CN111417854B - 乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒 - Google Patents

乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111417854B
CN111417854B CN201880077429.7A CN201880077429A CN111417854B CN 111417854 B CN111417854 B CN 111417854B CN 201880077429 A CN201880077429 A CN 201880077429A CN 111417854 B CN111417854 B CN 111417854B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
antibody
virus
hepatitis
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880077429.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111417854A (zh
Inventor
大植千春
饭田久美子
青柳克己
八木慎太郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujirebio Inc
Original Assignee
Fujirebio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujirebio Inc filed Critical Fujirebio Inc
Publication of CN111417854A publication Critical patent/CN111417854A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111417854B publication Critical patent/CN111417854B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高灵敏度的HBsAg的测定方法和测定试剂盒，其中，在样本预处理中，不进行强酸或碱处理，且不易受到自身抗体的影响。这种从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法包括：预处理工序，其中，将样本与包含还原剂的预处理试剂混和而将乙型肝炎病毒s抗原还原；和免疫测定工序，其中，使用抗体或其抗原结合性片段中的至少一种，对预处理后的样本进行乙型肝炎病毒s抗原的免疫测定，所述抗体能够与包含乙型肝炎病毒s抗原的第98‑179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。

Description

乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒。
背景技术
乙型肝炎目前是肝疾病中最多的疾病，是因乙型肝炎病毒(HBV)感染人而引起的病毒性肝炎。
该乙型肝炎病毒的本体是直径42nm的呈双层结构的球形颗粒的形状的、被称为“大球形(Dane)颗粒”的颗粒。已知大球形颗粒的表面由被称为乙型肝炎病毒s抗原(HBsAg)的表面抗原覆盖，此外在内部存在直径27nm的核心结构，上述核心结构包含HBc抗原(核心抗原)、HBe抗原、以及编码病毒基因的环状双链DNA。
HBsAg是具有感染性的HBV颗粒表面的肿瘤构成外壳蛋白，其包含在包裹着含有HBV-DNA的核心颗粒的来自肝细胞的脂质双层膜中。另外，HBV感染者的血液中，也存在没有核心颗粒的、包含HBsAg的不具有感染性的小球形颗粒、管型颗粒。小球形颗粒最多量地存在于血中，以相对于1个～几个HBV颗粒为约1000个的比率被观察到。目前市售的HBsAg检查主要是检测上述小球形颗粒形态的HBsAg。
HbsAg是由全长226个氨基酸残基构成的、4次贯穿脂质双层膜的膜蛋白(将其氨基酸序列示于序列号1)。虽然尚未完全明晰HBsAg的跨膜结构模型，但是例如非专利文献1中公开了一种跨膜模型之一(图1)。根据该跨膜模型，HBsAg中存在4个跨膜区，HBsAg的第8～23位的氨基酸残基为第1跨膜区，第80～98位的氨基酸残基构成第2跨膜区。除此以外，HBsAg中存在由第23～80位的氨基酸残基构成的脂质双层的第1内侧区域，由第98～179位的氨基酸残基构成的亲水性的第2外侧(内质网腔(ER lumen))区域，以及第179位以后的疏水性的第3跨膜区、第2内侧区域、第4跨膜区。
作为以往的HBsAg的分析方法，使用与HBsAg的共同抗原决定簇a结合的抗体的方法是常见的。共同抗原决定簇a位于HBsAg的第2外侧(内质网腔)区域、即局部存在于病毒颗粒表面的由第98～179位的氨基酸残基中的第110～156位的氨基酸残基构成的肽上。已经报道了该共同抗原决定簇a由复杂的高级结构构成，在其上存在至少4个表位(非专利文献2)。
HBV的急性感染患者中，在感染初期HBsAg为阳性，但是其后HBs抗体变为阳性，HBsAg变为阴性。在患者的血液中的HBs抗体为阳性的情况下，在上述的使用与共同抗原决定簇a结合的抗体的方法中当对HbsAg进行分析时，分析方法中使用的抗体与HBsAg的结合受到患者的HBs抗体的阻碍，测定值变低。对此，可采取利用酸化剂或碱化剂对样本进行预处理，避免来自患者的HBs抗体(自身抗体)因形成其与HBsAg的免疫复合体而造成的影响的方法；或者利用表面活性剂等对样本进行预处理而使存在于HBV颗粒的内侧的抗原(内侧抗原：自身抗体不易结合)露出，使用与内侧抗原特异性结合的抗体进行检测的方法(专利文献1、2)。
在HBs抗体价高的患者中，即使使HBs抗体(自身抗体)从免疫复合体解离，也仍然存在游离的自身抗体与免疫测定中使用的抗体之间发生竞争反应的可能性。因此，已知在样本的预处理工序中，通过较强酸处理或碱处理(例如小于pH3.0或超过pH12.0)使游离的自身抗体进一步灭活的方法(例如，专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第4430677号
专利文献2:EP 2088431 A1
专利文献3:日本专利第6026564号
非专利文献
非专利文献1:V.D.Siegler,Volker Bruss,Role of Transmembrane Domains ofHepatitis B Virus Small Surface Proteins in Subviral-Particle Biogenesis,J.Virology,87(3)2013,pp.1491-1496
非专利文献2:冈本宏明，日本临床，分子肝炎病毒病学基础·临床·预防下卷A、B、D、E型肝炎病毒汇编，平成7年10月26日发行，p.212-222
发明内容
(发明要解决的技术问题)
但是，在通过表面活性剂处理使HBV颗粒的内侧抗原露出、仅检测内侧抗原的方法中，存在因HBV株的不同情况而产生假阴性的可能性，因此需要与外侧抗原组合进行检测(专利文献2)。
另外，样本的预处理中，对于利用强酸或碱灭活自身抗体的方法，也存在因需要中和工序而导致操作繁杂、受到中和反应中产生的盐的影响等技术问题。
本发明的目的在于提供一种高灵敏度的HBsAg的测定方法和测定试剂盒，其中，在样本预处理中，不进行强酸或碱处理，且不易受到自身抗体的影响。
(用于解决技术问题的技术方案)
本发明人进行深入研究，结果发现：在对样本中的HbsAg进行测定的样本预处理工序中，使用还原剂将抗原还原，进而在后一阶段的免疫测定中使用能够与包含乙型肝炎病毒s抗原的第98-179位的氨基酸的被还原的肽发生反应的抗体，能够解决本发明的技术问题。
即，本发明如以下所述。
(1)一种从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其包含：
预处理工序，其中，将上述样本与包含还原剂的预处理试剂混和而将乙型肝炎病毒s抗原还原；和
免疫测定工序，其中，使用抗体或其抗原结合性片段中的至少一种，对预处理后的样本进行乙型肝炎病毒s抗原的免疫测定，所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第98-179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
(2)根据(1)记载的方法，其中，
上述还原剂为选自2-(二乙氨基)乙硫醇盐酸盐(DEAET)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(ME)、半胱胺、三丁基膦(TBP)中的至少一种还原剂，
上述预处理工序中的该还原剂的终浓度为0.5～100mM。
(3)根据(1)或(2)记载的方法，其中，
所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第111-170位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
(4)根据(3)记载的方法，其中，
所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第111-156位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
(5)根据(4)记载的方法，其中，
所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第111-130位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
(6)根据(1)～(5)中任一项记载的方法，其中，
所述预处理工序在pH3.0以上且12.0以下的条件下进行。
(7)根据(1)～(6)中任一项记载的方法，其中，
所述预处理试剂还含有表面活性剂。
(8)一种乙型肝炎病毒s抗原的测定试剂盒，其具有：
(i)包含还原剂的预处理试剂，以及
(ii)包含抗体或其抗原结合性片段中的至少一种的免疫测定试剂，其中，所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第98-179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
(发明效果)
根据本发明，可提供一种高灵敏度的HBsAg的测定方法和测定试剂盒，其中，不进行会使样本预处理成为灵敏度降低的原因的酸·碱处理，可减少自身抗体的影响。
附图说明
图1是HBsAg的跨膜模型的示意图。
具体实施方式
＜HBsAg的测定方法＞
本发明的方法为以下所述的HBsAg的测定方法，其包含将从生物体分离的样本与包含还原剂的预处理试剂混和的预处理工序，在免疫测定中，使用抗体(以下也称为“还原外侧识别抗体”)或其抗原结合性片段(在以下描述中，只要上下文没有矛盾，“抗体”这一术语以也包含“抗原结合性片段”的含义使用)中的至少一种，其中，所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原(HBsAg)的、包含序列号1的氨基酸序列中的第98-179位(从N末端开始计数。氨基酸的位置编号均是从N末端开始计数的编号)氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
本发明的方法中测定的HBsAg为4次贯穿脂质双层膜的由226个氨基酸残基构成的膜蛋白质。已知HBV具有几种基因型，例如，基因型A、B、C、D、E、F、和G，通过其基因型，HBsAg的氨基酸序列不同。另外也已知a区域的抗原性存在多个型。通过本发明的方法测定的HBsAg将具有存在这些异质性的氨基酸序列的HBsAg作为测定対象。
图1示出HBsAg的跨膜结构模型。图1的HBsAg的跨膜结构模型中的第98～179位氨基酸残基相当于亲水性的第2外侧(内质网腔)区域。本发明的方法中，在抗原抗体反应中使用的抗体(后述)是将HBsAg的第98～179位的被还原的肽作为表位的抗体，而第98～179位的区域相当于第2外侧区域。由HBsAg的第98～179位氨基酸残基构成的肽为在HBV颗粒的脂质双层膜的外侧的内质网腔中存在的亲水性肽。其标准的氨基酸序列为序列号1的第98～179位的氨基酸序列。但是，本说明书中的第2外侧区域只要是从HBsAg的N末端开始第2个存在于脂质双层的外侧(腔侧)的肽即可，不限定于由HBsAg的序列号1的第98～179位的氨基酸序列构成的肽，例如，也包括以下情形：从N末端开始的氨基酸的编号不同的肽；或者，在序列号1的第98～179位的氨基酸序列的1个或多个位置上取代(突变)、缺失和/或插入1个或多个氨基酸，由这样得到的氨基酸序列构成的肽。应予说明，即使为这样的使用由序列号1以外的氨基酸序列构成的肽作为免疫原的抗体或其抗原结合性片段，在使用能够与包含序列号1的氨基酸序列中的第98-179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段的情况下，也包含在本发明的范围内。
1.预处理工序
本发明的方法包含样本的预处理工序。本发明中，“样本”是指包含HBsAg的来自生物体的试样，具体而言，例如可举出血清、血浆、全血、尿、便、口腔粘膜、咽喉粘膜、肠管粘膜和活检试样(例如，胰脏试样、肠管试样、肝脏试样)以及它们的稀释物。样本优选为血清或血浆。另外，本发明中，“预处理”是指在使靶分子(这里为HBsAg)与特异性抗体反应的免疫测定工序之前，用于使样本中包含的靶分子的结构、性质等变化的处理。此外，本发明中，预处理可通过将样本与预处理试剂混和来实施。
上述预处理试剂可包含还原剂。作为还原剂，为了切断蛋白质的S-S键而通常使用的还原剂均能够使用，没有特别限定。例如，2-(二乙氨基)乙硫醇盐酸盐(DEAET)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、半胱胺、三丁基膦(TBP)等现有的还原剂均能够使用，DTT、TCEP、TBP由于溶液中的稳定性优异，因此可特别优选使用。作为还原剂的浓度，以与样本的混和液的终浓度计，优选为0.5～100mM，特别优选为1.0～50mM，进一步优选为2.0～20mM。
通过在上述预处理试剂中含有还原剂，样本中包含的HBsAg的S-S键被切断，其立体结构解离而成为线性结构。由此，图1的HBsAg的跨膜结构模型中的第2外侧区域(以下也称为“共同抗原决定簇a”或“a-loop”)的立体结构也成为线性。本发明人发现：自身抗体大多为识别a-loop的立体构象的抗体，对同一部分的被还原的(线性)肽不发生反应(后述·实施例2)。通过利用包含还原剂的预处理试剂对样本进行处理，能够使被还原的HBsAg与自身抗体的反应性降低，能够减少由自身抗体造成的对HBsAg测定值的不利影响。
关于预处理工序中的pH(样本与预处理试剂的混和液的pH)，优选pH为3.0以上且12.0以下，特别优选为5.0以上且10.0以下，进一步优选为6.0以上且9.0以下。本发明中，通过在预处理试剂中添加还原剂，使HbsAg的立体结构改变，从而能够在事实上消除自身抗体的靶分子的存在。由于不存在靶分子，因此无论抗体是否具有活性，自身抗体对抗原抗体反应产生的影响都会变得非常小。因此，不需要如以往的技术那样通过使抗体灭活来减小对靶分子(抗原)的影响。因此，即使在预处理试剂的pH接近相对中性的条件下，也能够实现本发明的目的。通过将预处理试剂的pH设为上述范围，能够省略抗原抗体反应工序之前的中和工序或减少中和剂量，能够避免或减小由中和工序带来的盐的生成的影响等。另外，由于样本中的自身抗体的失活不易发生，因此在HBsAg的测定的同时或HBsAg的测定后，也能够实施同一样本中的抗HBs抗体的测定。
上述预处理试剂可以含有pH缓冲剂。pH缓冲剂只要是适合上述pH范围的缓冲剂即可，没有特别限定，例如，磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、Tris、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-二(羟乙基)甘氨酸、Tris、咪唑、三乙胺、双甘氨肽等作为常见的pH缓冲剂被广泛使用的缓冲剂均能够使用。
上述预处理试剂可以包含表面活性剂。特别是在后述的抗原抗体反应工序中，在与还原外侧识别抗体组合使用能够与内侧抗原发生抗原抗体反应的抗体(内侧识别抗体)的情况下，为了使HBV颗粒的内侧的靶区域露出，需要使用表面活性剂。作为表面活性剂，阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂均能够使用，特别优选为阴离子型表面活性剂。作为阴离子型表面活性剂，优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、十二烷基硫酸锂、十二烷基苯磺酸钠、脱氧胆酸等，特别优选使用SDS。在使用阴离子表面活性剂的情况下，作为与样本混和而成的混和液的预处理时的浓度(重量基准)优选为0.1～12.5％，特别优选为0.25～10％，进一步优选为0.5～7.5％。
在预处理试剂所包含的主要的表面活性剂为阴离子型表面活性剂的情况下，在预处理后，为了减小带入反应体系的阴离子表面活性剂的影响，可以添加包含单独一种或多种阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂的中和液。
作为上述预处理试剂所包含的表面活性剂，可使用阳离子表面活性剂代替阴离子表面活性剂。作为阳离子表面活性剂，特别优选为在同一分子中具有碳原子数10个以上的单链烷基和叔胺或季铵盐的阳离子型表面活性剂。作为这样的表面活性剂的示例，可举出癸基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵(C16TAC)、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基氯化吡啶、十四烷基氯化吡啶、十六烷基氯化吡啶等。阳离子表面活性剂的添加量以与样本混和时的浓度计优选为0.1％以上且15％以下，进一步优选为0.5％～10％。
除了阳离子型表面活性剂，还可以包含非离子型表面活性剂等其它表面活性剂。通过添加其它表面活性剂，能够以进一步的高灵敏度检测HBsAg。
预处理试剂中，根据需要可以含有尿素、硫脲等其它蛋白变性剂。变性剂的浓度以处理时浓度计优选为0.1M以上，进一步优选为0.5M以上且小于4M。另外，预处理试剂中，为了增强处理效果，可以添加单糖类、二糖类、柠檬酸和柠檬酸盐类中的任一种或将它们组合添加。此外，预处理试剂中可以包含EDTA等螯合剂。
上述预处理工序中混和的样本与预处理试剂的体积比优选为1：10～10：1，特别优选为1：5～5：1，进一步优选为1：3～3：1。在预处理工序中，可以在将生物体试样与预处理试剂混和后，进一步进行加热。特别是，在预处理试剂中使用表面活性剂的情况下，为了提高其效果，优选进行加热。预处理工序的温度可以为95℃以下，特别是20～90℃，进一步可以为20～80℃、25～70℃、25～60℃、30～50℃或35～45℃。预处理工序中，如果在较高温的条件下进行加热，则能够在较短时间进行处理，但是，另一方面也能够在室温条件下实施，这种情况的优点在于，虽然反应时间变长，但是不需要用于高温加热的装置。预处理工序的反应时间不存在特定的上限，但通常为60分钟以下，特别是可以为30分钟以下。
2.免疫测定工序
经过本发明的方法的预处理工序处理得到的混和液接着可供于免疫测定工序。免疫测定工序包含(1)抗原抗体反应工序和(2)检测工序。
(1)抗原抗体反应工序
抗原抗体反应工序中，将上述混和液与包含针对HBsAg的抗体的抗原抗体反应液混合，使预处理后的抗原与抗体反应。
本发明的方法中使用的抗体只要是能够识别包括序列号1的被还原的(线性)第98～179位氨基酸序列的肽的抗体即可，没有特别限定，例如，可包括与包含序列号1的第98～179位氨基酸序列的肽发生抗原抗体反应的抗体，以及与包含通过在序列号1的第98～179位氨基酸序列的1个或多个位置上取代(突变)、缺失和/或插入1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽(其中，该肽是HBsAg的片段)发生抗原抗体反应的抗体。更具体而言，可包括与以下的肽发生抗原抗体反应的抗体：包含序列号1表示的氨基酸中第121～130位氨基酸序列的肽、包含第151～179位氨基酸序列的肽、包含第111～130位氨基酸的肽、包含第121～140位氨基酸的肽、包含第98～156位氨基酸序列的肽、或这些肽的部分氨基酸被取代而得到的肽等(肽均为线性)。本发明的方法中使用的抗体只要是与上述线性肽发生抗原抗体反应的抗体即可，没有特别限定，也可以是识别由复杂的高级结构构成的构象性表位(例如，共同抗原决定簇a)的抗体。也存在无法由仅包含序列号1的第98～179位氨基酸序列的部分肽形成、而是由比该部分肽更长的肽(例如，由HBsAg的全长、即226个氨基酸残基构成的全长肽)形成的表位。本发明中使用的抗体包括与上述线性肽反应且能够与下述构象性表位结合的抗体：例如，由比仅包含序列号1的氨基酸中的第98～179位氨基酸序列的部分肽更长的肽形成、并且存在于包含序列号1的第98～179位氨基酸序列的区域中的构象性表位。
作为本发明的方法中使用的抗体，只要是能够识别包含序列号1的被还原的第98～179位氨基酸序列的肽的抗体即可，没有特别限定。例如可举出多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、受体、或类似物等，优选为单克隆抗体或其抗原结合性片段(以下有时称为“抗体片段”)。
作为单克隆抗体的抗体片段，只要是能够识别包含序列号1的被还原的第98～179位氨基酸序列的肽的抗体片段即可，没有限定，例如可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、或Fv等。例如，可利用常规方法通过蛋白质分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)将本发明的单克隆抗体消化，继而利用常规方法的蛋白质的分离纯化方法进行纯化，从而得到上述抗体片段。
本发明的方法中的HBsAg的测定原理只要是免疫测定即可，没有特别限定，也可采用夹心法、竞争法、免疫凝集法等公知的免疫测定的任意方法。其中，优选为使用捕获抗体和检测抗体检测HBsAg的夹心法。作为夹心法，可举出作为2步法的正向夹心法(逐次进行固相化抗体与样本中的抗原的反应、结合于固相的抗原与标记抗体的反应)、反向夹心法(预先使标记抗体与样本中的抗原反应，使生成的抗原抗体复合物与固相化抗体反应)、以及1步法(固相化抗体、样本中的抗原、标记抗体的反应在1步中同时进行)，能够采用其中的任意一种方法。
本发明的方法中，将能够识别包含HBsAg的序列号1的被还原的第98～179位氨基酸序列的肽的抗体(还原外侧抗原识别抗体)用作捕获抗体和检测抗体中的至少一者。优选将还原外侧抗原识别抗体用作捕获抗体和检测抗体这两者。在捕获抗体采用还原外侧抗原识别抗体的情况下，检测抗体既可以为还原外侧抗原识别抗体，也可以为识别被还原的内侧抗原的抗体，但优选采用还原外侧抗原识别抗体。另外，在检测抗体采用还原外侧抗原识别抗体的情况下，捕获抗体既可以为还原外侧抗原识别抗体，也可以为还原内侧抗原识别抗体，但优选为还原外侧抗原识别抗体。应予说明，在任意的情况下，均不能使用识别未被还原的外侧抗原结构的抗体。另外，在竞争法、免疫凝集法等中，在仅使用1种抗体的情况下，使用的这1种抗体为还原外侧抗原识别抗体。
本发明的方法中，如果捕获抗体和检测抗体的任意一者采用至少一种还原外侧抗原识别抗体，则作为捕获抗体和/或检测抗体，可以组合使用多种抗体。
本发明的方法中，免疫测定工序可包含：使经过预处理工序的样本与捕获抗体和检测抗体接触的接触工序；和后述的检测检测抗体的信号的检测工序。另外，上述接触工序也能够分为使上述样本与捕获抗体接触的第1接触工序和使检测抗体与第1接触工序中形成的抗原抗体复合体接触的第2接触工序来进行。
更具体而言，例如，正向夹心法可通过以下方式进行。首先，使与HBsAg结合的捕获抗体固相化于微孔板、磁性珠等不溶性载体。其次，为了防止向捕获抗体、不溶性载体上的非特异性吸附，利用适当的封闭剂(例如，牛血清白蛋白、明胶等)进行不溶性载体的封闭。在固相化有捕获抗体的板、珠中，将经过预处理工序的样本与一次反应液一并添加，使捕获抗体与样本中的HBsAg接触并结合(一次反应工序)。然后，利用适当的清洗液(例如，包含表面活性剂的磷酸缓冲液)清洗未与捕获抗体结合的抗原、夹杂物。接着，添加识别被捕获的HBsAg的抗体与结合有碱性磷酸酶(ALP)等酶的标记抗体，使被捕获的抗原与标记抗体结合(二次反应工序)。通过该反应，可在微孔板等载体上形成捕获抗体-抗原-标记抗体的免疫复合体。用清洗液清洗未结合的标记抗体，添加针对标记抗体的酶的显色底物或发光底物，使酶与底物反应从而检测信号。
本发明的方法中使用的捕获抗体是指捕获样本中的HBsAg的抗体；在上述的使用不溶性载体的夹心法中，是指固相化于不溶性载体的固相抗体。本发明的方法中使用的检测抗体是指检测被捕获抗体捕获的样本中的HBsAg的抗体；在使用上述的不溶性载体的夹心法中，是指被酶等标记的标记抗体。
在捕获抗体和检测抗体这两者均采用还原外侧抗原识别抗体的情况下，使用它们结合的表位不同的抗体。“表位不同”是指表位不完全一致。例如，在2个抗体为相同的单克隆抗体的情况下，或者在2个抗体为在表位阻碍试验中被完全阻碍的抗体的情况下，可以说2个抗体的表位一致。另一方面，在捕获抗体与检测抗体的表位部分重复的情况下，多数情况下可用于本发明的方法中。
作为标记抗体的酶，可举出辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶和荧光素酶等。另外，除了酶以外，作为标记物质，也可使用吖啶衍生物等发光物质、铕等荧光物质、I125等放射性物质等。另外，可根据标记物质适当选择底物、发光诱导物质。
此外，本发明中的标记抗体也包括结合有半抗原、低分子量的肽、凝集素等能够用于抗原抗体反应的信号检测的物质作为检测标记物的抗体。半抗原也可包括生物素、二硝基苯(DNP)、FITC等。例如在使生物素与抗体结合来制作探针复合物的情况下，可以对与生物素具有亲和性的亲和素标记ALP等酶、荧光素等荧光物质或吖啶衍生物等发光物质，使其与探针复合体反应，通过显色、荧光、发光等来检测信号。
抗体的标记方法没有特别限定，可使用以往的公知的方法，例如包括：利用酶等标记物直接标记抗体的方法、使抗体和酶等标记物与葡聚糖等高分子化合物结合的方法、使标记抗体与葡聚糖等高分子化合物结合的方法等。
本发明的抗体包括动物的多克隆抗体和小鼠的单克隆抗体，关于为了得到抗体对动物进行免疫的方法以及用于得到产生单克隆抗体的杂交瘤的方法，除了使用HbsAg或HBsAg的部分肽作为免疫原的手段以外，可利用公知的方法实施，例如，可根据《续编生物化学实验讲座》(日本生化学会编)或《免疫生物化学研究法》(日本生化学会编)中记载的方法进行。免疫用HBsAg可使用病毒颗粒或者由病毒颗粒纯化HbsAg来使用。另外，关于HBsAg和部分肽，例如，可通过基因重组在大肠杆菌中表达这些抗原，并进行纯化从而得到。此外，HBsAg的部分肽可通过化学合成制备，例如，可通过Fmoc固相合成法、Boc固相合成法合成。合成的肽可利用HPLC等公知的方法进行纯狐，将末端的氨基酸设为半胱氨酸，利用其SH基使肽与载体蛋白质结合，也可作为免疫原使用。
本发明中使用的抗体可通过使用还原的HBsAg或其肽片段作为免疫原对动物进行免疫而取得。或者使用未还原的HBsAg或其肽片段作为免疫原取得多种抗体后，使用还原的HBsAg或其肽片段进行筛选，由此取得。免疫使用的动物没有特别限定，可使用绵羊、山羊、兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、牛、马等。将HBsAg或其肽片段例如与等量的弗氏完全佐剂或Titer-Max gold(Titer Max公司)乳化混合，在兔子的皮下或小鼠的腹腔内进行给药。之后，以1～2周的间隔进行同样的免疫操作。从经过这样的免疫的动物采血，制成血清或血浆，从而可制备本发明的抗体。
产生本发明的单克隆抗体的本发明的杂交瘤可从进行了上述的免疫操作的动物取得。例如，在对小鼠进行多次免疫操作2周后，从尾静脉接种溶解于磷酸缓冲化生理食盐水(PBS)等的HBsAg或其肽片段。在此2～3日后，从小鼠无菌摘出包含产生抗体的淋巴细胞的脾脏。通过使该淋巴细胞例如与骨髓瘤细胞进行细胞融合，能够构建产生单克隆抗体的杂交瘤。
细胞融合例如可在聚乙二醇的存在下通过使淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合来进行。骨髓瘤细胞例如可使用具有如次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷或胸苷激酶缺陷这样的标记物的公知的细胞。具体而言例如可举出p3·NS-1/1·Ag4.1或SP2/0-Ag14等细胞。融合的细胞通过使用选择性培养基、例如HAT培养基使未融合的细胞死亡从而进行选择。
其次，筛选增殖得到的杂交瘤的培养上清中抗体产生的有无。可通过使用固相酶免疫测定法(ELISA法)等测定针对HBsAg及其肽片段的特异性抗体的产生来实施筛选。选择分泌目的抗体的杂交瘤的克隆，进一步利用极限稀释法重复亚克隆，从而可保证单克隆抗体的克隆性。如此可选择产生本发明的抗体的杂交瘤。
本发明的杂交瘤可利用公知的任意的培养基，例如RPMI1640进行传代培养。本发明的单克隆抗体可通过培养该杂交瘤而制备，例如，在RPMI1640培养基中添加10％胎牛血清，在5％CO2存在下在37℃培养，由此可在培养上清中产生抗体。另外，在用降植烷(Pristane)进行了预处理的小鼠的腹腔内接种杂交瘤，10～20日后，回收腹水，由此能够在腹水中产生抗体。本发明的抗体可利用公知的方法纯化，例如，可利用使用ProteinG或ProteinA柱的纯化方法、使用结合有HBsAg的亲和柱的方法、或使用离子交换柱的方法等进行纯化。
得到的单克隆抗体识别的表位可使用由来自HBsAg的序列制作的重组抗原或化学合成的10～20个氨基酸左右的合成肽，通过固相酶免疫测定法(ELISA法)来确定。由本发明的各杂交瘤产生的单克隆抗体的表位根据对下述肽的反应性来确定：基于基因型不同的HBsAg的氨基酸序列每10个残基进行重叠、且为化学合成的由20个氨基酸残基构成的肽。
3.检测工序
对于抗原抗体反应工序中与HBsAg接触后的检测抗体，通过适合于检测抗体中使用的标记的方法、例如在使用酶标记的情况下添加酶的底物的手段来检测。例如，在使用碱性磷酸酶(ALP)作为标记抗体的情况下，可设为使用3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷氧酰)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)作为酶底物的化学发光酶免疫测定法(CLEIA)的体系。
＜HBsAg的测定试剂盒＞
本发明的试剂盒为乙型肝炎病毒s抗原的试剂盒，其具备(1)包含还原剂的预处理试剂、以及(2)包含至少一种抗体的抗原抗体反应试剂，其中，上述抗体能够与包含乙型肝炎病毒s抗原的第98-179位氨基酸的被还原的肽发生反应。
此处所谓的“抗原抗体反应试剂”，在试剂盒中，将包含捕获抗体的试剂和包含检测抗体的试剂制成不同的组成的情况下，表示任意一者或两者，在使用包含捕获抗体和检测抗体这两者的试剂的情况下，表示该试剂。即，捕获抗体和检测抗体中至少一者使用至少一种能够与包含乙型肝炎病毒s抗原的第98-179位氨基酸的被还原的肽反应的抗体(还原外侧抗原识别抗体)。
本发明的试剂盒在相互隔离的形态或组合物的形态中包含各个组成试剂。具体而言，各组成试剂可以以收纳于各自不同的容器(例如，管、板)中的形态提供，部分的组成试剂也可以以组合物的形态(例如，在同一溶液中)提供。或者，本发明的试剂盒可以以器件的形态提供。具体而言，组成试剂的全部可以以收纳于器件中的形态提供。或者，组成试剂的一部分以收纳于器件中的形态提供，剩余部分可以以不收纳于器件中的形态(例如，收纳于不同的容器中的形态)提供。此时，不收纳于器件中的组成试剂在测定靶物质时，可以通过注入器件中来使用。另外，本发明的试剂盒可包含HBsAg标准液、其它抗乙型肝炎病毒抗体、使用说明书等。
实施例
＜实施例1各种抗HBsAg单克隆抗体对还原抗原的反应性＞
(1)非还原·还原HBsAg固相化板的制备
利用PBS或包含6M尿素的PBS将市售的天然HBsAg(Subtype ad，TRINA公司制)稀释到12.2μg/mL，制备抗原稀释液(尿素(-)、尿素(+))。用离子交换水稀释二硫苏糖醇(DTT)，分别制备1、10、50、100、200、500、1000mM的还原剂液。在96孔微孔板(Nunc公司制)的各孔中，每孔分注抗原稀释液90μL，在其中各添加还原剂液10μL。在室温静置60分钟后，在其中以80μL/孔添加PBS或包含6M尿素的PBS。在4℃静置一晚后，用PBS清洗3次。分注封闭液(1％BSA、3％蔗糖、PBS)350μL，在室温下静置3小时后，吸引除去封闭液，在室温下风干。
(2)单克隆抗体对各抗原的反应性试验(ELISA)
使用表1所示的6种抗HBsAg单克隆抗体(抗体A～F)，实施与各板的反应性的试验。各抗体的制备除了将包含作为目标的表位区域的重组肽作为免疫原以外，使用与专利文献2相同的方法实施。另外，对于表位的解析，也使用与专利文献2相同的方法实施。
对于抗体A～F，即、对于(1)中制备的抗体A～F，分别用抗体稀释液(0.024M磷酸二氢钾、0.076M磷酸氢二钾、0.25M氯化钠、0.02MEDTA2Na、1％聚乙烯吡咯烷酮(k＝30)、1％BSA、0.05％Tween20(商品名)、pH7.3)稀释为1μg/mL，制备抗体溶液。
[表1]
抗体 表位
抗体A a-loop构象性
抗体B 31-50a.a.线性
抗体C 51-60a.a.线性
抗体D 111-130a.a.线性
抗体E 111-130a.a.线性
抗体F 151-170a.a.线性
抗体G 51-60a.a.线性
将各种抗体溶液分别以100μL/孔分注于(1)中制备的各种板中，在室温下静置60分钟。用板清洗液(包含0.05％Tween20(商品名)的PBS)清洗5次后，以100μL/孔分注标记抗体液(用抗体稀释液将HRP标记抗小鼠IgG抗体稀释10000倍而得到的溶液)，在室温下静置60分钟。用板清洗液清洗3次后，以100μL/孔分注底物溶液(TMB溶液)，在室温下静置30分钟后，以100μL/孔分注2N硫酸使反应停止。测定各孔的450/630nm的吸光度。将从各孔的吸光度减去空白(仅PBS)的吸光度得到的值示于表2。
[表2]
抗体A为识别HBsAg的a-loop的结构的抗体，但是通过还原抗原，与抗原的反应性显著降低。认为其原因在于：通过还原抗原，抗体A能够识别的抗原的立体构象被破坏掉了。另一方面，抗体B、C和F虽然对非还原抗原的反应性低，但是对还原抗原的反应性高，而且在尿素存在下的反应性高。还发现，抗体D、E虽然对非还原抗原的反应性也高，但是对还原抗原的反应性变得更高。另一方面，基本没有发现尿素的影响。
＜实施例2自身抗体阳性样本对还原抗原的反应性＞
对于抗HBs抗体(HBsAb)阳性的血清样本8例，进行对还原抗原的反应性试验。非还原·还原抗原固相化板用与实施例1相同的方法制备。
制备以下样品。
a)单克隆抗体溶液
用抗体稀释液分别将抗体A、D稀释到1μg/mL，制备抗体溶液。
b)自身抗体阴性血清
使用2例自身抗体阴性的血清(N1、N2)。
c)自身抗体阳性血清
使用8例自身抗体阳性的血清(P1～P8)。各样本的抗体效价使用LUMIPULSEHBsAb-N(富士瑞必欧公司制)进行测定。将各样本的测定值示于表3。
[表3]
将抗体稀释液以100μL/孔分注于各种板，在其中以每孔10μL分别添加抗体溶液、样本，在室温下静置60分钟。用板清洗液清洗5次后，以100μL/孔分注标记抗体液(用抗体稀释液将HRP标记抗小鼠IgG抗体或HRP标记抗人IgG抗体稀释10000倍而得到的溶液)，在室温下静置60分钟。用板清洗液清洗3次后，以100μL/孔分注底物溶液(TMB溶液)，在室温下静置30分钟后，以100μL/孔分注2N硫酸使反应停止。测定各孔的450/630nm的吸光度。将从各孔的吸光度减去空白(仅PBS)的吸光度得到的值示于表4。
[表4]
对于自身抗体阳性样本8例，可确认通过还原抗原，其反应性降低。对于8例中的2例(P2、P4)，显示对还原抗原也稍微发生了反应，但是对用还原剂和尿素进行变性后得到的抗原的反应性显著降低。另一方面，对于抗体D，未发现因还原剂、尿素引起的反应性降低，反而显示了反应性提高。以上情况提示：在进行血清样本的HBsAg的免疫测定时，通过还原样本并在抗原抗体反应体系中使用抗体D，能够减少样本中所包含的自身抗体与抗原的反应，并能够提高作为目标的抗原抗体反应的反应性。
＜实施例3自身抗体阳性样本与抗HBsAg单克隆抗体的竞争试验＞
在此研究了自身抗体阳性样本所包含的人抗HBsAg抗体是否会与各种单克隆抗体竞争。
使用自身抗体阳性的血清样本6例(P9～P14)。各血清样本的抗体效价使用LUMIPULSE HBsAb-N(富士瑞必欧公司制)进行测定。各样本的测定值如表3所示。
用与实施例1相同的方法制备非还原抗原固相化板。用抗体稀释液将抗体A、D、E、F分别稀释到100μg/mL，以100μL/孔分注。用PBS将血清样本P9～P14分别稀释5倍，在分注有抗体的孔中进一步以10μL/孔分注。在室温下静置60分钟后，用板清洗液清洗5次。以100μL/孔分注标记抗体液(用抗体稀释液将HRP标记抗小鼠IgG抗体或HRP标记抗人IgG抗体稀释10000倍得到的溶液)，在室温下静置60分钟。用板清洗液清洗3次后，以100μL/孔分注底物溶液(TMB溶液)，在室温下静置30分钟后，以100μL/孔分注2N硫酸使反应停止。测定各孔的450/630nm的吸光度。将从各孔的吸光度减去空白(仅PBS)的吸光度得到的值示于表5。
[表5]
当在各个自身抗体阳性样本中添加抗体A时，自身抗体对抗原的反应大幅降低，然而在添加抗体D、E、F时，完全没有观察到反应降低或者反应降低的程度非常有限。这提示样本中的人抗HBsAg抗体与抗体A竞争，但与抗体D、E、F基本不竞争。
＜实施例4-1自身抗体阳性样本的HBsAg测定(使用DTT)＞
(1)自身抗体阳性样本的模型样本的制备
对于HBsAg浓度已知的自身抗体阴性的对照血清样本2例(M3、H3)，分别添加Hebsbulin(聚乙二醇处理抗HBs人免疫球蛋白制剂)直至其终浓度达到1000mIU/mL，制备自身抗体阳性模型血清样本2例(M4、H4)。
(2)样本预处理
对于(1)中制备的4个样本(M3、M4、H3、H4)进行样本预处理。预处理试剂是通过在基础预处理试剂(2.39％NLS、50mM Tris、pH7.2)中添加DTT直至DTT终浓度达到20mM而制备的。将各样本100μL与各预处理试剂200μL混和，在37℃下加热60分钟。添加离子交换水400μL进行稀释，制备预处理混和液。另外，对于HBsAg阴性血清3个样本，进行相同的预处理，作为空白样本。
(3)HBsAg测定体系构建
在颗粒稀释液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA2Na、2％BSA、pH7.2)中添加分别固相化有抗体A、B、D、E、F的磁性颗粒直到达到0.05％的含量，制备磁性颗粒液。用标记体稀释液(100mM MES、1％BSA、1mMNaCl、0.1mM ZnCl2、pH6.8)将用碱性磷酸酶标记抗体A、D、E、G而得到的标记抗体调整至0.5μg/mL，制备标记体液。应予说明，抗体G的表位如表1所示。
除了将磁性颗粒液、标记体液变更为上述磁性颗粒液、标记体液，将血清样本变更为上述的预处理后的样本以外，使用LUMIPULSEHBsAg-HQ(富士瑞必欧公司制)，按照使用说明书中记载的方法进行HBsAg的测定，输出发光强度(计数)。将各条件下的测定结果示于表6-1、6-2。表6-1、6-2所示的测定结果为用各条件下的M3、M4、H3、H4的计数值减掉HBsAg阴性血清3个样本的平均计数值而得到的值。
[表6-1]
/>
N.D.没有数据
[表6-2]
N.D.没有数据
在使用抗体A作为固相化抗体或标记体的情况下，显示在预处理液不使用还原剂的条件下，强烈受到自身抗体的影响，另一方面，在使用还原剂的条件下计数值降低，整体上灵敏度降低。
在使用抗体D、抗体E作为固相化抗体或标记体的情况下，通过在预处理液中使用还原剂，整体上计数值提高，且因自身抗体的存在导致的发光强度的降低程度减小，发现计数值的Ab(+)/Ab(-)存在变为更接近于1的值的趋势。另外，在使用抗体F作为固相化抗体、使用抗体D或抗体E作为标记体的情况下，也观察到相同的趋势。
根据以上，提示在使用抗体D、E、F中的任一者在预处理液含有还原剂的条件下测定HBsAg的情况下，能够避免自身抗体的影响，且能够以更高灵敏度测定HBsAg。
＜实施例4-2自身抗体阳性样本的HBsAg测定(使用TCEP、DEAET)＞
(1)HBsAg测定体系构建
在黑色96孔微孔板(F16 Maxisorp、Thermo Fisher制)中，以100μL/孔分注分别含有5μg/mL的抗体B、抗体F的PBS，在4℃下静置一晩。用PBS清洗3次后，分注350μL封闭液(1％BSA、3％蔗糖、PBS)，在室温下静置3小时。吸引除去封闭液，在室温下风干，制备抗HBsAg抗体固相化板。
用标记体稀释液(100mM MES、1％BSA、1mM NaCl、0.1mM ZnCl2、pH6.8)将用碱性磷酸酶标记抗体D、E而得到的标记抗体调整为0.5μg/mL，制备标记体液。
(2)自身抗体阳性样本的模型样本的制备
对于HBsAg浓度已知的自身抗体阴性的血清样本2例(13(-)、H3)，分别添加Hebsbulin直至其终浓度达到1000mIU/mL，制备自身抗体阳性模型血清样本2例(13(+)、H4)。
(3)样本预处理
对于(2)中制备的4个样本(13(-)、13(+)、H3、H4)，进行样本预处理。预处理试剂是通过在基础预处理试剂(2.39％NLS、50mMTris、pH7.2)中添加TCEP或DEAET直至其终浓度达到20mM来制备的。将各样本100μL与各预处理试剂200μL混和，在37℃下加热60分钟。对于HBsAg阴性血清3个样本也进行相同的预处理，作为空白样本。
(4)HBsAg测定
在(1)制备的抗HBsAg抗体固相化板中以100μL/孔分注杂交缓冲液(0.024M磷酸二氢钾、0.076M磷酸氢二钾、0.25M氯化钠、0.02MEDTA2Na、1％聚乙烯吡咯烷酮(k＝30)、1％BSA、0.05％Tween20(商品名)、pH7.3)。进一步以50μL/孔分注(3)的已经过预处理的样本。在室温下静置60分钟后，用板清洗液清洗5次。以100μL/孔分注(1)中制备的标记体液，在室温下静置30分钟。用板清洗液清洗5次后，以100μL/孔分注LUMIPULSE底物液(富士瑞必欧公司制)。在室温下静置20分钟后，用酶标仪测定各孔的发光计数。将各条件下的测定结果示于表7。表7示出的结果为用各条件下的13(-)、13(+)、H3、H4的计数值减掉HBsAg阴性血清3个样本的平均计数值而得到的值。
[表7]
如表7所示，在使用TCEP、DEAET作为还原剂的情况下，通过在颗粒和/或标记体中使用抗体D、E、F中的任意一者来测定HBsAg，也显示出不易受到自身抗体的影响的效果。
序列表
<110> 富士瑞必欧株式会社
<120> 乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒
<130> PF619-PCT
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 1
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Ile Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Val Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225

Claims (8)

1.一种从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒s抗原的测定方法包括：
预处理工序，其中，将所述样本与包含还原剂的预处理试剂混和而将乙型肝炎病毒s抗原还原，由此切断样本中包含的所述乙型肝炎病毒s抗原的S-S键，使其立体结构解离而成为线性结构；和
免疫测定工序，其中，使用抗体或其抗原结合性片段中的至少一种，对预处理后的样本进行乙型肝炎病毒s抗原的免疫测定，所述抗体和其抗原结合性片段能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第98-179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应，所述抗体或其抗原结合性片段是与非还原抗原相比，与还原抗原优先反应的抗体或其抗原结合性片段。
2.根据权利要求1所述的从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其中，
所述还原剂为选自2-(二乙氨基)乙硫醇盐酸盐(DEAET)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(ME)、半胱胺、三丁基膦(TBP)中的至少一种还原剂，
所述预处理工序中的所述还原剂的终浓度为0.5～100mM。
3.根据权利要求1或2所述的从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其中，
所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第111-170位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
4.根据权利要求3所述的从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其中，
所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第111-156位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
5.根据权利要求4所述的从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其中，
所述抗体能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第111-130位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。
6.根据权利要求1或2所述的从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其中，
所述预处理工序在pH3.0以上且12.0以下的条件下进行。
7.根据权利要求1或2所述的从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法，其中，
所述预处理试剂还包含表面活性剂。
8.一种乙型肝炎病毒s抗原的测定试剂盒，其特征在于，具有：
(1)包含还原剂的预处理试剂，以及
(2)包含抗体或其抗原结合性片段中的至少一种的免疫测定试剂，其中，所述抗体和其抗原结合性片段能够与乙型肝炎病毒s抗原的、包含序列号1的氨基酸序列中的第98-179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应，
所述还原剂是能够切断样本中包含的所述乙型肝炎病毒s抗原的S-S键、使其立体结构解离而成为线性结构的还原剂，所述抗体或其抗原结合性片段是与非还原抗原相比，与还原抗原优先反应的抗体或其抗原结合性片段。
CN201880077429.7A 2017-11-30 2018-11-22 乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒 Active CN111417854B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-230194 2017-11-30
JP2017230194 2017-11-30
PCT/JP2018/043229 WO2019107279A1 (ja) 2017-11-30 2018-11-22 Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の測定方法及び測定キット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111417854A CN111417854A (zh) 2020-07-14
CN111417854B true CN111417854B (zh) 2023-12-08

Family

ID=66664463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880077429.7A Active CN111417854B (zh) 2017-11-30 2018-11-22 乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11454632B2 (zh)
EP (1) EP3719499B1 (zh)
JP (1) JP7198222B2 (zh)
CN (1) CN111417854B (zh)
TW (1) TWI809010B (zh)
WO (1) WO2019107279A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109870581B (zh) 2017-12-04 2021-05-04 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 一种定量检测HBsAg的试剂盒及方法
US20220349889A1 (en) 2019-09-27 2022-11-03 Fujirebio Inc. Immunoassay for hepatitis b virus core-related antigen and kit therefor
CN112526136B (zh) * 2020-11-03 2023-04-25 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒
JPWO2022154119A1 (zh) * 2021-01-18 2022-07-21
CN113777312B (zh) * 2021-09-03 2024-02-02 普十生物科技(北京)有限公司 乙肝抗体片段的制备方法、乙肝抗体片段、试剂盒及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023098A (zh) * 2004-09-22 2007-08-22 株式会社先端生命科学研究所 乙肝病毒s抗原的检测方法
WO2008053900A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 Advanced Life Science Institute, Inc. Procédé d'analyse immunologique à sensibilité élevée et réactif d'analyse immunologique pour le virus de l'hépatite b
JP2009288149A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Tosoh Corp Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体の測定方法
CN105074470A (zh) * 2013-01-28 2015-11-18 希森美康株式会社 用于检测HBs抗原的样品的预处理方法及其利用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6026564B2 (ja) 1982-07-01 1985-06-24 株式会社栗田機械製作所 フイルタプレスの濾布振動装置
WO2008053901A1 (en) * 2006-10-30 2008-05-08 Advanced Life Science Institute, Inc. METHOD FOR ANALYSIS OF HEPATITIS B VIRUS s ANTIGEN

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023098A (zh) * 2004-09-22 2007-08-22 株式会社先端生命科学研究所 乙肝病毒s抗原的检测方法
WO2008053900A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 Advanced Life Science Institute, Inc. Procédé d'analyse immunologique à sensibilité élevée et réactif d'analyse immunologique pour le virus de l'hépatite b
JP2009288149A (ja) * 2008-05-30 2009-12-10 Tosoh Corp Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体の測定方法
CN105074470A (zh) * 2013-01-28 2015-11-18 希森美康株式会社 用于检测HBs抗原的样品的预处理方法及其利用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Yibin Zhu.Toward the development of monoclonal antibody-based assays to probe virion-like epitopes in hepatitis B vaccine antigen.Human Vaccines & Immunotherapeutics.2014,第1013-1016,1020-1022页. *

Also Published As

Publication number Publication date
TWI809010B (zh) 2023-07-21
US20200371104A1 (en) 2020-11-26
JP7198222B2 (ja) 2022-12-28
EP3719499A1 (en) 2020-10-07
WO2019107279A1 (ja) 2019-06-06
JPWO2019107279A1 (ja) 2020-12-24
US11454632B2 (en) 2022-09-27
TW201925781A (zh) 2019-07-01
EP3719499A4 (en) 2021-06-30
EP3719499B1 (en) 2023-02-22
CN111417854A (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111417854B (zh) 乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒
US11372001B2 (en) Anti-human IgG4 monoclonal antibody and methods of making and using same
RU2620563C2 (ru) Способ детекции партнера по связыванию мультиспецифического связывающего агента
US20080261249A1 (en) Detecting and Quantifying Host Cell Proteins in Recombinant Protein Products
WO2007003090A1 (fr) Composition remplaçant un sérum positif utilisée comme témoin dans un agent de diagnostic et application de celle-ci
CN113138276A (zh) 用于检测HBcAg的方法及抗体
JP2020170001A (ja) エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の決定方法
JP5798679B2 (ja) ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途
WO2019189874A1 (ja) Ｄｕｐａｎ－２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。
WO2022265065A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット、並びにモノクローナル抗体又はその抗体断片
US10479827B2 (en) Monoclonal antibody reacting with glycopeptide, and use thereof
JP5261822B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法
US20060275849A1 (en) Monoclonal antibody reagents
WO2019189882A1 (ja) Ｎｃｃ－ｓｔ－４３９抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。
WO2022202876A1 (ja) Ｉ型コラーゲンｃ末端テロペプチドの免疫学的分析方法
JP7315966B2 (ja) 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法
JP7105970B1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット
JP6189499B1 (ja) 新規の結合アッセイ
JP7002101B2 (ja) 抗グリチルレチン酸抗体及びその利用
KR20220092744A (ko) 말 인플루엔자 바이러스 h3n8형에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 말인플루엔자 바이러스 검출용 조성물
CN118043666A (zh) 对定量药物和靶标浓度的测定
JP2020162572A (ja) 抗原の処理方法。
JP2011160696A (ja) 修飾ヒトｉｇｆ−１／ｅペプチドに対する抗体
JPWO2005063978A1 (ja) モルモット免疫グロブリンｅからなる画分及び抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant