JP5529051B2

JP5529051B2 - 質量分析技術を用いた免疫分析方法および免疫分析システム

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Publication number: JP5529051B2
Application number: JP2010550523A
Authority: JP
Inventors: 勝弘神田; 真野上; 泉和氣
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Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2009-02-10
Filing date: 2010-02-09
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Description

本発明は、臨床検査に用いられる免疫分析方法及び免疫分析システムに関する。

臨床検査における普及した検査手法の一つに免疫法がある。免疫法は、測定対象成分を特異的に認識する抗体を応用し、例えば検体中の測定対象成分を抗体（一次抗体）で捕捉した後に、その一次抗体をさらに選択的に捕捉する二次抗体を利用して検出する。このときの検出は、高感度化を図るために二次抗体に標識を付加している。標識は、例えば蛍光物質の場合や、酵素化学発光に必要な物質等の場合がある。免疫法は、簡便に高感度検出可能な測定技術であることから、検体中の微量成分の定量測定に適している。

一方、免疫法には交差反応性の問題がある。交差反応性は、一次抗体が本来認識すべき測定対象成分だけでなく、例えば測定対象成分の代謝物のように類似した構造を有する分子をも捕捉してしまう現象である。このことは、定量結果が真値よりも高くなり、測定対象成分を正確に定量できないことを意味している。

特に、低分子化合物等の場合は交差反応性が顕著になる傾向があり、抗体作製の際に測定対象成分へのキャリアタンパク質の付加により高分子化する必要があるため、その付加位置以外の部位のみエピトープとなり得ることから、位置によっては代謝物との構造差異の識別が不可能となることが原因の一つである。この交差反応性を抑制するためには、各種類似構造分子の差異を識別できる一次抗体の作製が求められるが、作製は困難であるとともにコストと労力がかかるため、非効率的である。

免疫法に対して質量分析法は、測定対象成分の質量に基づいて測定するため、例えば代謝物等の類似構造分子との識別が可能な測定技術である。特に、ＭＳ／ＭＳ解析やＭＳｎ解析の手法は、測定対象成分をフラグメントイオン化することにより、類似構造成分どうしの高精度識別を可能にする技術である。また、質量分析法は、抗体のような特殊な試薬作製を必要としないため、コストと労力の削減が可能である。

質量分析によるサンプル解析の前に、別の解析手法や処理を組み合わせた公知例がある。例えば、ウェスタンブロッティング法（特許文献１参照）、磁性ビーズによる標的細菌の回収（特許文献２参照）、プルダウンアッセイ法（特許文献３参照）、有機薄膜上への標的物質の回収（特許文献４参照）、ゲル電気泳動法（特許文献５参照）を質量分析前に実施している。

特開２００６−１２６０１３号公報特表２００５−５２４３９４号公報特開２００５−０９８８３０号公報特開２００５−２９１８２３号公報ＷＯ２００４−０３１７５９号公報

質量分析法は成分の識別検出に優れている反面、その成分の定量を行う場合には内部標準物質等の準備が必要となる。

また、質量分析法の場合、成分をイオン化する必要があり、そのイオン化効率が定量精度を左右することから、内部標準物質の選定には細心の注意が必要となる。

最も望ましいのは安定同位体標識した測定対象成分そのものであるが、その合成にはコストがかかるだけでなく、合成できない成分については安定同位体標識物を作製できない問題がある。

このため、前述した免疫法の交差反応性を解消するとともに、質量分析法の成分定量の問題を解決できる装置及び方法が提供できると、今までにない高精度な臨床検査技術を実現することができる。

本発明の目的は、免疫法の交差反応性を解消し、質量分析法の成分定量の問題を解決できる免疫分析方法及び免疫分析システムを実現することである。

本発明は、上記目的を達成するため、次のように構成される。

免疫分析方法及び免疫分析システムにおいて、免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉し、捕捉した測定対象物から測定対象成分を回収し、回収した測定対象成分を質量分析法により、質量分析を行い、測定対象物の成分の分析を行う。

好ましくは、免疫分析方法及び免疫分析システムにおいて、免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉し、捕捉した測定対象物の定量を行い、測定対象物の定量を行った廃液から上記測定対象物を回収し、回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定する。

免疫法の交差反応性を解消し、質量分析法の成分定量の問題を解決できる免疫分析方法及び免疫分析システムを実現することができる。

本発明の実施例１における試料免役分析システム全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。免役法の説明図である。免役法の廃液処理の説明図である。タクロリムスの交差反応性および薬効を示す図である。患者検体における測定対象に関するデータを示す図である。図１に示した試料免役分析システムの装置構成例を示す図である。図１に示した試料免役分析システムの他の装置構成例を示す図である。図１に示した試料免役分析システムのさらに他の装置構成例を示す図である。図１に示した試料免役分析システムのさらに他の装置構成例を示す図である。本発明の実施例２における試料免役分析システム全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。免疫法向け前処理における応用の説明図である。免疫法向け前処理産物からの測定対象成分回収の説明図である。図１０に示した試料免役分析システムの装置構成例を示す図である。図１０に示した試料免役分析システムの他の装置構成例を示す図である。免疫反応処理および固相抽出処理フローである。固相抽出処理に関わるシステム構成（上面図）である。固相抽出処理に関わるシステム構成（側面図）である。免疫反応処理および固相抽出処理のシーケンスである。

以下、本発明の実施例について、添付図面を参照して詳細に説明する。

本発明の実施例１について、免疫法による測光測定後の廃液を質量分析法による成分検出を行なう例について説明する。

図１は、実施例１における免役分析システム１０２全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。

患者血清等の試料１０１は、免疫法用前処理装置１０３により、前処理が施された後、免疫法用測光検出系１０４により測光される。続いて、質量分析法用前処理装置１０５により前処理が行われ、質量分析検出系１０６により、質量分析が行われる。これら試料免役分析システム１０２、免疫法用前処理装置１０３、免疫法用測光検出系１０４、質量分析法用前処理装置１０５、質量分析検出系１０６は、システム制御及びデータ処理用パーソナルコンピュータ１０７により動作制御され、分析結果１０８は、パーソナルコンピュータ１０７のディスプレイにより表示される。

生体由来の試料（例えば、全血、血漿、血清、尿等）中の測定対象成分は、まず免疫自動分析法に従って免疫法用前処理装置１０３にて前処理され、免疫法用測光検出系１０４により、測定対象成分を特異的に認識する抗体により選択的に捕捉される。予め抗体は磁性粒子に対して、例えばアビジン−ビオチン結合等により結合した状態にしておく。図２に示すように、磁性体２１０の磁力により測定対象成分２０５について抗体２０２、２０３、２０４、２０６を介して捕捉した磁性粒子２０１を集め、周囲の夾雑物等を洗い流した後、標識した抗免疫グロブリン抗体によりサンドイッチアッセイを行うことで検出器２１１により測定対象成分の検出および定量を行う。

この定量値には、測定対象成分だけでなく、例えばその成分に由来する代謝物をはじめとする構造類似物質等による交差反応性を含んだ値であるため、本来求めたい測定対象成分の定量真値よりも高い値を示す傾向がある。

そこで、免疫法で捕捉した試料あるいは免疫法による測定後の廃液を再利用して、そのなかに含まれている交差反応性を示す物質等の成分内訳（相対比率）を質量分析法で求めることにより、免疫法で求めた定量値から捕捉された成分の定量値を真値に近い値で個別に算出する。

質量分析法用前処理装置１０５において、免疫法で用いた試料（廃液）から、測定対象成分を回収する。例えば、免疫測定後の廃液を酸処理、アルカリ処理、イオン強度処理等により、抗原抗体反応を乖離させ、抗体から抗原（測定対象成分）を遊離させる。そして、図３に示すように、再び磁性粒子３０１の磁力で磁性ビーズを集め、上清を回収し、溶媒置換した後に質量分析検出系１０６に供給する。

測定対象成分の性状により、必要に応じてサイズ分画等のクロマトグラフィー手法で上清中に含まれている成分を分離したり、酵素消化等により断片化しても構わない。

そして質量分析検出系１０６において、上清中に含まれている成分を質量分析する。得られたクロマトグラムから成分ごとのシグナル強度やピーク面積を求め、その相対比率に基づいて免疫法で測定した定量値の内訳を成分ごとに算出する。そして、免疫法で算出した定量値に対して上記成分比率を掛け合わせて、成分毎の定量値を補正する。

これにより、免疫法では交差反応性等の影響を受けていた測定対象成分の定量値について、真値に近い定量値が求められるとともに、交差反応性の要因となる構造類似物質の内訳も定量的に求めることができる。

特に、構造類似物質の代表例に測定対象成分の代謝物が挙げられる。例えば、測定対象成分が治療薬の場合、測定対象薬剤とともにその代謝物の比率（プロファイル）や定量値を把握することは、投薬管理上重要であり、従来の免疫法では求められなかった代謝物の濃度を本発明により算出することが可能となる。

例えば、免疫抑制剤の１種であるタクロリムスの場合、図４に示すように、代謝物としてＭ−Ｉ（１３−ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ−ＩＩ（３１−ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ−ＩＩＩ（１５−ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ−ＩＶ（１２−ｏ−ｈｙｄｒｏｘｙｌ型）、Ｍ−Ｖ（１５，３１−ｏ−ｄｉｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ−ＶＩ（１３，３１−ｏ−ｄｉｄｅｍｅｔｈｙｌ型）、Ｍ−VＩＩ、Ｍ−VＩＩＩが知られている（K. Iwasaki, Drug Metab. Pharmacokinet., 22(5), 328-335, 2007）。これら代謝物について、評価に用いたモノクローナル抗体によるエンザイムイムノアッセイ法における交差反応性は各々０％、１０９％、９０．５％、８．８％、９２．２％、０％、０％、０％であることから、例えば、この抗体を用いて臓器移植後の患者に投与したタクロリムスについて、血液中のタクロリムス濃度を免疫法により測定した場合、定量値にはタクロリムスだけでなくＭ−ＩＩ、Ｍ−ＩＩＩ、Ｍ−ＩＶ、Ｍ−Ｖの各代謝物も含んで測定している可能性がある。

一方、Ｍ−Ｉ〜ＶＩＩＩで示される８種類の代謝物の免疫抑制効果は、M−Ｉ、M−ＩＩ、Ｍ−ＩＶ、Ｍ−ＶＩ、Ｍ−ＶＩＩＩでも認められる。前述の交差反応性を加味すると、Ｍ−ＩＩおよびＭ−ＩＶは交差反応性および免疫抑制効果の両性質を有することが認められる。このことは、Iwasakiが実験に使用したモノクローナル抗体を用いてタクロリムスの免疫法による測定を行う場合、M―ＩＩおよびＭ−ＩＶの血中濃度を測定対象薬剤であるタクロリムスとともに把握することが投薬管理の上で必須となる。

上記文献を引用し、タクロリムス、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＶの各定量値を求めるモデルを示す（図５）。なお、このモデルにおける、免疫法による測定値（10ng/ml）およびMS測定したときの各成分のピーク面積相対比率（タクロリムス100%、Ｍ−ＩＩ20%、Ｍ−ＩＶ10%）は、原理説明のために仮設定したものとする。

図５は、ＭＳ測定による捕捉成分の補正定量値算出までのプロセスを示す。患者検体中のタクロリムスを免疫法で定量したときの測定値が10ng/mlと仮定し、そのときのクロマトグラムからタクロリムスに相当するピーク面積を100%としたときのＭ−ＩＩおよびＭ−ＩＶに相当するピーク面積相対値が各々20%および10%と仮定したときの、タクロリムス、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＶの濃度内訳の算出法について示す。この場合、免疫法で捕捉した３成分（タクロリムス、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＶ）の内訳は、タクロリムスが76.9%、Ｍ−ＩＩが15.4%、Ｍ−ＩＶが7.7%となる。したがって、免疫法による定量値10ng/mlは、内訳比率で換算すると、タクロリムスが7.7ng/ml、Ｍ−ＩＩが1.5ng/ml、Ｍ−ＩＶが0.8ng/mlとなり、検体内のタクロリムス濃度は免疫法の測定値10ng/mlではなく、より正確には交差反応成分の推定値を除いた7.7ng/mlになることが示唆されることになる。

このように、免疫法による測定値に基づいて、ＭＳ測定による捕捉成分の存在比率から捕捉成分ごとの定量値を算出することは、免疫法で問題となる交差反応性による複数成分の総和でしか測定できないことを解消できるだけでなく、ＭＳ法による定量測定で必要となる内部標準物質なしに、免疫法で捕捉された各成分の存在比率をMS測定で求めることによって、免疫法測定値の内訳を換算し、各成分ごとの定量値を求めることが可能となる。

また、免疫法により捕捉された各成分の定量値を求めるだけでなく、各成分のプロファイル（存在比率のパターン）に基づいて、例えば患者の様態を基準となるプロファイル（例えば、平均的なその疾患特有のプロファイルやその患者の過去のプロファイル等）との乖離から、正常あるいは異常等の判断指標として応用することも可能である。

このことは、測定対象物質だけでなく薬としての効果を有するような代謝物等を含めた血中濃度を識別して把握することは、より安全かつ効果的な投与設計を行う技術となる。

例えば、本手法を自動処理するシステムにおいては、薬剤名、薬剤群あるいは疾患等を選択することで、必要な測定を行い、その情報を統合的に自動計算するソフトウェアの搭載が考えられる。

図６は、図１に示した試料免役分析システム１０２の装置構成例を示す図である。

図６に示した免疫法用前処理装置１０３において、検体ラック１０３３に収容された試料１０３２は、分注機構１０３１により、反応テーブル１０３５に配置された反応バイアル１０３４に分注される。また、免疫法用試薬カートリッジ１０３６に収容された試薬も、反応バイアル１０３４に分注される。反応バイアル１０３４は、反応バイアルラック１０３８から反応テーブル１０３５にバイアル移動機構１０３７により移動される。

また、免疫法用測光検出系１０４において、免疫法用前処理装置１０３から供給されたサンプルは、マグネット１０４１を備えるセル１０４２を通過し、光源１０４３からの光が照射され、測光器１０４４により測光されて定量データが検出される。

そして、免疫法用測光検出系１０４からの廃液が質量分析法用前処理装置１０５に供給される。

質量分析法用前処理装置１０５において、免疫法用測光検出系１０４からの廃液は、分注機構１０４６により、分注された抗原遊離試薬と混合され、マグネット１０４５の作用により、遊離抗原溶液が得られ、バッファー置換試薬により、置換されたサンプルが、質量分析検出系１０６に供給される。

質量分析系１０６は、イオン源１０６１と、質量分析部１０６２と真空ポンプ１０６３とを備える。そして、この質量分析検出系１０６により、質量分析され、スペクトルデータ１０８が得られる。

図７は、図１に示した、免疫分析システム１０２の他の装置構成例を示す図である。

図７に示した例は、図６に示した例と、免疫法用前処理装置１０３、質量分析法用前処理装置１０５及び質量分析検出系１０６の構成は同等であるが、免疫法用測光検出系１０４の構成が異なっている。

図７に示した免疫法用測光検出系１０４は、反応テーブル１０３５に配置されたセル付き反応バイアル１０４７に近接してマグネット１０４８が配置され、光源１０４３からの光が、セル付き反応バイアル１０４７内の試薬及び試料に照射され、測光器１０４４で定量データが測定される。

そして、免疫法用測光検出系１０４の廃液が質量分析法用前処理装置１０５に供給される。

図８は、図１に示した、免疫分析システム１０２の、さらに他の装置構成例を示す図である。

図８に示した例は、図６に示した例と、免疫法用前処理装置１０３及び質量分析検出系１０６の構成は同等であるが、免疫法用測光検出系１０４及び質量分析法用前処理装置１０５の構成が異なっている。

図８に示した免疫法用測光検出系１０４において、免疫法用前処理装置１０３からの反応後の試料は、分注機構１０４６により、抗原遊離試薬と共にマグネット１０４１が配置されたセル１０４２に供給される。

試料は、セル１０４２において、光源１０４３からの光が照射され、測光器１０４４により測光されて定量データが検出される。

そして、免疫法用測光検出系１０４からの廃液が質量分析法用前処理装置１０５において、バッファー置換試薬により置換され、質量分析検出系１０６に供給される。

図９は、図１に示した、免疫分析システム１０２の、さらに他の装置構成例を示す図である。

図９に示した例は、図６に示した例と、質量分析検出系１０６の構成は同等であるが、免疫法用前処理装置１０３、免疫法用測光検出系１０４及び質量分析法用前処理装置１０５の構成が異なっている。

図９に示した免疫法用前処理装置１０３、免疫法用測光検出系１０４及び質量分析法用前処理装置１０５において、検体ラック１０３３に保持された試料が分注機構１０３１により、反応テーブル１０３５に配置されたセル付き反応バイアル１０４７に分注される。反応バイアル１０４７には、免疫法用試薬カートリッジ１０３６の試薬も分注されている。反応バイアル１０４７は、反応バイアルラック１０３８からバイアル移動機構１０３７により反応テーブル１０３５に移動される。

セル付き反応バイアル１０４７の近傍にはマグネット１０４８が配置され、光源１０４３からの光が反応バイアル１０４７内の試料に照射され、測光器１０４４により、定量データが得られる。

反応テーブル１０３５には、置換用バイアルラック１０４９からバイアル移動機構１０３７により移動された置換用バイアル１０３９が配置されている。セル付き反応バイアル１０４７の試料には、抗原遊離試薬が供給され、遊離抗原溶液が反応バイアル１０４７から置換用バイアル１０３９に供給され、バッファー置換試薬により置換された溶液が、質量分析検出系１０６に供給される。

図６〜図９に示した試料免役分析システム１０２のいずれにおいても、上述した本発明の効果を得ることができる。

次に、本発明の実施例２について説明する。

本発明の実施例２は、免疫法による測光測定のための試料を質量分析法による成分検出に応用する事例である。免疫法による二次抗体を用いたサンドイッチアッセイではなく、一次抗体で捕捉した測定対象物質および交差反応性を示す代謝物等の類似構造物質を質量分析法で定量するものである。

図１０は、本発明の実施例２における試料免役分析システム５０２全体の概略構成図であり、測定の流れを示すための図である。試料分析システム５０２全体の動作は、システム制御およびデータ処理用パーソナルコンピュータ５０６により制御される。

図１０、図１１において、生体由来の試料５０１（例えば、全血、血漿、血清、尿等）中の測定対象成分は、まず免疫法前処理装置５０３により免疫自動分析法に従って前処理され、測定対象成分６０５を特異的に認識する抗体６０４により選択的に捕捉される。予め抗体６０４は磁性粒子に対して、例えば、アビジン−ビオチン結合（６０２−６０３）等により結合した状態にしておく。磁性体６０６の磁力により測定対象成分について抗体６０４を介して捕捉した磁性粒子６０１を集め、周囲の夾雑物等を洗い流す。

捕捉した成分には、測定対象成分だけでなく、例えばその成分に由来する代謝物をはじめとする構造類似物質等による交差反応性を含んでいるため、抗体が本来認識すべき単一成分のみとは限らない。そこで、捕捉成分中の成分内訳（相対比率）を質量分析法で求める。

図１２に示すように、質量分析法用前処理装置５０４にて、抗原抗体反応により捕捉した成分３０５を回収する。例えば、抗原抗体反応産物を酸処理、アルカリ処理、イオン強度処理等により、抗原抗体反応を乖離させ、抗体３０４から抗原（測定対象成分３０５）を遊離させる。再び磁力で磁性ビーズ３０１を集め、上清を回収し、溶媒置換した後に質量分析検出系５０５に供給する。

質量分析検出系５０５にて、上清中に含まれている成分を質量分析する。得られたクロマトグラムから成分ごとのシグナル強度やピーク面積を求め、その相対比率を求める。別途、内部標準物質を用い、成分ごとの定量値を算出しても構わない。

図１３は、図１０に示した試料分析システム５０２の装置構成例を示す図である。

図１３に示した免疫法用前処理装置５０３において、検体ラック５０３３に収容された試料５０３２は、分注機構５０３１により、反応テーブル５０３５に配置された反応バイアル５０３４に分注される。また、免疫法用試薬カートリッジ５０３６に収容された試薬も、反応バイアル５０３４に分注される。反応バイアル５０３４は、反応バイアルラック５０３８から反応テーブル５０３５にバイアル移動機構５０３７により移動される。

また、質量分析法用前処理装置５０４において、免疫法用前処理装置５０３から供給された免疫反応後の溶液は、分注機構５０４６により、分注された抗原遊離試薬と混合され、マグネット５０４５の作用により、遊離抗原溶液が得られ、バッファー置換試薬により、置換されたサンプルが、質量分析検出系５０５に供給される。

質量分析系５０５は、イオン源５０６１と、質量分析部５０６２と真空ポンプ５０６３とを備える。そして、この質量分析検出系５０５により、質量分析され、スペクトルデータ５０７が得られる。

図１４は、図１０に示した、分析システム５０２の、さらに他の装置構成例を示す図である。

図１４に示した免疫法用前処理装置５０３及び質量分析法用前処理装置５０４において、検体ラック５０３３に保持された試料が分注機構５０３１により、反応テーブル５０３５に配置された反応バイアル５０３４に分注される。反応バイアル５０３４には、免疫法用試薬カートリッジ５０３６の試薬も分注されている。反応バイアル５０３４は、反応バイアルラック５０３８からバイアル移動機構５０３７により反応テーブル５０３５に移動される。

反応バイアル５０３４の近傍にはマグネット５０４８が配置される。反応テーブル５０３５には、置換用バイアルラック５０４９からバイアル移動機構５０３７により移動された置換用バイアル５０３９が配置されている。反応バイアル５０３４の試料には、抗原遊離試薬が供給され、遊離抗原溶液が反応バイアル５０３４から置換用バイアル５０３９に供給され、バッファー置換試薬により置換された溶液が、質量分析検出系５０５に供給される。

例えば、免疫法で捕捉した成分を免疫法用試薬に用いられている捕捉器材（例えば磁気ビーズ）から遊離させた後、磁気ビーズをマグネットで捕捉したときの上清（反応溶液）を固相抽出処理することにより、測定対象成分のみを抽出しても構わない。

固相抽出剤は、測定対象成分の物性に応じて選択する。例えば、測定対象成分と発光検出試薬の分子サイズ、疎水性、イオン性が異なる場合、各々サイズ分画、逆相分離、イオン交換分離等の抽出モードを応用することで、両者を分離回収することが可能となる。このような固相抽出処理を実施するために、必要に応じて上清（反応溶液）の組成、濃度、pH等の条件を変更しても構わない。

免疫反応および固相抽出処理工程は、図１５に示した順序にしたがって行われる。

この工程を自動処理するためには、例えばターンテーブル上の区画ごとに免疫反応および固相抽出を実施するための機構を配置することで可能となる（図１６）。以下に、免疫反応および固相抽出を同一ターンテーブル上で自動処理する場合の流れを説明する。

図１５に免疫反応および固相抽出処理のフローを示す。免疫反応は、免疫試薬を用いた抗原抗体反応による検体中の測定対象成分の捕捉工程、夾雑成分の洗浄除去工程、免疫試薬からの測定対象成分の遊離工程で構成される。一方、固相抽出処理は、有機溶媒とH₂Oを用いた固相抽出充填剤のコンディショニング工程、固相抽出充填剤への試料供試工程、固相抽出充填剤に非特異吸着した夾雑物の洗浄除去工程、固相抽出充填剤に特異的に吸着させたターゲット成分の溶出回収工程で構成される。得られた抽出物は、例えば質量分析装置等に供試することにより、それに含まれている成分の同定あるいは定量を行うことで臨床検査に用いることができる。

同一ターンテーブル上で上記免疫反応および固相抽出処理を行う場合、免疫反応処理中に固相抽出剤のコンディショニング工程を並行して実施し、免疫反応を応用して得られた測定対象成分を粗精製した溶液（抗原抽出溶液）を得るタイミングと固相抽出剤のコンディショニング完了のタイミングを合わせる必要がある。例えば、図１８に示したように、最初のステップとして試料１の免疫反応処理の区画Ｓから始まった場合、免疫反応処理の区画Uに到達したと同時に固相抽出処理の区画Ａが開始し、免疫反応処理の区画Ｚに到達したときに得られる抗原抽出溶液を固相抽出処理の区画Ｆに添加することで、試料１の免疫反応は完了し、残りの固相抽出処理のみ引き続き実行される。

試料２以降も同様に処理され、それらの開始のタイミングは、前の試料が区画Ｔに移行することで区画Ｓが空いている場合に実行される。

したがって、区画Ｚから区画Ｆに抗原抽出液を移す場合には、同一の分注機構を兼用することが望ましい。

固相抽出処理においては、試薬あるいは試料等を固相抽出剤に対して通液させるため、圧力印加を行う（固相抽出カートリッジ上流側の加圧処理あるいは下流側の陰圧処理で実施）。固相抽出剤を通過して排出される溶液は、最終工程の溶出回収工程で得られるもののみを回収して分析に供試するが、それ以外の各工程から排出される溶液はいずれも廃液として処置する。

図１６に固相抽出カラムと回収デバイスが分離している個別型の固相抽出カートリッジを用いた場合の固相抽出処理を自動化するためのシステム構成の上面図の事例を示す。臨床検査等で求められる検体あるいは検査項目ごとに対応したランダム性を実現するため、例えば、免疫反応処理容器をターンテーブルの同心円周上に８区画配列し（区画Ｓ〜Ｚに位置するカートリッジ保持部９７１〜９７８に配置）、固相抽出カートリッジをターンテーブルの同心円周上に14区画配列し（区画Ａ〜Ｎに位置するカートリッジ保持部９０１〜９１４に配置）、図１５記載のフローおよび図１８記載のシーケンスにしたがって、免疫反応および固相抽出処理を構成する各工程を同円周上で並行して順次実施する仕組みになっている。以下に血中薬物濃度測定を事例にして具体的な操作手順を説明する。なお、システムには処理工程の状況を監視するためのモニタリング機構（９３８）を備え、システム全体の制御およびデータ解析等の演算はPC（９３７）で実施する。

免疫反応処理は以下の手順で行われる。

最初にターンテーブル上の区画Ｓに位置するカートリッジ保持部（９７１）に免疫反応容器を器材移動機構により搬送する。

次に、ターンテーブル上の区画Ｔに位置するカートリッジ保持部（９７２）に移動し、免疫反応容器に検体が添加される。

次に、ターンテーブル上の区画Uに位置するカートリッジ保持部（９７３）に移動し、免疫試薬が添加される。

次に、ターンテーブル上の区画Ｖに位置するカートリッジ保持部（９７４）に移動し、容器内の検体と試薬が撹拌される。

次に、ターンテーブル上の区画Ｗに位置するカートリッジ保持部（９７５）に移動し、検体中の抗原を捕捉した磁性ビーズをマグネットで集め、反応溶液を除去し、洗浄液により磁性ビーズ洗浄後、洗浄液を除去する。

次に、ターンテーブル上の区画Xに位置するカートリッジ保持部（９７６）に移動し、抗原遊離液が添加される。

次に、ターンテーブル上の区画Yに位置するカートリッジ保持部（９７７）に移動し、容器内の溶液が撹拌される。

次に、ターンテーブル上の区画Ｚに位置するカートリッジ保持部（９７８）に移動し、磁性ビーズをマグネットで集め、遊離した抗原を有する溶液を回収し、区画Ｆに位置するコンディショニング済みの固相抽出剤に供試する。その際、必要に応じて抗原抽出溶液の組成（条件）を適宜調整しても構わない。また、使用済みの免疫反応容器を廃棄する。

固相抽出処理は、免疫反応処理に並行して以下の手順で行われる。

最初に、免疫反応処理が区画Uに到達したのと同期して、固相抽出カートリッジ移動機構（９４１）が固相抽出カートリッジストック機構（９３１）から1本の固相抽出カートリッジをターンテーブル（９２１）上の区画Ａに位置するカートリッジ保持部（９０１）に搬送する。この固相抽出カートリッジを便宜的にＣ１と仮称して以下を説明する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計回りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Bに位置するカートリッジ保持部（９０２）に移動する。Ｃ１に対してコンディショニング用有機溶媒分注機構（９４２）が一定量の有機溶媒（例えば１００%メタノール）を分注する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Cに位置するカートリッジ保持部（９０３）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、有機溶媒を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Dに位置するカートリッジ保持部（９０４）に移動する。Ｃ１に対してコンディショニング用Ｈ_２Ｏ分注機構（９４２）が一定量のＨ_２Ｏを分注する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｅに位置するカートリッジ保持部（９０５）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、有機溶媒を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｆに位置するカートリッジ保持部（９０６）に移動する。Ｃ１に対して、区画Ｚで回収した抗原抽出溶液を供試する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｇに位置するカートリッジ保持部（９０７）に移動する。Ｃ１に対して、内部標準物質分注機構（９４２）が内部標準物質配置機構（９３３）の内部標準物質分注位置に配置した内部標準物質容器から一定量の内部標準物質を採取して分注する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Hに位置するカートリッジ保持部（９０８）に移動する。Ｃ１に対して撹拌機構（９４４）で検体と内部標準物質を撹拌する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｉに位置するカートリッジ保持部（９０９）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、検体と内部標準物質の混合溶液を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｊに位置するカートリッジ保持部（９１０）に移動する。Ｃ１に対して洗浄液分注機構（９４２）が一定量の洗浄液を分注する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｋに位置するカートリッジ保持部（９１１）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、洗浄液を固相抽出剤に通液させる。廃液はドレインあるいは廃液回収容器等で回収した後、廃棄する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｌに位置するカートリッジ保持部（９１２）に移動する。Ｃ１に対して溶出液分注機構（９４２）が一定量の溶出液を分注する。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｍに位置するカートリッジ保持部（９１３）に移動する。Ｃ１に対して圧力付加機構（９４３）で加圧することにより、洗浄液を固相抽出剤に通液させる。図１７に区画Ｍにおけるシステム構成の側面図を示す。固相抽出カートリッジ（１００１）Ｃ１から排出された溶出液は、回収容器配置機構（９３４、１００６）上のＣ１排出口直下の位置に待機している回収容器（１００２）で回収する。また、質量分析工程に移行するために、溶出液を回収した回収容器（１００２）は回収容器設置機構（９３４、１００６）の所定の位置に移動した後、溶出液は質量分析装置（９３６、１００７）にオンラインあるいはオフライン方式により供試され、溶出液中の目的成分を分離しながら定量する。

例えば、オフライン方式によるＭＳへのサンプル供試事例として、抽出物を分注機構が必要量吸液し、ＭＳのイオン源に直接的あるいは間接的（例えばフローインジェクション方式）に導入することが挙げられる。

続いて、ターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転し、Ｃ１は区画Ｎに位置するカートリッジ保持部（９１４）に移動する。固相抽出カートリッジ移動機構（９４１）がターンテーブル（９２１）からＣ１を回収してカートリッジ廃棄部（９３５）に廃棄する。

以上がターンテーブル上で行われる一連の作業であり、次にターンテーブル（９２１）が時計周りに1区画分回転すると、Ｃ１廃棄後の空のカートリッジ保持部は区画Ａ（９５１）に戻り、固相抽出処理が1処理分完了となる。

固相抽出処理後の回収容器は、廃棄する代わりに回収アームによりターンテーブルから取り外されて、保存することも可能である。抽出物を再測定する場合には、保存している回収容器をターンテーブルの空いた区画に設置し、例えば回収容器がバーコード管理されている場合にはそれを自動認識し、その回収容器をＭＳにロードする位置に移動し、再測定を行う。

保存中の回収容器は、必要に応じて抽出物の乾燥を避けるために回収容器上端に蓋をしても構わない。乾燥した場合であっても、溶媒で再溶解することで再測定を行うことができる。そのときの溶媒添加量は、例えば固相抽出時の抽出物の液面（あるいは容量）のモニタリング値から、測定に消費した容量を差し引いた値に制御する。

例えば、前述においてＣ１が区画Ｂに位置するカートリッジ保持部（９０２）に移動した後の区画Ａに位置することになる空のカートリッジ保持部には、新たな固相抽出カートリッジ（１００１）としてＣ２（仮称）が投入され、Ｃ２により２検体目の処理がＣ１に続いて1区画（作業）遅れで開始される。３検体目以降も同様にＣ２に引き続いて処理されるため、ターンテーブル（９２１）上では区画数に相当する合計１４検体分の処理が順繰りに並行して行われることになる。再検査の場合も同様に処理される。

図１３、図１４に示した試料分析システム５０２のいずれにおいても、上述した本発明の効果を得ることができる。

本発明は、免疫法による測定データの高精度化に有効であり、基礎研究分野、医療、創薬、検査、診断等の各分野に幅広く適用することが可能である。

本発明は、免疫法および質量分析法が抱えている問題点を相互補完することで解決し、より高精度の信頼性の高い臨床検査結果を提供することができる。

すなわち、免疫法による測定対象成分の定量を行った際に、交差反応性によって生じる真値からの乖離を、質量分析法による定量成分内訳の相対比率を求めることにより補正する。このことにより、内訳を構成している成分ごとの定量値に換算することで、免疫法では得られない交差反応成分と測定対象成分の定量値を個別に求めることにある。

また、合わせて各内訳成分の薬効に関する相対値に基づいて、例えば代謝物を含む正確な薬効を求めることもできる。免疫法の簡便かつ高速な測光定量と質量分析法による内訳成分の相対値算出の両方を活かすことにより、両測定手法のデメリット、すなわち免疫法の交差反応性および質量分析法の定量性能を相互補完し、今までにない簡便かつ高精度な臨床検査技術を実現することができる。

１０１、５０１、１０３２・・・試料、１０２、５０２・・・免役分析システム、１０３、５０３・・・免疫法用前処理装置、１０４・・・免疫法用測光検出系、１０５、５０４・・・質量分析法用前処理装置、１０６、５０５・・・質量分析検出系、１０７、５０６・・・システム制御およびデータ処理用パーソナルコンピュータ、１０３１、１０４６、５０３１、５０４６・・・分注機構、１０３３、５０３３・・・検体ラック、１０３４、５０３４・・・反応バイアル、１０３５・・・反応テーブル、１０３６、５０３６・・・免疫法用試薬カートリッジ、１０３７、５０３７・・・バイアル移動機構、１０３８、５０３８・・・反応バイアルラック、１０３９、５０３９・・・置換用バイアル、１０４１、１０４５、１０４８、５０４５、５０４８・・・マグネット、１０４２・・・セル、１０４３・・・光源、１０４４・・・測光器、１０４７・・・セル付き反応バイアル、１０４９、５０４９・・・置換用バイアルラック、１０６１、５０６１・・・イオン源、１０６２、５０６２・・・質量分析部、１０６３、５０６３・・・真空ポンプ

Claims

免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物（１０１、５０１、１０３２）を、抗体を用いて捕捉し、
捕捉した測定対象物（１０１、５０１、１０３２）の定量を行い、
測定対象物の定量を行った廃液から上記測定対象物（１０１、５０１、１０３２）を回収し、
回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定することを特徴とする免疫分析方法。
請求項１記載の免疫分析方法において、免疫分析法による前処理（１０３）により、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉し、捕捉した測定対象物に光を照射して測定対象物の定量を行うことを特徴とする免疫分析方法。
請求項２記載の免疫分析方法において、上記定量が行われた測定対象物の回収は、一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて回収することを特徴とする免疫分析方法。
請求項２記載の免疫分析方法において、上記質量分析法により、上記免疫法により行った測定対象物の成分比率を算出し、上記免疫法で算出した定量値に対して上記成分比率を掛け合わせることにより、成分毎の定量値を補正することを特徴とする免疫分析方法。
請求項１記載の免疫分析方法において、上記測定対象物の定量を行った廃液から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収し、回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行うことを特徴とする免疫分析方法。
免疫分析システムにおいて、
免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉する免疫法用前処理手段（１０３）と、
捕捉した測定対象物の定量を行う免疫法用検出手段（１０４）と、
測定対象物の定量を行った廃液から上記測定対象物を回収する質量分析法用前処理手段（１０５）と、
回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定する質量分析手段（１０６）と、
を備えることを特徴とする免疫分析システム。
請求項６記載の免疫分析システムにおいて、上記免疫法用前処理手段（１０３）は、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉し、上記免疫法用検出手段（１０４）は、捕捉した測定対象物に光を照射して測定対象物の定量を行うことを特徴とする免疫分析システム。
請求項７記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析法用前処理手段（１０５）は、測定対象物を、一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて回収することを特徴とする免疫分析システム。
請求項７記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析手段（１０６）は、上記免疫法により行った測定対象物の成分比率を算出し、上記免疫法用検出手段（１０４）が算出した定量値に対して上記成分比率を掛け合わせることにより、成分毎の定量値を補正することを特徴とする免疫分析システム。
請求項６記載の免疫分析システムにおいて、上記質量分析法用前処理手段（１０５）は上記免疫法用検出手段（１０４）が測定対象物の定量を行った廃液から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収することを特徴とする免疫分析システム。
免疫分析システムにおいて、
免疫分析法による前処理により、試料溶液中の測定対象物を抗体を用いて捕捉する免疫法用前処理手段（１０３）と、
捕捉した測定対象物から上記測定対象物を回収する質量分析法用前処理手段（１０５）と、
回収した測定対象物を質量分析法により、質量分析を行い、上記免疫法により行った測定対象物の成分を測定する質量分析手段（１０６）と、
を備え、
上記質量分析法用前処理手段（１０５）は上記測定対象物から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収し、
上記測定対象物から抗原抗体反応により抗原を捕捉し、捕捉した抗原を遊離化した後に回収する工程を固相抽出処理で行い、
目的が異なる複数の処理工程として、固相抽出処理および免疫反応処理を、同一の無限軌道上で並行して自動処理することを特徴とする免疫分析システム。
請求項１１記載の免疫分析システムにおいて、上記免疫法用前処理手段（１０３）は、試料溶液中の測定対象物を一次抗体（２０４）、二次抗体（２０６）及び磁性粒子（２０１）を用いて捕捉することを特徴とする免疫分析システム。
請求項１１記載の免疫分析システムにおいて、免疫反応により粗精製した抗原を遊離回収した溶液を得る工程と、その溶液をコンディショニング済みの固相抽出剤に供試することが同期することを特徴とする免疫分析システム。
請求項１１記載の免疫分析システムにおいて、免疫反応により粗精製した抗原を遊離回収した溶液を回収する分注機構と、その溶液をコンディショニング済みの固相抽出剤に供試する分注機構が同一であることを特徴とする免疫分析システム。