaissance de leur cellule hôte, leur auto- réplication rapide, leur longue durée de conservation, leur faible coût, et leur potentiel à différencier les cellules viables des non viables (lié au fait qu'ils ne sont capables d'infecter que des bactéries métaboliquement actives). Les bactériophages à queue [Caudoviridae, tels que le bactériophage T4), qui sont les plus fréquemment rencontrés, présentent un cycle qui aboutit à la lyse de la bactérie hôte infectée. Cependant certains bactériophages, tels que les bactériophages filamenteux [Inoviridae, tel que le bactériophage M13) sont relargués par la bactérie hôte infectée sans provoquer de lyse. À l'heure actuelle, la détection bactérienne peut être réalisée par différentes approches utilisant des bactériophages. Elles sont décrites dans une récente publication (Smartt and Ripp 2011 [1]) et présentées succinctement ci- dessous. La détection des bactéries peut être réalisée :
• à l'aide d'un composant phagique capable de reconnaître et de se lier à une bactérie cible définie, tel qu'un domaine de liaison d'endolysines ou une protéine de fibre caudale. Des outils de détection sont commercialisés sous la marque VIDAS® UP;
• via l'ADN phagique marqué par un colorant fluorescent ;
• à l'aide d'un bactériophage rapporteur, comportant un gène rapporteur— codant pour une protéine bioluminescente (luciférase) ou fluorescente (GFP), une enzyme (bêta-galactosidase) ou une protéine de nucléation de la glace (gène inaW)— qui n'est exprimé qu'au sein des bactéries hôtes infectées par le bactériophage rapporteur ;
• à l'aide d'un bactériophage rapporteur marqué par un Quantum-Dot (QD) colloïdal, qui est une sonde fluorescente consistant en des nanocristaux inorganiques semiconducteurs ; le marquage des bactériophages nécessite de les modifier génétiquement afin qu'ils expriment une protéine de capside fusionnée à un peptide qui est biotinylé in vivo pour interagir avec un QD fonctionnalisé à l'aide de streptavidine (Edgar et al. 2006 [2] ; Yim et al. 2009 [3]) ;
• via des signaux liés à la lyse de la bactérie hôte consécutive à l'infection phagique, tels que des constituants intracellulaires de l'hôte (enzyme adenylate kinase) ou des ions relargués au moment de la lyse ;
• à l'aide d'une amplification phagique, tel que décrit de manière plus détaillée ci- dessous.
Lorsque des bactériophages sont ajoutés à une culture de bactéries hôtes susceptibles aux bactériophages, l'infection conduit à la formation de nombreuses particules phagiques néoformées qui sont relarguées dans le milieu. Différentes méthodes sont utilisées pour détecter les particules phagiques néoformées. Parmi elles, la visualisation de plages de lyse sur milieux de culture solides en boite de Pétri (phage amplification assay) passe par un protocole en 4 étapes : étape 1) ajout des bactériophages à l'échantillon et infection de bactéries hôtes si elles sont présentes, étape 2) avant lyse des bactéries hôtes consécutive à l'infection, ajout d'un virucide pour inactiver les bactériophages restés libres dans le milieu extracellulaire, étape 3) neutralisation du virucide et ajout d'une population de bactéries hôtes saines auxiliaires (« helper » ou « sensor » ou « signal-amplifying cells ») qui seront rapidement infectées par les bactériophages néoformés issus de la lyse des bactéries de l'échantillon, étape 4) amplification du processus par infection des bactéries auxiliaires et visualisation via la formation de plages de lyse sur un tapis bactérien. Cette méthode est utilisée par la société Biotec Laboratories (Ipswich, UK) qui commercialise des tests pour la détection (FastPlaqueTB™ diagnostic assay) ou la susceptibilité à la rifampicine (FastPlaque-Response™ diagnostic assay) de Mycobacterium tuberculosis [4,5,6]. Cette technique est complexe et sa mise en œuvre requiert l'emploi d'au moins un virucide. Or, l'utilisation de ce virucide peut s'avérer problématique à cause de son efficacité non- universelle.
Afin d'éviter l'emploi d'un tel virucide (étape 2), une alternative utilise une étape de séparation immuno-magnétique (billes magnétiques sensibilisées avec un anticorps antibactérie) des cellules cibles. La séparation immuno-magnétique permet de concentrer les cellules cibles avant leur infection par le bactériophage et de réaliser des lavages pour éliminer les bactériophages restés libres en solution après l'infection (Favrin et al. 2001 [7]). Comme alternative à la visualisation des plages de lyse (étape 4), les mêmes auteurs utilisent une lecture de densité optique (DO) de la culture liquide des bactéries auxiliaires (diminution de la DO en cas de lyse par les bactériophages). Ce nouveau type de test a été utilisé pour des matrices alimentaires artificiellement contaminées par des bactéries [Salmonella enteritidis ou Escherichia coli 0157:H7) (Favrin et al. 2003 [8]).
D'autres adaptations des tests fondés sur l'amplification phagique ont été décrites en détectant non plus les particules phagiques entières, mais des constituants du bactériophage tels que l'ADN génomique ou les protéines structurales. Sergueev et al. (2010) [9] ont décrit le suivi de l'augmentation des particules phagiques néoformées par PCR quantitative en temps réel à l'aide d'amorces ciblant le génome du bactériophage. Madonna et al. (2003) [10] ont décrit l'identification de la protéine de capside du bactériophage MS2 par spectrométrie de masse MALDI-TOF pour la détection d'E. coli. De plus, Rees et Voorhees (2005) [11] ont décrit la détection simultanée par MALDI-TOF d'E. coli et Salmonella en suivant les signatures protéiques spécifiques (protéines de capside) de leurs bactériophages respectifs. MicroPhage Inc. [12,13,14] a également développé une série de tests pour l'identification et la susceptibilité aux antibiotiques de Staphylococcus aureus reposant sur la détection rapide par immunoessais (test bandelette) des protéines de bactériophages néoformés.
Ces dernières techniques d'analyse par spectrométrie de masse présentent néanmoins des inconvénients. En effet, afin de ne pas induire de faux-positifs pour les méthodes de détection couplant l'amplification phagique et la spectrométrie de masse, il est nécessaire de pouvoir distinguer les bactériophages injectés pour initier l'infection bactérienne (bactériophages parents) de ceux qui sont produits (bactériophages néoformés) par l'infection de la bactérie cible.
Ainsi, le document WO-A-03/087772 décrit l'utilisation de bactériophages taggués (protéine de capside biotinylée) pour la détection de bactéries. Ces bactériophages taggués induisent une différence de masse entre les bactériophages/marqueurs parents et les bactériophages/marqueurs néoformés. Ce marquage permet d'utiliser une quantité importante de bactériophages parents (amélioration du critère de multiplicité d'infection - « Multiplicity of Infection » en langue anglaise ou MOI), ce qui favorise l'infection, en particulier dans le cas où il y a peu de bactéries hôtes présentes dans l'échantillon biologique et permet donc de diminuer la limite de détection.
Par ailleurs, Pierce et al. (2011) [15] décrit l'utilisation d'une solution de bactériophages marqués à l'isotope stable 15N pour initier l'infection bactérienne (phages parents) ; le marquage de ces phages a été préalablement obtenu en les faisant croître dans un milieu ne contenant que l'isotope stable 15N. L'infection de la bactérie cible se fait dans un milieu de culture classique composé de 14N et chaque bactérie infectée produit des particules virales constituées de protéine comportant du 14N. Par conséquent, il est possible de distinguer les bactériophages parents, dont les protéines sont marquées au 15N, des bactériophages néoformés, dont les protéines contiennent du 14N.
Si ces techniques permettent effectivement d'éviter les résultats faux-positifs du fait de la différentiation entre la population de bactériophages utilisée pour l'infection (bactériophages parents) et celle de bactériophages néoformés, elles présentent pour autant des inconvénients liés à la nécessité de passer par l'étape de marquage préalable de la population de bactériophages parents, qui est souvent lourde à mettre en œuvre.
Un autre moyen permettant d'éviter d'obtenir des résultats faussement positifs dus à la détection d'un composant du bactériophage parent (par exemple une protéine structurale de ce dernier) consiste en l'utilisation d'une quantité de bactériophages parents (destinés à l'infection des bactéries cibles) inférieure à la limite de détection de l'instrument de spectrométrie de masse. Ainsi, lors de l'analyse, les bactériophages détectés par spectrométrie de masse sont forcément les bactériophages néoformés lors de l'infection bactérienne. Une telle technique est décrite dans les publications Madonna ét al. (2003) [10] et Rees et Voorhees (2005) [11]. Madonna et al. (2003) [10] décrit une méthode de détection basée sur l'amplification de bactériophages couplée à la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Leur méthodologie comprend trois étapes : 1) Concentration des bactéries par séparation immuno-magnétique, 2) Infection des bactéries isolées par un bactériophage lytique, 3) Détection du signal dû à l'amplification des bactériophages par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Le bactériophage utilisé dans cette étude est le virus MS2, dont le génome code pour seulement quatre protéines. Son cycle viral lytique génère entre 10 000 et 20 000 particules virales néoformées en 40 minutes. Le spectre MALDI-TOF de 1.109 UFP (Unité Formant Plage) de bactériophage MS2 (solution stock) montre un signal correspondant à la protéine de capside du bactériophage MS2. Une série de dilution au 1:10 a permis de déterminer la limite de détection de ce marqueur à 1.106 UFP. Par conséquent, dans leur protocole d'infection, les auteurs utilisent une quantité initiale de bactériophage parents de 1.105 UFP, qui est inférieure à la limite de détection du marqueur par le spectromètre de masse MALDI- TOF. Ainsi, le signal du marqueur phagique ne devient détectable que si l'amplification du bactériophage a eu lieu suite à l'infection de la bactérie hôte.
Rees et Voorhees (2005) [11] décrivent une méthode de détection basée également sur l'amplification de bactériophages couplée à la spectrométrie de masse MALDI-TOF. À la différence de Madonna et al. (2003) [10], cette méthode ne comprend pas de séparation immuno-magnétique des bactéries en amont de l'infection par le bactériophage et ne s'avère pas particulièrement sensible. En revanche, elle permet de détecter simultanément la présence de deux espèces bactériennes présentes dans un même échantillon grâce à l'amplification de deux bactériophages, chacun spécifique d'une des deux espèces. Les signaux correspondants aux protéines majoritaires de capsides des deux bactériophages sont détectés par MALDI-TOF. La présence de plusieurs espèces de bactéries et bactériophages n'induit pas d'effets particuliers sur la détection des marqueurs.
Les modèles étudiés par cette équipe sont Escherichia co/z'/bactériophage MS2 et Salmonella spp./bactériophage MPSS-1. La méthode décrite permet la détection de 1.105UFC (Unité Formant Colonie) /mL de chaque espèce bactérienne.
Dans ce contexte, l'objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détection/caractérisation de bactéries basée sur une amplification phagique, facile à mettre en œuvre et permettant d'obtenir des résultats d'analyse dans des temps compatibles avec les besoins des laboratoires d'analyse. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de caractérisation d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon,
ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou des bactérie(s) à caractériser ;
b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) à caractériser et, éventuellement (notamment lorsque l'on souhaite déterminer les propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s)), au moins un antimicrobien ;
c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ;
d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non- structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de caractériser ladite ou lesdites bactérie(s).
Par caractérisation, on entend la détection et l'identification de ladite ou des bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien, tel qu'un antibiotique.
Par « bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) à caractériser », l'on entend :
- un bactériophage connu pour infecter ladite ou lesdites bactéries à caractériser dont la présence est possible, envisagée voire suspectée, ou
un bactériophage dont la nature et/ou les propriétés semblent indiquer/indiquent que le bactériophage possède une spécificité d'infection par rapport à ladite ou auxdites bactérie(s) à caractériser dont la présence est possible, envisagée voire suspectée.
Par « protéines non-structurales de bactériophages », l'on entend le sens généralement attribué à cette expression dans le domaine technique concerné, à savoir des protéines qui sont exprimées dans la cellule bactérienne infectée durant le cycle de multiplication du bactériophage (par exemple des enzymes de type protéase, hélicase, etc.) mais qui n'entrent pas dans la composition de la particule virale dudit bactériophage. Cette expression est employée par opposition aux « protéines structurales de bactériophages », lesquelles entrent dans la composition de la particule virale des bactériophages matures. La présence de protéines non-structurales de bactériophages dans le milieu (généralement détectées après la lyse des bactéries) est révélatrice de l'infection des bactéries cibles par le(s) bactériophage(s) parent(s), susceptible(s) d'être spécifique(s) de ces dernières, et indirectement de la formation de bactériophages néoformés au cours de laquelle les protéines non-structurales de bactériophages sont produites. Les protéines non- structurales de bactériophages jouent ainsi le rôle de marqueurs de l'infection de la bactérie hôte dont elles révèlent indirectement la présence dans un échantillon. Les bactéries peuvent ainsi être caractérisées en fonction du type de bactériophage parent utilisé et de sa spécificité d'infection connue. Ceci permet d'éviter des résultats faussement positifs liés à la détection des bactériophages parents en l'absence d'infection (faux-positifs induits par la non-différentiation/confusion entre les bactériophages parents et les bactériophages néoformés lorsqu'on détecte les protéines structurales de bactériophages), en particulier lorsque la concentration en bactériophages parents est importante (supérieure à la limite de détection de l'instrument de détection), et ce sans avoir à marquer ces derniers au préalable.
Divers modèles [espèce bactérienne X/protéine(s) non-structurale(s) d'un bactériophage Y spécifique de l'espèce bactérienne X] peuvent être envisagés en fonction des besoins de l'utilisateur.
La présente invention concerne également un procédé d'identification d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon
ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) à identifier ;
b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) à identifier ;
c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ;
d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non- structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de confirmer l'identification de ladite ou desdites bactérie(s). La présente invention concerne en outre un procédé de détermination des propriétés de résistance potentielle à un antimicrobien, d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) dont les propriétés de résistance potentielle à un antimicrobien doivent être déterminées;
b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) et au moins un antimicrobien ;
c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ;
d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non- structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de déterminer des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) audit au moins un antimicrobien.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, à l'étape d), la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages s'effectue via un instrument de détection, par exemple un spectromètre de masse, de préférence couplé à la chromatographie liquide, et, à l'étape b), la quantité de bactériophages utilisée est supérieure ou égale, de préférence supérieure, à la limite de détection de l'instrument de détection utilisé, par exemple à la limite de détection du spectromètre de masse. Cette limite de détection est un paramètre connu ou, si tel n'est pas le cas, peut être aisément déterminée par l'homme du métier sur la base de tests de routine.
Les bactériophages sont avantageusement utilisés «non-marqués », afin de ne pas impliquer une ou plusieurs étapes contraignantes de marquage (par exemple marquage par un isotope radioactif, également dénommé « marquage isotopique »).
Selon un mode particulier de l'invention, le procédé comporte une étape supplémentaire c') de lyse des bactéries. En effet, les bactériophages sont classés en deux catégories :
• Les bactériophages lytiques qui ont la capacité de lyser les cellules qu'ils ont infectées pour permettre la libération des particules virales néoformées, mais également des protéines phagiques non-structurales, dans l'environnement extérieur.
• Les bactériophages non-lytiques qui n'engendrent pas de lyse des cellules hôtes, lors de la libération des particules virales néo-formées. Ces particules sortent par extrusion de la membrane bactérienne, et les protéines non-structurales du bactériophage sont conservées au sein de la cellule bactérienne.
Dans le cas de cette seconde population, il est donc nécessaire de prévoir dans le procédé selon l'invention, une étape de lyse des bactéries hôtes après un temps nécessaire à l'infection et à la production des nouvelles particules virales, afin de libérer les protéines non-structurales dans l'environnement extérieur et permettre leur détection subséquente.
De façon préférentielle, la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages est mise en œuvre par spectrométrie de masse, de préférence par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse.
La spectrométrie de masse utilisée est une spectrométrie de type MS, MS/MS ou MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS.
Avantageusement, la spectrométrie de masse est une spectrométrie de type SRM (pour « Selected Reaction Monitoring » en langue anglaise, précédemment désignée dans la littérature sous la dénomination « Multiple Reaction Monitoring », largement connue sous l'acronyme M RM , (cf. Murray et al. 2006 [44]).
Selon un mode de réalisation alternatif, la détection de la présence de protéines non- structurales de bactériophages peut être mise en œuvre par une réaction ligand/anti-ligand. Par réaction ligand/anti-ligand, l'on entend une réaction entre deux partenaires de liaison spécifiques. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, la réaction ligand/anti- ligand est une réaction antigène/anticorps. L'antigène est ici constitué par une protéine non-structurale ou un ou plusieurs peptides issus de ladite protéine, contre lesquels auront été produits un ou des anticorps. Avantageusement, le ou les anticorps est/sont conjugué(s) à un marqueur permettant de mettre en évidence la réaction antigène/anticorps. Ces techniques de détection dites immunoessais sont bien connus du biologiste et depuis de nombreuses années. La détection des protéines non-structurales peut par exemple être mise en œuvre par un test de type ELISA (« Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay » en langue anglaise) ou ELFA (« Enzyme-Linked Fluorescent Assay » en langue anglaise). Plus généralement, la révélation de la formation du complexe ligand/anti-ligand comprend tout moyen apte à permettre la détection du complexe ligand/anti-ligand. De tels moyens de révélation sont bien connus de l'homme du métier et peuvent, à titre d'exemple, consister en un ou plusieurs anticorps secondaires (dit(s) « de détection »), susceptibles de se lier à un anti-ligand de type anticorps primaire/de capture (généralement sur le fragment constant Fc de ce dernier). Sur ce(s) anticorps secondaire(s) sont généralement fixés de façon covalente (ou « conjugués ») une molécule facile à détectée, dénommée « marqueur » ou « traceur ».
Une liste non-limitative de ces marqueurs /traceurs consiste en :
les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I.
L'anticorps secondaire « conjugué » peut être éventuellement remplacé par la protéine A ou la protéine G conjuguée avec un marqueur/traceur (par exemple avec une enzyme).
Des systèmes indirects de détection bien connus de l'homme du métier peuvent également être utilisés, comme par exemple les systèmes suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou WO-A-95/08000.
Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera, le cas échéant, des réactifs permettant la visualisation du marquage.
Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire c") de concentration ou de fractionnement des protéines non- structurales, avant l'étape de détection d). Une telle étape de concentration permet d'augmenter la sensibilité de détection, dans la mesure où les protéines sont isolées du milieu complexe dans lequel a eu lieu la lyse. Avantageusement, la concentration est réalisée au moyen de billes magnétiques ajoutées au milieu réactionnel. Des telles billes peuvent être à titre d'exemple, celles commercialisées par la société ADEMTECH (France, www.ademtech.com) sous la dénomination commerciale Carboxylic Adembeads.
Le fractionnement peut être par exemple réalisé en insérant dans le milieu réactionnel des anticorps qui reconnaissent spécifiquement les protéines non-structurales de bactériophages présentes dans le milieu. Ces anticorps peuvent être fixés sur des particules magnétiques, de sorte qu'ils peuvent être éliminés du milieu réactionnel par aimantation. Il est alors possible de récupérer directement dans le milieu réactionnel (surnageant), les protéines solubles dont font partie les protéines non-structurales.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comporte une étape supplémentaire b') de capture spécifique de la ou desdites bactéries préalablement à l'étape d'infection c). Cette étape de capture spécifique a pour but de concentrer les bactéries cibles et éventuellement de les laver, améliorant ainsi la limite de détection. Une telle étape de capture spécifique peut ainsi être réalisée par séparation immuno-magnétique (IMS). Une telle technique de séparation est notamment décrite dans le document WO-A-03/087772.
Un autre moyen permettant de capturer spécifiquement la ou lesdites bactéries consiste dans l'utilisation d'un composant phagique tel que décrit supra (cf. page 2).
Selon un autre mode particulier du procédé selon l'invention, les protéines non- structurales de bactériophages sont choisies parmi les protéines rlll et motB du bactériophage T4, la protéine GllP du bactériophage SPPl et la protéine GPpl3 du bactériophage Felix-01. Néanmoins, toute protéine codée par le génome du bactériophage T4, SPPl ou Felix-01, mais n'entrant pas dans la composition de la particule virale correspondante, peut également être utilisée.
Selon un autre mode particulier du procédé selon l'invention, l'identification de ladite ou des bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien, met en œuvre au moins un peptide de séquence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
Avantageusement, la ou les bactérie(s) caractérisée(s) par le procédé selon l'invention, est/sont obtenue(s) à partir d'un milieu de culture, préférentiellement liquide.
Selon un mode de réalisation particulier, la solution contenant ledit ou lesdits bactériophages est mise en contact avec ladite ou lesdites bactérie(s) à caractériser en présence d'un inhibiteur de protéase, par exemple en présence de PEFABLOC® ((Aminoéthyl-2)-benzolsulfonylfluorure-4 hydrochlorure ; n° CAS : 30827-99-7). De préférence, cet inhibiteur de protéase est ajouté afin d'obtenir une concentration finale en inhibiteur de protéase comprise entre 0,15mM et 0,40mM, de préférence entre 0,2mM et 0,3mM, avantageusement de l'ordre de 0,25mM (de préférence 0,25mM). L'emploi d'un inhibiteur de protéase s'avère particulièrement avantageux dans le cadre du modèle E.coli B / bactériophage T4 (cf. exemple 1 infra).
Un autre objet de la présente invention concerne un peptide de séquence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
L'invention a également pour objet un anti-ligand, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps, se liant spécifiquement/capable de se lier spécifiquement à un ligand consistant en une protéine non-structurale de bactériophages ou au moins un peptide spécifique (de préférence protéotypique) de ladite protéine non-structurale. De préférence, ledit ligand est choisi parmi:
une protéine choisi parmi les protéines rlll et motB du bactériophage T4, la protéine G11P du bactériophage SPP1 et la protéine GPpl3 du bactériophage Felix-01 et/ou un peptide de séquence SEQ ID NO : 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
Par « anticorps ou fragment d'anticorps», l'on entend un anticorps polyclonal, un anticorps monoclonal, un anticorps humanisé, un anticorps humain ou un fragment desdits anticorps, en particulier les fragments Fab, Fab', F(ab')2, ScFv, Fv, Fd. La condition requise est que lesdits anticorps doivent être spécifiques des protéines et/ou peptides susvisés, c'est à dire qu'ils ne présentent pas de réactions croisées avec d'autres protéines et/ou peptides.
Un autre objet de la présente invention concerne également un kit permettant de mettre en œuvre le procédé selon l'invention, ledit kit comprenant :
au moins une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) à caractériser et
au moins un moyen de détection spécifique d'au moins une protéine non- structurale de bactériophages ou d'au moins un peptide spécifique (de préférence protéotypique) de ladite au moins une protéine non-structurale.
Un peptide est dit « spécifique d'une protéine non-structurale de bactériophage » lorsque sa détection permet de conclure à la présence de la protéine non-structurale de bactériophage dont il est issu. Il représente la signature de cette dernière. Avantageusement, le peptide « spécifique d'une protéine non-structurale de bactériophage » est un peptide protéotypique, à savoir dont la séquence peptidique n'est trouvée que dans une seule protéine connue, en l'espèce dans une protéine non-structurale de bactériophage donnée, et sert ainsi pour identifier cette protéine.
Selon un premier mode de réalisation, le moyen de détection spécifique comprend :
- au moins un standard interne consistant en au moins une protéine non-structurale de bactériophages ou au moins l'un de ses peptides spécifiques (de préférence protéotypiques) dérivés, ledit standard interne étant marqué, par exemple par marquage isotopique, ledit standard interne étant spécifiquement adapté à une utilisation dans une méthode de détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages par spectrométrie de masse, et
- au moins une information permettant de caractériser en spectrométrie de masse ladite au moins une protéine non-structurale de bactériophages ou ledit au moins un des peptides spécifiques dérivés (de préférence protéotypiques).
Dans le cas d'une analyse en spectrométrie de masse de type SRM, l'information fournie consiste, par exemple, en la séquence du ou des peptides protéotypiques dérivés de ladite ou desdites protéine(s) non-structurale(s) de bactériophages et dans la nature du marquage isotopique du standard interne.
Selon un deuxième mode de réalisation, le moyen de détection spécifique est constitué par :
- au moins un anti-ligand, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps complémentaire d'un ligand (c'est-à-dire capable de se lier spécifiquement à ce ligand) consistant en au moins une protéine non-structurale de bactériophages ou au moins l'un de ses peptides spécifiques dérivés (de préférence protéotypiques)
- au moins un moyen de révélation de la formation du complexe ligand/anti-ligand. Le moyen de révélation de la formation du complexe ligand/anti-ligand comprend tout moyen apte à permettre la détection du complexe ligand/anti-ligand. De tels moyens de révélation sont bien connus de l'homme du métier et peuvent, à titre d'exemple, consister en un ou plusieurs anticorps secondaires (dit(s) « de détection »), susceptibles de se lier à un anti-ligand de type anticorps primaire/de capture (généralement sur le fragment constant Fc de ce dernier). Sur ce(s) anticorps secondaire(s) sont généralement fixés de façon covalente (ou « conjugués ») une molécule facile à détecter, dénommée « marqueur » ou « traceur ». Une liste non-limitative de ces marqueurs /traceurs consiste en :
les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I.
L'anticorps secondaire « conjugué » peut être éventuellement remplacé par la protéine A ou la protéine G conjuguée avec un marqueur/traceur (par exemple avec une enzyme).
Des systèmes indirects de détection bien connus de l'homme du métier peuvent également être utilisés, comme par exemple les systèmes suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou WO-A-95/08000.
Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera, le cas échéant, des réactifs permettant la visualisation du marquage.
De préférence, ledit kit comprend des instructions d'utilisation indiquant notamment la spécificité d'infection dudit ou desdits bactériophage(s) et, éventuellement, la multiplicité d'infection recommandée lorsque la quantité de bactéries à infecter est connue.
Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le bactériophage utilisé est du type non- lytique, le kit selon l'invention comprend avantageusement un nécessaire de lyse pour réaliser l'étape c') de lyse des bactéries.
Avantageusement, ledit kit comprend au moins un moyen de concentration des protéines non-structurales pour réaliser l'étape c"), de préférence au moins un moyen magnétique tel que des billes magnétiques.
De préférence, ledit kit comporte au moins un moyen de capture spécifique, de préférence un moyen de séparation immuno-magnétique (IMS) tel que des billes magnétiques et un aimant. De préférence, ladite au moins une protéine non-structurale de bactériophages est choisie parmi les protéines rlll et motB du bactériophage T4, la protéine G11P du bactériophage SPPl et la protéine GPpl3 du bactériophage Felix-01. Ledit au moins un des peptides spécifiques (protéotypiques) de ladite protéine non-structurale est, quant à lui, avantageusement choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
L'invention concerne également l'utilisation de ce kit pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Par détermination de la résistance à au moins un antimicrobien, l'on entend la détermination de la résistance d'un microorganisme à être détruit par un antimicrobien. Ainsi, si le microorganisme est une bactérie, l'antimicrobien contre lequel il peut développer une résistance est un antibiotique. Dans le procédé selon l'invention, la détection des protéines non-structurales de bactériophages constitue une détermination indirecte de la résistance de la bactérie cible du bactériophage à un antibiotique particulier. En effet, lorsque la bactérie possède les mécanismes de résistance audit antibiotique, la présence dudit antibiotique n'a aucune incidence sur la croissance bactérienne et n'entraîne pas la destruction des bactéries. Les bactériophages sont donc en mesure d'infecter ces dernières. Il s'ensuit donc une production des protéines non-structurales lors de la multiplication des bactériophages ; les dites protéines non-structurales pouvant alors être détectées par le procédé selon l'invention. A contrario, lorsque les bactéries sont sensibles à l'antibiotique, elles sont détruites par ce dernier, empêchant l'infection des bactéries par le bactériophage.
L'échantillon sur lequel le procédé de l'invention peut être mis en œuvre est tout échantillon susceptible de contenir un microorganisme cible. L'échantillon peut être d'origine biologique, soit animale, végétale ou humaine. Il peut alors correspondre à un prélèvement de fluide biologique (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo- rachidien, sécrétion organique, par exemple), un prélèvement tissulaire ou des cellules isolées. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel, ou peut subir préalablement à l'analyse, une préparation de type enrichissement, extraction, concentration, purification, culture, selon des méthodes connues de l'homme du métier.
L'échantillon peut être d'origine industrielle, soit, selon une liste non exhaustive un prélèvement d'air, un prélèvement d'eau, un prélèvement effectué sur une surface, une pièce ou un produit manufacturé, un produit d'origine alimentaire. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produit lacté (yaourts, fromages), de viande, de poisson, d'œuf, de fruit, de légume, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment des farines animales.
En amont de la détection par spectrométrie de masse, l'échantillon à analyser est préférentiellement traité au préalable pour générer des peptides à partir de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon pour fragmenter ces protéines en peptides, par exemple par digestion avec une enzyme protéolytique (protéase), ou par action d'un réactif chimique. En effet, le clivage des protéines peut être fait par un traitement physico- chimique, par un traitement biologique ou par une combinaison des deux traitements. Parmi les traitements utilisables, on peut citer le traitement par des radicaux hydroxyle, notamment avec de Η2Ο2. Le traitement par les radicaux hydroxyle provoque une coupure des liaisons peptidiques qui se fait de manière aléatoire sur n'importe quelle liaison peptidique de la protéine. La concentration en radicaux hydroxyle conditionne le nombre de clivages opérés et donc la longueur des fragments peptidiques obtenus. D'autres traitements chimiques peuvent également être utilisés comme, par exemple, le traitement au bromure de cyanogène (CNBr) qui scinde spécifiquement les liaisons peptidiques au niveau du groupe carboxylique des résidus méthionyle. Il est également possible de réaliser un clivage acide partiel au niveau des résidus aspartyle par chauffage à 1000°C d'une solution de protéines dans de l'acide trifluoroacétique.
Le traitement des protéines par digestion enzymatique est néanmoins préféré par rapport au traitement physico-chimique car il préserve davantage la structure des protéines, et est plus facile à contrôler. Par « digestion enzymatique », l'on entend l'action simple ou combinée d'une ou de plusieurs enzymes dans des conditions de réaction appropriées. Les enzymes effectuant la protéolyse, appelées protéases, coupent les protéines à des endroits spécifiques. Chaque protéase reconnaît généralement une séquence d'acides aminés au sein desquels elle effectue toujours la même coupure. Certaines protéases reconnaissent un seul acide aminé ou une séquence de deux acides aminés entre lesquels elles opèrent un clivage, d'autres protéases ne reconnaissent que des séquences plus longues. Ces protéases peuvent être des endoprotéases ou des exoprotéases. Parmi les protéases connues l'on peut citer, comme décrit dans le document WO-A-2005/098071 :
- les enzymes spécifiques comme la trypsine qui scinde la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus Arg et Lys, l'endolysine qui clive la liaison peptidique du groupe -CO des lysines, la chymotrypsine qui hydrolyse la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la pepsine qui coupe au niveau du groupe NH2 des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la protéase V8 de la souche V8 de Staphylococcus aureus qui clive la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique du résidu Glu ;
- les enzymes non-spécifiques comme la thermolysine provenant de la bactérie Bacillus thermoproteolyticus qui hydrolyse la liaison peptidique du groupe NH2 des acides aminés hydrophobes (Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe), la subtilisine et la pronase qui sont des protéases bactériennes qui hydrolysent pratiquement toutes les liaisons et peuvent transformer les protéines en oligopeptides dans des conditions de réaction contrôlées (concentration en enzyme et durée de réaction).
Plusieurs protéases peuvent être utilisées de façon simultanée, si leurs modes d'action sont compatibles, ou elles peuvent être utilisées de façon successive. Dans le cadre de l'invention, la digestion de l'échantillon est, de préférence, réalisée par action d'une enzyme protéase, par exemple la trypsine.
La génération de peptides à l'aide d'un réactif chimique ou d'une protéase, peut être obtenue par simple réaction en solution. Elle peut également être mise en œuvre avec un four à micro-ondes [16], ou sous pression [17], ou bien encore avec un dispositif à ultrasons [18]. Dans ces trois derniers cas, le protocole sera beaucoup plus rapide.
Parmi les peptides ainsi obtenus, les peptides spécifiques de la protéine, sont nommés peptides protéotypiques. Ce sont eux qui seront dosés par spectrométrie de masse.
De même, l'échantillon contenant des marqueurs de caractérisation d'origine protéique peut également être préalablement traité à des fins de purification. Lorsque les marqueurs sont d'origine protéique, ce traitement préalable de purification peut être mis en œuvre avant ou après l'étape de génération de peptides tels que décrits précédemment.
Le traitement préalable de purification d'échantillon est largement connu de l'homme du métier et pourra notamment mettre en œuvre des techniques de centrifugation, de filtration, d'électrophorèse ou de chromatographie. Ces techniques séparatives peuvent être utilisées seules ou combinées entre elles pour obtenir une séparation multidimensionnelle. Par exemple, une chromatographie multidimensionnelle peut être utilisée en associant une séparation par chromatographie d'échange d'ions à une chromatographie en phase inverse, comme décrit par T. Fortin et al. [19], ou H. Keshishian et al. [20]. Dans ces publications, le milieu chromatographique peut être en colonne ou en cartouche (extraction en phase solide).
La fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des peptides protéotypiques est caractéristique de chaque peptide et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner le ou les peptides protéotypiques à doser. Un tel fractionnement des peptides générés permet d'accroître la spécificité et la sensibilité du dosage ultérieur par spectrométrie de masse.
La spectrométrie de masse à mettre en œuvre dans le procédé de l'invention est largement connue de l'homme du métier comme un outil puissant pour l'analyse et la détection de différents types de molécules. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisée peut être détecté en fonction de sa masse moléculaire à l'aide d'un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à détecter, d'origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la détection, cette dernière comprend une étape d'ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires, dans le cas présent une étape d'ionisation des marqueurs de caractérisation, et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse.
Tous les spectromètres de masse comportent donc :
i) une source d'ionisation destinée à ioniser les marqueurs présents dans l'échantillon à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces marqueurs ;
ii) un analyseur de masse destiné à séparer les marqueurs ionisés, ou ions moléculaires, en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ;
iii) un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci- après.
L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer, notamment :
- l'ionisation électronique (El), l'ionisation chimique (CI) et la désorption- ionisation chimique (DCI)
- le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions
(SIMS, LSIMS)
- le couplage plasma inductif (ICP)
- l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI)
- l'électronébulisation ou électrospray (ESI)
- la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS)
- l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART)
Notamment, l'ionisation peut être mise en œuvre comme suit : l'échantillon contenant les molécules cibles est introduit dans une source d'ionisation, où les molécules sont ionisées à l'état gazeux et ainsi transformées en ions moléculaires qui correspondent aux molécules initiales. Une source d'ionisation de type électrospray (ESI pour ElectroSpray Ionisation) permet d'ioniser une molécule tout en la faisant passer d'un état liquide à un état gazeux. Les ions moléculaires obtenus correspondent alors aux molécules présentes à l'état liquide, avec en mode positif un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Par exemple, lorsque la molécule cible est une protéine, une ionisation des peptides protéotypiques obtenus après fractionnement de la protéine cible, grâce à une source de type électrospray fonctionnant en mode positif, conduit à des ions multichargés à l'état gazeux, avec un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et qui sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus, et permet un passage d'un état liquide à un état gazeux [21]. Ce type de source est particulièrement bien adapté, lorsque les molécules cibles ou peptides protéotypiques obtenus sont préalablement séparées par chromatographie liquide en phase inverse. Néanmoins, le rendement d'ionisation des molécules présentes dans l'échantillon peut varier en fonction de la concentration et de la nature des différentes espèces en présence. Ce phénomène se traduit par un effet matrice bien connu de l'homme de l'art.
Une source d'ionisation MALDI permettra d'ioniser des molécules, à partir d'un échantillon à l'état solide. L'analyseur de masse dans lequel est mis en œuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment un secteur magnétique (FT-ICR) un appareil à temps de vol (TOF) ou un Orbitrap.
La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en œuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS3 et plus généralement, lorsque n séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS".
Parmi les techniques mettant en œuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM (Selected Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage d'une seule molécule cible, ou bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, sont des utilisations particulières de séparation MS2. De même le mode MRM3 est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS. On parle alors de spectrométrie de masse ciblée.
Dans le cas d'une détection en mode MS simple, c'est le rapport masse/charge des ions moléculaires obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter.
Dans le cas d'une détection en mode MS/MS, essentiellement deux étapes sont ajoutées, par rapport à un dosage MS qui sont :
i) une fragmentation des ions moléculaires, alors appelés ions précurseurs, pour donner des ions dits « ions fragments de lère génération », et
ii) une séparation des ions dits « ions fragments de lère génération » en fonction de leur masse (m/z)2, le rapport (m/z)i correspondant au rapport (m/z) des ions précurseurs.
C'est alors le rapport masse/charge des ions fragments de lère génération ainsi obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Par ion fragment de première génération, l'on entend un ion issu de l'ion précurseur, suite à une étape de fragmentation et dont le rapport masse sur charge m/z est différent de l'ion précurseur. Les couples (m/z)i et (m/z)2 sont baptisés transitions et sont représentatifs des ions caractéristiques à détecter.
Le choix des ions caractéristiques qui sont détectés pour être corrélés à la molécule cible est effectué par l'homme du métier selon les méthodes standards. Leur sélection conduira avantageusement aux dosages les plus sensibles, les plus spécifiques et les plus robustes possibles, en termes de reproductibilité et fiabilité. Dans les méthodes développées pour la sélection de peptides protéotypiques (m/z)i, et de fragment de première génération (m/z)2, le choix est essentiellement basé sur l'intensité de la réponse. Pour plus de détails, on pourra se référer à V. Fusaro et al. [22]. Des logiciels commerciaux, tels que les logiciels MIDAS et MRM Pilote d'Applied Biosytems ou encore MRMaid [23] pourront être utilisés par l'homme de l'art pour lui permettre de prédire tous les couples de transitions possibles. Il pourra également être fait appel à une base de données nommée PeptideAtlas, construite par F. Desiere et al. [24] pour compiler l'ensemble des transitions MRM de peptides décrites par la communauté scientifique. Cette base PeptideAtlas est disponible en accès libre sur internet. Pour des molécules non protéiques, il est également possible d'utiliser des bases de données, telles que par exemple celle accessible au travers du logiciel Cliquid de la société Applied Biosytems (Etats Unis d'Amérique).
La fragmentation des ions précurseurs sélectionnés est mise en œuvre dans une cellule de fragmentation telle que les modèles de type triple quadripôle [25], ou de type trappe ionique [26], ou encore de type temps de vol (TOF) [27], lesquels permettent également la séparation des ions. La ou les fragmentations seront classiquement réalisées par collision avec un gaz inerte tel que l'argon ou l'azote, au sein d'un champ électrique, par photo-excitation ou photodissociation à l'aide d'une source lumineuse intense, collision avec des électrons ou espèces radicalaires, par application d'une différence de potentiel, par exemple dans un tube de temps de vol, ou par tout autre mode d'activation. Les caractéristiques du champ électrique conditionnent l'intensité et la nature de la fragmentation. Ainsi, le champ électrique appliqué en présence d'un gaz inerte, par exemple dans un quadripôle, conditionne l'énergie de collision apportée aux ions. Cette énergie de collision sera optimisée, par l'homme du métier, pour accroître la sensibilité de la transition à doser. A titre d'exemple, il est possible de faire varier l'énergie de collision entre 5 et 180 e V en q2 dans un spectromètre de masse AB SCIEX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems (Foster City, Etats Unis d'Amérique). De même, la durée de l'étape de collision et l'énergie d'excitation au sein, par exemple, d'une trappe ionique seront optimisées, par l'homme du métier, pour conduire au dosage le plus sensible. A titre d'exemple, il est possible de faire varier cette durée, baptisée temps d'excitation, entre 0,010 et 50 ms et l'énergie d'excitation entre 0 et 1 (unité arbitraire) en Q3 dans un spectromètre de masse AB SCIEX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems.
Enfin, la détection des ions caractéristiques sélectionnés se fait de façon classique, notamment grâce à un détecteur et à un système de traitement. Le détecteur collecte les ions et produit un signal électrique dont l'intensité dépend de la quantité d'ions collectée. Le signal obtenu est ensuite amplifié pour qu'il puisse être traité informatiquement. Un ensemble informatique de traitement des données permet de transformer les informations reçues par le détecteur en spectre de masse.
Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôle à trappe ionique sont généralement utilisés.
Dans le cas d'un dispositif triple quadripôle (Qlq2Q3) utilisé en mode MS2, en vue du dosage ou de la détection d'une protéine cible, le premier quadripôle (Ql) permet de filtrer les ions moléculaires, correspondant aux peptides protéotypiques caractéristiques de la protéine à doser et obtenus lors d'une étape antérieure de digestion, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Seuls les peptides ayant le ratio masse/charge du peptide protéotypique recherché, ratio appelé (m/z)i, sont transmis dans le deuxième quadripôle (q2) et jouent le rôle d'ions précurseurs pour la fragmentation ultérieure. L'analyseur q2 permet de fragmenter les peptides de ratio masse/charge (m/z)i en ions fragments de première génération. La fragmentation est généralement obtenue par collision des peptides précurseurs avec un gaz inerte, comme de l'azote ou de l'argon dans q2. Les ions fragments de première génération sont transmis dans un troisième quadripôle (Q3) qui filtre les ions fragments de première génération en fonction d'un ratio masse sur charge spécifique, ratio appelé (m/z)2. Seuls les ions fragments de première génération ayant le ratio masse/charge d'un fragment caractéristique du peptide protéotypique recherché (m/z)2 sont transmis dans le détecteur pour être détectés, voire quantifiés.
Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, en relation avec la sélection de l'ion précurseur d'une part et de la sélection de l'ion fragment de première génération d'autre part. La spectrométrie de masse en mode SRM ou MRM est donc avantageuse pour la quantification. Lorsque la spectrométrie de masse mise en œuvre dans le procédé de l'invention est une spectrométrie de masse en tandem (MS2, MS3, MS4 ou MS5), plusieurs analyseurs de masse peuvent être couplés entre eux. Par exemple, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.
L'identification peut être mise en œuvre directement à partir de l'échantillon dans lequel on effectue l'identification, ou bien les microorganismes contenus dans l'échantillon peuvent être cultivés par des méthodes bien connues de l'homme du métier avec des milieux de culture et des conditions de culture optimales adaptées en fonction des espèces de microorganismes à rechercher, comme décrit par Murray P.R. et al. dans Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9ème édition, Vol. I, Section III, chapitre 14, et en particulier dans le Vol. I, Section IV, chapitre 21 pour les bactéries, Vol. II, Section VI, chapitre 81 pour les virus, Vol. II, Section VIII, chapitre 117 pour les levures, et Vol. II, Section X, chapitre 134 pour les protozoaires.
Au lieu de cultiver les microorganismes, ces derniers peuvent être concentrés par capture directement dans l'échantillon au moyen de surfaces actives. Un tel procédé a été décrit par W.-J. Chen et al. [16] qui ont capturé différentes espèces bactériennes à l'aide de billes magnétiques avec une surface activée au FesC /TiC . Une capture par d'autres moyens est également possible, telle qu'une capture par des lectines [28], ou par des anticorps [29], ou encore par de la Vancomycine [30]. La capture permet de concentrer les microorganismes et ainsi de réduire ou même de supprimer l'étape de culture. Il s'en suit un gain de temps considérable.
L'identification peut également être mise en œuvre par spectrométrie de masse, selon les techniques décrites précédemment, de préférence par MS, par MS/MS, ou bien par MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS, ce qui constitue un mode de réalisation de l'invention. Dans ce cas également, l'échantillon peut être soumis préalablement à une étape de culture telle qu'un ensemencement sur gélose.
L'utilisation d'un procédé d'identification par MS est avantageux car il peut être réalisé en quelques minutes et qu'il nécessite un spectromètre de masse avec un seul analyseur, c'est à dire un instrument moins complexe qu'un spectromètre de masse en tandem utilisé en MS/MS. L'utilisation d'un procédé d'identification par MS suivi d'une spectrométrie de type MS/MS est également avantageuse. Elle permet de s'assurer de l'identité des ions observés en MS, ce qui augmente la spécificité de l'analyse.
L'utilisation d'un procédé d'identification par MS/MS de type MRM présente l'avantage d'être plus sensible et plus simple que les approches MS puis MS/MS traditionnelle. Ce procédé ne nécessite ni logiciel performant pour traiter l'information entre l'acquisition du spectre MS et du spectre MS/MS, ni changement du réglage des paramètres machines pour enchaîner des spectres MS puis MS/MS.
Le procédé d'identification par MS peut être mis en œuvre avec une source électrospray sur échantillon brut, comme décrit par S. Vaidyanathan et al. [31] ou encore par R. Everley et al. [32] après séparation chromatographique. Différentes gammes de m/z permettent alors d'identifier les microorganismes. S. Vaidyanathan et al. ont utilisé une fenêtre entre 200 et 2000 Th et R. Everley et al. une fenêtre entre 620 et 2450 Th. Les spectres de masse peuvent également être déconvolués pour accéder à la masse des protéines indépendamment de leur état de charge. R. Everley et al. ont ainsi exploité les masses entre environ 5 000 et 50 000 Da. De façon alternative, le procédé d'identification par MS peut être également mis en œuvre à l'aide d'un MALDI-TOF, comme décrit par Claydon et al [33] et T. Krishnamurthy et P. Ross [34]. L'analyse associe l'acquisition d'un spectre de masse et l'interprétation d'un logiciel expert. Elle est extrêmement simple et peut être effectuée en quelques minutes. Ce procédé d'identification se répand actuellement dans les laboratoires d'analyse médicale [35].
L'identification de bactéries par MS puis MS/MS via leurs protéines présentes dans l'échantillon, a été largement appliquée par de nombreuses équipes. A titre d'exemple, il est possible de citer les travaux récents de Mânes N. et al. [36] qui ont étudié le peptidome de Salmonelle enterica, ou les travaux de R. Nandakumar et al. [37] ou de L. Hernychova et al.
[38] qui ont étudié le protéome de bactéries après digestion des protéines avec de la trypsine. L'approche classique consiste à i) acquérir un spectre MS, ii) sélectionner successivement chaque ion précurseur observé sur le spectre MS avec un signal intense, iii) fragmenter successivement chaque ion précurseur et acquérir son spectre MS/MS, iv) interroger des bases de données protéiques telles que SWISS-PROT ou NCBI, aux travers de logiciels tels que Mascot (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni), BioworksBrowser (Thermo Fisher Scientific) ou SEQUEST (Thermo Scientific, Waltham, Etats-Unis d'Amérique), pour identifier le peptide ayant une forte probabilité de correspondre au spectre MS/MS observé. Cette méthode peut conduire à l'identification d'un microorganisme si une protéine ou un peptide caractéristique de l'espèce est identifié.
Un des avantages de l'utilisation de la spectrométrie de masse réside en ce qu'elle est particulièrement utile pour quantifier des molécules, dans le cas présent les marqueurs des propriétés de typage, résistance à au moins un antimicrobien. Pour ce faire, on utilise l'intensité de courant détectée, laquelle est proportionnelle à la quantité de molécule cible. L'intensité de courant ainsi mesurée pourra servir de mesure quantitative permettant de déterminer la quantité de molécule cible présente, laquelle est caractérisée par son expression en unités du Système International (SI) de type mol/m3 ou kg/m3, ou par les multiples ou sous-multiples de ces unités, ou par les dérivées usuelles des unités SI, y compris leurs multiples ou sous-multiples. A titre d'exemple non limitatif, les unités telles que ng/ml ou fmol/1 sont des unités caractérisant une mesure quantitative.
Un calibrage est néanmoins nécessaire pour pouvoir corréler l'aire du pic mesurée, correspondant à l'intensité de courant induit par les ions détectés, à la quantité de molécule cible à doser. Pour cela, les calibrages classiquement utilisés en spectrométrie de masse pourront être mis en œuvre, dans le cadre de l'invention. Les dosages MRM sont classiquement calibrés à l'aide de standards externes ou, de préférence, à l'aide de standards internes tels que décrits par T. Fortin et al. [19]. Dans le cas où la molécule cible est un peptide protéotypique, permettant de doser une protéine d'intérêt, la corrélation entre la mesure quantitative et la quantité de peptide protéotypique cible, et par la suite de protéine d'intérêt, est obtenue en étalonnant le signal mesuré par rapport à un signal étalon pour lequel la quantité à doser est connue. L'étalonnage peut être réalisé au moyen d'une courbe d'étalonnage, par exemple obtenue par injections successives de peptide protéotypique étalon à différentes concentrations (étalonnage externe), ou de façon préférentielle, par étalonnage interne en utilisant un peptide lourd, comme standard interne, par exemple conformément aux méthodes AQUA, QconCAT ou PSAQ détaillées ci-après. Par « peptide lourd », on entend un peptide correspondant au peptide protéotypique, mais dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone 12 (12C) est (sont) remplacé(s) par du carbone 13 (13C), et/ou un ou plusieurs atomes d'azote 14 (14N) est (sont) remplacé(s) par de l'azote 15 (15N).
L'utilisation de peptides lourds, comme standards internes (AQUA), a également été proposée dans la demande de brevet US 2004/0229283. Le principe est de synthétiser artificiellement des peptides protéotypiques avec des acides aminés comportant des isotopes plus lourds que les isotopes naturels usuels. De tels acides aminés sont obtenus, par exemple, en remplaçant certains des atomes de carbone 12 (12C) par du carbone 13 (13C), ou en replaçant certains des atomes d'azote 14 (14N) par de l'azote 15 (15N). Le peptide artificiel (AQUA) ainsi synthétisé a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que le peptide naturel (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est généralement ajouté, à une concentration donnée, à l'échantillon, en amont du dosage par spectroscopie de masse, par exemple entre le traitement entraînant le clivage des protéines de l'échantillon d'intérêt et le fractionnement des peptides obtenus après l'étape de traitement. De ce fait, le peptide AQUA est co-purifié avec le peptide naturel à doser, lors du fractionnement des peptides. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour le dosage. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et AQUA, dont la concentration est connue, permet de calculer la concentration du peptide naturel et de remonter ainsi à la concentration de la protéine à doser. Une variante de la technique AQUA a été proposée par J.-M. Pratt et al. [39] sous le nom de QconCat. Cette variante est également décrite dans la demande de brevet WO 2006/128492. Elle consiste à concaténer différents peptides AQUA et à produire le polypeptide artificiel sous forme de protéine recombinante lourde. La protéine recombinante est synthétisée avec des acides aminés comportant des isotopes lourds. De cette façon, il est possible d'obtenir un standard pour calibrer le dosage simultané de plusieurs protéines à moindre coût. Le standard QconCAT est ajouté dès le début, en amont du traitement entraînant le clivage des protéines et avant les étapes de fractionnement des protéines, de dénaturation, de réduction puis de blocage des fonctions thiols des protéines, si celles-ci sont présentes. Le standard QconCAT subit donc le même cycle de traitement entraînant le clivage des protéines que la protéine naturelle, ce qui permet de tenir compte du rendement de l'étape de traitement entraînant le clivage des protéines. En effet, le traitement, notamment par digestion, de la protéine naturelle peut ne pas être complet. Dans ce cas l'utilisation d'un standard AQUA conduirait à sous-estimer la quantité de protéine naturelle. Pour un dosage absolu, il peut donc être important de tenir compte des rendements de traitement entraînant le clivage des protéines. Cependant, V. Brun et al. [40] ont montré que, parfois, les standards QconQAT ne reproduisaient pas exactement le rendement de traitement notamment par digestion de la protéine naturelle, sans doute du fait d'une conformation tridimensionnelle différente de la protéine QconCAT.
V. Brun et al. [40] ont alors proposé d'utiliser une méthode baptisée PSAQ et décrite dans la demande de brevet WO 2008/145763. Dans ce cas, le standard interne est une protéine recombinante, ayant la même séquence que la protéine naturelle mais synthétisée avec des acides aminés lourds. La synthèse est réalisée ex-vivo avec des acides aminés lourds. Ce standard a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que la protéine naturelle (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est ajouté dès le début, avant l'étape de fractionnement des protéines, lorsque cette dernière est présente. Il est donc co- purifié avec la protéine native, lors de l'étape de fractionnement des protéines. Il présente le même rendement de traitement, notamment par digestion, que la protéine native. Le peptide lourd obtenu après clivage est également co-purifié avec le peptide naturel, si une étape de fractionnement des peptides est réalisée. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour être dosés quantitativement. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et des peptides de référence dans la méthode PSAQ permet de calculer la concentration de la protéine à doser en tenant compte de la totalité des étapes du procédé de dosage.
L'ensemble de ces techniques, à savoir AQUA, QconCAT ou PSAQ ou toute autre technique de calibrage, utilisée dans des dosages par spectrométrie de masse et en particulier dans les dosages MRM ou MS, pourront être mises en œuvre pour effectuer le calibrage, dans le cadre de l'invention.
Selon l'invention, le procédé de caractérisation des bactéries met en œuvre au moins un bactériophage spécifique de la bactérie à caractériser (identification et/ou propriétés de résistance potentielle à un ou plusieurs antimicrobiens).
Par exemple, la caractérisation d'Escherichia coli B peut être mise en œuvre au moyen du bactériophage T4.
En particulier, la caractérisation d'Escherichia coli B peut être mise en œuvre par détection des protéines rlll et motB du phage T4, qui sont des protéines non-structurales.
Pour la protéine rlll, la caractérisation d'Escherichia coli B peut mettre en œuvre la protéine complète de séquence SEQ ID NO: 1 suivante :
MIKQLQHALELQRAWNNGHENYGASIDVEAEALEILRYFKHLNPAQTALAAELQEKDELKY AKPLASAARKAVRHFVVTLK
Elle peut également mettre en œuvre au moins un peptide appartenant à la protéine rlll de SEQ ID NO: 2 et 3, tels que définis dans le tableau 2, ci-après : Peptide SEQ ID Séquence d'acides aminés Localisation dans SEQ ID NO: NO: 1
2 QLQHALELQR 4-13
3 HLNPAQTALAAELQEK 42-57
Tableau 2
Pour la protéine motB, la caractérisation d'Escherichia coli B peut mettre en œuvre la protéine complète de séquence SEQ ID NO: 4 suivante :
MIINIGELARVSDKSRSKAAGKLVEVVSIQLKHGVKDEDSEVKVRIIPKDGKSKPQFGYVRAKF
LESAFLKAVPAKGIETIDTSHVGVDFKWKLGQAIKFIAPCEFNFIKDDGRWYTRAMCGYITD
QWVEDGVKLYNVVFLGTYKVIPESWIKHYSNALYA
Elle peut mettre en œuvre au moins un peptide appartenant à la protéine motB de SEQ ID NO: 5 et 6, tels que définis dans le tableau 3, ci-après :
Figure imgf000029_0001
Tableau 3
Bien entendu, par au moins un peptide, l'on entend au moins un, au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins 6 ou plus peptides représentatifs du marqueur que l'on veut détecter. De préférence, l'on utilisera au moins deux, voire au moins trois, voire au moins quatre peptides par caractéristique.
Les peptides utiles aux fins de l'invention, de séquence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 (ainsi que ceux de séquence SEQ ID NO: 8, 9, 13-15 ; cf. exemples 2 et 3 infra), sont nouveaux et constituent un autre objet de l'invention.
Le procédé de l'invention et ses avantages ressortiront de la suite de la présente description relatant divers exemples non limitatifs de mise en œuvre du procédé de l'invention.
Exemple 1 : Caractérisation d'E Coli B via la détection de protéines non-structurale du bactériophage T4 (modèle E. Coli B/bactériophage T4)
1.1 Identification de protéines non-structurales du bactériophage T4 comme marqueurs de l'infection bactérienne
Les marqueurs protéiques de l'infection ont été identifiés en centrifugeant les bactéries infectées non encore lysées. En effet, lors des étapes du cycle viral qui précèdent la lyse, les protéines phagiques sont toutes concentrées au sein de la bactérie hôte. Le culot bactérien est alors lysé chimiquement (protocole éthanol /acide formique, adapté de Freiwald et Sauer (2009) [41]). Après une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) haute-résolution (type Orbitrap), des protéines marqueurs de l'infection d'E. coli B par le bactériophage T4 ont pu être identifiées : protéines structurales et non-structurales.
Paramètres de la chromatographie liquide :
- Chaîne chromatographique Accela (Thermo Fisher Scientific)
- Colonne Zorbax C18-300SB, 2.1mm de diamètre interne, 150mm de long, taille des particules 5μηι (Agilent Technologies)
- Solvant A : H20 - 0.1% acide formique
- Solvant B : ACN - 0.1% acide formique
- Gradient HPLC défini en tableau 4 ci-après :
Temps (min) Débit (μί,/ηπη) Solvant A (%) Solvant B (%)
0 200 95 5
40 200 40 60
45 200 5 95
48 200 5 95
50 200 95 5
60 200 95 5
Tableau 4
L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source d'ionisation electrospray (ESI) du spectromètre de masse de type LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Fisher Scientific).
Les paramètres machine utilisés sont les suivants :
Polarité : positive
Source électrospray (ESI)
Tension de cône : 4000V
Gaz de nébulisation : 35 (unité arbitraire)
Gaz rideau : 10 (unité arbitraire)
Gaz auxiliaire : 20 (unité arbitraire)- Type de balayage : Balayage dépendant des données d'acquisition
• Evénement de balayage 1
Gamme dynamique (m/z) : 200-2000
Résolution : 30000
Polarité : positive
• Evénement de balayage 2: Balayage intelligent avec MS/MS des ions les plus intenses (répété pour les trois plus intenses))
Type de collision : CID
Minimum de signal requis: 500
Energie de collision : 35 Etat de charge par défaut : 2
Cette analyse a permis d'identifier un nombre important de protéines de bactériophages. Parmi celles-ci, plusieurs sont des protéines non-structurales. La première identifiée comme potentiellement intéressante pour être utilisée dans la caractérisation de E. coli B est la protéine motB (SEQ ID NO: 4), une protéine de régulation de la transcription. Elle est une des premières protéines non-structurales identifiées par le logiciel Bioworks Browser (V3.3.1 SP1, Thermo Fisher Scientific). La deuxième est la protéine rlll (SEQ ID NO: 1), de faible poids moléculaire (<10kDa) ce qui permet de la détecter sous forme de protéine intacte (non digérée) ou sous forme de peptides protéotypiques. Les données présentées ci- après aux exemples 1.2 - 1-4 ne concernent que ces deux protéines non-structurales. Il peut néanmoins être envisagé de mettre en œuvre d'autres protéines non-structurales identifiées par le logiciel Bioworks pour ce modèle E. coli B/bactériophage T4.
1.2 Protocole de caractérisation de bactéries E. coli B par détection des protéines non- structurales du bactériophage T4
1- A partir d'une culture d'E. coli B en phase de croissance exponentielle (environ 108 cfu /mL) dans un milieu LB liquide et ajouter les bactériophages T4 (avantageusement avec une multiplicité d'infection égale à 0.01) en présence d'un inhibiteur de protéase (pefabloc à 0.25mM final).
2- Incuber 2h à 37°C sous agitation à 220rpm.
3- Centrifuger 20min à 12000g à 4°C.
4- Récupérer le surnageant de lyse bactérienne (induite suite à l'infection par le bactériophage T4).
5- Prélever 40 de billes magnétiques de type carboxyl-Adembeads (Ademtech), aimanter les billes et jeter le surnageant.
6- Laver les billes avec 200μί d'acétate de sodium lOOmM (pH=5.5), aimanter les billes et jeter le surnageant. Répéter cette étape une seconde fois.
7- Resuspendre les billes dans 400μί d'acétate de sodium lOOmM (pH=5.5).
8- Ajouter 200μί de surnageant de lyse préparé à l'étape 4. Bien homogénéiser, et laisser reposer quelques minutes sur la paillasse.
9- Aimanter les billes et jeter le surnageant. 10- Laver les billes avec 200μί d'acétate de sodium lOOmM (pH=5.5), aimanter les billes et jeter le surnageant. Répéter cette étape une seconde fois.
11- Eluer les protéines non-structurales avec 40μΙ_, d'acide formique à 2%. Bien homogénéiser, et laisser reposer quelques minutes sur la paillasse.
12- Aimanter les billes et récupérer le surnageant (ou éluat).
13- Prendre 20 de l'éluat préparé à l'étape 12, et neutraliser avec 30μί de tampon bicarbonate d'ammonium à 0.4M (vérifier que pH«8).
14- Ajouter ^g de trypsine (Promega).
15- Digestion à 37°C toute la nuit à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
16- Fractionner le digestat préparé à l'étape 15 sur une unité de filtration lOkDa par centrifugation 10min à 10000g (Nanosep, membrane oméga lOkDa). Récupérer le filtrat.
Complément d'informations sur le protocole :
Infection : L'infection des bactéries hôtes par les bactériophages est réalisée en milieu liquide (milieu LB) avec une multiplicité d'infection égale à 0.01 (c'est-à-dire un ratio du nombre de bactériophages sur le nombre de bactéries égal à 0.01, soit 1 bactériophage pour 100 bactéries). L'incubation est effectuée pendant 2h à 37°C sous agitation à 220rpm. L'infection est réalisée en présence d'un inhibiteur de protéase (pefabloc à 0.25mM) afin de conserver les protéines non-structurales intactes dans le surnageant de lyse. Une courte centrifugation à 12000g permet d'éliminer les débris cellulaires et de récupérer le surnageant de lyse.
Concentration : Par la suite, ces protéines non-structurales sont concentrées sur des billes magnétiques carboxyliques (Carboxyl-Adembeads, Ademtech). Une première étape de conditionnement des billes est réalisée afin de déprotoner les groupements carboxyliques, et ainsi obtenir des groupements COO pour procéder à l'échange de cations, plus précisément de protéines chargées positivement. Suite à ce conditionnement, l'échantillon est chargé sur les billes échangeuses de cations. Les protéines chargées positivement sont captées, puis lavées, et enfin éluées à pH acide (pH pour reprotoner les groupements carboxyliques).
Digestion : Une digestion enzymatique à la trypsine (Promega) permet de générer les peptides protéotypiques. La neutralisation de l'éluat des billes magnétiques est nécessaire car l'activité enzymatique de la trypsine est optimale dans un tampon dont le pH est compris entre 7 et 9.
Fractionnement : Le digestat obtenu est fractionné sur une membrane de lOkDa par centrifugation (Nanosep lOkDa, Pall Corporation). Le filtrat, contenant les peptides protéotypiques, est ensuite analysé par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en mode MRM.
1.3 Détection des marqueurs dans le surnageant de lyse
Chaque échantillon est traité selon l'exemple 1.2, puis un volume de 20μΙ_, de protéines digérées est injecté et analysé selon les conditions suivantes :
Chaîne chromatographique Agilent 1100 (Agilent Technologies, Massy, France)
Colonne Zorbax C18-300SB,
2.1mm de diamètre interne,
150mm de long,
Taille des particules 5μηι (Agilent Technologies)
Solvant A : H20 - 0.1% acide formique
Solvant B : ACN - 0.1% acide formique
Gradient HPLC défini en tableau 5 ci-après :
Figure imgf000034_0001
Tableau 5 Des peptides synthétiques de séquences identiques aux séquences SEQ ID NO: 2, 3, 5 et 6 , marqués aux isotopes stables 13C et 15N sur les lysine ou arginine terminales (la digestion trypsique induisant une coupure en R/K terminale), sont ajoutés à l'échantillon. Ces standards internes permettent de normaliser les variations analytiques de la chromatographie liquide et du processus d'ionisation, mais également de s'assurer de l'identification des peptides protéotypiques.
L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source d'ionisation du spectromètre de masse de type TSQ Quantum Ultra (Thermo Fisher Scientific). Les peptides, issus de la digestion des protéines préalablement isolées sur billes magnétiques, sont ensuite analysés par le spectromètre de masse en mode MRM. Seuls les peptides indiqués dans le tableau suivant sont détectés. Pour cela, les fragments (issus d'une collision de type CID) indiqués dans le tableau 6 ci-après, sont détectés.
Figure imgf000035_0001
Tableau 6
L'état de charge du peptide précurseur, son temps de rétention et les transitions, c'est-à-dire les rapports (m/z) en Ql et (m/z) en Q3, sont indiqués dans le tableau 7. L'énergie de collision utilisée pour fragmenter l'ion précurseur et la valeur du « tube lens » pour transférer les ions fragments sont également indiqués. Etat de (m/z) (m/z)
Transition Temps de Energie de Tube charge du filtré en filtré en
n° rétention collision lens précurseur Qi Q3
1 3 8.2 412.8 545.1 16 68
2 3 8.2 412.8 658.2 18 78
3 3 9.1 578.8 717.2 17 73
4 3 9.1 578.8 788.3 20 70
5 2 10.2 565.5 545.1 23 78
6 2 10.2 565.5 885.2 23 87
7 2 10.3 659.0 827.3 21 75
8 2 10.3 659.0 1040.5 22 80
Tableau 7
Les autres paramètres machine utilisés sont les suivants :
Type de balayage : M RM
Polarité : positive
Source d'ionisation :
- Electrospray ionization (ESI)
- Tension de cône : 4000 V
- Gaz de nébulisation : 60 (unité arbitraire)
- Gaz rideau : 2 (unité arbitraire)
- Gaz auxiliaire : 15 (unité arbitraire)
- Température de source : 350°C
- Energie de collision source : 5V
Résolution Q1/Q3 : 0.7 (fwhm)
Temps de cycle total =ls
Les aires obtenues pour chacune des transitions ont été mesurées. Toutes les transitions dont l'aire est supérieure à 1000 (unité arbitraire) sont considérées comme positives et sont notées « 1 » dans le tableau 8 infra. Toutes les transitions dont l'aire est inférieure à 1000 sont considérées comme négatives et sont notées « 0 » dans le tableau 8 infra. 1.4 Préparation de la solution stock de bactériophage T4
La solution stock de bactériophages T4 utilisés comme parents est préparée selon le protocole décrit ci-après :
1- A partir d'une culture liquide d'E. coli B en phase croissance exponentielle, ajouter les bactériophages T4 avec une multiplicité d'infection égale à 0.01 en présence d'un inhibiteur de protéase (pefabloc à 0.25mM final).
2- Incuber 2h à 37°C sous agitation à 220rpm.
3- Centrifuger 20min à 12000g à 4°C.
4- Récupérer le surnageant de lyse.
5- Centrifuger le surnageant de lyse à 12000g et 4°C toute la nuit.
6- Reprendre le culot avec un tampon TSG (Tris-HCl 0.01M pH7.5 / NaCl 150mM / gélatine 0.03%).
7- Conserver la solution stock de bactériophages à 4°C.
Lorsque le protocole de capture de protéines non-structurales décrit dans l'exemple 1.1 est appliqué sur cette solution stock de bactériophages (temps de conservation à 4°C supérieur à 1 an), aucun signal n'est détecté pour les protéines rlll et motB (transitions n°l à 8), comme indiqué dans le tableau 8.
Par conséquent, la détection de marqueurs non-structuraux (absents de la solution stock de bactériophages) permet d'utiliser des concentrations de bactériophages parents qui peuvent être supérieures à la limite de détection de l'instrument, et ce sans nécessiter de marquage préalable desdits bactériophages parents.
Surnageant Solution
Transition n° Protéine
de lyse stock
1 rlll 1 0
2 rlll 1 0
3 rlll 1 0
4 rlll 1 0
5 motB 1 0
6 motB 1 0
7 motB 1 0
8 motB 1 0
Tableau 8 D'autres protocoles de préparation de solution stock de bactériophages sont bien décrits dans la littérature. Parmi elles, la méthode de préparation par gradient de chlorure de césium présente un haut degré de purification.
Dans ce modèle E. coli B / bactériophage T4, et lorsque la quantité de bactéries à infecter est connue, il s'avère avantageux d'utiliser une multiplicité d'infection (MOI) voisine de 0,01 (de préférence de 0,01).
Comme mentionné précédemment, divers modèles espèce bactérienne X/protéine(s) non-structurale(s) d'un bactériophage Y, spécifique de l'espèce bactérienne X, peuvent être envisagés en fonction des besoins de l'utilisateur. A titre d'exemple, un autre modèle, le modèle Bacillus subtilis /_bactériophage SPPl, est décrit ci-après, sous l'intitulé « Exemple 2 ».
Exemple 2 : Caractérisation de Bacillus subtilis via la détection d'une protéine non- structurale du bactériophage SPPl (modèle Bacillus subtilis / bactériophage SPPl ) 2.1 identification d'une protéine non-structurale (la protéine GllP) comme marqueur de l'infection bactérienne.
Le bactériophage SPP1 appartient à l'ordre des Caudovirales et plus particulièrement à la famille des Siphoviridae. Ce bactériophage lytique infecte la bactérie à Gram positif Bacillus subtilis.
Les marqueurs de l'infection ont été identifiés par une étude protéomique réalisée à différents temps post-infection de Bacillus subtilis par le bactériophage SPP1, dans le but de suivre l'évolution de l'expression des protéines au cours de l'infection.
En pratique, les bactéries infectées non encore lysées ont été centrifugées. En effet, au cours du cycle viral lors des étapes précédant la lyse, les protéines phagiques sont concentrées au sein de la bactérie hôte. Le culot bactérien est ensuite lysé chimiquement (protocole éthanol /acide formique, adapté de Freiwald et Sauer (2009) [41].
Après une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) haute-résolution (Orbitrap), et à l'aide des informations sur le génome séquencé et annoté du bactériophage SPP1 [42], des protéines marqueurs de l'infection de Bacillus subtilis par le bactériophage SPP1 ont pu être identifiées.
Paramètres de la chromatographie liquide :
- Chaîne chromatographique Accela (Thermo Fisher Scientific)
- Colonne Zorbax C18-300SB, 2.1mm de diamètre interne, 150mm de long, taille des particules 5μηι (Agilent Technologies)
- Solvant A : H20 - 0.1% acide formique
- Solvant B : ACN - 0.1% acide formique
- Gradient HPLC défini en tableau 1 ci-après : Temps (min) Débit (μί,/ηπη) Solvant A (%) Solvant B (%)
0 200 95 5
40 200 40 60
45 200 5 95
48 200 5 95
50 200 95 5
60 200 95 5
Tableau 9
L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source d'ionisation electrospray (ESI) du spectromètre de masse de type LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Fisher Scientific).
Les paramètres machine utilisés sont les suivants :
Polarité : positive
Source électrospray (ESI)
Tension de cône : 4000V
Gaz de nébulisation : 35 (unité arbitraire)
Gaz rideau : 10 (unité arbitraire)
Gaz auxiliaire : 20 (unité arbitraire) - Type de balayage : Balayage dépendant des données d'acquisition
• Evénement de balayage 1
Gamme dynamique (m/z) : 200-2000
Résolution : 30000
Polarité : positive
• Evénement de balayage 2: Balayage intelligent avec MS/MS des ions les plus intenses (répété pour les trois plus intenses)
Type de collision : CID
Minimum de signal requis: 500 Energie de collision : 35
Etat de charge par défaut : 2
Cette analyse a permis d'identifier un nombre important de protéines codées par le génome du bactériophage SPP1. Parmi celles-ci, plusieurs sont des protéines non-structurales.
Les protéines phaqiques ont été identifiées lors d'une étude cinétique de l'infection de Bacillus subtilis (5 à 25 min post-infection) par le bactériophage SPP1.
Plus précisément, dans le cadre de cette étude cinétique, trente-neuf protéines phagiques ont été identifiées par le logiciel Bioworks Browser (V3.3.1 SPl, Thermo Fisher Scientific).
Parmi ces trente-neuf protéines phagiques, plusieurs sont des protéines non- structurales. Une de ces dernières a retenu plus particulièrement l'attention des demanderesses, à savoir la protéine GllP, décrite comme étant exprimée en quantité très importante dans la bactérie hôte, sans être présente dans la particule virale infectieuse [42] [43] En effet, un intermédiaire d'assemblage de la particule virale SPP1 est clairement décrit dans la littérature. Cet intermédiaire est une pro-capside, composée de 3 protéines structurales (G6P, G13P et G7P) et de la protéine non-structurale GllP. Les exemples qui suivent concernent cette protéine non-structurale GllP. Il peut néanmoins être envisagé de mettre en œuvre d'autres protéines identifiées par le logiciel Bioworks pour le modèle Bacillus suèt;7;'s/bactériophage SPP1.
La séquence de la protéine GllP (numéro d'accession uniprot #Q38580), référencée en tant que SEQ ID NO: 7, est la suivante :
MSLKEQLGEELYGQVLAKLGEGAKLVDISDGSFIPKEKFDAVNSEKKSLEQQLTDRDQQLQELSTKA TGHDELSAKIADLQKANEEAKQAFEAEKQQLKYEHALETALRDSGAKNPKAVKALLDTESIKLDGD KLLGFEDQIKALKEQEDYLFKGTEPNGGVQGTPPPGKGADLGGLPTKKNPFKQGPDFNLTEQGILF RENPELAKKLQAEAQ
2.2 : Protocole de caractérisation de bactéries Bacillus subtilis par détection de la protéine non-structurale GllP du bactériophage SPP1 1- A partir d'une culture de Bacillus subtilis en phase de croissance exponentielle (environ 108 cfu /mL) dans un milieu LB liquide contenant lOmM de CaCl2, ajouter les bactériophages SPPl (avantageusement à une MOI de 5).
2- Incuber 3h à 37°C sous agitation à 220 rpm.
3- Centrifuger 20min à 12000g à 4°C.
4- Récupérer le surnageant de lyse bactérienne (induite par l'infection par le bactériophage SPPl).
5- Prendre 30 μί du surnageant de lyse préparé à l'étape 4, et neutraliser avec un tampon bicarbonate d'ammonium à 0.05M (vérifier que pH«8).
6- Ajouter ΙΟμί de surfactant RapiGest™ à 5% et 5μΙ_, de dithiothréitol à 15,4 mg/mL.
7- Incuber 10min à 95°C sous agitation à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
8- Laisser revenir à température ambiante et ajouter 5μί d'iodoacétamide à 44,4 mg/mL.
9- Incuber 45min à l'abri de la lumière et à température ambiante.
10- Ajouter ^g de trypsine (Promega).
11-Digestion à 37°C toute la nuit à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
12- Ajouter 5μί d'acide chlorhydrique à 1M.
13- Incuber 45min à 37°C à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
14- Centrifuger 10min à 13000rpm.
15- Récupérer le surnageant et conserver pour une analyse ultérieure des digestats trypsiques.
2.3 Détection des marqueurs dans le surnageant de lyse
Les digestats trypsiques préparés selon l'exemple 2.2 ont été analysés afin de déterminer si les protéines non-structurales de SPPl y sont détectées. Les échantillons ont été analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) haute-résolution (Orbitrap) en utilisant les mêmes paramètres que ceux de présentés dans l'exemple 2.1.
La protéine GllP (24kDa) ayant une masse moléculaire supérieure à 20 kDa n'est pas directement détectable sous forme de protéine entière avec l'instrumentation utilisée. En revanche, les analyses de digestats trypsiques ont montré la présence de deux peptides protéotypiques, révélateurs de la présence de la protéine GllP dans le surnageant de lyse, à savoir les peptides : GADLGGLPTK (SEQ ID NO: 8), et
LVDISDGSFIPK (SEQ ID NO: 9). 2.4 Analyse d'une solution stock de bactériophages SPPl
Une solution stock de bactériophages SPPl, (purifiés par gradient de chlorure de césium) a été analysée comme décrit aux étapes 5 à 15 de l'exemple 2.2. par LC-MS. Les mêmes paramètres de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse que ceux de présentés dans l'exemple 2.1 ont été utilisés. Aucun signal correspondant à la protéine G11P (et en particulier aux deux peptides protéotypiques de séquences SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9) n'a été détecté.
En revanche, des protéines structurales ont pu être détectées, comme attendu, via la détection de deux peptides protéotypiques de la protéine structurale G6P, à savoir :
- VSGDGGVDTLR (SEQ ID NO: °10), et
- TQYLVGEPVTFTSDNK (SEQ ID NO: °11).
Par conséquent, tout comme pour le modèle E. Coli B/bactériophage T4,_la détection de marqueurs non-structuraux (absents de la solution stock de bactériophages) de SPPl, en l'espèce des deux peptides protéotypiques de séquences SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9 de la protéine G11P, permet d'utiliser des concentrations de bactériophages parents qui peuvent être supérieures à la limite de détection de l'instrument, et ce sans nécessiter un marquage préalable desdits bactériophages parents.
Dans le cas du modèle Bacillus subtilis / bactériophage SPPl , et lorsque la quantité de bactéries à infecter est connue, il s'avère avantageux d'utiliser une multiplicité d'infection (MOI) voisine de 5 (de préférence de 5).
Un troisième modèle, le modèle Salmonella typhimurium / bactériophage Felix-01, est décrit ci-après, sous l'intitulé « Exemple 3 ».
Exemple 3 : Caractérisation de Salmonella enterica serovar Typhimurium via la détection d'une protéine non-structurale du bactériophage Felix-01 (modèle Salmonella typhimurium / bactériophage Felix-01) 3.1 Identification d'une protéine non-structurale (la protéine GPpl3, appelée lysozyme) comme marqueur de l'infection bactérienne.
Le bactériophage Felix-01 appartient à l'ordre des Caudovirales et plus particulièrement à la famille des Myoviridae. Ce bactériophage lytique infecte la bactérie à Gram négatif Salmonella [45]. Les marqueurs protéiques de l'infection bactérienne par Felix-01 ont été identifiés en centrifugeant les bactéries infectées non encore lysées, au stade du cycle viral auquel les protéines phagiques sont concentrées au sein de la bactérie hôte, et en lysant le culot bactérien chimiquement (protocole éthanol /acide formique, adapté de Freiwald et Sauer (2009) [41] pour libérer les protéines. Après une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) haute-résolution (Orbitrap), et à l'aide des informations sur le génome séquencé et partiellement annoté du bactériophage Felix-01 [46], des protéines marqueurs de l'infection de Salmonella enterica serovar Typhimurium par le bactériophage Felix-01 ont pu être identifiées.
Paramètres de la chromatographie liquide :
- Chaîne chromatographique Accela (Thermo Fisher Scientific)
- Colonne Zorbax C18-300SB, 2.1mm de diamètre interne, 150mm de long, taille des particules 5μηι (Agilent Technologies)
- Solvant A : H20 - 0.1% acide formique
- Solvant B : ACN - 0.1% acide formique
- Gradient HPLC défini en tableau 1 ci-après :
Temps (min) Débit (μί/ηπη) Solvant A (%) Solvant B (%)
0 200 95 5
40 200 40 60
45 200 5 95
48 200 5 95
50 200 95 5
60 200 95 5 Tableau 9
L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans la source d'ionisation electrospray (ESI) du spectromètre de masse de type LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Fisher Scientific).
Les paramètres machine utilisés sont les suivants :
Polarité : positive
Source électrospray (ESI)
Tension de cône : 4000V
Gaz de nébulisation : 35 (unité arbitraire)
Gaz rideau : 10 (unité arbitraire)
Gaz auxiliaire : 20 (unité arbitraire) - Type de balayage : Balayage dépendant des données d'acquisition
• Evénement de balayage 1
Gamme dynamique (m/z) : 200-2000
Résolution : 30000
Polarité : positive
• Evénement de balayage 2: Balayage intelligent avec MS/MS des ions les plus intenses (répété pour les trois plus intenses)
Type de collision : CID
Minimum de signal requis: 500
Energie de collision : 35
Etat de charge par défaut : 2
Cette analyse a permis d'identifier un nombre important de protéines codées par le génome du bactériophage Felix-01. Parmi celles-ci, plusieurs sont des protéines non-structurales. Une de ces dernières a retenu plus particulièrement l'attention des demanderesses, à savoir la protéine GPpl3 aussi appelée lysozyme (ou lysine), décrite comme hydrolysant le peptidoglycane afin de lyser la paroi bactérienne et ainsi libérer les bactériophages néoformés. Les exemples qui suivent concernent cette protéine non-structurale GPpl3. Il peut néanmoins être envisagé de mettre en œuvre d'autres protéines non-structurales identifiées pour le modèle Salmonella t pftz'murium/bactériophage Felix-01.
La séquence de la protéine GPpl3 (numéro d'accession Uniprot #Q6KGN3, NCBI #gi38707815), référencée en tant que SEQ ID NO: 12, est la suivante :
MQLSRKGLEAIKFFEGLKLEAYEDSAGIPTIGYGTIRIDGKPVKMGMKITAEQAEQYLLADVEKFVA AVNKAIKVPTSQNEFDALVSETYNIGITAMQDSTFIKRHNAGNKVGCAEAMQWWNKVTVKGQKV TSNGLKNRRRMEADIYLDSVYPK
3.2 : Protocole de caractérisation de bactéries Salmonella typhimurium par détection de la protéine non-structurale GPpl3 du bactériophage Felix-01
1- A partir d'une culture de Salmonella enterica serovar Typhimurium en phase de croissance exponentielle (environ 108 cfu /mL) dans un milieu LB liquide contenant lOmM de CaCl2, et 40 mM MgC12, ajouter les bactériophages Felix-01 (avantageusement à une MOI de 0,1).
2- Incuber 2h à 37°C sous agitation à 220 rpm.
3- Centrifuger 20min à 12000g à 4°C.
4- Récupérer le surnageant de lyse bactérienne (induite suite à l'infection par le bactériophage Felix-01).
5- Prendre 30 du surnageant de lyse préparé à l'étape 4, et neutraliser avec un tampon bicarbonate d'ammonium à 0.05M (vérifier que pH«8).
6- Ajouter ΙΟμί de surfactant RapiGest™ à 5% et 5μί de dithiothréitol à 15,4 mg/mL. 7- Incuber 10min à 95°C sous agitation à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
8- Laisser revenir à température ambiante et ajouter 5μί d'iodoacétamide à 44,4 mg/mL.
9- Incuber 45min à l'abri de la lumière et à température ambiante.
10- Ajouter ^g de trypsine (Promega).
11-Digestion à 37°C toute la nuit à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
12- Ajouter 5μΙ_, d'acide chlorhydrique à 1M.
13- Incuber 45min à 37°C à 500rpm (Thermomixer Eppendorf).
14- Centrifuger 10min à 13000rpm. 15-Récupérer le surnageant et conserver pour une analyse ultérieure des digestats trypsiques.
3.3 Détection des marqueurs dans le surnageant de lyse
Les digestats trypsiques préparés selon l'exemple 3.2 ont été analysés afin de déterminer si les protéines non-structurales de Felix-01 y sont détectées. Les échantillons ont été analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) haute-résolution (Orbitrap) en utilisant les mêmes paramètres que ceux de présentés dans l'exemple 3.1.
La protéine GPpl3 (17kDa) ayant une masse moléculaire proche de 20 kDa n'est pas directement détectable sous forme de protéine entière avec l'instrumentation utilisée. En revanche, les analyses de digestats trypsiques ont montré la présence de trois peptides protéotypiques, révélateurs de la présence de la protéine GPpl3 dans le surnageant de lyse, à savoir les peptides :
- LEAYEDSAGIPTIGYGTIR (SEQ ID NO: 13),
- ITAEQAEQYLLADVEK (SEQ ID NO: 14),
- VPTSQNEFDALVSETYNIGITAMQDSTFIK (SEQ ID NO: 15)
3.4 Préparation de la solution stock de bactériophages Felix-01
1- Récupérer le surnageant de lyse préparé à l'étape 4 de l'exemple 3.2.
2- Centrifuger le surnageant de lyse à 12000g et 4°C toute la nuit.
3- Reprendre le culot avec un tampon TSG (Tris-HCl 0.01M pH7.5 / NaCl 150mM / gélatine 0.03%).
4- Conserver la solution stock de bactériophages à 4°C.
3.5 Analyse d'une solution stock de bactériophages Felix-01
Une solution stock de bactériophages Felix-01 préparée comme décrit dans l'exemple 3.4 a été analysée comme décrit aux étapes 5 à 15 de l'exemple 3.2. par LC-MS. Les mêmes paramètres de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse que ceux de présentés dans l'exemple 3.1 ont été utilisés. Aucun signal correspondant à la protéine GPpl3 (et en particulier aux trois peptides protéotypiques de séquences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15) n'a été détecté.
Par conséquent, la bactérie SalmoneUa enterica serovar Typhimurium peut être détectée à l'aide de marqueurs non-structuraux du bactériophage Felix-01, en l'espèce des trois peptides protéotypiques de séquences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 et SEQ ID NO: 15 de la protéine GPpl3. Ainsi des concentrations de bactériophages parents supérieures à la limite de détection de l'instrument peuvent être utilisées, et ce sans nécessiter de marquage préalable desdits bactériophages parents pour la détection de la bactérie SalmoneUa enterica serovar Typhimurium.
Dans le cas du modèle SalmoneUa typhimurium / bactériophage Felix-01, et lorsque la quantité de bactéries à infecter est connue, il s'avère avantageux d'utiliser une multiplicité d'infection (MOI) voisine de 0,1 (de préférence de 0,1 ).
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Claims

REVENDICATIONS
Procédé de caractérisation d'au moins une bactérie, présente dans un échantillon, comprenant l'identification de ladite ou desdites bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien,
ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
a) Obtenir une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) à caractériser ;
b) Mettre en contact la solution contenant le ou lesdits bactériophage(s) avec ladite ou lesdites bactérie(s) à caractériser et, éventuellement, au moins un antimicrobien ;
c) Se mettre dans des conditions permettant l'infection des bactéries par les bactériophages et la multiplication de ces derniers à l'intérieur desdites bactéries ;
d) Détecter par toute méthode appropriée la présence de protéines non- structurales de bactériophages, produites lors de l'infection des bactéries ; la présence desdites protéines non-structurales permettant de confirmer l'identification de ladite ou des bactérie(s) et/ou de confirmer la résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien.
Procédé selon la revendication 1, dans lequel, à l'étape d), la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages s'effectue via un instrument de détection, par exemple un spectromètre de masse, et dans lequel, à l'étape b), la quantité de bactériophages utilisée est supérieure ou égale, de préférence supérieure, à la limite de détection de l'instrument de détection utilisé.
Procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire c') de lyse des bactéries.
Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages est mise en œuvre par spectrométrie de masse, de préférence par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse.
5. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la spectrométrie de masse est une spectrométrie de type MS, MS/MS ou MS suivie d'une spectrométrie de type MS/MS.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel la spectrométrie de masse est une spectrométrie de type SRM.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages est mise en œuvre par une réaction ligand/anti-ligand.
8. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la réaction ligand/anti-ligand est une réaction antigène/anticorps.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire c") de concentration des protéines non-structurales, avant l'étape de détection d).
10. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape de concentration est réalisée au moyen de billes magnétiques.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire b') de capture spécifique de ladite ou desdites bactéries préalablement à l'étape d'infection c).
12. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la capture spécifique est réalisée par séparation immuno-magnétique (IMS).
13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les protéines non- structurales de bactériophages sont choisies parmi les protéines rlll et motB du bactériophage T4, la protéine G11P du bactériophage SPP1 et la protéine GPpl3 du bactériophage Felix-01.
14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'identification de ladite ou desdites bactérie(s) et/ou la détermination des propriétés de résistance potentielle de ladite ou desdites bactérie(s) à au moins un antimicrobien, met en œuvre au moins un peptide de séquence SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite ou lesdites bactérie(s) sont obtenues à partir d'un milieu de culture.
16. Peptide de séquence SEQ ID NO : 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
17. Anti-ligand, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps, se liant spécifiquement à un ligand consistant en une protéine non-structurale de bactériophages ou au moins un peptide spécifique de ladite protéine non-structurale. 18. Anti-ligand selon la revendication 17, se liant spécifiquement à un ligand consistant en: une protéine choisie parmi les protéines rlll et motB du bactériophage T4, la protéine G11P du bactériophage SPP1 et la protéine GPpl3 du bactériophage Felix- 01 et/ou
un peptide de séquence SEQ ID NO : 2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
19. Kit permettant de mettre en œuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 15, ledit kit comprenant :
au moins une solution contenant au moins un bactériophage susceptible d'être spécifique de ladite ou desdites bactérie(s) à caractériser et au moins un moyen de détection spécifique d'au moins une protéine non- structurale de bactériophages ou d'au moins un des peptides spécifiques de ladite au moins une protéine non-structurale.
20. Kit selon la revendication 19, dans lequel le moyen de détection spécifique comprend : - au moins un standard interne consistant en au moins une protéine non-structurale de bactériophages ou au moins l'un de ses peptides spécifiques dérivés, ledit standard interne étant marqué, par exemple par marquage isotopique, ledit standard interne étant spécifiquement adapté à une utilisation dans une méthode de détection de la présence de protéines non-structurales de bactériophages par spectrométrie de masse, et
- au moins une information permettant de caractériser en spectrométrie de masse ladite au moins une protéine non-structurale de bactériophages ou ledit au moins un de ses peptides spécifiques dérivés.
21. Kit selon la revendication 19, dans lequel le moyen de détection spécifique comprend : - au moins un anti-ligand, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps, complémentaire d'un ligand consistant en au moins une protéine non-structurale de bactériophages ou au moins l'un de ses peptides spécifiques dérivés, et
- au moins un moyen de révélation de la formation du complexe ligand/anti-ligand.
22. Kit selon l'une des revendications 19 à 21, ledit kit comprenant un nécessaire de lyse bactérien pour réaliser l'étape c').
23. Kit selon l'une des revendications 19 à 22, dans lequel ladite au moins une protéine non- structurale de bactériophages est choisie parmi les protéines rlll et motB du bactériophage T4, la protéine G11P du bactériophage SPP1 et la protéine GPpl3 du bactériophage Felix-01 et dans lequel ledit au moins un des peptides spécifiques de ladite protéine non-structurale est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO:°2, 3, 5, 6, 8, 9, 13, 14 ou 15.
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