CN111512154B - 针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供简便并且/或者高精度地进行针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测的方法。具体而言,本发明提供针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测方法,其包含:(a)用酸或碱对包含大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的血液样品进行处理,所述代谢产物具有大环内酯结构;和(b)使用抗体,对血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测方法等。
背景技术
例如他克莫司(FK506)、环孢菌素A等大环内酯类免疫抑制剂,对避免器官移植后的排异反应、自身免疫疾病的治疗等是有效的,但是为了将用于适当治疗的血液中药物浓度确保在适当的治疗浓度域内,在治疗期间中需要监测血液中药物浓度。
给药的他克莫司和环孢菌素A的大部分,存在于患者血中红细胞成分。因此,作为治疗药物监测(TDM,Therapeutic Drug Monitoring)中的血液样品,使用包含红细胞成分的全血。
然而,在全血等的血液样品包含针对药物的结合蛋白的情况下,为了对血液样品中的药物浓度进行测定,必须通过适当的预处理使血液样品中的药物从其结合蛋白解离。在这样的预处理中,通常而言,使用有机溶剂、变性剂、表面活性剂等化学物质。
例如,作为记载这样的预处理的现有技术,可以举出以下技术。
专利文献1中记载了两性离子表面活性剂和皂苷的使用。
专利文献2中记载了包含非离子类表面活性剂(例如,皂苷)或辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的溶血剂、和包含胆盐表面活性剂的提取剂的使用。
专利文献3中记载了包含二甲基亚砜(DMSO)、二醇(例如,乙二醇)和锌盐类(例如,硫酸锌)的试剂的使用。
专利文献4中记载了蛋白酶、二醇(例如,乙二醇)和醇(例如,甲醇)的使用。
专利文献5中记载了包含二醇(例如,乙二醇)、醇(例如,甲醇)和盐(例如,氯化钠)的提取试剂样品的使用。
专利文献6中记载了皂苷、甲醇、乙二醇和硫酸锌的使用。
专利文献7中记载了溶血剂和表面活性剂[例如,离子性表面活性剂(例如,SDS)、非离子性表面活性剂(例如,Triton X-405)]的使用。
专利文献8中记载了游离剂(例如,疏水性药物的类似体)、和选择性可溶剂(例如,乙二醇、甘油、1-甲氧基-2-丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基砜或二甲基甲酰胺)的使用。
此外,许多这样的预处理中,为了使药物从其结合蛋白解离后,使药物与其结合性蛋白质分离,而需要进行蛋白质成分的沉淀操作(离心分离)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2008-538001号公报
专利文献2:日本专利第5124467号
专利文献3:日本专利第5134692号
专利文献4:日本专利第5450092号
专利文献5:日本专利第4968611号
专利文献6:日本专利第5174898号
专利文献7:日本专利第5690888号
专利文献8:日本专利第4940438号
发明内容
发明所解决的技术问题
在如上所述的现有技术中,需要用特殊的物质对样品进行的预处理和沉淀操作,作为试验(Assay)而易于变得复杂,由此出发,存在试验难以简便化这样的问题。
此外,在使用挥发性较高的有机溶剂的方法中,由于提取的各阶段、试验中的培养(incubation)期间发生有机溶剂的蒸发,因此,还存在药物的浓度的测定值表观上显示出较高的值、缺乏精确度这样的问题。
因此,本发明的目的在于,提供可以简便和/或高精度地进行针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测的代替性方法。
解决问题的技术手段
本发明人等进行了深入研究,结果发现,在用抗体进行针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测的情况下,采用酸或碱进行的血液样品的预处理是有效的,并且通过这样的预处理可以解决所述问题,完成了本发明。
即,本发明如下所述。
[1]一种血液检测方法,其针对大环内酯类免疫抑制剂,并且包含:
(a)用酸或碱对包含大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的血液样品进行处理,所述代谢产物具有大环内酯结构;和
(b)使用抗体,对血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
[2]根据[1]的方法,其中,大环内酯类免疫抑制剂为他克莫司、环孢菌素A或依维莫司。
[3]根据[1]或[2]的方法,其中,
血液样品为人血液样品。
[4]根据[1]~[3]中的任一项的方法,其中,
所述血液样品的处理为采用酸进行的处理。
[5]根据[4]的方法,其中,
所述采用酸进行的处理通过将所述血液样品与酸性缓冲液混合来进行。
[6]根据[5]的方法,其中,
酸性缓冲液的pH为1.0~5.0。
[7]根据[1]~[6]中的任一项的方法,其中,
针对免疫抑制剂的抗体为IgG、IgM或它们的抗体片段。
[8]根据[1]~[7]中的任一项的方法,其包含:
(a’)用酸或碱对包含所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的血液样品进行处理,制备酸性血液样品或碱性血液样品;和
(b’)使用抗体,对所述酸性血液样品或所述碱性血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
[9]根据[1]~[7]中的任一项的方法,其包含:
(a”)用酸或碱对包含所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的血液样品进行处理而制备酸性血液样品或碱性血液样品后,进行中和,制备中性血液样品;和
(b”)使用抗体,对所述中性血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
[10]根据[9]的方法,其中,
所述中和通过使包含离液变性剂的中和液与所述酸性血液样品或碱性血液样品混合而进行。
[11]一种血液检测试剂,其针对大环内酯类免疫抑制剂,并且包含:
(1)酸或碱;和
(2)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的抗体,所述代谢产物具有大环内酯结构。
[12]根据[11]的试剂,其中,
酸为酸性缓冲液。
[13]根据[11]或[12]的试剂,其进一步包含(3)中和液。
发明效果
本发明可以良好地进行针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测。
例如,本发明能够实现简便且高精度、并且处理能力高的检测。
更具体而言,如果根据本发明,则能够通过包含大环内酯类免疫抑制剂及其代谢产物的血液样品的酸性化(例如,血液样品和酸性缓冲液的混合)或碱性化(例如,血液样品和碱性缓冲液的混合)这样的简便的操作(预处理),用抗体顺利地测定酸性血液样品中或碱性血液样品中的大环内酯类免疫抑制剂及其代谢产物的浓度。由此,能够避免与个人的技术熟练度对应的测定值的变动,并且能够改善检测的处理能力(高通量)。
此外,如果根据本发明,则由于有机溶剂的使用不是必须的,因此能够避免有机溶剂的蒸发引起的浓缩,能够高精度地测定大环内酯类免疫抑制剂及其代谢产物的浓度。
附图说明
[图1-1]图1-1是表示各种pH条件下的从他克莫司结合蛋白解离的他克莫司的免疫测定的图。固相抗体:抗他克莫司抗体(作为本公司抗体的小鼠IgG);检测抗体:抗他克莫司鸡IgM。
[图1-2]图1-2是表示各种pH条件下的从他克莫司结合蛋白解离的他克莫司的免疫测定的图。固相抗体:抗他克莫司抗体(作为市售抗体的小鼠IgM);检测抗体:抗他克莫司鸡IgM。
[图1-3]图1-3是表示各种pH条件下的从他克莫司结合蛋白解离的他克莫司的免疫测定的图。固相抗体:抗他克莫司抗体(作为市售抗体的小鼠IgG);检测抗体:抗他克莫司鸡IgM。
[图2]图2是表示用酸对包含他克莫司(校准曲线物质)及其结合蛋白的血液样品进行了预处理的情况下他克莫司浓度的测定值与检测材料中他克莫司的加标浓度的相关性的图。
[图3]图3是表示各种pH条件下的从环孢菌素A结合蛋白解离的环孢菌素A的免疫测定的图。固相抗体:抗他克莫司抗体(作为本公司抗体的小鼠IgG);检测抗体:抗他克莫司鸡IgM。
[图4]图4是表示用酸对包含环孢菌素A(校准曲线物质)及其结合蛋白的血液样品进行了预处理的情况下的环孢菌素A浓度的测定值与检测材料中的环孢菌素A的加标浓度的相关性的图。
[图5-1]图5-1是表示与中性溶液中的各种他克莫司类似化合物的浓度对应的抗他克莫司抗体与生物素标记他克莫司的结合率(%)的图。
[图5-2]图5-2是表示与酸性溶液中的各种他克莫司类似化合物的浓度对应的抗他克莫司抗体与生物素标记他克莫司的结合率(%)的图。
[图6]图6是表示同时存在酸性溶液中的他克莫司及其特异性结合蛋白的结合的解离和抗体对解离的他克莫司进行结合的图。
[图7]图7是表示在全血检测材料的预处理中使用了碱性溶液的情况下从他克莫司结合蛋白解离的他克莫司的免疫测定的结果的图。固相抗体:抗他克莫司抗体(作为本公司抗体的小鼠IgG);检测抗体:抗他克莫司鸡IgM。
[图8-1]图8-1是表示对全血检测材料在酸处理后用含有尿素的中和液进行处理而得的检测材料中与各他克莫司浓度对应的免疫测定的结果的图。
[图8-2]图8-2是表示对全血检测材料在酸处理后用含有盐酸胍的中和液进行处理而得的检测材料中与各他克莫司浓度对应的免疫测定的结果的图。
[图9]图9是表示对全血检测材料在酸处理后用含有盐酸胍的中和液进行处理而得的检测材料中与各依维莫司的浓度对应的、抗依维莫司抗体与依维莫司-BSA缀合物的结合率(%)的图。
具体实施方式
本发明提供针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测方法,所述血液检测方法包含:
(a)用酸或碱对包含大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的血液样品进行处理,所述代谢产物具有大环内酯结构;和
(b)使用抗体,对血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
本发明中使用的血液样品是包含大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的动物血液样品,所述代谢产物具有大环内酯结构。这样的血液样品能够从给药了大环内酯类免疫抑制剂的动物中采集。动物血液样品中,包含针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的结合蛋白,大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和结合蛋白能够相互结合而形成复合体。这样的血液样品所源自的动物优选为哺乳动物(例如,人、猴子、黑猩猩等灵长类;小鼠、大鼠、兔等啮齿类;和牛、猪、马、山羊、绵羊等家畜和使役动物),更优选为灵长类,特别优选为人。此外,作为血液样品,例如可举出:全血、血清、血浆和其它血液成分。由于大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和针对它们的结合蛋白的大部分存在于给定的血液成分(例如,红细胞成分)中,因此,在大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的血中浓度的测定中,可以使用这样的血液成分或包含这样的血液成分的血液样品(例如,全血)。从省略分离操作并且简便地对浓度进行测定的观点出发,作为血液样品,优选使用全血。此外,血液样品优选是从患有期望的免疫抑制的疾病(例如,自身免疫疾病、类风湿关节炎、重症肌无力症、克罗恩病、狼疮性肾炎、活动期溃疡性结肠炎、多发性肌炎、移植物抗宿主病(GVDH)、皮肌炎合并间质性肺炎)的哺乳动物或接受了内脏器官、组织或者细胞的移植(例如,心脏移植、肾脏移植、骨髓移植、肺移植、肝移植、胰脏移植、小肠移植)的哺乳动物采集的血液。从这样的哺乳动物采集的血液样品可以进行预备处理(例如,过滤、加热、溶血)。
大环内酯类免疫抑制剂是包含大环内酯结构(由12个以上的原子构成的环状内酯结构),并且使免疫系统的活动降低或具有抑制作用的化合物。作为大环内酯类免疫抑制剂,可举出:他克莫司(FK506)、环孢菌素A、西罗莫司(雷帕霉素)及其衍生物(例如,依维莫司、替西罗莫司(Temsirolimus))、佐他莫司、Biolimus、Novolimus、吡美莫司、Miorimusu、Maiorimusu和Deforolimus。
具有大环内酯结构的大环内酯类免疫抑制剂的代谢产物,根据大环内酯类免疫抑制剂的种类而不同,但是只要能够结合与大环内酯类免疫抑制剂的种类对应的结合蛋白,则没有特别限定。例如公开了,在大环内酯类免疫抑制剂为他克莫司的情况下,作为具有大环内酯结构的他克莫司代谢产物,例如可举出13-O-去甲基他克莫司(MI)、31-O-去甲基他克莫司(MII)、15-O-去甲基他克莫司(MIII)、12-O-羟基他克莫司(MIV)、15,31-O-双去甲基他克莫司(MV)、13,31-O-双去甲基他克莫司(MVI)、13,15-O-双去甲基他克莫司(MVII)、MVIII他克莫司、C22肟他克莫司、C24琥珀酸他克莫司、C32琥珀酸他克莫司(Clin.Chem.,2014Apr,60(4),621-30);并且这样的他克莫司代谢产物与他克莫司结合蛋白结合而能够形成复合体(Ther.Drug.Monit.,1999Jun,21(3),274-80;Biochem.Biophys.Res.Commun.,1994Jul,15,202(1),437-43;Drug Metabolism and Disposition,November 1993,21(6),971-977)。公开了,在大环内酯类免疫抑制剂为环孢菌素A的情况下,作为具有大环内酯结构的环孢菌素A代谢产物,例如可举出环孢菌素AM1、环孢菌素AM9、环孢菌素AM4N、环孢菌素AM1c、环孢菌素AM19(Br.J.Clin.Pharmacol.,2003Feb,55(2),203-11);并且这样的环孢菌素A代谢产物与环孢菌素A结合蛋白结合而能够形成复合体(Clin.Biochem.,1991Feb,24(1),71-4;CLIN.CHEM.,37(3),403-410(1991))。公开了,作为具有大环内酯结构的西罗莫司代谢产物,例如可举出16-O-去甲基西罗莫司、24-羟基西罗莫司、25-羟基西罗莫司、46-羟基西罗莫司、39-O-去甲基西罗莫司、7-O-去甲基西罗莫司、32-O-去甲基西罗莫司、41-O-去甲基西罗莫司、羟基西罗莫司、seco-西罗莫司、11-羟基西罗莫司、3,4-二氢二醇西罗莫司、5,6-二氢二醇西罗莫司(Ther.Drug.Monit.,2015Jun,37(3),395-9;Rapalimus 1mg制造贩卖批准申请书附加资料第2部(模块2)2.4非临床试验的概括评价);并且这样的西罗莫司代谢产物与西罗莫司结合蛋白结合而能够形成复合体(Clin.Biochem.,1996Aug,29(4),309-13)。作为具有大环内酯结构的依维莫司代谢产物,例如,46-羟基依维莫司、24-羟基依维莫司、25-羟基依维莫司、45-羟基依维莫司、2-羟基依维莫司、11-羟基依维莫司、14-羟基依维莫司、39-O-去甲基依维莫司、27-O-去甲基依维莫司、40-O-去乙基羟基依维莫司(西罗莫司)(Ther.Drug Monit.,2007Dec,29(6),743-9)。就大环内酯类免疫抑制剂和具有大环内酯结构的大环内酯类免疫抑制剂的代谢产物而言,虽然应该考虑个体差异等因素,但是可以以给定的比例而存在于人等动物的血液中。因此,针对大环内酯类免疫抑制剂的血液检测,可以通过血液样品中的代谢产物的浓度测定而间接性地进行。优选血液检测可以通过大环内酯类免疫抑制剂的浓度测定而进行。
作为血液样品中包含的针对大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的结合蛋白,对于人等哺乳动物已知有内源性的各种蛋白质,所述代谢产物具有大环内酯结构。更具体而言,作为针对他克莫司(FK506)或其具有大环内酯结构的代谢产物的特异性结合蛋白,例如可举出FK506结合蛋白(FKBP)(例如,FKBP12、FKBP13、FKBP14、FKBP2、FKBP3)。作为针对环孢菌素A或其具有大环内酯结构的代谢产物的特异性结合蛋白,例如可举出亲环素A、亲环素B。作为针对西罗莫司(雷帕霉素)及其衍生物或它们的具有大环内酯结构的代谢产物的特异性结合蛋白,例如可举出FKBP12。这样的特异性结合蛋白主要存在于红细胞成分。此外,作为针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的非特异性结合蛋白,例如可举出:白蛋白、脂蛋白、α1-酸性糖蛋白。
作为本发明的方法中使用的酸,可以利用能够使血液样品酸性化的任意的酸。作为这样的酸,例如可举出:无机酸(例如,磷酸、硼酸、碳酸、盐酸、硫酸、硝酸)、有机酸(例如,乙酸、柠檬酸、甘氨酸、酒石酸、2-吗啉代乙磺酸(MES)、甲酸、草酸、乳酸、马来酸、三氟乙酸、苯二甲酸)和它们的2种以上(例如,2种、3种、4种或5种)的混合物。
此外,作为本发明的方法中使用的碱,可以利用能够使血液样品碱性化的任意的碱。作为这样的碱,例如可举出:无机碱(例如,氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙等金属(例如,一价金属、二价金属)的氢氧化物、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙等金属(例如,一价金属、二价金属)的碳酸氢盐、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙等金属(例如,一价金属、二价金属)的碳酸盐、磷酸钠、磷酸钾等金属(例如,一价金属)的磷酸盐、硼酸钠、硼酸钾等金属(例如,一价金属)的硼酸盐、氨)、有机碱(例如,三甲胺和三乙胺等胺、吡啶等含氮杂环化合物)和它们的2种以上(例如,2种、3种、4种或5种)的混合物。
在本发明的方法中,血液样品的处理可以使用酸或碱中的任一种,但是从血液样品中的大环内酯类免疫抑制剂的检测灵敏度的观点出发,作为血液样品的处理,更优选进行采用酸进行的处理。以下,对采用酸或碱进行的处理进行详细说明。
作为包含大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的血液样品的采用酸或碱进行的处理,只要是能够使血液样品的酸性度增强(换言之,能够使pH降低)或碱性度增强(换言之,能够使pH上升)至能够使大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和针对它们的结合蛋白解离的程度的处理,则没有特别限定,例如可举出:血液样品与酸性溶液(例如,酸性缓冲液、没有缓冲能力的酸性溶液)或碱性溶液(例如,碱性缓冲液、没有缓冲能力的碱性溶液)的混合(换言之,血液样品的稀释)、和酸(固体)或碱(固体)向血液样品中的溶解,但是从操作的简便性等观点出发,优选血液样品与酸性溶液或碱性溶液的混合。
就待处理的血液样品的容量而言,只要能够通过本发明的方法对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物进行测定,则没有特别限定,例如为0.1~500μL,优选为0.5~400μL,更优选为1.0~300μL,进一步优选为2.0~200μL。就应该与血液样品混合的酸性溶液或碱性溶液的容量而言,只要能够使血液样品的酸性度或碱性度增强至能够使大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和针对它们的结合蛋白解离的程度,则没有特别限定,例如为0.5~5000μL,优选为1.0~3000μL,更优选为2.0~1000μL,进一步优选为5.0~500μL。就血液样品与酸性溶液或碱性溶液的混合比例(血液样品/酸性溶液、或血液样品/碱性溶液)而言,只要能够使血液样品的酸性度或碱性度增强,则没有特别限定,例如为1/100~100,优选为1/50~50,更优选为1/30~30,进一步优选为1/20~20。血液样品是源自如上所述的动物的样品,表现出中性的性质。当用酸处理这样的血液样品时,能够使其中包含的大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物从其结合蛋白解离。因此,通过这样的处理,而能够制备处于从结合蛋白解离的状态的、包含大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的酸性血液样品或碱性血液样品。为了使大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物从结合蛋白充分解离,优选在混合或溶解后,在给定的温度条件下,设定用于充分解离的时间(例如,放置)。另一方面,为了极力避免采用酸进行的成分(例如,大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物)的水解,而优选温度不高、时间不长。这样的温度例如为5~45℃,优选为15~40℃。作为这样的时间,例如为10秒~60分钟,优选为20秒~30分钟,更优选为30秒~15分钟。
在用酸性溶液进行血液样品的处理的情况下,从酸性血液样品的简便并且迅速的制备和对酸性血液样品的一定酸性度的赋予等观点出发,优选处理为血液样品与酸性缓冲液的混合。作为酸性缓冲液,可以使用包含能够在酸性区域中表现出缓冲能力的任意的酸的缓冲液。作为这样的酸,例如可举出:无机酸(例如,磷酸、硼酸、碳酸)、有机酸(例如,乙酸、柠檬酸、甘氨酸、酒石酸、2-吗啉代乙磺酸(MES)、三氟乙酸、苯二甲酸)以及它们的2种以上(例如,2种、3种、4种或5种)的混合物。
酸性缓冲液等酸性溶液的pH可以根据大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和其结合蛋白的种类和浓度等因素而变动,例如为1.0~5.0。作为pH1.0~5.0的酸性溶液,优选能够在这样的pH的酸性区域中表现出缓冲能力的缓冲液。作为这样的缓冲液,例如可举出:磷酸缓冲液、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、三氟乙酸缓冲液、苯二甲酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液。从极力排除所述因素的影响并且提高通用性等观点出发,pH可以优选为1.5以上,更优选为2.0以上,进一步优选为2.5以上。此外,pH可以优选为4.8以下,更优选为4.5以下。更具体而言,pH可以优选为1.5~4.8,更优选为2.0~4.8,进一步优选为2.5~4.8,特别优选为2.5~4.5。pH的测定可以使用该领域中公知的方法进行。优选pH可以采用使用具有玻璃电极的pH计在25℃下测定得到的值。
在用碱性溶液进行血液样品的处理的情况下,从碱性血液样品的简便并且迅速的制备和对碱性血液样品的一定碱性度的赋予等观点出发,优选处理为血液样品与碱性缓冲液的混合。作为碱性缓冲液,可以使用包含能够在碱性区域中表现出缓冲能力的任意的碱的缓冲液。这样的碱与如上所述的同样。
碱性缓冲液等碱性溶液的pH可以根据大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和其结合蛋白的种类和浓度等因素而变动,例如为8.0~13.0。作为pH8.0~13.0的碱性溶液,优选能够在这样的pH的碱性区域中表现出缓冲能力的缓冲液。作为这样的缓冲液,例如可举出:磷酸缓冲液、碳酸-碳酸氢盐缓冲液、硼酸缓冲液、MES缓冲液、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)缓冲液、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)缓冲液、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵盐酸盐缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲液、乙酰胺甘氨酸缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液、甘氨酸酰胺缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液。从极力排除所述因素的影响并且提高通用性等观点出发,pH可以优选为9.0以上。此外,pH可以优选为12.0以下,特别优选为11.0以下。更具体而言,pH可以优选为pH9.0~12.0,特别优选为pH9.0~11.0。pH的测定如上所述。
酸性缓冲液等酸性溶液或碱性缓冲液等碱性溶液可以包含针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体,也可以不包含。在酸性溶液或碱性溶液包含这样的抗体的情况下,大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的浓度的测定,可以利用该抗体进行。此外,酸性溶液或碱性溶液可以包含其他物质。作为这样的其他物质,例如可举出:可以与水混和的有机溶剂(例如,醇、醚、酯)、变性剂(例如,离液剂)、表面活性剂(例如,阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子性表面活性剂、胆盐表面活性剂)、溶血剂、拮抗剂(例如,类似体)等物质(例如,所述专利文献1~9)。
通过血液样品的采用酸或碱进行的处理而制备的酸性血液样品或碱性血液样品的pH,与针对酸性缓冲液等酸性溶液或碱性缓冲液等碱性溶液的所述pH同样。因此,对于这样的酸性血液样品或碱性血液样品的pH的实例和优选的实例,可以参照所述酸性溶液或碱性溶液的pH。
本发明中使用的抗体是针对大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的抗体,所述代谢产物具有大环内酯结构。这样的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体的任一种。抗体可以是免疫球蛋白(例如,IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)的任一同种型。此外,抗体可以是全长抗体。全长抗体是指包含重链和轻链的抗体(例如,包含2个Fab部分和Fc部分的抗体),所述重链和轻链各自包含可变区和恒定区。此外,抗体可以是源自这样的全长抗体的抗体片段。抗体片段是全长抗体的一部分,例如可举出恒定区缺失抗体(例如,F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv)。此外,抗体可以是单链抗体等修饰抗体。优选抗体可以为IgG、IgM或它们的抗体片段。在本发明中,不仅可以使用1种抗体,而且可以使用2种以上(例如,2种、3种)抗体。
作为抗体,可以使用仅识别大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体。或者,在本发明中使用2种以上的抗体的情况下,除了可以使用仅识别大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体之外,还可以使用识别大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物和针对其的抗体形成的复合体的抗体,作为针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体(例如,国际公开第2004/11644号;国际公开第2013/042426号;Nucleic Acids Res.(Feb 2011)vol.39,no.3,e14)。
针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体,可以使用该领域中公知的任意的方法来制备。例如,抗体可以使用大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物作为抗原来制备。此外,由于针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体被市售,因此,也可以使用这样的市售品。
在本发明中,可以使用1种以上(例如,1种、2种)的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体。在本发明中,也可以使用针对抗体的2次抗体。
抗体可以固定在固相上。在本说明书中,固定于固相上的抗体有时简称为固相抗体。作为固相,例如可举出可以容纳或搭载液相的固相(例如,孔板、微流路、玻璃毛细管、纳米柱、整体柱、管等容器;和板、膜、滤纸等支撑体)和可以悬浮或分散于液相中的固相(例如,粒子等固相载体)。作为固相的材料,例如可举出:玻璃、塑料、金属和碳。此外,作为固相的材料,可以使用非磁性材料或磁性材料,但是对于固相载体,从操作的简便性等观点出发,优选为磁性材料。作为将抗体固定在固相上的方法,可以利用该领域中公知的任意的方法。作为这样的方法,例如可举出:物理性吸附法、共价键合法、利用亲和性物质(例如,生物素、链霉亲和素)的方法和离子键合法。
抗体可以用标记物质标记。在本说明书中,有时将用标记物质标记了的抗体简称为标记抗体。作为标记物质,例如可举出:酶(例如,过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、β半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如,链霉亲和素、生物素)、荧光物质或蛋白质(例如,荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、发光或吸光物质(例如,萤光素、水母发光蛋白、Aclidinium)、放射性物质(例如,3H、14C、32P、35S、125I)。
采用抗体进行的、大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的浓度测定,可以通过免疫测定进行。作为这样的免疫测定,例如可举出:酶免疫测定法(EIA)[例如,化学发光EIA(CLEIA)、酶吸附EIA(ELISA)]、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法、凝聚法、免疫染色、流量法、生物膜层干涉法、In Situ PLA法、化学增幅型发光·邻近·均相·试验(Chemically amplified luminescence proximityhomogeneous assay)、线性免疫印迹法、蛋白质印迹法。
本发明通过包含以下内容的方法进行。
(a)用酸或碱对包含大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的血液样品进行处理,所述代谢产物具有大环内酯结构;和
(b)使用抗体,对血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
工序(a)和(b)可以同时进行或分别进行。例如,在采用酸或碱进行的血液样品处理中,在使用包含针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的酸性缓冲液或者碱性缓冲液的情况下,采用酸或碱进行的血液样品处理和采用抗体进行的浓度测定,可以同时进行。在这种情况下,在采用抗体进行的浓度测定中,可以进一步使用:与酸性缓冲液或者碱性缓冲液中包含的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的第1抗体(例如,固相抗体)不同的、针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的第2抗体(例如,标记抗体)。另一方面,例如,在采用酸或碱进行的血液样品处理中,在不使用包含针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的酸性缓冲液或者碱性缓冲液的情况下,采用酸或碱进行的血液样品处理和采用抗体进行的浓度测定可以分别进行。在这种情况下,工序(a)和(b)可以连续性或非连续性地进行。在工序(a)和(b)非连续性地进行的情况下,用酸处理了的血液样品可以进行进一步处理。作为这样的处理,例如可举出:与如上所述的预备处理同样的处理(例如,过滤、加热、溶血)、pH的变更、基于给定的化学物质的处理。
在特定的实施方式中,本发明通过包含以下内容的方法而进行:
(a’)用酸或碱对包含所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的血液样品进行处理,制备酸性血液样品或碱性血液样品;和
(b’)使用抗体,对所述酸性血液样品或所述碱性血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
工序(a’)和(b’)可以同时进行或分别进行。此外,工序(a’)和(b’)可以连续性或非连续性地进行。例如,在工序(a’)和(b’)连续进行的情况下,工序(a’)中制备的酸性血液样品或碱性血液样品可以直接进行工序(b’)。在工序(a’)和(b’)非连续地进行的情况下,酸性血液样品或碱性血液样品可以进行进一步处理。就这样的处理而言,例如与工序(a)和(b)有关的说明中所述的同样。
本发明基于:在酸性条件下或碱性条件下的血液样品中,可以使作为免疫抑制剂使用的大环内酯类物质和其结合蛋白的结合解离,同时用抗体对解离的大环内酯类物质的浓度进行测定,并且测定中定量性优异这样的知识。这样的大环内酯类物质是具有特定的环状结构(相对刚性的结构,缺乏挠性),并且具有相对较高的疏水度的高分子量(分子量约800~1300)的化合物。尽管没有意图通过该说明限定本发明的范围,但是,即使在酸性条件或碱性条件这样的相对严酷的条件下进行,本发明也定量性优异的一个原因可能在于,使用具有这样的特征的大环内酯类物质。
在其他实施方式中,本发明可以通过包含以下内容的方法而进行:
(a”)用酸或碱对包含所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的血液样品进行处理而制备酸性血液样品或碱性血液样品后,进行中和,制备中性血液样品;和
(b”)使用抗体,对所述中性血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
即,在本发明的方法中,用酸或碱处理了血液样品后,可以进行中和处理。就进行中和处理的情况,对于使用下述抗体测定大环内酯类免疫抑制剂等的浓度的工序(工序(b”)中使用的抗体,也可以选择对酸或碱的耐性较低的抗体。
作为中和处理中使用的中和液,只要是能够使采用酸或碱进行的处理中生成的酸性血液样品或碱性血液样品的pH为约6.5~7.5的组成,则没有特别限定。针对酸性血液样品的中和液,例如包含作为上述碱而示出的物质,就pH而言,可以优选使用pH8.0~13.0的物质。针对碱性血液样品的中和液,例如包含作为上述酸示出的物质,就pH而言,可以优选使用pH1.0~6.5的物质。
此外,中和液除了碱性物质或酸性物质外,还可以包含离液变性剂(Chaotropicdenaturant)。作为离液变性剂,可举出:尿素、硫脲、盐酸胍、硫氰酸胍、水杨酸钠、硫氰酸钠、高氯酸钠、乙酰胺和甲酰胺等。离液变性剂的最终浓度优选为0.5M~8.0M。
在用酸或碱处理了血液样品后,进行中和时,能够降低对酸或碱的耐性较低的抗体的活性降低的风险,另一方面,存在由于解离的大环内酯类免疫抑制剂与结合蛋白发生再结合而使灵敏度降低的风险。通过在中和液中添加离液变性剂,而能够使所述再结合的影响降低。需要说明的是,就离液变性剂而言,如上所述,可以不是添加在中和液中,而添加在酸性溶液或碱性溶液中。或者,可以添加在中和液与酸性溶液或者碱性溶液的两者中。
此外,本发明提供一种血液检测试剂,其针对大环内酯类免疫抑制剂,并且包含:(1)酸或碱;和(2)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的抗体,所述代谢产物具有大环内酯结构。
酸或碱如上所述。酸或碱可以是固体,也可以是液体,但是优选为液体。因此,本发明的试剂优选包含:(1’)酸性溶液或碱性溶液;和(2’)1种以上(例如,1种、2种)的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体。酸性溶液或碱性溶液和其pH如上所述。
酸性溶液或碱性溶液可以是酸性缓冲液或碱性缓冲液,也可以是不具有缓冲能力的酸性溶液或碱性溶液,但是优选为酸性缓冲液或碱性缓冲液。因此,本发明的试剂优选包含:(1”)酸性缓冲液或碱性缓冲液;和(2”)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体。酸性缓冲液或碱性缓冲液和其pH如上所述。
酸性缓冲液等酸性溶液或碱性缓冲液等碱性溶液,可以以液体或冷冻物的方式提供。酸性缓冲液或碱性缓冲液可以收纳在瓶子等大型的容器或如上所述的容器中。1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体,可以以溶解于缓冲液等液体中的方式或其冷冻物的方式或者抗体的冷冻干燥物的方式而提供。1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体,可以以游离的方式(例如,溶液、冷冻物)或固定于如上所述的固相上的方式而提供。
在一个实施方式中,本发明的试剂可以是,(1”)酸性缓冲液或碱性缓冲液、和(2”)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体相互一体形成的组合物,即包含1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的、酸性缓冲液或碱性缓冲液。在使用这样的酸性缓冲液或碱性缓冲液的情况下,可以简便地同时进行解离和测定,所述解离是酸或碱引起的大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物从其结合蛋白的解离,所述测定是解离了的大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的浓度的采用抗体进行的测定。在这样的情况下,本发明的试剂中,除了包含1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的酸性缓冲液或碱性缓冲液之外,还可以包含与该抗体不同的1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体和/或针对抗体的2次抗体。这样的试剂可以适用于使用2种以上的抗体的免疫测定中。
在另一实施方式中,本发明的试剂可以是以进行了隔离的方式而包含(1”)酸性缓冲液或碱性缓冲液、和(2”)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的试剂盒。如果是这样的方式,则由于1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体和酸性缓冲液或碱性缓冲液被隔离,因此,能够长期保持1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的性能。在这样的情况下,本发明的试剂具有优异的保存性。
此外,在另一实施方式中,本发明的试剂除了包含(1)酸或碱、和(2)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体之外,还包含(3)中和液。中和液及其pH如上所述。
此外,本发明的试剂可以包含大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物(标准品)。就大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物而言,例如,可以在用于定量的校准曲线的绘制中使用和/或用作阳性对照(positive control)。
此外,本发明的试剂可以进一步包含使用针对大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物的抗体的免疫测定中必要的构成要素。作为这样的构成要素,可举出:所述的标记物质和酶的基质、稀释液、2次抗体、抗体的稳定剂,可从哺乳动物采集样品的器具(例如,注射器、活检针)。
实施例
以下,通过实施例对本发明进行详细说明,但是本发明不限于这些实施例。
实施例1:基于酸处理的全血检测材料中的他克莫司检测ELISA
实施例1中使用的材料如下所述。
96孔免疫板:Nunc Maxisorp C96免疫板(Thermo,Cat#430341)
抗他克莫司固相抗体1(小鼠IgG):Tac5-26-8(本公司抗体)
抗他克莫司固相抗体2(小鼠IgM):FK1(HyTest,目录编号:4FK42)
抗他克莫司固相抗体3(小鼠IgG):FK2(Biorbyt,目录编号:orb79532)
清洗液:0.5容量%Tween20/PBS
封闭溶液:1重量%BSA/PBS
检测材料:Lyphocheck(注册商标)Whole Blood Immunosuppressant Control(BIO-RAD公司)Levels 1、2、3、4和5。在本检测材料中,将他克莫司、环孢菌素A和依维莫司加标于全血样品中,并且分别公开了基于各种测定系统的测定值。基于本申请实施例中采用的HPLC-MS的他克莫司的测定值为4.75ng/mL(Level 1)、8.44ng/mL(Level 3)、15.8ng/mL(Level 4)、23.6ng/mL(Level 5)。基于本申请实施例中采用的HPLC-MS的环孢菌素A的测定值为87ng/mL(Level 1)、152ng/mL(Level 2)、354ng/mL(Level 3)、755ng/mL(Level 4)、1211ng/mL(Level 5)。在以下实施例中,根据试验的目的而适宜变更检测材料的浓度和数量而进行使用。
含有抗他克莫司抗体的培养上清液(检测抗体):含有抗他克莫司鸡IgM的CHO培养上清液(本公司抗体)
培养上清稀释液:1重量%BSA/PBS
ALP标记抗体:碱性磷酸酶标记小鼠抗鸡IgM mAb(本公司抗体)
标记抗体稀释液:1重量%BSA/TBS
发光基质液:Lumipulse用发光基质(AMPPD)
在实施例1中,使用以下酸性缓冲液。
就磷酸缓冲液(pH1.0~pH3.0)而言,将磷酸(H3PO4)和磷酸二氢钠·二水合物(NaH2PO4·2H2O)水溶液混合而制备。
就柠檬酸缓冲液(pH3.5)而言,将柠檬酸(C6H8O7)水溶液和柠檬酸钠(Na3C6H8O7)水溶液混合而制备。
就乙酸缓冲液(pH4.0~pH5.5)而言,使用Biacore用的市售品。
就磷酸缓冲液(pH6.0~pH8.0)而言,将磷酸二氢钠·二水合物(NaH2PO4·2H2O)和磷酸氢二钠·12水合物(Na2HPO4·12H2O)水溶液混合而制备。
就硼酸缓冲液(pH8.5)而言,使用Biacore用的市售品。
即,实施例1中使用的酸性缓冲液的pH和种类如下所述。
[表1]
表1.酸性缓冲液的PH和种类
pH | 种类 |
1.0 | 100mM磷酸缓冲液 |
1.5 | 100mM磷酸缓冲液 |
2.0 | 100mM磷酸缓冲液 |
2.5 | 100mM磷酸缓冲液 |
3.0 | 100mM磷酸缓冲液 |
3.5 | 100mM柠檬酸缓冲液 |
4.0 | 10mM乙酸缓冲液 |
4.5 | 10mM乙酸缓冲液 |
5.0 | 10mM乙酸缓冲液 |
5.5 | 10mM乙酸缓冲液 |
6.0 | 100mM磷酸缓冲液 |
6.5 | 100mM磷酸缓冲液 |
7.0 | 100mM磷酸缓冲液 |
7.5 | 100mM磷酸缓冲液 |
8.0 | 100mM磷酸缓冲液 |
8.5 | 10mM硼酸缓冲液 |
实施例1通过以下步骤进行。
(1)用PBS分别将抗他克莫司固相抗体1、抗他克莫司固相抗体2和抗他克莫司固相抗体3稀释至3μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)用酸性缓冲液将检测材料稀释10倍,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用培养上清稀释液将含有抗他克莫司抗体的培养上清液稀释至0.2μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)用标记抗体稀释液将ALP标记抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(10)用清洗液将孔槽清洗3次。
(11)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
其结果,与使用了3种类的抗体的实验相同,在酸性的pH区域中,观察到与他克莫司的浓度对应的发光计数(图1-1~1-3)。这表示,在酸性的pH区域中,在使他克莫司从其特异性结合蛋白(FKBP)和非特异性结合蛋白(白蛋白等)解离的同时,能够用抗体检测出解离的他克莫司。
由此可见,在用抗体检测包含他克莫司和其特异性结合蛋白的血液样品中的他克莫司的情况下,采用酸进行的血液样品的预处理是有效的。
实施例2:基于酸处理的全血检测材料中的他克莫司的定量ELISA
实施例2中使用的材料如下所述。
酸性缓冲液:100mM磷酸缓冲液/pH2.0
校准曲线物质:他克莫司(1mg/mL in DMSO)
校准曲线稀释液:0.5%Tween20/PBS
实施例2中使用的其他材料与实施例1同样。
实施例2通过以下步骤进行。
(1)用PBS将抗他克莫司固相抗体1稀释至3μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5A)用磷酸缓冲液(pH2.0)将检测材料稀释10倍,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(5B)用校准曲线稀释液稀释作为校准曲线物质的他克莫司(1mg/mL in DMSO)稀释并制备40、13、4.4、1.5、0.49、0.16、0.050、0ng/mL的稀释系列,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用培养上清稀释液将含有抗他克莫司抗体的培养上清液稀释至0.2μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)用标记抗体稀释液将ALP标记抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(10)用清洗液将孔槽清洗3次。
(11)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
(12)使用校准曲线的线性近似式,基于检测材料测定时的计数算出他克莫司测定值。
其结果,通过酸对包含他克莫司及其特异性结合蛋白和非特异性结合蛋白的血液样品进行了预处理的情况下的他克莫司浓度的测定值,显示出与他克莫司的加标浓度具有非常高的相关性(图2)。
由此可见,在通过酸对包含他克莫司及其特异性结合蛋白和非特异性结合蛋白的血液样品进行了预处理的情况下,该血液样品中的他克莫司的定量性优异。
实施例3:基于酸处理的全血检测材料中的环孢菌素A的检测ELISA
实施例3中使用的材料如下所述。
抗环孢菌素固相抗体1(小鼠IgG):CS5-12-27(本公司抗体)
酸性缓冲液:10mM乙酸缓冲液/pH4.0
含抗环孢菌素抗体的培养上清液:含抗环孢菌素鸡IgM的CHO培养上清液(本公司抗体)
实施例3中使用的其他材料与实施例1、2同样。
实施例3通过以下步骤进行。
(1)用PBS将抗环孢菌素固相抗体1稀释至2.5μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)用酸性缓冲液将检测材料稀释10倍,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用培养上清稀释液将含抗环孢菌素抗体的培养上清液稀释至0.2μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)用标记抗体稀释液将ALP标记抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(10)用清洗液将孔槽清洗3次。
(11)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
其结果,对于使用了抗体的实验,在酸性的pH区域中,观察到较高的发光计数(图3)。这表示,在酸性的pH区域中,在使环孢菌素A从其特异性结合蛋白(亲环素)和非特异性结合蛋白(白蛋白等)解离的同时,能够用抗体检测解离的环孢菌素A。
由此可见,在包含环孢菌素A及其特异性结合蛋白的血液样品中的环孢菌素A的检测中,采用酸进行的血液样品的预处理是有效的。
实施例4:基于酸处理的全血检测材料中的环孢菌素A的定量ELISA
实施例4中使用的材料如下所述。
酸性缓冲液:10mM乙酸缓冲液/pH4.0
校准曲线物质:环孢菌素A(1mg/mL in DMSO)
校准曲线稀释液:0.5%Tween20/PBS
实施例4中使用的其他材料与实施例1~3同样。
实施例4通过以下步骤进行。
(1)用PBS将抗环孢菌素固相抗体1稀释至2.5μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5A)用乙酸缓冲液(pH4.0)将检测材料稀释10倍,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(5B)用校准曲线稀释液稀释环孢菌素A(1mg/mL in DMSO)并制备200、100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.13、0ng/mL的稀释系列,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用培养上清稀释液将含抗环孢菌素抗体的培养上清液稀释至0.3μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)用标记抗体稀释液将ALP标记抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(10)用清洗液将孔槽清洗3次。
(11)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
(12)使用校准曲线的线性近似式,基于检测材料测定时的计数算出环孢菌素A测定值。
其结果,通过酸对包含环孢菌素A及其特异性结合蛋白和非特异性结合蛋白的血液样品进行了预处理的情况下的环孢菌素A浓度的测定值,显示出与环孢菌素A的加标浓度具有非常高的相关性(图4)。
由此可见,在通过酸对包含环孢菌素A及其特异性结合蛋白和非特异性结合蛋白的血液样品进行了预处理的情况下,该血液样品中的环孢菌素A的定量性优异。
实施例5:酸性溶液中的测定对固相抗体的特异性的影响的确认
实施例5中使用的材料如下所述。
掺有表面活性剂的酸性缓冲液:0.5%Tween20/10mM乙酸缓冲液/pH4.0
掺有表面活性剂的中性缓冲液:0.5%Tween20/PBS/pH6.8
生物素标记他克莫司:Tac-PEG2-Biotin(1mg/mL in DMSO,自行制备品)
他克莫司类似化合物1:西罗莫司
他克莫司类似化合物2:依维莫司
他克莫司类似化合物3:替西罗莫司(Temsirolimus)
他克莫司类似化合物4:吡美莫司
他克莫司类似化合物5:Dihydro-FK506
他克莫司:他克莫司(1mg/mL in DMSO)
ALP标记链霉亲和素:碱性磷酸酶标记链霉亲和素(Calbiochem)
稀释液:1重量%BSA/TBS
实施例5中使用的其他材料与实施例1~4同样。
实施例5通过以下步骤进行。
(A)生物素标记他克莫司与他克莫司类似化合物形成的混合液的制备
(1)用掺有表面活性剂的酸性缓冲液或者掺有表面活性剂的中性缓冲液,将生物素标记他克莫司稀释至10ng/mL。
(2)对于(1)中制备的掺有生物素标记他克莫司的溶液,以使得最终浓度从100000ng/mL逐步稀释10倍的方式添加他克莫司或者他克莫司类似化合物(1mg/mL inDMSO)而制备稀释系列。
(B)抑制试验
(1)用PBS将抗他克莫司固相抗体1稀释至3μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)以每孔槽50μL的量添加(A)中制备的生物素标记他克莫司与他克莫司类似化合物的混合液,在37℃下进行1小时反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用稀释液将ALP标记链霉亲和素稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
其结果,在使用了抗他克莫司固相抗体和生物素标记他克莫司以及作为它们的结合的抑制剂的各种他克莫司类似化合物的结合抑制实验中,酸性溶液中的结合抑制样式与中性溶液中的同样(图5-1和5-2)。这表示,酸性条件不影响抗体的特异性。
由此可见,在酸性溶液中抗体的特异性得到了保持。
实施例6:酸处理中的大环内酯类免疫抑制剂从特异性结合蛋白的解离的确认
实施例6中使用的材料如下所述。
FKBP12:重组FKBP12(Sino Biological Inc,目录编号:10268-H08E)
他克莫司:他克莫司(1mg/mL in DMSO)
他克莫司·FKBP稀释液1:0.5%Tween20/PBS
他克莫司·FKBP稀释液2:0.5%Tween20/200mM磷酸缓冲液/pH2.0
实施例6中使用的其他材料与实施例1~5同样。
实施例6通过以下步骤进行。
(A)他克莫司与FKBP12的结合
(1)用他克莫司·FKBP稀释液1将他克莫司稀释,制备240ng/mL、80ng/mL、26.6ng/mL、8.89ng/mL、1.48ng/mL、0.49ng/mL、0.165ng/mL、0的稀释系列。
(2)用他克莫司·FKBP稀释液1将FKBP12稀释至100μg/mL。
(3)将稀释的他克莫司与稀释的FKBP12等量混合(例:最终浓度:他克莫司120μg/mL+FKBP12 50μg/mL,他克莫司40μg/mL+FKBP12 50μg/mL)。
(4)使他克莫司与FKBP12在溶液中在室温下进行1小时反应。
(B)结合的他克莫司与FKBP12的解离实验
(1)用PBS将抗他克莫司固相抗体1稀释至3μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)将(A)中制备的他克莫司与FKBP12的混合液用他克莫司·FKBP稀释液1或他克莫司·FKBP稀释液2进行10倍稀释后,每孔槽添加50μL,在37℃下进行1小时反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用培养上清稀释液将含有抗他克莫司抗体的培养上清液稀释至0.2μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)用标记抗体稀释液将ALP标记抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(10)用清洗液将孔槽清洗3次。
(11)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
其结果,当将他克莫司与FKBP12混合,接着用中性溶液稀释混合液,从而在中性条件下实施抗原抗体反应时,未观察到他克莫司浓度依赖性的信号(图6中的0.5%Tween20/PBS的条件)。另一方面,当将他克莫司与FKBP12混合,接着用酸性溶液稀释混合液,从而在酸性溶液中实施抗原抗体反应时,观察到他克莫司浓度依赖性的信号(图6中的0.5%Tween20/200mM PB/pH2.0的条件)。这表示,在酸性条件下,能够在使他克莫司和FKBP12的结合解离的同时,用抗体对解离的他克莫司的浓度进行测定。
当将本实施例的结果与实施例1~5的结果一起考虑时,表示在通过抗体对包含大环内酯类物质(大环内酯类免疫抑制剂或其具有大环内酯结构的代谢产物)及其特异性结合蛋白的血液样品中的免疫抑制剂的浓度进行测定的情况下,采用酸进行的血液样品的预处理是有效。
实施例7:基于碱处理的全血检测材料中的他克莫司检测ELISA
实施例7中使用的96孔免疫板、抗他克莫司固相抗体1、清洗液、封闭溶液等的材料与实施例1~6中使用的材料同样。
实施例7通过以下步骤进行。
(1)用PBS将抗他克莫司固相抗体1稀释至3μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)对于他克莫司浓度已知的4检测材料,用中性缓冲液(50mM磷酸缓冲液,pH7.0)或者碱性缓冲液(50mM MES,pH10.0)进行10倍稀释,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用抗他克莫司IgM抗体稀释液将抗他克莫司IgM抗体稀释至0.5μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)用标记抗体稀释液将碱性磷酸酶标记抗鸡IgM抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(10)用清洗液将孔槽清洗3次。
(11)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
将各条件中的发光计数的结果示于图7。在将全血检测材料与碱性的缓冲液混合并处理了的情况下,相比于与中性的缓冲液混合的情况,得到的发光计数依赖于他克莫司浓度并检测出更高浓度。
由此可见,在通过碱对包含他克莫司的血液样品进行了预处理的情况下,能够以高灵敏度测定该血液样品中的他克莫司。
实施例8:基于酸处理和中和处理的全血检测材料中的他克莫司检测ELISA
实施例8中使用的材料如下所述。
酸性缓冲液:50mM磷酸缓冲液/pH2.0
中性缓冲液:200mM磷酸缓冲液/pH7.0
中和液1:8M尿素/200mM磷酸缓冲液/pH8.0
中和液2:4M盐酸胍/200mM磷酸缓冲液/pH8.0
实施例8中使用的其他材料与实施例1~7同样。
实施例8通过以下步骤进行。
(1)用PBS将抗他克莫司固相抗体1稀释至3μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)对于检测材料6μL,添加酸性缓冲液24μL并使其反应后,添加30μL中和液1或中和液2来中和经过了预处理的检测材料。为了比较,而准备:用中性缓冲液对检测材料进行5倍稀释后用包含8M尿素或4M盐酸胍的中性缓冲液(pH7.0)稀释2倍得到的物质、用中性缓冲液对检测材料稀释10倍得到的物质。
(6)每孔槽添加50μL已处理的样品,在37℃下进行10分钟反应。
(7)用清洗液将孔槽清洗3次。
(8)用抗他克莫司IgM抗体稀释液将抗他克莫司IgM抗体稀释至0.5μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(9)用清洗液将孔槽清洗3次。
(10)用标记抗体稀释液将碱性磷酸酶标记抗鸡IgM抗体稀释至0.1μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(11)用清洗液将孔槽清洗3次。
(12)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
将各条件中的发光计数的结果示于图8。显示在对检测材料进行酸处理后,用含有离液变性剂(特别是盐酸胍)的中和液进行了中和的情况下,与仅用中性缓冲液进行了稀释的情况相比,计数显著上升。另一方面,在不进行采用酸进行的处理,仅添加离液变性剂的情况下,也发现计数上升。
实施例9:基于酸处理和中和处理的全血检测材料中的依维莫司检测ELISA
实施例9中使用的材料如下所述。
缀合物固相:依维莫司-BSA缀合物(本公司抗体)
抗依维莫司抗体(兔多克隆抗体):EVER抗体液1(依维莫司试剂盒Nanopia TDMEverolimus(SEKISUI MEDICAL公司制))
清洗液:Lumipulse清洗液
检测材料:ClinCal(注册商标)Whole Blood Calibrator Set Lyophilised(RECIPE)。基于本申请实施例中采用的HPLC-MS的依维莫司的测定值为0ng/mL(Level 0)、1.45ng/mL(Level 1)、2.86ng/mL(Level 2)、5.27ng/mL(Level 3)、11.7ng/mL(Level 4)、23.2ng/mL(Level 5)、48.0ng/mL(Level 6)。
ALP标记抗体:碱性磷酸酶标记猪抗兔Ig多克隆抗体(DAKO,目录编号:D0306)
抗体稀释液:0.5容量%Tween20/PBS
实施例9中使用的其他材料与实施例1~8同样。
实施例9通过以下步骤进行。
(1)用PBS将依维莫司-BSA缀合物稀释至5μg/mL,以每孔槽50μL的量添加至96孔免疫板中,在37℃下进行1小时反应。
(2)用清洗液将孔槽清洗3次。
(3)每孔槽添加150μL封闭溶液,在4℃下进行一晚反应。
(4)用清洗液将孔槽清洗3次。
(5)使48μL的酸性缓冲液与6μL的检测材料反应,添加18μL的中和液2或酸性缓冲液,制备预处理液。使该预处理液与5倍稀释的抗体溶液以体积比1:1混合,以每孔槽50μL的量添加至固相化有依维莫司-BSA缀合物的96孔免疫板中,在37℃下进行10分钟反应。
(6)用清洗液将孔槽清洗3次。
(7)用抗体稀释液将ALP标记抗体稀释至0.2μg/mL,每孔槽添加50μL,在37℃下进行10分钟反应。
(8)用清洗液将孔槽清洗3次。
(9)每孔槽添加50μL发光基质,在室温下进行5分钟反应后,检测到发光。
将各条件中的发光计数的结果示于图9。对于用酸处理了全血检测材料后未进行中和的检测材料,由于抗依维莫司抗体因酸而失活,因此未得到发光计数(数据未显示)。在将全血检测材料用pH2.0的酸性缓冲液处理后,用含有胍的中和液进行了中和的预处理液,能够以比添加中性缓冲液代替酸性缓冲液而得的检测材料更高的灵敏度而检测出依维莫司。这表示,酸性缓冲液可高效地从全血检测材料中提取依维莫司。
由此可见,在用抗体检测包含依维莫司及其特异性结合蛋白的血液样品中的依维莫司的情况下,采用酸进行的血液样品的预处理是有效的。此外,即使在使用对酸的耐性较低的抗体的情况下,也可以通过在检测材料的酸处理之后并且抗原抗体反应之前进行中和工序,而高效地进行依维莫司检测。
工业实用性
就本发明而言,例如,在大环内酯类免疫抑制剂的治疗药物监测中是有用的。
Claims (12)
1.一种血液检测方法,其针对大环内酯类免疫抑制剂,并且包含:
(a)用酸或碱对包含大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的血液样品进行处理,所述代谢产物具有大环内酯结构,此处,酸为选自磷酸缓冲液、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、三氟乙酸缓冲液、苯二甲酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸-碳酸氢盐缓冲液以及2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液中的1种以上的酸性缓冲液;和
(b)使用抗体,对血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,
大环内酯类免疫抑制剂为他克莫司、环孢菌素A或依维莫司。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,
血液样品为人血液样品。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,
所述血液样品的处理为采用所述1种以上的酸性缓冲液进行的处理。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,
所述采用所述1种以上的酸性缓冲液进行的处理,通过将所述血液样品与所述1种以上的酸性缓冲液混合来进行。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,
所述1种以上的酸性缓冲液的pH为1.0~5.0。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,
针对免疫抑制剂的抗体为IgG、IgM或它们的抗体片段。
8.根据权利要求1所述的方法,其包含:
(a’)用酸或碱对包含所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的血液样品进行处理,制备酸性血液样品或碱性血液样品,此处,酸为所述1种以上的酸性缓冲液;和
(b’)使用抗体,对所述酸性血液样品或所述碱性血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
9.根据权利要求1所述的方法,其包含:
(a”)用酸或碱对包含所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的血液样品进行处理而制备酸性血液样品或碱性血液样品后,进行中和,制备中性血液样品,此处,酸为所述1种以上的酸性缓冲液;和
(b”)使用抗体,对所述中性血液样品中的所述大环内酯类免疫抑制剂或所述代谢产物的浓度进行测定。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,
所述中和,通过使包含离液变性剂的中和液与所述酸性血液样品或碱性血液样品混合而进行。
11.一种血液检测试剂,其针对大环内酯类免疫抑制剂,并且包含:
(1)酸或碱;和
(2)1种以上的针对大环内酯类免疫抑制剂或其代谢产物的抗体,所述代谢产物具有大环内酯结构,
此处,酸为选自磷酸缓冲液、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、三氟乙酸缓冲液、苯二甲酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸-碳酸氢盐缓冲液以及2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液中的1种以上的酸性缓冲液。
12.根据权利要求11所述的试剂,其进一步包含(3)中和液。
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7376361B2 (ja) * | 2017-03-07 | 2023-11-08 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 免疫調節マクロライドのための安定な配合物 |
CN115469026B (zh) * | 2022-07-14 | 2023-10-20 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 用于检测环孢素a肾毒性相关标志物的检测试剂、试剂盒及其用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998000696A1 (en) * | 1996-07-03 | 1998-01-08 | Jaklitsch Anna P | Pretreatment reagents and methods using the same |
JP2016540220A (ja) * | 2013-12-13 | 2016-12-22 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドSiemens Healthcare Diagnostics Inc. | 非凝集検定における前処理剤 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5134692B1 (zh) | 1969-04-02 | 1976-09-28 | ||
US3657152A (en) | 1969-05-26 | 1972-04-18 | Basf Wyandotte Corp | Catalyst and process for the preparation of 1 3-cyclohexanedianes,3-cyclohexanediamine |
JPS4940438B1 (zh) | 1970-12-30 | 1974-11-01 | ||
CN100379862C (zh) | 2002-07-30 | 2008-04-09 | 独立行政法人理化学研究所 | 增强体细胞同源重组的方法和构建特异抗体的方法 |
US20060216762A1 (en) | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Bayer Healthcare Llc | Extracting reagent for hydrophobic analyte in whole blood |
US7575875B2 (en) * | 2005-10-13 | 2009-08-18 | Abbott Laboratories, Inc. | Method of tacrolimus extraction and quantification using aqueous detergents |
US7883855B2 (en) * | 2006-07-21 | 2011-02-08 | Abbott Laboratories | Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays |
EP2118654B1 (en) | 2006-12-29 | 2013-03-27 | Abbott Laboratories | Diagnostic test for the detection of a molecule or drug in whole blood |
ES2393135T3 (es) * | 2006-12-29 | 2012-12-18 | Abbott Laboratories | Ensayo mejorado para fármacos inmunosupresores |
WO2008147982A1 (en) | 2007-05-24 | 2008-12-04 | Abbott Laboratories | Immunoassays exhibiting reduced cross-reactivity with hydrophobic drug analyte metabolites |
US7790401B2 (en) | 2007-08-06 | 2010-09-07 | Siemens Healthcare Diagnostics | Methods for detection of immunosuppressant drugs |
US7910378B2 (en) | 2007-12-14 | 2011-03-22 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Methods for detection of hydrophobic drugs |
BRPI0722361B8 (pt) * | 2007-12-19 | 2021-07-27 | Abbott Lab | métodos para avaliar a concentração de um fármaco imunossupressor em uma amostra de sangue humano, composição de reagente de extração e kit de teste |
JP5529051B2 (ja) | 2009-02-10 | 2014-06-25 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 質量分析技術を用いた免疫分析方法および免疫分析システム |
US8329424B2 (en) | 2010-06-25 | 2012-12-11 | Siemens Healthcare Diagnostics | Reduction in false results in assay measurements |
US9599608B2 (en) | 2011-09-21 | 2017-03-21 | Fujirebio Inc. | Antibody against affinity complex |
JP6150559B2 (ja) * | 2013-02-28 | 2017-06-21 | 旭化成株式会社 | マイコプラズマ・ニューモニアの検出方法 |
JP6566607B2 (ja) * | 2014-05-22 | 2019-08-28 | 株式会社 資生堂 | 生体試料中レナリドミドの前処理方法及び分析方法 |
CN104749009B (zh) * | 2015-03-30 | 2018-05-04 | 上海云泽生物科技有限公司 | 用于免疫分析的免疫抑制剂药物提取试剂 |
-
2018
- 2018-12-19 JP JP2019561573A patent/JP7325336B2/ja active Active
- 2018-12-19 WO PCT/JP2018/046785 patent/WO2019131380A1/ja unknown
- 2018-12-19 CN CN201880083007.0A patent/CN111512154B/zh active Active
- 2018-12-19 EP EP18895443.2A patent/EP3734271A4/en active Pending
- 2018-12-19 US US16/957,301 patent/US20210285975A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998000696A1 (en) * | 1996-07-03 | 1998-01-08 | Jaklitsch Anna P | Pretreatment reagents and methods using the same |
JP2016540220A (ja) * | 2013-12-13 | 2016-12-22 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドSiemens Healthcare Diagnostics Inc. | 非凝集検定における前処理剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2019131380A1 (ja) | 2020-12-24 |
JP7325336B2 (ja) | 2023-08-14 |
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