MX2013002870A - Ensayo de deteccion residual de anticuerpo monoclonal altamente sensible. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos altamente sensibles para la detección de productos residuales de biotecnología, cuando se desea monitorear el acarreo de producto y/o verificar la limpieza en la manufactura de productos fabricados por biotecnología.

Description

ENSAYO DE DETECCION RESIDUAL DE ANTICUERPO MONOCLONAL ALTAM ENTE SENS I BLE Referencia a la Prioridad Relacionada La presente solicitud reivindica el derecho de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. de Serie 61 /382,41 3, presentada el 1 3 de septiembre del 201 0, la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia . 1 . I NTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos altamente sensibles para la detección de prod uctos residuales de biotecnolog ía , cuando se monitorea el acarreo de prod ucto y/o se verifica la limpieza en la manufactura de productos biotecnológicos. En particular, la presente invención se refiere a inmu noensayos en los que se utilizan uno o más anticuerpos de captu ra , o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, para detectar residuos asociados con la producción de productos de biotecnolog ía . 2. Antecedentes de la Invención La verificación de la limpieza del equipo de procesamiento es necesaria para cumplir con las Buenas Prácticas de Manufactura (" BPM") y tal cumplimiento pretende aseg urar que los prod uctos terapéuticos cumplan con las características de calidad y pureza que se pretende o se declara q ue poseen . Como parte del cumplimiento de las BPM , tradicionalmente se ha utilizado el ensayo de Carbono Orgánico Total ("COT") , para verificar la efectividad de los procedimientos de limpieza para la remoción de residuos de productos de biotecnolog ía. El ensayo de COT se puede emplear entre corridas de producción individuales, así como cuando los sitios de producción cambian entre distintos productos. Sin embargo, una limitación importante del ensayo de COT es q ue el límite de detección , <0.1 ppm , puede no ser adecuado para monitorear el acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza de dosis muy bajas de producto, tales como ciertos agentes terapéuticos con anticuerpos, cuyo límite de acarreo permisible máximo está por debajo del límite de detección del ensayo de COT.

Además de los aspectos referentes al cumplimiento con productos de dosis muy baja, la Conferencia I nternacional sobre Armonización de Requerimientos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Consumo Humano (" I C H"), documento ICH Q7A, adoptado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados U nidos en el 2001 , así como la Gu ía Canadiense de Salud 0028, ambos recomiendan el desarrollo de ensayos específicos de I ngredientes Activos Farmacéuticos ("IAF") para monitorear el acarreo de prod ucto y/o la verificación de la limpieza. Como el ensayo de COT no es específico de IAF, sino que mide el carbón orgán ico total independientemente de su fuente, no cumple con tales recomendaciones.

A la luz de las inherentes limitaciones del ensayo de COT, sería deseable un ensayo más sensible y específico de IAF como método alternativo o suplementario a la detección de residuos de productos de biotecnolog ía, cuando se monitorea el acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza. La presente invención cumple con esa necesidad al introducir un ensayo analítico general para detectar cantidades traza de residuos de ácido nucleico o proteína , incluyendo residuos de anticuerpos monoclonales , el cual se puede emplear para el monitoreo del acarreo del producto y/o de la verificación de la limpieza . 3. Breve Descripción de la Invención En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar un residuo de producto de biotecnolog ía , en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o una porción de unión al antígeno del mismo, y la detección del complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un residuo de producto de biotecnolog ía.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar un residuo de producto de biotecnolog ía, en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o u na porción de unión al antígeno del mismo, y la detección de u n complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un residuo de producto de biotecnolog ía , en donde la detección del complejo anticuerpo-antígeno se logra al monitorear la unión de u n anticuerpo de detección marcado capaz de unirse al complejo anticuerpo-antígeno.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar un residuo de producto de biotecnolog ía , en donde u na muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende u n anticuerpo de captura , o una porción de unión al antígeno del mismo, y la detección de u n complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un residuo de producto de biotecnología, en donde la presencia del resid uo del producto de biotecnología es indicativa del acarreo de prod ucto.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar un residuo de prod ucto de biotecnolog ía, en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o una porción de u nión al antígeno del mismo, y la detección de un anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un residuo de producto de biotecnología , en donde la presencia del resid uo de producto de biotecnología es indicativa de un proceso de limpieza insuficiente.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar un producto de biotecnolog ía residual , en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o una porción de unión al antígeno del mismo, y la detección de u n complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un residuo de producto de biotecnología , en donde el antígeno se deriva de un producto de ácido nucleico .

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar u n producto de biotecnología residual , en donde una muestra de prueba se pone en contacto con u n sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o una porción de unión al antígeno del mismo, y la detección de un complejo anticuerpo-antígeno es ind icativa de la presencia de un producto de biotecnolog ía residual, en donde el antígeno es un derivado de una enzima ; u na hormona peptídica ; un anticuerpo policlonal ; un anticuerpo monoclonal humano; un anticuerpo monoclonal humanizado; un anticuerpo monoclonal q uimérico; u n anticuerpo de una sola cadena; un fragmento de anticuerpo Fab; un fragmento de anticuerpo F(ab')2; un fragmento de anticuerpo Fd , un fragmento de anticuerpo Fv; una región determinante de complementariedad (C DR) aislada; un diacuerpo; y una proteína de inmunoad hesión .

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar u n producto residual de biotecnología, en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o u na porción de unión al antígeno del mismo, y la detección de u n complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un producto residual de biotecnolog ía, en donde el antígeno es un derivado de un producto de anticuerpo. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos para detectar un producto residual de biotecnolog ía, en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura , o una porción de u nión al antígeno del mismo, y la detección de u n complejo anticuerpo-sntígeno es indicativa de la presencia de un producto resid ual de biotecnolog ía, en donde el anticuerpo de captura o la porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-lgG humana (H + L) , un anticuerpo contra el fragmento F(ab')2 de IgG h umana; un anticuerpo contra la región kappa de IgG humana, un anticuerpo contra la región lambda de IgG humana, anticuerpos anti-lgG murina (H + L) y combinaciones de los mismos.

En ciertas modalidades, presente invención se refiere a métodos para detectar un residuo biológico, en donde una muestra de prueba se pone en contacto con un sustrato que comprende dos o más anticuerpos de captura, o porciones de unión al antígeno de los mismos, que tienen distintas especificidades de un ión, y en donde la detección de un complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un prod ucto resid ual de biotecnolog ía q ue comprende el sustrato. En ciertas modalidades, los anticuerpos de captura que tienen d istintas especificidades, estarán presentes en el sustrato en relaciones específicas. 4. Breve Descri pción de los Di bujos La Figura 1 ilustra los resultados de experimentos en donde la detección de los anticuerpos seleccionados (conjugados H RP) se probó para el reconocimiento de dos productos, utilizando Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato de Sodio (SDS-PAG E , por sus siglas en ing lés) e inmunoeletrotransferencia tipo Western (Western blot) : Ab #1 , el objetivo principal de este estudio, Ab #2 , como modelos para probar el reconocimiento después de la exposición a los agentes de limpieza. Los Ab #1 y el Ab #2 fueron incubados con CIP-100 (al 2.5%) y CIP-200 (al 2.5%) a 75°C durante 30 minutos, para imitar las condiciones de estricta limpieza de las instalaciones. Después de la incubación, las muestras de prueba fueron neutralizadas. Las moléculas intactas y las muestras tratadas neutralizadas, se cargaron en un gel de SDS-PAGE y se sometieron a inmunoelectrotransferencia contra anticuerpo anti-lgG humana (H + L). La figura específicamente ilustra la SDS-PAGE y la inmunoelectrotransferencia (Western blot) de anticuerpos anti-lgG humana (H+L) de los Ab #2 y Ab #1 intactos (*), tratados con CIP-100 (1) o tratados con CIP-200 (2).

La Figura 2 ilustra una separación por SDS-PAGE de los siguientes: Estándar SeeBlue Plus2 (carrill); Ab #1 (carril 3); Ab #2 (carril 4); Ab #11 (carril 5); Ab #3 (carril 6); Ab #13 (carril 7); Ab #9 (carril 8); y estándar SeeBlue Plus2 (carril 10). Los carriles 3 y 9 fueron blancos.

La Figura 3 ilustra el análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blot) de una separación por SDS-PAGE realizada como se señaló en la Figura 2, utilizando un anticuerpo anti-lgG humana (H+L).

La Figura 4 ilustra un análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blot) de una separación por SDS-PAGE realizada como se señaló en la Figura 2, utilizando un anticuerpo F(ab')2 anti-lgG humana.

La Figura 5 ilustra un análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blot) de una separación por SDS-PAGE realizada como se señaló en la Figura 2 , utilizando u n anticuerpo lambda anti-lgG h umana.

La Figura 6 ilustra un análisis de inmu noelectrotransferencia (Western blot) de una separación por SDS-PAGE realizada como se señaló en la Fig ura 2 , utilizando un anticuerpo kappa anti-lgG humana.

La Figura 7 ilustra un análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blot) de una separación por SDS-PAGE realizada como se señaló en la Figura 2, utilizando un anticuerpo anti-lgG murina (H + L) .

La Figura 8 ilustra una curva estándar de referencia basada en los anticuerpos combinados (como se señala en la Tabla 5 q ue se presenta más adelante) , basándose en la sensibilidad de la combinación y la adecuabilidad para la detección de los Ab #1 , Ab #2 y Ab #1 1 . Todas las curvas tienen un coeficiente de correlación de 0.9999 con u n aj uste cuadrático, y cada rango de curva fue de 0.25 a 8 ng/mL.

La Figura 9 ilustra experimentos realizados para establecer la linearidad de los métodos analíticos empleados en la presente. La "linearidad" de un método analítico es su capacidad de prod ucir resultados de prueba que ya sea estén directamente proporcionales, o que mediante una transformación matemática bien defin ida sean proporcionales, a la concentración de la sustancia por analizar de interés. Los estándares que variaron de 0.25 a 8 ng/mL fueron preparados a partir de la sustancia farmacéutica Ab #1 . Los estándares y el blanco de amortiguador se cargaron en una placa y se probaron . La gráfica se muestra en la Fig ura 9: Curva estándar del Ab #1 (Placa 1 , parte superior; placa #2, en medio, y placa #3, abajo). El coeficiente de correlación del ajuste cuadrático fue mayor de 0.999. Los resu ltados indican q ue las respuestas de absorbancia de los estándares, son proporcionales a la concentración de proteína por el ajuste cuadrático.

La Figura 1 0 ilustra experimentos realizados para establecer el rango de los métodos analíticos empleados en la presente. El "rango" de u n método anal ítico, es el intervalo en el cual las concentraciones superior e inferior de la sustancia por analizar se pueden determinar con u n nivel de precisión , exactitud y linearidad adecuados, empleando el método tal como fue escrito. El rango del ensayo se estableció en un valor de 0.25 a 8 ng/m L, basándose en la linearidad , exactitud, precisión y límite de cuantificación . El valor del coeficiente de correlación del ajuste cuadrático, fue mayor de 0.999. Esto indica que en el rango de 0.25 a 8 ng/m L, las respuestas de absorbancia son proporcionales a la concentración de proteína por el ajuste cuad rático. Se realizaron estud ios de recuperación de siembras a 1 .0, 2.0 y 4.0 ng/mL de estándares, en dos diferentes muestras en proceso. Las recu peraciones fueron de 1 00 ± 7.9% . Esto indica que el ensayo es preciso y exacto dentro del rango estimado. Los resultados se resumen en la Tabla 1 7 y las curvas estándar de referencia del primero y segundo lotes, se muestra n en la Fig u ra 1 0: curva estándar del Ab #1 utilizando el primero (parte superior) y segundo (parte inferior) lotes de anticuerpos. 5. Descri pción Detallada de la I nvención La presente invención se refiere a composiciones y métodos altamente sensibles, para la detección de productos residuales de biotecnolog ía, cuando se monitorea el acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza en la manufactu ra de tales productos de biotecnolog ía. En particular, la presente invención se refiere a inmunoensayos en donde uno o más anticuerpos de captura, o fragmentos de u n ión al antígeno de los mismos, se utilizan para detectar residuos asociados con la producción de productos de biotecnolog ía . 5.1 Monitoreo del Acarreo y Verificación de la Limpieza El monitoreo del acarreo de producto y la verificación de la limpieza del eq uipo mediante las composiciones y métodos de la presente invención , se pueden aplicar a situaciones y etapas de proceso en donde u na contaminación o acarreo de materiales posea un gran riesgo para la calidad del I ngrediente Activo Farmacéutico (IAF). Sin embargo, las composiciones y métodos de la presente invención son igualmente aplicables a situaciones y etapas de proceso q ue posean un riesgo mínimo o ningú n riesgo directo para la calidad del IAF, pero en donde el uso de las composiciones y métodos de la presente invención sea de alg una otra manera deseable. Los factores que tienen impacto en lo deseable de tales implementaciones , incluyen pero no se limitan a: la salud y seg uridad de los empleados, mantenimiento del eq uipo de proceso , necesidad de optimizar el desarrollo de un proceso eficiente, así como condiciones ambientales referentes a las instalaciones y/o al equipo de procesamiento empleados en la producción de los productos de biotecnología.

En ciertas modalidades, el monitoreo del acarreo y/o la verificación de los procedimientos de limpieza, utilizando las composiciones y métodos de la presente invención, están diseñados para reflejar los patrones de uso real del equipo. Por ejemplo, pero sin limitaciones, en casos en donde se fabrica más de un IAF utilizando el mismo equipo y el equipo es limpiado por el mismo proceso, se puede seleccionar un IAF representativo para la validación a través de las composiciones y métodos de la presente invención. En modalidades alternativas, una combinación de uno o más, o la totalidad de los lAFs fabricados utilizando el mismo equipo, se puede seleccionar para la validación a través de las composiciones y métodos de la presente invención.

En ciertas modalidades, la selección del IAF, o combinaciones de lAFs, se basa en factores tales como, pero no limitándose a, la solubilidad y dificultad de limpieza del IAF. Además, en ciertas modalidades, el cálculo de los límites residuales se basará en factores tales como, pero no limitándose a la potencia, toxicidad y estabilidad del IAF.

En ciertas modalidades, el método de la presente invención incluye muestrear en etapas de proceso particulares, con el fin de monitorear el acarreo y/o de verificar los procedimientos de limpieza.

En ciertas modalidades, el muestreo incluye, pero no se limita a frotar con hisopo, el método de enjuague, y cualquier método alternativo conocido por los técnicos en la materia para obtener materiales de prueba (por ejemplo, por extracción directa) . En ciertas modalidades, el muestreo se realiza para detectar residuos insolubles. En modalidades alternativas, el muestreo se emplea para detectar residuos solubles. En ciertas modalidades, el muestreo se emplea para detectar tanto residuos insolubles como residuos solubles.

En ciertas modalidades, los procedimientos de limpieza son mon itoreados a intervalos particulares después de la validación inicial , para asegurar que los procesos sigan siendo efectivos cuando se utilizan durante la producción de rutina . En ciertas modalidades, el intervalo será después de cada corrida de producción . No obstante , en la técnica se conocen intervalos alternativos, por ejemplo, pero no limitándose a después de un número específico de corridas de producción , después de que un equ ipo de proceso particular, tal como filtros o ventiladores, es reemplazado , o después de que componentes de prod ucción específicos, tales como medios de cultivo, son introducidos. 5.2 Ensayos de Detección de Productos Residuales de Biotecnología La presente invención se refiere a ensayos de detección de productos residuales de biotecnología , q ue comprenden uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, capaces de unirse al producto residual , o residuos de interés. En ciertas modalidades, el anticuerpo de captura o un fragmento de unión al antígeno del mismo, se emplea en el contexto de un inmunoensayo. Tales inmunoensayos incluyen, pero no se limitan a ensayos de ELISA en emparedado, ELISA de inhibición, radioinmunoensayos, inmunoensayos de fluorescencia e inmunoensayos quimioluminiscentes. En una modalidad específica de la presente invención, se utiliza una prueba de ELISA en emparedado.

En ciertas modalidades de la presente invención, se utiliza una prueba de ELISA en emparedado para ensayar una muestra de producto o productos residuales de biotecnología. Hablando en términos generales, en la prueba de ELISA en emparedado, primero se prepara una superficie de tal modo que se pueda unir una cantidad de anticuerpo de captura. Después, se bloquea cualquier sitio de unión no específica en la superficie preparada. Tal bloqueo puede estar acompañado por métodos generalmente conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a exposición de la superficie a proteínas bloqueadoras tales como, pero no limitándose a albúmina sérica bovina. Después del bloqueo de los sitios de unión no específica, la superficie se pone en contacto con una muestra de prueba. La superficie se incuba con la muestra de prueba para permitir la unión entre los productos residuales y el anticuerpo de captura, si es que hubiera cualquier producto residual presente. Una vez que el periodo de incubación concluye, la superficie es lavada para retirar las moléculas no unidas. En ciertas modalidades, después se utiliza un segundo anticuerpo no marcado capaz de unirse al prod ucto residual. En tales modalidades, se agrega u n tercer anticuerpo ligado a una enzima , o marcado de alguna otra manera , específico contra la región constante del seg undo anticuerpo. Posteriormente, la superficie se lava de tal modo q ue los conjugados de anticuerpo-marca q ue no se unieron, se deslaven. Después se añade una sustancia q u ímica para activar una señal proveniente de la marca; por ejemplo, un color o una señal electroqu ímica que pueda medirse. La señal se mide como una indicación de la presencia y cantidad de los fragmentos objetivo. En modalidades alternativas, el segundo anticuerpo mismo está marcado o ligado a una enzima, eliminando de esta manera la necesidad de un tercer anticuerpo.

En ciertas modalidades, la fase sólida utilizada como superficie sobre la cual se realiza el inmunoensayo, puede ser cualquier soporte o veh ículo inerte que esencialmente sea insoluble en ag ua, incluyendo soportes/vehículos en forma de superficies, partículas , matrices porosas o similares. Ejemplos de soportes/veh ículos incluyen hojas pequeñas, Sephadex™, cloruro de polivinilo, cuentas de plástico, y placas de ensayo o tubos de ensayo fabricados de polietileno, polipropileno, poliestireno y similares, incluyendo microplacas de 96 pozos, así como materiales particu lados tales como papel filtro, agarosa , dextrán reticulado y otros polisacáridos. Alternativamente, se pueden emplear adecuadamente matrices reactivas insolubles en agua tales como carboh idratos activados con bromu ro de cianógeno y sustratos reactivos, para la inmovilización del reactivo de captu ra .

En modalidades específicas, el anticuerpo de captu ra inmovilizado es revestido en una microplaca. Por ejemplo, y no como limitación , la fase sólida puede ser una microplaca con múltiples pozos, la cual se puede utilizar para analizar varias m uestras de una sola vez. Ejemplos de microplacas incluyen las microplacas de ELI SA de 96 pozos, tales como M axisorb™ o I mmulon™ (N u nc, Roskilde, Dinamarca) . Adicionalmente, se pueden emplear tecnologías de ELI SA multiplex, tales como la tecnolog ía Luminex™, para correr cientos de pruebas de ELI SA simultáneamente (Millipore). Tales técnicas de ensayo de ELI SA multiplex son bien conocidas en este campo e incluyen , además de la tecnolog ía Lu minex™, una variedad de tecnolog ías que incluyen el uso de múltiples anticuerpos de captu ra y/o detección , para la detección simultánea de numerosas sustancias por analizar. La discriminación entre los diversos anticuerpos de detección en tales ensayos mu ltiplex, incluye el uso de múltiples marcas distintas. Las tecnolog ías de ensayos multiplex alternativas, incluyen el sistema LiquiChip™ (Qiagen) y el Arreglo de Cuentas Citométricas BD™ (BD Bioscience) .

La presente invención abarca todos los anticuerpos de captura que exhiban las características requeridas q ue aq uí se describen . Por ejemplo, pero no como limitación , los anticuerpos que tienen los patrones de reactividad ilustrados en la presente, están dentro de los alcances de la presente invención, independientemente de la clase o subclase de inmuno-globulina a la cual pertenezcan. En modalidades particulares, los anticuerpos monoclonales adecuados pueden ser de la clase lgG 1 , lgG2a, lgG2b, lgG3, o de las clases IgM , IgA, o de cualquier otra clase o subclase de Ig conocida .

Los anticuerpos de fractura o fragmentos de unión al antígeno de los mismos seleccionados de la presente invención , son inmovilizados en un sustrato adecuado, mediante cualqu ier método disponible para los técnicos en la materia. En ciertas modalidades, ol anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se liga directamente a un gru po fu ncional seleccionado en el sustrato. Alternativamente, el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, se liga indirectamente al sustrato a través de u n ligando o separador. En ciertas modalidades no limitantes, el ligamiento se puede llevar a cabo mediante la unión covalente del anticuerpo de captu ra o un fragmento de u nión al antígeno del mismo a estreptavidina (o biotina) y después la unión al sustrato ocurre indirectamente a través de u na porción biotina (o estreptavidina) que se enlaza covalentemente al sustrato. Alternativamente , se puede utilizar un silano tiol-terminal para recubrir la superficie del sustrato, y se puede emplear u n reticulador heterobifuncional , por ejemplo éster de N-gamma-maleimidobutu riloxi succin imida (G M BS) para unirse al anticuerpo o u n fragmento de unión al antígeno del mismo. Véase la Patente Norteamericana U . S. No. 5,077,21 0. Con este método, el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, se puede inmovilizar a una alta densidad (por ejemplo, 2 ng/mm2) .

Otro tipo de técnica de inmovilización de superficie utiliza matrices poliméricas de hidrogel. Estos materiales típicamente contienen una gran cantidad de agua, son suaves y son bioinertes. Algunos ejemplos incluyen películas poliméricas reticuladas de alcohol polivinílico y películas de carboximetildextrán. Véase Kobayashi, J. y Y. Ikada, "Covalent Immobilization of Proteins Onto the Surface of Poly(vinyl alcohol) Hydrogel," Biomaterials, 12, (1991), páginas 747-751; Johnsson, B. et al., "Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran-Modified Gold Surface for Biospecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance Sensors," Anal. Biochem., 196, (1991), 268-277; Lofas, S. y B. Johnsson, "A Novel Hydrogel Matrix on Gold Surfaces in Surface Plasmon Resonance Sensors for Fast and Efficient Covalent Immobilization of Ligands," J. Chem. Soc. Commun., (1990), páginas 1526-1528).

Los anticuerpos de captura de la presente invención incluyen, pero no se limitan a los siguientes: a Hu IgG (H + L); a Hu IgG F(ab')2; a Hu IgG ?; a Hu IgG ?; y a Ms IgG (H + L).

Además, la función proporcionada por el anticuerpo de captura o el fragmento de unión al antígeno del mismo, por ejemplo la unión de productos residuales de biotecnología particulares a la superficie del sustrato, se puede llevar a cabo utilizando anticuerpos monoclonales alternativos a los tradicionales. Los anticuerpos monoclonales alternativos a los tradicionales incluyen imitaciones de anticuerpo, tales como pero no limitándose a anticuerpos, dominios de anticuerpo, nanocuerpos y unicuerpos.

En ciertas modalidades , múltiples anticuerpos de captura o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, teniendo diferentes especificidades de unión, están unidos a la superficie del sustrato. La inclusión de múltiples anticuerpos de captura o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, permite la detección de múltiples productos residuales de biotecnolog ía , de manera simultánea. Tales productos resid uales de biotecnología se pueden derivar del mismo producto o de diferentes productos. Por ejemplo , pero sin limitaciones, la producción de un solo producto de anticuerpo monoclonal puede dar como resultado una variedad de prod uctos residuales, incluyendo, pero no limitándose a residuos de cadenas pesadas, residuos de cadenas ligeras , residuos de regiones variables, y residuos de regiones constantes. En ciertas modalidades, los diversos anticuerpos de captura , o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, estarán presentes en relaciones específicas. Un ejemplo no limitante de tal mezcla de anticuerpos de captura , se señala en la Tabla 5 que se presenta más adelante, en donde están presentes los siguientes anticuerpos: a H u IgG (H + L) ; a H u IgG F(ab')2; a Hu IgG ?; a Hu ?; y a Ms IgG (H + L) , en la siguiente relación: 1 :2 : 1 6:8 :8.

Después de la inmovilización de u n anticuerpo de captu ra seleccionado, o u n fragmento de u nión al antígeno del mismo, en un sustrato adecuado, y luego de la exposición de ese a nticuerpo de captura o fragmento de unión al antígeno del mismo, a u na muestra para monitorear el acarreo y/o para verificar la limpieza, es necesario visualizar la unión del prod ucto residual de biotecnolog ía . Tal visualización comúnmente se lleva a cabo mediante la adición de un anticuerpo de detección , que se une específicamente a u n epítopo del producto residual de biotecnolog ía.

Los anticuerpos de detección pueden ser detectados directamente a través de porciones tales como marcas de fluocromo, porciones quimioluminiscentes y porciones radioactivas, o indirectamente a través de porciones tales como enzimas, q ue se pueden hacer reaccionar o se pueden derivar. Ejemplos de porciones que pueden ser detectadas directamente, incluyen rad ioisótopos, fluoróforos tales como q uelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados; rodamina y sus derivados. Ejemplos de porciones que deben reaccionar o derivarse, incluyen , pero no se limitan a dansilo; umbeliferona ; luciferasas; luciferina, 2 , 3-d ihidroftalazinodionas; peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina ; ß-galactosidasa, glucoamilasa; lisozima ; sacárido oxidasas; oxidasas heterocíclicas; biotina/avidina; biotina/estreptavidina; biotina/estreptavidina-H RP; marcas de espín ; marcas con bacteriófagos; radicales libres estables; y similares . Se dispone de métodos convencionales para unir covalentemente estas porciones detectables con un anticuerpo de detección . Por ejemplo, se pueden utilizar agentes de acoplamiento tales como dialdeh ídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos , bis-bencidina diazotada , y similares, para marcar los anticuerpos con las etiquetas anteriormente descritas.

Debido a que los dos anticuerpos en un ensayo en emparedado operan más efectivamente cuando cada u no de ellos se une al antígeno objetivo , pero no interactúan ni se une a ni ngún otro, el anticuerpo de captu ra inmovilizado o un frag mento de u nión al antígeno del mismo, se prueba con respecto a su reactividad con el anticuerpo de detección , o en el caso de un sistema de tres anticuerpos, se prueba la reactividad con los anticuerpos secundario y de detección . Se prefiere una baja reactividad entre el anticuerpo de captura o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y el anticuerpo de detección , mientras que se retenga una alta afinidad por el antígeno objetivo. Además, los pares de anticuerpo operarán más efectivamente cuando cada uno de ellos se una al producto residual de biotecnolog ía objetivo en distintos lugares. De conformidad con esto, los anticuerpos se deben evaluar para evitar que se u nan anticuerpos con especificidades de unión superpuestas.

El uso de anticuerpos de captura o fragmentos de u n ión al antígeno de los mismos, contra prod uctos residuales de biotecnolog ía , es un enfoq ue ventajoso para el monitoreo del acarreo y/o para validar la limpieza . Debido a la alta especificidad y sensibilidad de los anticuerpos monoclonales, las composiciones y métodos de la presente invención son capaces de detectar productos residuales de biotecnolog ía a dosis muy bajas, mucho más allá de los l ímites actuales del ensayo de COT. Además, tales métodos de detección de anticuerpos son capaces de identificar específicamente la presencia del o los lAFs de interés y, por lo tanto, caen dentro de las recomend aciones de IC H Q7A y de la Gu ía Canadiense de Salud- 0028. 5.3 Monitoreo del Acarreo y Verificación de la Limpieza en la Producción de Anticuerpos En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza, en el contexto de la producción de productos farmacéuticos, en donde el IAF es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo se puede emplear en el contexto farmacéutico como un anticuerpo desnudo, como un anticuerpo conjugado a otra molécula (tal como, pero no limitándose a una toxina o marca), o de alguna otra manera puede estar modificado (tal como, pero no limitándose a la inclusión de aminoácidos modificados o mediante la adición, deleción o modificación de cadenas laterales de carbohidrato). En ciertas modalidades, tal monitoreo del acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza, serán en el contexto de la producción de anticuerpos policlonales. En ciertas modalidades, tal monitoreo del acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza, serán en el contexto de la producción de anticuerpos monoclonales. En ciertas modalidades, tal monitoreo del acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza, serán en el contexto de la producción de anticuerpos para utilizarse en investigación o diagnóstico. En ciertas modalidades, tal monitoreo del acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza, serán en el contexto de la producción de anticuerpos para uso terapéutico.

En ciertas modalidades, el monitoreo del acarreo de producto y/o la verificación de la limpieza, serán en el contexto de la producción de anticuerpos monoclonales para usos terapéuticos. Existen tres amplias categorías de moléculas de anticuerpo monoclonal terapéutico actualmente en producción comercial: anticuerpos humanos completos, anticuerpos h umanizados y anticuerpos q uiméricos. U na molécula de anticuerpo humano completo es un anticuerpo derivado de células humanas o de células no humanas que expresan genes de inmunoglobulina humana . En contraste, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo generado en un animal no h umano, tal como u n ratón , pero que posteriormente fue modificado para reflejar secuencias de anticuerpo humano. Esta modificación ocu rre principalmente para min imizar las respuestas inmunológicas a la administración del anticuerpo. No obstante, en ciertas modalidades, los anticuerpos huma nizados retendrá n u na o más de las secuencias no h umanas originales. Tal retención de secuencias no h umanas comúnmente se realiza con el fin de conservar la actividad terapéuticamente efectiva del anticuerpo. Finalmente, una molécula de anticuerpo q uimérico está compuesta de una región constante humanizada y una región variable no humana . Los anticuerpos q uiméricos común mente se producen utilizando la tecnología de ADN recombinante, para ligar de manera operable la reg ión variable (de unión al antígeno) de u n anticuerpo producido en un animal no humano, con la región constante (sistema efector inmune) de un anticuerpo humano.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza, en el contexto de la producción de anticuerpos completamente humanos. En modalidades alternativas, la presente Invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza en el contexto de la producción de anticuerpos humanizados. En modalidades alternativas, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza, en el contexto de la producción de anticuerpos quiméricos. En ciertas modalidades específicas, cuando se están produciendo múltiples anticuerpos utilizando las mismas instalaciones y/o el mismo equipo de procesamiento, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza, en el contexto de: la producción de anticuerpos completamente humanos y humanizados; completamente humanos y quiméricos; humanizados y quiméricos; o completamente humanos, humanizados y quiméricos.

Una diversidad adicional entre los anticuerpos, incluyendo, pero no limitándose a anticuerpos terapéuticos, ocurre en relación con las cadenas específicas pesadas y ligeras, que comprenden un anticuerpo particular. Las moléculas de inmunoglobulina están comprendidas de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como RVCP o VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VCL o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL, adicionalmente, pueden estar subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), que están intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de marco estructural (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, arregladas, del extremo amino-terminal al extremo carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Por ejemplo, los anticuerpos humanos se pueden dividir en los siguientes isotipos específicos, basándose en la secuencia de aminoácidos de sus cadenas pesadas. lgA1; lgA2, Ig D , IgE, Igd; lgG2, lgG3, lgG4, e IgM. Además, los anticuerpos se pueden dividir en dos grupos, dependiendo de si la secuencia de su cadena ligera es (?) o lambda (?).

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza, en el contexto de la producción de anticuerpos IgA!, lgA2, IgD, IgE, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, e IgM. En modalidades alternativas, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza , en el contexto de la producción de anticuerpos kappa o lamba. En ciertas modalidades específicas, cuando se producen múltiples anticuerpos utilizando las mismas instalaciones y/o el mismo equipo de procesamiento , la presente invención se refiere a composiciones y métodos para monitorear el acarreo de producto y/o para verificar la limpieza , en el contexto de la producción de anticuerpos q ue tienen una combinación de isotipo de anticuerpo y uso de cadena ligera.

Además de los anticuerpos de longitud completa, a men udo se emplean fragmentos de anticuerpo en investigación , desarrollo, y en terapéutica . Por ejemplo , pero sin limitaciones , tales fragmentos de anticuerpo pueden comprender la porción de unión al antígeno completa del anticuerpo de longitud completa , o porciones de los mismos. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados en el término "porción de unión al antígeno" de una molécula de anticuerpo, incluyen : (i) u n fragmento Fab, un fragmento monovalente q ue comprende los dominios VL, VH , C L y CH ^ (ii) un fragmento F(ab')2, u n fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro a la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd q ue comprende los dominios VH y CH 1 , (iv) un fragmento Fv que comprende los dominios VL y VH de u na sola rama de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al . , (1 989) Nature 341 :544-546, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente como referencia) , q ue comprende un dominio VH ; y (vi) una región determinante de complementariedad (C DR) aislada. Además, aunq ue los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, éstos se pueden unir, utilizando los métodos recombinantes, mediante un ligando sintético que haga posible que éstos se formen como una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como fragmentos Fv de una sola cadena (ScFv); véase por ejemplo Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, cuyas enseñanzas se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). Tales anticuerpos de una sola cadena también están abarcados dentro del término de "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de una sola cadena, tales como los diacuerpos, también están incluidas. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizan un ligando que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios a aparearse con dominios complementarios provenientes de otra cadena, y crear dos sitios de unión al antígeno (véase por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente como referencia). Todavía adicionalmente, un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo, puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de la estreptavidina, para forma una molécula ScFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo cisteína, un péptido marcador y una marca de polihistidina C-terminal para preparar moléculas ScFv bivalentes y biotinadas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar a partir de anticuerpos completes, utilizando las técnicas convencionales, tales como la digestión con papaína o con pepsina, respectivamente, de los anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión, se pueden obtener utilizando las técnicas estándar de recombinación de ADN. En un aspecto, las porciones de unión al antígeno son dominios completos o pares de dominios completos.

En ciertas modalidades, la presente invención incluye composiciones y métodos para la detección de uno o más, o cualquier combinación de los fragmentos de anticuerpo y moléculas que contienen fragmentos de anticuerpo seleccionados a partir del siguiente grupo no limitante: Fab; F(ab')2; Fd; Fv; scFv; CDRs aisladas; diacuerpos; y proteínas de inmunoadhesión. 5.4 Producción de Anticuerpos de Captura y Detección Los términos "anticuerpo de captura" y "anticuerpo de detección" tal como se utilizan en esta sección , se refieren a un anticuerpo intacto o un fragmento de u n ión al antígeno del mismo. Los anticuerpos de captura y detección de la presente invención, pueden ser generados por una variedad de técnicas, incluyendo la inmunización de u n animal con un antígeno de interés, segu ida por los métodos convencionales de anticuerpos monoclonales, por ejemplo la técnica estándar de hibridación en células somáticas de Kohler y M ilstein (1 975) Nature 256:495. Aunq ue se prefieren los procedimientos de hibridación celular somática, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo la transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

U n sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de h ibridomas es u n procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmun ización y técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión , son conocidos en la técnica. Los patrones de fusión (por ejemplo, células de mieloma mu rinas) y los procedimientos de fusión , también son conocidos.

U n anticuerpo de preferencia puede ser u n anticuerpo humano, quimérico o humanizado. Los anticuerpos qu iméricos o h umanizados de la presente invención , se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no hu mano preparado de la manera anteriormente descrita. El ADN que codifica para inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera, se puede obtener a partir del hibridoma no humano de interés, y se puede manipular por ingeniería genética para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas), empleando las técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas pueden ser ligadas a regiones constantes humanas, utilizando los métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo la Patente Norteamericana U.S. No. 4,816,567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, se pueden insertar regiones CDR murinas en un marco estructural humano, utilizando los métodos conocidos en la técnica (véanse por ejemplo, la Patente Norteamericana U.S. 5,225,539 de Winter, y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al.).

En ciertas modalidades, la presente invención incluye la evaluación de un panel de captura y/o anticuerpos de detección o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, para identificar el anticuerpo de captura y/o de detección apropiado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para el producto de biotecnología particular que está siendo producido. Un ejemplo sin limitaciones de un panel incluye: anticuerpos anti-lgG humana (H + L), anticuerpos contra el fragmento F(ab')2 de la IgG humana, anticuerpos contra la región kappa de la IgG humana, anticuerpos contra la región lambda de la IgG humana y anticuerpos anti-lgG murina (H + L). Los anticuerpos anti-lgG humana (H + L) se emplean para capturar y/o detectar moléculas de producto enteras (anticuerpos completamente humanos/humanizados); los anticuerpos contra el fragmento F(ab')2 de la IgG humana, anticuerpos contra la región kappa de la IgG humana y anticuerpos contra la región lambda de la IgG humana, capturarán y/o detectarán sitios de unión del producto, si tales sitios de unión son humanos o humanizados; y los anticuerpos anti-lgG murina (H + L) proporcionarán especificidad para productos quiméricos. En ciertas modalidades, particularmente aquellas modalidades que ocurren después de la limpieza, cuando los productos residuales pueden estar fragmentos, degenerados o desnaturalizados de alguna otra manera, una combinación de varios anticuerpos de captura y/o detección, asegurará la detección de tantos residuos de producto como sea posible. 6. EJEMPLOS 6.1 Ensayo de Detección de ELISA La presente invención se refiere, en ciertas modalidades, a inmunoensayos en los cuales uno o más anticuerpos de captura o anticuerpos de captura o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, se utilizan para detectar residuos asociados con la producción de productos de biotecnología. Como se muestra en la Tabla 1, se evaluaron cinco anticuerpos de captura disponibles en el comercio, en relación con el desarrollo del ensayo inicial. Estos mismos cinco anticuerpos ("ab") conjugados con peroxidasa de rábano (HRP), también fueron evaluados en este estudio como anticuerpos de detección.

Tabla 1. Anticuerpos de Captura Los anticuerpos de detección seleccionados (conjugados con HRP) fueron probados con respecto al reconocimiento de dos productos, utilizando la prueba de inmunoelectrotransferencia (Western blot): Ab #1, el objetivo principal en este estudio, y Ab #2, como modelos para probar el reconocimiento después de la exposición a agentes de limpieza. Los Ab #1 y AB #2 fueron incubados con CIP-100 (2.5%) y con CIP-200 (2.5%) a 75°C durante 30 minutos, para imitar las estrictas condiciones de limpieza de las instalaciones. Después de la incubación, las muestras de prueba fueron neutralizadas. Las moléculas intactas y las muestras tratadas neutralizadas, se cargaron en un gel SDS-PAGE y se sometieron a inmunoelectrotransferencia contra anticuerpos anti-lgG humana (H + L).

Como se muestra en la Figura 1, se detectaron residuos de los Ab #1 y Ab #2 por los anticuerpos anti-lgG humana (H + L). Las muestras tratadas con CIP-100 estaban más degradadas. Los productos degradados no se detectaron, sin embargo, los productos resid uales todavía fueron detectados. Las muestras tratadas con CI P-200 generaron algunos agregados y una cantidad sig n ificativa de residuos de Ab. Los agregados y los productos resid uales fueron detectados por el anticuerpo anti-lgG humana (H + L) . El anticuerpo anti-lgG humana (H + L) es adecuado para detectar productos de anticuerpos monoclonales . La concentración de anticuerpo sembrada en las soluciones de limpieza , se anticipó que fuera aproximadamente 1000 veces más alta que una muestra de limpieza real proveniente de un cambio en la prod ucción. Era necesaria u na concentración de proteína más alta para seleccionar los reactivos de detección de E LISA para el desarrollo del ensayo.

Para estudiar adicionalmente el reconocimiento de moléculas generales de mAb, completamente h umanas, human izadas, quiméricas, anticuerpos monoclonales de cadena ligera kappa y lambda por el anticuerpo de detección , se probaron contra los cinco anticuerpos de detección disponibles en el comercio que se muestran en la Tabla 1 . Los resultados se muestran en las Figu ras 2 a 7.

Los cinco Ab de detección reconocieron los productos esperados (Tabla 2). Los anticuerpos anti-lgG hu mana (H+L) y contra F(ab')2 de IgG humana reconocieron todos los productos (Figuras 3 y 4). Los anticuerpo contra región lambda de IgG humana sólo reconocieron los Ab #1 y Ab #3 con cadenas ligeras lambda (véase la Figu ra 5). Los anticuerpos contra la región kappa de IgG humana reconocieron fuertemente los Ab #2 , Ab #1 1 , Ab #1 3 y Ab #9 con cadenas ligeras kappa , pero también mostraron u na ligera reacción cruzada con las otras moléculas (Figu ra 6) . Los anticuerpos anti-lgG murina (H + L) reconocieron fuertemente el Ab #1 1 , que es un producto quimérico murino y humano, pero también detectaron ligeramente otros prod uctos humanos (Figura 7) . Este fenómeno de ligera reacción cruzada , dependía de la dosis en el análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blot) , ya que este modelo no es cuantitativo y no se realizó ningún estudio de la cantidad cargada. A contin uación se describen otros estudios para distinguir la reactividad cruzada entre las moléculas de prueba.

Tabla 2. Productos de mAb Producidos en ABC Cada Ab individual de captura y detección fue evaluado individualmente por la técnica de ELISA para una evaluación inicial. La placa fue recubierta con 10 g/mL de Ab de captura y se detectó con 2 y 5 g/mL de Ab de detección. Con base en estos resultados de selección, cada cantidad de Ab individual fue estudiada adicionalmente, realizando un experimento en donde cada Ab fue probado bajo tres condiciones de captura y seis condiciones de detección, contra productos relacionados. Los anticuerpos anti-lgG humana (H + L) y contra la región F(ab')2 de IgG fueron aplicados al Ab #1, ya que éste es el principal objetivo en el proyecto. Las condiciones y resultados experimentales, se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. DOE de Ab Individuales y Resultados * Valor fuera de rango; el pozo de la placa estaba contaminado valores no se usaron para la evaluación.

La meta de la prueba de Ab individuales fue encontrar una combinación óptica para lograr la mejor sensibilidad para cada Ab. Las condiciones en letra negrilla en la Tabla 3, indican que en el rango dinámico de 0.25 a 8 ng/mL, la señal más baja fue mayor de 0.1, la cual es una lectura confiable sobre el fondo, y la señal más alta alcanzó el máximo de lectura de la placa. Bajo estas condiciones, el ensayo alcanzó una sensibilidad más de 10 veces mayor que el requerido para el Ab #1. La Tabla 4 lista el límite de acarreo permisible del Ab #1.

Tabla 4. Sensibilidad Requerida del Ab #1 El límite de cuantificación de ELISA es 0.25 ng/mL.

La reactividad cruzada dependiente de la dosis observada durante las pruebas de Western blot, no se observó en la técnica de ELISA, posiblemente debido a la concentración más baja de muestra probada (datos no mostrados).

Los cinco Ab individ uales se co m binaron de acuerdo con resultados experimentales anteriormente descritos , tal como m uestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Com binación de Ab Los Ab combinados fueron reconfirmados con respecto a sensibilidad y adecuabilidad para la detección de Ab #1 , Ab #2 y Ab #1 1 . La Figura 8 muestra la curva estándar para esos productos. Todas las cu rvas tienen un coeficiente de correlación de 0.9999 con un ajuste cuadrático, y cada rango de curva fue de 0.25 a 8 ng/mL.

El objetivo para la preparación de los combinados de Ab de recubrimiento y detección , fue ser suficiente para 1 000 placas. Basándose en la relación de combinación , se prepararon los grandes combinados de Ab de captura y detección de acuerdo con las Tablas 6 y 7. El combinado de Ab se utilizó para la calificación del ensayo.

Tabla 6. Combinado de Ab de Captura Tabla 7. Combinado de Ab de Detección Para verificar la confiabilidad del ensayo, el eluato SP y la ultrafiltración/diafiltración ("UF/DF") final del Ab #1, se emplearon para el ensayo de calificación . Se reportó que esas muestran eran aproximadamente 5 mg/mL y fueron dil u idas de conformidad con este estudio Bajo condiciones normales, se almacenaron muestras de sustancia farmacéutica a -80CC antes de la prueba. Las condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente du rante 4 horas, a 2°-80C durante 48 horas y tres ciclos de congelamiento/descongelamiento, fueron desafiados para abarcar las posibles circunstancias de laboratorio. Los resultados se resumen en la Tabla 8. Los resultados de prcteína no se vieron afectados significativamente por las diferentes condiciones de almacenamiento (< 0%).

Tabla 8. Efecto del Almacenam iento de las M uestras El tiempo de desarrollo de color del sustrato de ELI SA se estableció en 14 minutos . Para evaluar la variabilidad del tiempo, se probaron 14 ± 1 minutos. Los resultados no fueron afectados du rante una ventana de 1 minuto (Tabla 9) .

Tabla 9. Tiempo de Desarrollo del Sustrato Las placas de prueba fueron leídas inmediatamente después de la adición de ácido fosfórico 2 M para detener la reacción , y se leyeron nuevamente después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. No se observaron diferencias significativas (< 1 0%) (Tabla 1 0.) Tabla 10. Tiempo de I ncubación de la Placa La "precisión" del método anal ítico es el g rado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales , cuando el método es aplicado repetidas veces a múltiples muéstreos de u na muestra homogénea.

La "repetibilidad del ensayo" mide la precisión del procedimiento anal ítico cuando es realizado múltiples veces bajo condiciones analíticas uniformes. Se probaron seis al ícuotas de eluato SP y de UF/DF final en una placa. La concentración de proteína se calculó en cada alícuota. Se calcu ló el valor del porcentaje de detección estándar relativa de la concentración , utilizando las seis med iciones. Los resultados se resumen en la Tabla 1 1 . La desviación estándar relativa para las mediciones de proteína, fue < 7% .

Tabla 1 1 . Repetibilidad del ensayo El término "precisión intermediaria" es u na medición de la dispersión de los resultados de prueba producidos en el laboratorio, cuando el procedimiento analítico se realiza en diferentes d ías o es realizado por diferentes analistas.

Se probaron tres alícuotas de cada eluato SP y de cada U F/DF final. Este experimento se repitió otras dos veces en diferentes días, por un diferente analista . Los primeros tres resultados de la repetibilidad del ensayo fueron utilizados para el d ía 1 de este estudio. Los resultados se m uestran en la Tabla 1 2. El porcentaje de desviación estándar relativa para la medición de proteína fue < 5% , dentro del rango de precisión esperado de 20%.

Tabla 12. Precisión intermediariaria Para estimar el límite de cuantificación, el punto más bajo de la curva estándar, se prepararon diluciones en serie de dos de estándares de Ab #1 de 8 ng/mL seis veces, y se cargaron en seis diferentes placas. Los resultados se muestran en la Tabla 13. De conformidad con los lineamientos de la ICH, el límite de cuantificación del ensayo es la concentración mínima a la cual la relación de señal con respecto al ruido es mayor de 10:1 y la desviación estándar relativa es menor del 20%. La medición del ruido del blanco fue de 0.004 UA. La señal promedio del estándar de 0.25 ng/mL fue de 0.122 UA. Mientras que 0.125 ng/mL cumple los criterios, se seleccionó 0.25 como el límite de cuantificación (LDC), para asegurar la robustez del ensayo. El límite de cuantificación se estableció en 0.25 ng/mL, con una relación de señal/ruido de 30.5:1 y una desviación estándar relativa de 14% .

Tabla 13. Estudio del Límite de C uantificación La "linearidad" de un método analítico, es su capacidad de produci r resultados de prueba que sean ya sea d irectamente proporcionales, o que sean proporcionales mediante u na transformación matemática bien definida, a la concentración de la sustancia por analizar de interés.

Los estándares que van de 0.25 a 8 ng/mL se prepararon a partir de la sustancia farmacéutica Ab #1 . Los estándares y el blanco de amortiguador se colocaron en una placa y se probaron . La gráfica se muestra en la Figu ra 9. El coeficiente de correlación del aj uste cuadrático fue mayor de 0.999. Los resultados indican que las respuestas de absorbancia de los estándares son proporcionales a la concentración de proteína por el ajuste cuadrático.

La exactitud del ensayo se estudió utilizando el método de siembra y recu peración . El eluato SP y el U F/DF final se sembraron a concentraciones estándar finales de 1.0, 2.0 y 4.0 ng/mL. El ensayo se calculó como la relación de proteína recuperada, dividida entre la concentración experimental de la siembra, y se expresó como porcentaje. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 14. Las recuperaciones de las siembras estuvieron en el rango de 100 ± 7.9% para todas las concentraciones sembradas.

Tabla 14. Siembra y Recuperación Las muestras de eluato SP y UF/DF final se diluyeron en series de dos, en el rango de calibración de la curva estándar de referencia, para evaluar la linearidad de dilución de la muestra. En la Tabla 15 se demuestra que las diluciones de la muestra no afectan los resultados. La variable fue menor de 10%. Sólo se necesitaron tres puntos de dilución para confirmar la dilución de muestra para la prueba de muestras desconocidas.

Tabla 15. Linearidad de la Dilución de las M uestras El "rango" de u n método anal ítico es el intervalo entre la concentración superior e inferior de la sustancia por analizar, q ue se puede determinar con u n nivel razonable de precisión , exactitud y linearidad , empleando e método tal como está escrito. El rango del ensayo se estableció como 0.25 a 8 ng/m L, basándose en la linearidad , exactitud , precisión y límite de cuantificación . Los valores del coeficiente de correlación del ajuste cuad rático fueron mayores de 0.999. Esto indica que en el rango de 0.25 a 8 ng/mL, las respuestas de absorbancia son proporcionales a la concentración de proteína, por el ajuste cuad rático . Se realizaron estudios de siembra y recuperación a concentraciones de 1 .0, 2.0 y 4.0 ng/mL de los estándares, en dos diferentes muestras en proceso. Las recuperaciones estuvieron dentro del rango de 1 00 ± 7.9% . Esto indica que el ensayo es preciso y exacto en el rango estimado.

Para cubrir las necesidades futu ras del suministro comercial , se evaluó un seg undo lote de cada anticuerpo. La Tabla 1 6 indica el primer lote que fue utilizado para u n combinado grande y el seg undo lote para comparación.

Tabla 16. Lotes de Ab Uti lizados para Com paración de Resultados Los resultados se resumen en la Tabla 1 7 y las cu rvas estándar de referencia de los primero y segundo lotes , se muestran en la f igu ra 1 0. El seg undo lote no afectó el resultado.

Tabla 17. Comparación del Segundo lote de Ab Para evaluar la adecuabilidad del ensayo para la detección de concentraciones de proteína de producto residual en enjuag ues del equipo, se estudió la recuperación de proteína de superficies del equipo. El eq uipo de prod ucción está hecho de acero inoxidable, hastelloy o vid rio. Un cupón representativo (es decir, u na muestra representativa tal como un raspado con hisopo, un enjuague u otra forma de muestra) de cada material individual , se aplicó con 40 mide sustancia farmacéutica Ab #1 , la cual se diluyó hasta 2 y 3 ppm. La su perficie se dejó secar al aire d urante 3 a 4 horas, y después se enj uagó con 40 ml_ de agua M illiQ . Se colectaron los enjuagues. La recuperación de la proteína de la superficie se calculó como la relación de la concentración de proteina en el enj uag ue, dividida entre la concentración de la siembra , y se expresó como porcentaje.

Como se muestra en la Tabla 1 8 , el promedio de recu peración fue de 76% para superficies de vidrio, 87% para superficies de acero inoxidable y 76% para superficies de la aleación hastelloy. Los resultados cumplen los criterios de aceptación (50 - 1 50%) y demostraron que el ensayo es adecuado para probar m uestras de enjuague de eq uipo de prod ucción.

Tabla 18. Recuperación del Enjuague de Superficies La validación del proceso de Ab #1 incluye la corrida de blancos después de correr el producto del proceso, para evaluar el acarreo de prod ucto. Las corridas de blanco incluyen cromatog rafía con proteína A, SP sefarosa y Q sefarosa, y operaciones de U F/DF. El acarreo de producto A se evaluó utilizando el ensayo de Bradford; sin embargo, el l ímite de acarreo residual (LAR) para el producto de A a B , es de 4 ng/mL (VR-2249, VR-2250 y VR-2251 ) , lo cual está por debajo del LDC del ensayo de Bradford (1 .25 pg/mL) . El ensayo de mAb se evaluó con respecto a su adecuabilidad para soportar o respaldar el estudio de acarreo de Ab #1 del punto A al punto B . La interferencia del amortiguador del proceso con el ensayo se evaluó realizando experimentos de siembra y recuperación del amortiguador. Cada uno de los amortig uadores del proceso tal como está y en dilución de cinco (con amortiguador de d ilución) , se sembraron a concentraciones estándar finales de 1 .0, 2.0 y 4.0 ng/mL.

Como se muestra en la Tabla 1 9, la recuperación fue de aproximadamente 70% para el amortiguador de elución Q sefarosa SR-488 y el amortig uador de elución SP sefarosa SR-61 0 que estuvo dentro de los criterios de aceptación (de 50 a 1 50%) , pero el amortig uador de elución de proteína A SR-493 sólo se recuperó 1 .1 % , debido a las condiciones acidas que interfieren con la unión del antígeno y el anticuerpo.

Tabla 19. Siem bra y Recuperación de Amortig uadores del roceso para Ab #1 tal como Está Los resu ltados de siembra y recuperación del amortiguador diluido, se resumen en la Tabla 20. La recuperación de la proteína íue aceptable de 1 1 0.3 a 1 21 .9% cuando se diluyó en u n factor de cinco. El límite de cuantificación del ensayo es de 1 .25 ng/mL con la dilución en un factor de cinco. Por lo ta nto, para u na operación del ensayo robusta , se recomendó una dilución en un factor de cinco para los tres amortiguadores del proceso. Este formato de ensayo con un LDC de 1 .25 ng/m L, es adecuado para evaluar el acarreo del producto del punto A al punto B .

Tabla 20. Siembra y Recuperación de Amortiguadores de Proceso de Ab #1 Diluidos en un Factor de Cinco Se han desarrollado un nuevo formato de ensayo y condiciones para detectar productos residuales relacionados con mAb en general . Los resultados anteriormente descritos demuestran la reproducibilidad del ensayo. El nuevo ensayo es capaz de cuantificar niveles traza de proteínas mAb, con un límite de cuantificación de 0.25 ng/m L para el Ab #1 . Por lo tanto, la prueba de ELI SA de mAb recién desarrollada proporciona una valiosa herramienta para cuantificar moléculas residuales relacionadas con mAb, para la verificación del cambio de producción y de la limpieza de instalaciones de producción .

Se calificó el desempeño del ensayo para la cuantificación del producto Ab #1 en muestras en proceso. Se estudió la robustez, precisión , límite de cuantificación , linearidad , exactitud , linearidad de la dilución de las muestras, rango, y reactivos comerciales del segundo lote. Todos los resultados anteriores caen dentro de los valores de exactitud y precisión esperados para u na prueba de ELISA. Las condiciones del ensayo se resumen en la Tabla 21 . Además, el estudio de recuperación probó que este ensayo es adecuado para estudios de enjuag ues y estud ios de acarreo de procesos de producción de Ab #1 . Sin embargo, para las corridas de blancos , se necesita una d ilución en u n facto r de cinco para elim ina r la interferencia del amortig uador.

Tabla 21 . Condiciones del Ensayo El ensayo anteriormente descrito se utilizó para probar enjuagues finales provenientes de ciclos de limpieza realizados en el biorreactor, en los tanques de cosecha y de proceso posteriores, en mangueras y alojamientos de filtro, q ue conten ían intermediarios del proceso de prod ucción del anticuerpo #1 , después de las BPM-1 . Todos los enjuagues finales estuvieron por debajo del LDC . Además, se muestrearon enjuagues intermediarios del biorreactor Z-3200 y el tanque TK-2830. Como se muestra en la Tabla 23, sólo los primeros enjuag ues de agua USP del biorreactor Z-3200 y el tanq ue TK-2830, detectaron resid uos de proteína a un n ivel muy bajo. Los resultados probaron adicíonalmente la sensibilidad y especificidad del ensayo anteriormente descrito.

Tabla 23. Resultados de Limpieza para el Enjuague de Equipo para BPM-1* LDC = 0.25 ng/mL Las muestras de enjuag ue final del equipo asociado con las corridas de validación del proceso, se probaron por el ensayo anteriormente descrito. Todas las muestras probadas estuvieron por debajo del límite de cuantificación (LDC) . Los resultados de la validación del proceso, corrida 1 ("VP-1 ") , se listan en la Tabla 24. Después de la limpieza, la concentración de anticuerpo #1 reportable (0.25 ng/mL) es al menos 16 veces menor que el límite de acarreo máximo permisible (4 - 1 3 ng/mL).

Tabla 24. Resultados de Limpieza para Enjuague del Equipo para VP-1 Debido a la alta sensibilidad del ensayo, los productos de mAb rutinariamente trabajados en el laboratorio, potencialmente podrían causar contaminación en este ensayo. Por lo tanto, se recomienda tomar precauciones para asegurar que el equipo y el ambiente utilizados durante las pruebas de las muestras, sean tan limpios como sea posible.

En la presente se citan varias publicaciones, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad como referencia.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un producto residual de biotecnología, caracterizado porque se pone en contacto una muestra de prueba con un sustrato que comprende un anticuerpo de captura o una porción de unión al antígeno del mismo, específico para el producto residual, y la detección de un complejo anticuerpo-antígeno es indicativa de la presencia de un producto residual de biotecnología.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la detección del complejo anticuerpo-antígeno se logra al monitorear la unión de un anticuerpo de detección marcado, capaz de unirse al complejo anticuerpo-antígeno.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia del producto residual de biotecnología es indicativa del acarreo de producto.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de producto residual de biotecnología, es indicativa de la efectividad del proceso de limpieza.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el producto residual se deriva de un producto de ácido nucleico.

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el producto residual se deriva de un producto proteico.

7. El método de la reivindicación 6, caracterizado porque el producto proteico se selecciona del grupo que consiste de: enzimas, hormonas peptídicas; anticuerpos policlonales; anticuerpos monoclonales humanos; anticuerpos monoclonales h umanizados; anticuerpos monoclonales quiméricos; anticuerpos de u na sola cadena ; fragmentos Fab de anticuerpo; fragmentos F(ab')2 de anticuerpo; fragmentos Fd de anticuerpo, fragmentos Fv de anticuerpo; C DRs aisladas ; diacuerpos; y proteínas de inmunoad hesión .

8. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porq ue el anticuerpo de captura o una porción de u nión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo anti-lgG humana (H + L) , anticuerpo contra el fragmento F(ab')2 de la IgG humana, anticuerpo contra la región kappa de la IgG humana ; anticuerpo contra la región lambda de la IgG humana ; anticuerpo anti-lgG murina (H + L) ; y combinaciones de los mismos.

9. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porq ue el sustrato comprende dos o más anticuerpos de captu ra o frag mentos de u nión al antígeno de los mismos, que tienen distintas especificidades de unión .