JP2013537971A

JP2013537971A - 高感度なモノクローナル抗体残留物検出アッセイ

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Publication number: JP2013537971A
Application number: JP2013528381A
Authority: JP
Inventors: ヤン，リーホワ; ラマスブラマニアン，ナタラジヤン
Original assignee: アッヴィ・インコーポレイテッド
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2011-09-13
Publication date: 2013-10-07
Also published as: MX2013002870A; US8945860B2; WO2012037095A1; CA2811003A1; US20120129196A1; CN103221823A; EP2616807A1

Abstract

本発明は、バイオテクノロジー生成物の製造において、生成物キャリーオーバーをモニタリングする時にバイオテクノロジー生成物残留物を検出するための、および／または洗浄確認のための組成物および高感度な方法に関する。特に、本発明は、１つまたは複数の捕捉抗体またはこの抗原結合断片が、バイオテクノロジー生成物の生成に伴う残留物を検出するのに使用される免疫アッセイを対象とする。

Description

本出願は、全体が本明細書に参照により組み込まれている、２０１０年９月１３日に出願された米国仮出願第６１／３８２，４１３号からの優先権の利益を主張するものである。

本発明は、バイオテクノロジー生成物の製造において、生成物キャリーオーバーをモニタリングする時にバイオテクノロジー生成物残留物を検出するための、および／または洗浄確認のための、組成物および高感度な方法に関する。特に、本発明は、１つまたは複数の捕捉抗体またはこの抗原結合断片が、バイオテクノロジー生成物の生成に伴う残留物を検出するのに使用される免疫アッセイを対象とする。

工程装置の洗浄確認は、医薬品の製造管理および品質管理基準（「ＧＭＰ」）遵守に必要とされ、このような遵守は、治療薬が有すると主張する、または有すると示される品質特性および純度特性を、治療薬が満たすことを確保することを目的としている。ＧＭＰ遵守の一環として、全有機炭素（「ＴＯＣ」）アッセイが、バイオテクノロジー生成物残留物を除去するための洗浄手順の有効性を検証するのに伝統的に使用されている。ＴＯＣアッセイは、個々の生成実行の間のほか、生成場所が別個の生成物の間で交換される場合に使用することができる。しかし、ＴＯＣアッセイの重要な限界は、検出限界、＜０．１ｐｐｍが、最大許容キャリーオーバー限界がＴＯＣ検出限界より低い、特定の抗体治療薬などの極低用量生成物に関する生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認に適さない場合があることである。

極低用量生成物の遵守に関する問題に加えて、２００１年に米国食品医薬品局に採択された日米欧医薬品規制調和国際会議（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅＯｎＨａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎＯｆＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓＦｏｒＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎＯｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＦｏｒＨｕｍａｎＵｓｅ）（「ＩＣＨ」）文書ＩＣＨＱ７Ａ、およびカナダ保健省ガイド−００２８（ＨｅａｌｔｈＣａｎａｄａＧｕｉｄｅ−００２８）はいずれも、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための原薬（「ＡＰＩ」）特異的アッセイの開発を推奨している。ＴＯＣアッセイはＡＰＩ特異的ではなく、むしろ源を問わず全有機炭素を測定することから、このような推奨に適合しない。

日米欧医薬品規制調和国際会議（「ＩＣＨ」）文書ＩＣＨＱ７Ａカナダ保健省ガイド−００２８

ＴＯＣアッセイに固有の限界を考慮すると、より感度の高い、ＡＰＩ特異的なアッセイが、生成物キャリーオーバーをモニタリングする時にバイオテクノロジー生成物残留物を検出するための、および／または洗浄確認のための代替方法または補助的方法として望ましいであろう。本発明は、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認に使用することができる、モノクローナル抗体残留物を含む、微量の核酸またはタンパク質残留物を検出する一般的な分析アッセイを導入することにより、この必要性を満たすものである。

（発明の要旨）
特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示す方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、抗体−抗原複合体の検出が、抗体−抗原複合体を結合することができる標識された検出抗体の結合をモニタリングすることにより達成される方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、バイオテクノロジー生成物残留物の存在が生成物キャリーオーバーを示す方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、バイオテクノロジー生成物残留物の存在が不十分な洗浄工程を示す方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、抗原が核酸生成物に由来する方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、抗原が、酵素、ペプチドホルモン、ポリクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆｄ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、単離されたＣＤＲ、ダイアボディおよび免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）に由来する方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、抗原が抗体生成物に由来する方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示し、捕捉抗体またはこの抗原結合部分が、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体、抗ヒトＩｇＧカッパ抗体、抗ヒトＩｇＧラムダ抗体、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を対象とする。

特定の実施形態において、本発明は、バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、別個の結合特異性を有する２つ以上の捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出が、基質が含むバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示す方法を対象とする。特定の実施形態において、別個の特異性を有する捕捉抗体は、特定の比で基質上に存在する。

選択された検出抗体（ＨＲＰコンジュゲート）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを用いて２つの生成物：この試験における主な標的であるＡｂ＃１および洗浄剤に曝露後の認識をテストするためのモデルとしてのＡｂ＃２の認識についてテストされた実験の結果を示す図である。ストリンジェントな設備洗浄条件を模倣するために、Ａｂ＃１およびＡｂ＃２は、７５℃で３０分間、ＣＩＰ−１００（２．５％）およびＣＩＰ−２００（２．５％）と共にインキュベートされた。インキュベーション後、テスト試料は中和された。インタクトな分子および中和処理された試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加され、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と比較してブロットされた。図は、インタクトな（＊）、ＣＩＰ−１００処理（１）またはＣＩＰ−２００処理（２）されたＡｂ＃２およびＡｂ＃１の抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを具体的に表している。下記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す図である：ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２ＳＴＤ（レーン１）；Ａｂ＃１（レーン３）；Ａｂ＃２（レーン４）；Ａｂ＃１１（レーン５）；Ａｂ＃３（レーン６）；Ａｂ＃１３（レーン７）；Ａｂ＃９（レーン８）；およびＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２ＳＴＤ（レーン１０）。レーン３および９はブランクである。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いた、図２に概説されているように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のウェスタンブロット分析を示す図である。抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体を用いた、図２に概説されているように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のウェスタンブロット分析を示す図である。抗ヒトＩｇＧラムダ抗体を用いた、図２に概説されているように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のウェスタンブロット分析を示す図である。抗ヒトＩｇＧカッパ抗体を用いた、図２に概説されているように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のウェスタンブロット分析を示す図である。抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いた、図２に概説されているように実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のウェスタンブロット分析を示す図である。Ａｂ＃１、Ａｂ＃２およびＡｂ＃１１を検出するための組み合わせの感受性および適合性に基づき組み合わされたＡｂ（下の表５に概説されているような）に基づく参照標準曲線を示す図である。曲線は全て、二次フィットと０．９９９９の相関係数を有し、各曲線範囲は０．２５から８ｎｇ／ｍＬであった。本明細書で使用される分析方法の直線性の確立に向けた実験を示す図である。分析方法の「直線性」は、目的とする分析物の濃度に正比例する、または十分に定義された数学的変換により目的とする分析物の濃度に比例するテスト結果を導く該方法の能力である。０．２５から８ｎｇ／ｍＬの範囲の標準物質は、Ａｂ＃１薬剤物質から調製された。標準物質および緩衝液ブランクがプレートに添加され、テストされた。プロットは図９に示されている：Ａｂ＃１標準曲線（プレート１、上段；プレート＃２、中段およびプレート＃３、下段）。二次フィットの相関係数は、０．９９９より大きかった。結果は、標準物質の吸光反応が二次フィットによるタンパク質濃度に比例することを示している。本明細書で使用される分析方法の範囲の確立に向けた実験を示す図である。分析方法の「範囲」は、分析物の上位と下位の間の区間であり、該区間は、書かれているような方法を用いて適切なレベルの精度、正確度および直線性により決定することができる。アッセイの範囲は、直線性、正確度、精度および定量限界に基づき０．２５から８ｎｇ／ｍＬとして確立された。二次フィットの相関係数値は、０．９９９より大きかった。これは、０．２５から８ｎｇ／ｍＬの範囲において、吸光反応が二次フィットによるタンパク質濃度に比例することを示している。スパイク回収試験は、２つの異なる工程内試料中の１．０、２．０および４．０ｎｇ／ｍＬレベルの標準物質で実施された。回収率は１００±７．９％であった。これは、アッセイが推定範囲において厳密および正確であることを示している。結果は表１７にまとめられており、第１および第２ロットからの参照標準曲線は図１０に示されている：第１（上段）および第２ロット（下段）Ａｂを用いたＡｂ＃１標準曲線。

５．１キャリーオーバーモニタリングおよび洗浄確認
本発明の組成物および方法によるキャリーオーバーモニタリングおよび洗浄確認は、材料の汚染またはキャリーオーバーがＡＰＩ品質に最大のリスクをもたらす状況および工程段階に対して行うことができる。しかし、本発明の組成物および方法は、ＡＰＩ品質に最小限のリスクをもたらすか直接のリスクをもたらさない状況および工程段階に同様に適用できるが、その他の点では本発明の組成物および方法の使用は望ましいこのような実施の望ましさに影響を与える要因には、従業員の健康および安全性、工程装置保守、効率的な工程開発最適化の必要性、ならびにバイオテクノロジー生成物の生成に使用される設備および／または工程装置に関する環境条件を含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、本発明の組成物および方法を用いたキャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄手順の確認は、実際の装置使用パターンを反映するように設計される。限定するものではないが、例えば、１つを超えるＡＰＩが同じ装置を用いて製造され、および装置が同じ工程により洗浄される状況では、代表的なＡＰＩが本発明の組成物および方法によるバリデーションに選択され得る。代替の実施形態において、同じ装置を用いて製造された１つもしくは複数のＡＰＩの組み合わせ、または全てのＡＰＩの組み合わせが、本発明の組成物および方法によるバリデーションに選択され得る。特定の実施形態において、ＡＰＩまたはＡＰＩの組み合わせの選択は、ＡＰＩの溶解度および洗浄の困難さなどの（ただし、これらに限定されない）要因に基づく。さらに、特定の実施形態において、残留限界の計算は、ＡＰＩの効力、毒性および安定性などの（ただし、これらに限定されない）要因に基づく。

特定の実施形態において、本発明の方法は、キャリーオーバーをモニタリングおよび／または洗浄手順を確認するために、特定の工程段階での試料採取を伴う。特定の実施形態において、試料採取には、スワブ法（ｓｗａｂｂｉｎｇ）、リンス法（ｒｉｎｓｉｎｇ）、およびテスト材料を得るための当業者に公知の任意の代替方法（例えば、直接抽出）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、試料採取は、不溶性残留物を検出するために実施される。代替の実施形態において、試料採取は、可溶性残留物を検出するために使用される。特定の実施形態において、試料採取は、不溶性および可溶性残留物の両方を検出するために使用される。

特定の実施形態において洗浄手順は、手順が日常的な生成の中で使用される場合に依然として有効であることを確保するために、最初のバリデーション後特定の間隔でモニタリングされる。特定の実施形態において、該間隔は各生成実行後となる。しかし、代替の間隔、例えば（ただし、これらに限定されない）、特定の回数の生成実行後、フィルターもしくはベントなどの特定の工程装置が交換された後、または培地などの特定の生成構成要素が導入された後は、当技術分野で公知である。

５．２バイオテクノロジー生成物残留物の検出アッセイ
本発明は、目的とする生成物残留物を結合することができる１つまたは複数の捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む、バイオテクノロジー生成物残留物検出アッセイに関する。特定の実施形態において、捕捉抗体またはこの抗原結合断片は、免疫アッセイとの関連で使用される。このような免疫アッセイには、サンドイッチＥＬＩＳＡ、阻害ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイおよび化学発光免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。本発明の具体的な実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡが使用される。

本発明の特定の実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡが、バイオテクノロジー生成物残留物の試料をアッセイするために使用される。一般的に言えば、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、表面は最初に、多量の捕捉抗体が結合され得るように調製される。調製された表面上のいずれの非特異的結合部位も、次いでブロックされる。このようなブロックは、ウシ血清アルブミンなどの（ただし、これに限定されない）ブロッキングタンパク質に表面を曝露させることを含む（ただし、これに限定されない）、当技術分野で一般的に公知の方法により達成することができる。非特異的結合部位のブロック後、表面はテスト試料と接触する。表面は、生成物残留物と捕捉抗体の間の結合を可能にするためにテスト試料と共にインキュベートされ、任意の生成物残留物が存在するはずである。インキュベーション期間が完了すると、表面は、非結合分子を除去するために洗浄される。特定の実施形態において、生成物残留物を結合することができる第二の非標識抗体が、次いで添加される。このような実施形態において、二次抗体の定常領域に特異的な第三の酵素結合抗体、またはさもなければ標識抗体が添加される。表面は次いで、非結合抗体−標識コンジュゲートが洗い流されるように洗浄される。標識からのシグナル、例えば、測定することができるカラーシグナルまたは電気化学的シグナルを誘発するために、化学薬品が次いで添加される。シグナルは、標的断片の存在および量の指標として測定される。代替の実施形態において二次抗体は、これ自体が標識されまたは酵素に結合され、これにより三次抗体の必要性を現実的に意味のないものにする。

特定の実施形態において、免疫アッセイが実施される表面として使用される固相は、表面、粒子、多孔性マトリックス等の形態での支持体／担体を含む、本質的に水不溶性である任意の不活性支持体または担体であってもよい。例示的な支持体／担体には、小シート、セファデックス（商標）、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、および９６ウェルマイクロタイタープレートを含む、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等から製造されるアッセイプレートまたは試験管のほか、濾紙、アガロース、架橋デキストランおよび他の多糖類などの粒子材料が含まれる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスおよび反応性基質が、捕捉試薬固定化に適切に使用されてもよい。

具体的な実施形態において、固定化捕捉抗体は、マイクロタイタープレートにコーティングされる。限定するものではなく、例えば、固相は、いくつかの試料を同時に分析するのに使用することができるマルチウェルマイクロタイタープレートであってもよい。マイクロタイタープレートの例には、Ｍａｘｉｓｏｒｂ（商標）またはＩｍｍｕｌｏｎ（商標）（Ｎｕｎｃ、ロスキレ、デンマーク）などの９６ウェルＥｌｉｓａプレートが含まれる。さらに、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）技術などの多重ＥＬＩＳＡ技術は、数百のＥＬＩＳＡを同時に行うのに使用することができる（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。このような多重ＥＬＩＳＡアッセイ法は、当技術分野でよく知られており、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）技術のほかに、多数の分析物を同時に調べるための複数の捕捉および／または検出抗体の使用を伴うさまざまな技術を含む。このような多重アッセイにおけるさまざまな検出抗体の識別は、複数の別個の標識の使用を伴う。代替の多重アッセイ技術には、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）およびＢＤ（商標）ＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれる。

本発明は、本明細書に記載された必要とされる特徴を示す全ての捕捉抗体を包含する。限定するものではないが、例えば、本明細書に例証された反応性のパターンを有する抗体は、該抗体が属する免疫グロブリンクラスまたはサブクラスにかかわらず本発明の範囲内である。特定の実施形態において適切なモノクローナル抗体は、クラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはクラスＩｇＭ、ＩｇＡ、または任意の他の公知のＩｇクラスもしくはサブクラスの抗体であり得る。

本発明の選択された捕捉抗体またはこの抗原結合断片は、当業者に利用可能な任意の方法により適切な基質に固定化される。特定の実施形態において抗体または抗原結合断片は、基質上の選択された官能基に直接結合される。あるいは、抗体または抗原結合断片は、リンカーまたはスペーサーを介して基質に間接的に結合される。特定の非限定的な実施形態において、結合は、捕捉抗体またはこの抗原結合断片をストレプトアビジン（またはビオチン）に共有結合させて達成することができ、次いで、基質に共有結合されたビオチン（またはストレプトアビジン）部分を介して基質への結合が間接的に生じる。あるいは、チオール末端シランが基質表面のコーティングに使用されてもよく、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば、Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）が、抗体または抗原結合断片結合に使用されてもよい。米国特許第５，０７７，２１０号を参照のこと。この方法により、抗体またはこの抗原結合断片は、高密度（例えば、２ｎｇ／ｍｍ２）で固定化され得る。

別の種類の表面固定化法は、ポリマーヒドロゲルマトリックスを使用する。これらの材料は、典型的には大量の水を含有し、柔らかく、生体不活性である。例には、ポリ（ビニルアルコール）の架橋ポリマーフィルムおよびカルボキシメチルデキストランの架橋ポリマーフィルムが含まれる。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｊ．およびＹ．Ｉｋａｄａ、「ＣｏｖａｌｅｎｔＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓＯｎｔｏｔｈｅＳｕｒｆａｃｅｏｆＰｏｌｙ（ｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ）Ｈｙｄｒｏｇｅｌ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１２、（１９９１）、７４７−７５１頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら、「ＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｔｏａＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ＭｏｄｉｆｉｅｄＧｏｌｄＳｕｒｆａｃｅｆｏｒＢｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅＳｅｎｓｏｒｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９６、（１９９１）、２６８−２７７頁；Ｌｏｆａｓ，Ｓ．およびＢ．Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、「ＡＮｏｖｅｌＨｙｄｒｏｇｅｌＭａｔｒｉｘｏｎＧｏｌｄＳｕｒｆａｃｅｓｉｎＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅＳｅｎｓｏｒｓｆｏｒＦａｓｔａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＣｏｖａｌｅｎｔＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓ」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍｕｎ．、（１９９０）、１５２６−１５２８頁）を参照のこと。

本発明の捕捉抗体には、α ＨｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、α ＨｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２、α ＨｕＩｇＧ λ、α ＨｕＩｇＧ κおよびα ＭｓＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）が含まれるが、これらに限定されない。

さらに、捕捉抗体またはこの抗原結合断片により提供される機能、例えば、基質表面への特定のバイオテクノロジー生成物残留物の結合は、伝統的なモノクローナル抗体の代替物を用いて達成されてもよい。伝統的なモノクローナル抗体の代替物には、アフィボディ、ドメイン抗体、ナノボディおよびユニボディなどの抗体模倣体が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、別個の結合特異性を有する複数の捕捉抗体またはこの抗原結合断片が、基質表面に結合される。複数の捕捉抗体またはこの抗原結合断片の包含は、複数のバイオテクノロジー生成物残留物を同時に検出することを可能にする。このようなバイオテクノロジー生成物残留物は、同じまたは異なる生成物から得ることができる。限定するものではないが、例えば、単一のモノクローナル抗体生成物の生成は、重鎖残留物、軽鎖残留物、可変領域残留物、および定常領域残留物を含むが、これらに限定されないさまざまな生成物残留物をもたらし得る。特定の実施形態において、さまざまな捕捉抗体またはこの抗原結合断片は、特定の比で存在する。捕捉抗体の混合物のような１つの非限定的な例は、下の表５に概説されており、下記の抗体：α ＨｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、α ＨｕＩｇＧＦ（ａｂ’）２、α ＨｕＩｇＧ λ、α Ｈｕ κ、およびα ＭｓＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）が、下記の比：１：２：１６：８：８で存在している。

選択された捕捉抗体またはこの抗原結合断片を適切な基質に固定化し、およびこの捕捉抗体またはこの抗原結合断片を、キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための試料に曝露させた後、バイオテクノロジー生成物残留物の結合を可視化することが必要である。このような可視化は、バイオテクノロジー生成物残留物上のエピトープを特異的に結合する検出抗体の添加により、一般に達成される。

検出抗体は、蛍光色素、化学発光および放射性標識などの部分を通じて直接検出されてもよく、または酵素などの、反応もしくは誘導体化されなければならない部分を通じて間接的に検出されてもよい。直接検出することができる部分の例には、放射性同位体、希土類キレートまたはフルオレセインおよびこの誘導体；ローダミンおよびこの誘導体などのフルオロフォアが含まれる。反応または誘導体化されなければならない部分の例には、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ストレプトアビジン−ＨＲＰ、スピン標識、バセリオファージ（ｂａｃｅｒｉｏｐｈａｇｅ）標識、安定なフリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されない。これらの検出可能な部分を検出抗体に共有結合するには、従来の方法が利用可能である。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンキシジン（ｂｉｓ−ｄｉａｚｏｔｉｚｅｄｂｅｎｘｉｄｉｎｅ）等のカップリング剤が、抗体を上記標識でタグ付けするのに使用されてもよい。

サンドイッチアッセイにおいて２つの抗体は、各々が標的抗原を結合し、しかし互いに相互作用または結合しない場合に最も有効に作動するため、検出抗体による反応性について、固定化捕捉抗体もしくはこの抗原結合断片がテストされ、または３つの抗体系の場合、二次抗体および検出抗体がテストされる。標的抗原に対する高い親和性を保持しつつ、捕捉抗体またはこの抗原結合断片と検出抗体の間では低い反応性が好ましい。さらに、抗体対は、各々が別個の位置で標的バイオテクノロジー生成物残留物を結合する場合に最も有効に作動する。したがって、抗体は、重複する結合特異性を有する抗体の対形成を避けるように評価されるべきである。

バイオテクノロジー生成物残留物に対する捕捉抗体またはこの抗原結合断片の使用は、キャリーオーバーをモニタリングする、および／または洗浄をバリデーションするための有利なアプローチである。モノクローナル抗体の高い特異性および感受性のため、本発明の組成物および方法は、ＴＯＣアッセイの現在の限界よりはるかに低い極低用量のバイオテクノロジー生成物残留物を検出することができる。さらに、このような抗体検出方法は、目的とするＡＰＩの存在を特異的に同定することができ、故にＩＣＨＱ７Ａおよびカナダ保健省ガイド−００２８の推奨範囲に入る。

５．３抗体生成のキャリーオーバーモニタリングおよび洗浄確認
特定の実施形態において、本発明は、ＡＰＩが抗体である医薬品の生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。特定の実施形態において、抗体は、裸の抗体として、（毒素または標識などの、ただし、これらに限定されない）パートナー分子にコンジュゲートされた抗体として医薬品との関連で使用されてもよく、またはさもなければ修飾されてもよい（修飾アミノ酸の包含、または炭水化物側鎖の付加、欠失もしくは修飾によるなど（ただし、これらに限定されない））。特定の実施形態において、このような生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認は、ポリクローナル抗体の生成との関連においてのものである。特定の実施形態においてこのような生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認は、モノクローナル抗体の生成との関連においてのものである。特定の実施形態においてこのような生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認は、研究または診断用途で使用する抗体の生成との関連においてのものである。特定の実施形態において、このような生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認は、治療用途の抗体の生成との関連においてのものである。

特定の実施形態において生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認は、治療用途のモノクローナル抗体の生成との関連においてのものである。商業的生成では現在、治療的モノクローナル抗体分子の３つの幅広いカテゴリー：完全ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体がある。完全ヒト抗体分子は、ヒト細胞に由来、またはヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト細胞に由来する抗体である。対照的に、ヒト化抗体は、マウスなどのヒト以外の動物において得られる抗体であるが、ヒト抗体配列を反映するようにこの後に修飾されている。この修飾は主に、抗体の投与に対する免疫学的応答を最小化するように生じる。しかし、特定の実施形態において、ヒト化抗体は、１つまたは複数の最初の非ヒト配列を保持する。非ヒト配列のこのような保持は、一般に、抗体の治療的に有効な活性を保存するために実施される。最後に、キメラ抗体分子は、ヒト化定常領域および非ヒト可変領域からなる。キメラ抗体は、一般に、ヒト以外の動物で生成された抗体の可変（抗原結合）領域を、ヒト抗体の定常（免疫系エフェクター）領域に作動可能に結合するための組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。

特定の実施形態において、本発明は、完全ヒト抗体生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。代替の実施形態において、本発明は、ヒト化抗体生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。代替の実施形態において、本発明は、キメラ抗体生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。特定の実施形態、具体的には、複数の抗体が同じ設備および／または工程装置を用いて生成されている実施形態において、本発明は、完全ヒトおよびヒト化、完全ヒトおよびキメラ、ヒト化およびキメラ、または完全ヒト、ヒト化およびキメラ抗体生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。

治療的抗体を含むがこれに限定されない抗体の間のさらなる多様性は、特定の抗体を含む特異的重鎖および軽鎖に関連して生じる。免疫グロブリン分子は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に下記の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んでいる。例えば、ヒト抗体は、重鎖のアミノ酸配列に基づき下記の特定のアイソタイプ：ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４およびＩｇＭに分類することができる。さらに、抗体は、軽鎖の配列がカッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖配列かどうかに応じて、２つの群に分類することができる。

特定の実施形態において、本発明は、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４およびＩｇＭ抗体生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。代替の実施形態において、本発明は、カッパまたはラムダ抗体生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。特定の実施形態、具体的には、複数の抗体が同じ設備および／または工程装置を用いて生成されている実施形態において、本発明は、抗体アイソタイプおよび軽鎖利用の任意の組み合わせを有する抗体の生成との関連で、生成物キャリーオーバーのモニタリングおよび／または洗浄確認のための組成物および方法を対象とする。

完全長抗体に加えて、特定の抗体断片が、研究、開発においておよび治療薬としてしばしば使用される。限定するものではないが、例えば、このような抗体断片は、完全長抗体またはこの部分の抗原結合部分全体を含むことができる。用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む一価断片、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６頁、この教示全体が参照により本明細書に組み込まれている）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製できるようにする合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁（これらの教示全体が参照により本明細書に組み込まれている）を参照のこと）。このような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されることが意図される。ダイアボディなどの、単鎖抗体の他の形態もまた包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現される二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用い、これによりドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作る（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３頁（これらの教示全体が参照により本明細書に組み込まれている）を参照のこと）。さらに、抗体またはこの抗原結合部分は、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有または非共有結合性会合により形成される、より大きな免疫接着分子の部分であってもよい。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１頁）、ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８頁）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ、抗体全体のパパインまたはペプシン消化などの従来手法を用いて、抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、標準的組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。１つの態様において、抗原結合部分は、完全なドメインまたは完全なドメインの対である。

特定の実施形態において、本発明は、下記の非限定的な群：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単離されたＣＤＲ、ダイアボディ、および免疫接着物から選択される１つもしくは複数の、または任意の組み合わせの抗体断片および抗体断片含有分子を検出するための組成物および方法を含む。

５．４捕捉および検出抗体の生成
用語「捕捉抗体」および「検出抗体」は、本セクションで使用されるとき、インタクトな抗体またはこの抗原結合断片を指す。本開示の捕捉および検出抗体は、目的とする抗原による動物の免疫化と、これに続く従来のモノクローナル抗体の方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５頁の標準的体細胞ハイブリダイゼーション法）を含むさまざまな手法により得ることができる。原則として、体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、モノクローナル抗体を生成するための他の手法が使用されてもよい（例えば、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発がん性形質転換）。

ハイブリドーマを調製するための１つの好ましい動物系は、ネズミ系である。ハイブリドーマ生成は、極めて十分に確立された手順である。融合のために免疫化脾細胞を単離する免疫化プロトコルおよび手法は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、ネズミ骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。

抗体は、好ましくは、ヒト、キメラまたはヒト化抗体であってもよい。本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的とする非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的分子生物学手法を用いて、非ネズミ（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように改変することができる。例えば、キメラ抗体を作るには、ネズミ可変領域が、当技術分野で公知の方法を用いてヒト定常領域に結合されてもよい（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらに対する米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作るには、ネズミＣＤＲ領域が、当技術分野で公知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されてもよい（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照のこと）。

特定の実施形態において、本発明は、生成されている特定のバイオテクノロジー生成物に対する適切な捕捉および／または検出抗体またはこの抗原結合断片を同定するための、捕捉および／または検出抗体またはこの抗原結合断片のパネルの評価を伴う。例示的だが非限定的なパネルには、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体、抗ヒトＩｇＧカッパ抗体、抗ヒトＩｇＧラムダ抗体および抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体が含まれる。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、（完全ヒト／ヒト化抗体）生成物分子全体を捕捉および／または検出するために使用され；抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２、抗ヒトＩｇＧカッパおよび抗ヒトＩｇＧラムダは、生成物結合部位がヒトまたはヒト化されている場合、生成物結合部位を捕捉および／または検出し、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、キメラ生成物に対する特異性を提供する。特定の実施形態、特に、装置洗浄後に生じるような実施形態において、残留生成物が断片化され、分解されまたはさもなければ変性される可能性がある場合、さまざまな捕捉および／または検出抗体の組み合わせが、できる限り多くの生成物残留物の検出を確保する。

６．１ＥＬＩＳＡ検出アッセイ
本発明は、特定の実施形態において、１つまたは複数の捕捉抗体またはこの結合断片が、バイオテクノロジー生成物の生成に伴う残留物を検出するのに使用される免疫アッセイを対象とする。表１に示されているように、５つの市販の捕捉抗体を、最初のアッセイ開発に関連して評価した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたこれらの同じ５つの抗体（「Ａｂ」）も、検出抗体としてこの試験において評価した。

選択した検出抗体（ＨＲＰコンジュゲート）を、ウェスタンブロッティングを用いて２つの生成物：この試験における主な標的であるＡｂ＃１および洗浄剤に曝露後の認識をテストするためのモデルとしてのＡｂ＃２の認識についてテストした。ストリンジェントな設備洗浄条件を模倣するために、Ａｂ＃１およびＡｂ＃２を、７５°Ｃで３０分間、ＣＩＰ−１００（２．５％）およびＣＩＰ−２００（２．５％）と共にインキュベートした。インキュベーション後、テスト試料を中和した。インタクトな分子および中和処理した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加し、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と比較してブロットした。

図１に示されているように、Ａｂ＃１およびＡｂ＃２残留物は、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により検出された。ＣＩＰ−１００処理した試料が最も分解されていた。分解された生成物は検出されなかったが、残留生成物は依然として検出された。ＣＩＰ−２００処理した試料からいくつかの凝集物およびかなりの量のＡｂ残留物が生じた。凝集物および残留生成物は、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により検出された。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、モノクローナル抗体生成物を検出するのに適している。洗浄溶液にスパイクした抗体濃度は、生成切り替えからの実際の洗浄試料より約１０００倍高いことが予測された。より高いタンパク質濃度が、アッセイ開発のためのＥＬＩＳＡ検出試薬を選択するのに必要とされた。

一般的なｍＡｂ分子の検出Ａｂ認識をさらに試験するために、完全ヒト、ヒト化、キメラ、カッパおよびラムダ軽鎖モノクローナル抗体を、表１の５つの市販の検出Ａｂに対してテストした。結果を図２から図７に示す。

全ての５つの検出Ａｂは、予測された生成物を認識した（表２）。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）および抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２は、全ての生成物を認識した（図３および図４）。抗ヒトＩｇＧラムダのみが、ラムダ軽鎖を有するＡｂ＃１およびＡｂ＃３を認識した（図５）。抗ヒトＩｇＧカッパは、カッパ軽鎖を有するＡｂ＃２、Ａｂ＃１１、Ａｂ＃１３およびＡｂ＃９を強く認識したが、他の分子ともわずかに交差反応性があった（図６）。抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、マウスおよびヒトキメラ生成物、Ａｂ＃１１を強く認識したが、他のヒト生成物もわずかに検出した（図７）。このわずかな交差反応性現象は、ウェスタンブロットでは、この方法が定量的でないことから用量依存的であり、無負荷量試験（ｎｏｌｏａｄｑｕａｎｔｉｔｙｓｔｕｄｙ）を実施した。テスト分子間の交差反応性を識別するためのさらなる試験を以下に記載する。

各単一捕捉および検出Ａｂを、最初の評価のため個々にＥＬＩＳＡにより個々に評価した。プレートを１０μｇ／ｍＬ捕捉Ａｂでコーティングし、２および５μｇ／ｍＬ検出Ａｂで検出した。これらのスクリーニング結果に基づき、関連生成物に対し、各Ａｂを３つの捕捉条件および６つの検出条件でテストする実験を実施して、各単一Ａｂ量をさらに試験した。Ａｂ＃１が本プロジェクトにおける主な標的であることから、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）およびＩｇＧＦ（ａｂ’）２をＡｂ＃１に適用した。条件および実験結果を表３に示す。

単一Ａｂテストの目的は、各Ａｂについて最高の感受性を達成する最適な組み合わせを見出すことであった。表３の太字にした条件は、０．２５から８ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジにおいて、最小シグナルはバックグラウンドを上回る信頼できる測定値である０．１を超え、最大シグナルはプレートリーダーの最大値に達したことを示した。これらの条件下で、アッセイは、必要とされるＡｂ＃１より１０倍を超える感受性に達した。表４は、Ａｂ＃１の許容可能キャリーオーバー限界を列挙している。

表５に示されているように、５つの単一Ａｂを上記実験結果に従って組み合わせた。

組み合わせたＡｂを、Ａｂ＃１、Ａｂ＃２およびＡｂ＃１１検出のための感受性および適合性について再確認した。図８は、これらの生成物に関する標準曲線を示している。曲線は全て、二次フィットと０．９９９９の相関係数を有し、各曲線範囲は０．２５から８ｎｇ／ｍＬであった。

コーティングおよび検出Ａｂプールを調製する目的は、１０００個のプレートに対して十分であるようにするためである。組み合わせ比に基づき、大きな捕捉および検出Ａｂプールを、表６および表７に従って調製した。Ａｂプールは、アッセイ適格性確認に使用した。

アッセイの信頼性を確認するために、Ａｂ＃１スケールアップ実行からのＳＰ溶出液および最終限外濾過／透析濾過（「ＵＦ／ＤＦ」）をアッセイ適格性確認に使用した。これらの試料は約５ｍｇ／ｍＬであることが報告され、したがってこの試験のために希釈された。

通常の条件下で、薬剤物質試料をテスト前に−８０℃で貯蔵した。見込まれる実験室環境を網羅するために、４時間、周囲温度、４８時間、２から８℃、３回の凍結／解凍サイクルでの貯蔵条件を検証した。結果を表８にまとめる。タンパク質結果は、異なる貯蔵条件により著しい影響を受けなかった（＜１０％）。

ＥＬＩＳＡ基質発色時間は１４分間を予定した。時間変動性を評価するために、１４±１分間をテストした。結果は、１分のウィンドウ中に影響を受けなかった（表９）。

テストプレートを、２Ｍリン酸の添加後すぐに読み取って反応を止め、次いで周囲温度に３０分間放置した後、再び読み取った。著しい差は観察されなかった（＜１０％）（表１０）。

分析方法の「精度」は、方法が均一試料の複数回の試料採取に反復して適用される場合、個々のテスト結果の一致度である。

「アッセイ反復性」は、分析手順が一様な分析条件下で複数回実施される場合、該手順の精度を測定する。ＳＰ溶出液および最終ＵＦ／ＤＦの６アリコートを１つのプレート内でテストした。タンパク質濃度はアリコートごとに計算した。濃度値のパーセント相対標準偏差は、全ての６つの測定値を用いて計算した。結果を表１１にまとめる。タンパク質測定値の相対標準偏差は＜７％であった。

「中間精度」は、分析手順が、異なる日または異なる分析者により実施される場合、実験室内でもたらされたテスト結果の分散の測定値である。

ＳＰ溶出液および最終ＵＦ／ＤＦそれぞれの３アリコートをテストした。この実験は、異なる日に異なる分析者によりさらに２回反復された。試験のアッセイ反復部からの最初の３つの結果を、この試験の１日目に使用した。結果を表１２に示す。タンパク質測定値のパーセント相対標準偏差は、＜５％であり、２０％の予測された精度範囲内であった。

標準曲線の最低点、定量化限界（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｌｉｍｉｔ）を推定するために、８ｎｇ／ｍＬＡｂ＃１標準物質の２倍連続希釈を６回調製し、６つの異なるプレートに添加した。結果を表１３に示す。ＩＣＨガイドラインによれば、アッセイの定量化限界は、シグナル対ノイズ比が１０：１より高い最低濃度、および相対標準偏差が２０％未満である。ブランク測定値のノイズは、０．００４ＡＵであった。０．２５ｎｇ／ｍＬ標準物質の平均シグナルは、０．１２２ＡＵであった。０．１２５ｎｇ／ｍＬは基準を満たすが、０．２５を、アッセイ頑健性を確保するためのＬＯＱとして選択した。定量限界は、シグナル対ノイズ比３０．５：１、および相対標準偏差１４％の０．２５ｎｇ／ｍＬに設定した。

分析方法の「直線性」は、目的とする分析物の濃度に正比例する、または十分に定義された数学的変換により目的とする分析物の濃度に比例するテスト結果を導く該方法の能力である。

０．２５から８ｎｇ／ｍＬの範囲の標準物質をＡｂ＃１薬剤物質から調製した。標準物質および緩衝液ブランクをプレートに添加し、テストした。プロットを図９に示す。二次フィットの相関係数は、０．９９９より大きかった。結果は、標準物質の吸光反応が二次フィットによるタンパク質濃度に比例することを示している。

アッセイの正確度は、スパイクおよび回収方法を用いて試験した。ＳＰ溶出液および最終ＵＦ／ＤＦを、１．０、２．０および４．０ｎｇ／ｍＬの最終標準レベルでスパイクした。アッセイは、回収されたタンパク質の濃度をスパイクの実験濃度で割った比として計算し、パーセンテージとして表した。この試験の結果を表１４に示す。スパイクの回収率は、全てのスパイクレベルについて１００±７．９％の範囲にあった。

ＳＰ溶出液および最終ＵＦ／ＤＦ試料を、参照標準曲線校正範囲で２倍連続希釈して試料希釈直線性を評価した。表１５に示されているように、試料希釈は結果に影響を与えなかった。変数は１０％未満であった。３つの希釈点のみは、未知試料テストについて試料希釈を確認する必要があった。

分析方法の「範囲」は、分析物の上位と下位の間の区間であり、該区間は、書かれているような方法を用いて適切なレベルの精度、正確度および直線性により決定することができる。アッセイの範囲は、直線性、正確度、精度および定量限界に基づき０．２５から８ｎｇ／ｍＬとして確立した。二次フィットの相関係数値は、０．９９９より大きかった。これは、０．２５から８ｎｇ／ｍＬの範囲において、吸光反応が二次フィットによるタンパク質濃度に比例することを示している。スパイク回収試験は、２つの異なる工程内試料中の１．０、２．０および４．０ｎｇ／ｍＬレベルの標準物質で実施した。回収率は１００±７．９％であった。これは、アッセイが推定範囲において厳密および正確であることを示している。

商業的供給のさらなる必要性をカバーするため、各抗体の第２ロットを評価した。表１６は、大きいプールに使用した第１ロットおよび比較のための第２ロットを示している。

結果を表１７にまとめ、第１および第２ロットからの参照標準曲線を図１０に示す。第２ロットは結果に影響を与えなかった。

装置リンス液（ｒｉｎｓａｔｅ）中の残留生成物タンパク質レベルを検出するためのアッセイ適合性を評価するために、装置表面からのタンパク質の回収率を試験した。生成装置は、ステンレス鋼、ハスタロイ（ｈａｓｔａｌｌｏｙ）またはガラス製であった。各材料の代表的クーポン（すなわち、スワブ、リンス液、または他の試料形態などの代表的試料）を２および３ｐｐｍに希釈した４０ｍＬのＡｂ＃１薬剤物質でスポッティングした。表面を３から４時間空気乾燥させ、次いで４０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水ですすいだ。リンス液を回収した。表面からのタンパク質回収率は、リンス液中のタンパク質の濃度をスパイクの濃度で割った比として計算し、パーセンテージとして表した。

表１８に示されているように、平均回収率は、ガラス表面が７６％、ステンレス鋼が８７％およびハスタロイが７６％である。結果は、合格基準（５０−１５０％）を満たし、アッセイが生成装置すすぎ試料テストに適していることを実証した。

Ａｂ＃１工程バリデーションは、生成物キャリーオーバーを評価するための生成物工程実行後のブランク実行を含む。ブランク実行は、プロテインＡ、ＳＰセファロースおよびＱセファロースクロマトグラフィーおよびＵＦ／ＤＦ操作を含む。生成物ＡからＡのキャリーオーバーはＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて評価されるが、生成物ＡからＢの残留物キャリーオーバー限界（ＲＣＬ）は、ＢｒａｄｆｏｒｄアッセイＬＯＱ（１．２５ｕｇ／ｍＬ）より低い４ｎｇ／ｍＬ（ＶＲ−２２４９、ＶＲ−２２５０およびＶＲ−２２５１）である。ｍＡｂアッセイは、Ａｂ＃１ＡからＢへのキャリーオーバー試験を裏付けるための適合性について評価した。アッセイへの工程緩衝液干渉は、緩衝液スパイクおよび回収実験を実施して評価した。未希釈および５倍希釈（十分な希釈緩衝液による）での各工程緩衝液を、１．０、２．０および４．０ｎｇ／ｍＬの最終標準レベルでスパイクした。

表１９に示されているように、回収率は、Ｑセファロース溶出緩衝液ＳＲ−４８８およびＳＰセファロース溶出（ｅｌｕａｔｉｏｎ）緩衝液ＳＲ−６１０について約７０％であり、これは合格基準（５０から１５０％）内であったが、プロテインＡ溶出緩衝液ＳＲ−４９３のみは、抗原および抗体結合を妨げる酸性条件のため１．１％を回収した。

希釈緩衝液のスパイクおよび回収結果を表２０にまとめる。タンパク質回収率は、５倍に希釈した場合、許容可能な１１０．３から１２１．９％であった。アッセイ定量限界は、５倍希釈で１．２５ｎｇ／ｍＬである。したがって、頑健なアッセイ操作には、５倍希釈が３種類の工程緩衝液全てに推奨される。１．２５ｎｇ／ｍＬのＬＯＱによるこのアッセイフォーマットは、生成物ＡからＢのキャリーオーバーを評価するのに適している。

全体的な残留ｍＡｂ関連生成物を検出するための新たなアッセイフォーマットおよび条件を開発した。上記結果は、アッセイの再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｒｙ）を実証するものでる。新たなアッセイは、Ａｂ＃１については０．２５ｎｇ／ｍＬの定量限界で微量レベルのｍＡｂタンパク質を定量化することができる。故に、新たに開発されたｍＡｂＥＬＩＳＡは、設備切り換えおよび洗浄確認のために残留ｍＡｂ関連分子を定量化する貴重なツールを提供する。

工程内試料におけるＡｂ＃１生成物定量化のためのアッセイの性能は、適格とされた。アッセイ頑健性、精度、定量化限界、直線性、正確度、試料希釈直線性、範囲、第２ロット市販試薬を試験した。全ての上記の結果は、ＥＬＩＳＡの予測された正確度および精度内である。アッセイ条件を表２１にまとめる。さらに、回収試験は、このアッセイがリンス液試験およびＡｂ＃１工程キャリーオーバー試験に適していることを証明した。しかし、ブランク実行については、緩衝液干渉を排除するために５倍希釈が必要とされる。

上記アッセイを、ＧＭＰ−１後に抗体＃１工程中間体を含有するバイオリアクター、回収および下流工程タンク、フレックスホースならびにフィルターハウジンングで実施した洗浄サイクルからの最終すすぎをテストするのに使用した。最終すすぎは全てＬＯＱより低かった。さらに、中間すすぎを、バイオリアクターＺ−３２００およびタンクＴＫ−２８３０について試料採取した。表２３に示されているように、Ｚ−３２００およびＴＫ−２８３０からの最初のＵＳＰ水すすぎのみが、極めて低いレベルでタンパク質残留物を検出した。結果は、上記アッセイの感受性および特異性をさらに証明した。

工程バリデーション実行に関連した装置からの最終すすぎ試料を、上記アッセイによりテストした。テストした全ての試料はＬＯＱより低かった。工程バリデーション実行１（「ＰＶ−１」）からの結果を表２４に列挙する。洗浄後、報告対象の抗体＃１レベル（０．２５ｎｇ／ｍｌ）は、最大許容キャリーオーバー限界（４−１３ｎｇ／ｍＬ）より少なくとも１６倍低い。

高いアッセイ感受性のため、実験室で日常的に一緒に作業されるｍＡｂ生成物は、このアッセイでは汚染の潜在的な原因になり得る。したがって、試料テスト中に使用される装置および環境ができる限り清浄であることを確保するための予防措置が講じられることが推奨される。

さまざまな刊行物が本明細書で引用されており、その内容は全体が本明細書に組み込まれている。

Claims

バイオテクノロジー生成物残留物を検出する方法であって、テスト試料が、生成物残留物に特異的な捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む基質と接触し、抗体−抗原複合体の検出がバイオテクノロジー生成物残留物の存在を示す方法。
抗体−抗原複合体の検出が、抗体−抗原複合体を結合することができる標識された検出抗体の結合をモニタリングすることにより達成される、請求項１に記載の方法。
バイオテクノロジー生成物残留物の存在が生成物キャリーオーバーを示す、請求項１に記載の方法。
バイオテクノロジー生成物残留物の量が洗浄工程の有効性を示す、請求項１に記載の方法。
生成物残留物が核酸生成物に由来する、請求項１に記載の方法。
生成物残留物がタンパク質生成物に由来する、請求項１に記載の方法。
タンパク質生成物が、酵素、ペプチドホルモン、ポリクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆｄ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、単離されたＣＤＲ、ダイアボディおよび免疫接着物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
捕捉抗体またはこの抗原結合部分が、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体、抗ヒトＩｇＧカッパ抗体、抗ヒトＩｇＧラムダ抗体、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
基質が、別個の結合特異性を有する２つ以上の捕捉抗体またはこの抗原結合断片を含む、請求項１に記載の方法。